Xây dựng quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion - Scd) dùng trong đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng người

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 82 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT SỰ PHÂN TÁN NHIỄM SẮC CHẤT CỦA TINH TRÙNG (SPERM CHROMATIN DISPERSION - SCD) DÙNG TRONG ĐÁNH GIÁ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG NGƯỜI Nguyễn Trương Thái Hà*, Nguyễn Thị Thúy An*, Mã Phạm Quế Mai*, Phạm Nguyễn Thảo Trang*, Hồ Mạnh Tường* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng. Đối tượng: 70 mẫu tinh dịch của tình nguyện viên nam tuổi từ 18 - 40. Phương pháp nghiên cứu: Các bước xây dựng quy trình gồm khảo sát: mật độ tinh trùng làm tiêu bản, thành phần dung dịch ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính trước ly giải. Mẫu tinh dịch xử lý H2O2 2% làm chứng dương. Hiệu quả của quy trình sẽ được đối chứng với kết quả từ bộ thuốc thử Halosperm® G2. Kết quả: Quy trình khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion – SCD) thực hiện với mật độ tinh trùng dùng làm tiêu bản là 106 tinh trùng/ml, sử dụng dung dịch biến tính là HCl 0.08N, một dung dịch ly giải gồm Tris 0.4M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5M, SDS 1%, EDTA 50mM, pH 7.5, thuốc nhuộm là DAPI 2µg/ml. Hiệu quả của quy trình cho kết quả tương quan dương mạnh (r = 0.97, p < 0.01) khi chạy thống kê SPSS ver.16 với bộ thuốc thử thương mại Halosperm®. Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình SCD với thao tác đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị vô sinh nam cũng như mở ra các hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng tại Việt Nam. Từ khóa: Halosperm, hỗ trợ sinh sản, SCD, phân mảnh DNA tinh trùng, vô sinh nam. SUMMARY ESTABLISHING THE PROCEDURE SPERM CHROMATIN DISPERSION (SCD) FOR DETERMINATION OF HUMAN SPERM DNA FRAGMENTATION Nguyen Truong Thai Ha, Nguyen Thi Thuy An, Ma Pham Que Mai, Pham Nguyen Thao Trang, Ho Manh Tuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - No 5 - 2016: 82 - 87 Objective: Establish the procedure for determination of human sperm DNA fragmentation Subjects: 70 semens from male volunteers in ages 18 - 40. Methods: The experiments were surveyed such as the optimal semen dilution for templates, semen dilution, the concentration of the components in the lysis solution and conditions for human sperm DNA treatment. The H2O2 2% treated semen was used as positive control. In addition, DFI was evaluated by both of the established procedure and the halo sperm G2 kit in order to assess correlation between two methods. Result: It is shown that the optimal sperm concentration is 106 sperm/ml. Samples should be treated in the denaturing solution HCl 0.08N before using lysis solution (Tris 0.4 M, DTT 0.4mM, NaCl 1.5 M, SDS 1 %, EDTA 50 mM, pH 7.5). Sperm DNA was stained by fluorescence dye DAPI 2 µg/ml. And DFI can be analyzed on fluorescence microscopy at 40X. The strong positive correlation was observed to both of the improved SCD test and Halosperm kit (r=0.97, P<0.01). Conclusion: It is believed that the improved SCD test could be applied in male infertility diagnosis as well as in research on human sperm DNA fragmentation in Viet Nam due to its advantages as simple, suitable cost and * Trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH), Khoa Y, Đại học Quốc Gia TP.HCM Tác giả liên lạc: CN Nguyễn Trương Thái Hà Email: thaiha@vnuhcm.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học 83 short duration. Key word: ART, Halosperm, male infertility, SCD, sperm DNA fragmentation. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo nghiên cứu của Schoor và cộng sự(15), tỷ lệ vô sinh ở các cặp đôi trong độ tuổi sinh sản là 15 – 20% và ngày càng gia tăng. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán vô sinh trong hỗ trợ sinh sản là một nhiệm vụ rất cần thiết. Cho đến nay, phương pháp chẩn đoán vô sinh nam chủ yếu dựa trên kết quả tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế Giới – WHO 2010. Tuy nhiên vẫn tồn tại nhiều trường hợp bệnh nhân bị vô sinh với các chỉ số tinh dịch đồ nằm trong giới hạn bình thường(17). Các nghiên cứu gần đây cho thấy phân mảnh DNA tinh trùng là một trong những nguyên nhân gây vô sinh(1,15). Nhiều phương pháp đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng người đã ra đời, góp phần không nhỏ vào việc chẩn đoán và điều trị vô sinh như phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng – SCSA (Sperm chromatin structural assay)(4,5) , điện di tế bào đơn – COMET(3,14), sử dụng chất nhuộm chromomycin-A3 – CMA3(13), dịch mã đứt gãy tại chỗ (in situ nick translation assay)(2) Trong các phương pháp này, phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng - SCD (sperm chromatin dispersion) là phương pháp có nhiều ưu điểm như đơn giản, hiệu quả cao và thời gian thực hiện ngắn(11). Bên cạnh đó, SCD còn có thể kết hợp với nhiều phương pháp khác như lai huỳnh quang tại chỗ - FISH (Fluorescent insitu hybridization) hoặc bổ sung các kháng thể đặc hiệu để chẩn đoán các bất thường di truyền ở tinh trùng(7,6,8). Phương pháp SCD cũng đã được cải tiến thành bộ thuốc thử thương mại Halosperm®G2(6) với các thành phần hóa chất pha sẵn, thao tác tiến hành đơn giản, tuy nhiên giá thành ở Việt Nam lại khá cao (1.5 triệu đồng/1 xét nghiệm), không phù hợp để trở thành một chẩn đoán thường quy cho các bệnh nhân vô sinh nam. Vì vậy, chúng tôi chọn quy trình SCD với mục tiêu xây dựng và cải tiến quy trình chẩn đoán phân mảnh DNA tinh trùng người phù hợp với điều kiện Việt Nam để trở thành một công cụ xét nghiệm góp phần chẩn đoán và điều trị vô sinh trong hỗ trợ sinh sản. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 70 mẫu tinh dịch từ các tình nguyện viên tham gia nghiên cứu, thu nhận bằng phương pháp thủ dâm tại phòng thí nghiệm của Trung tâm nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH), Khoa Y, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Tiêu chuẩn mẫu: có mật độ tối thiểu 107 tinh trùng/ml theo tiêu chuẩn đánh giá mật độ của Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO 2010); thu nhận từ các tình nguyện viên nam trong độ tuổi sinh sản từ 18 – 40 tuổi, không có triệu chứng vô tinh, không mắc các bệnh truyền nhiễm, bệnh hiểm nghèo, bệnh nam khoa, kiêng xuất tinh từ 2-7 ngày. Hình 1: Phân loại phân mảnh tinh trùng, hình ảnh của Halosperm (a) và SCD (b) Phương pháp nghiên cứu Dựa trên quy trình tham khảo của Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 84 Fernández và cộng sự(7,6), chúng tôi xây dựng và cải tiến quy trình SCD theo điều kiện ở Việt Nam, với các thí nghiệm: độ pha loãng tinh dịch, nồng độ các thành phần trong dung dịch ly giải, thời gian ly giải và điều kiện biến tính trước ly giải, mỗi nghiệm thức tiến hành lặp lại đồng thời trên 3 mẫu tinh dịch đại diện cho 3 nhóm phân mảnh tinh trùng: (1) Không phân mảnh: DFI <15%, (2) Phân mảnh mức độ nhẹ: DFI 15 – 30%, (3) Phân mảnh nặng: >30%(11) được đánh giá bằng bộ thuốc thử thương mại Halosperm® G2 (Halotech DNA, Madrid, Spain), bộ thuốc thử được phát triển dựa theo nguyên tắc và quy trình thực hiện của phương pháp SCD của Férnandez và cộng sự năm 2005(6). Cách đánh giá DFI: Phân tích kết quả của tối thiểu 200 tế bào trên kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX-53, Nhật, độ phóng đại 40X, kết quả hình ảnh được phân tích bằng chương trình phân tích hình ảnh Image J, đo độ rộng vòng sáng quanh đầu tinh trùng (r) và đường kính nhỏ nhất của đầu tinh trùng (d). Phân loại như sau: r ≥ d: halo lớn (hình 1-1a, b), 1/3d ≤ r < d: halo trung bình (hình 1-2a, b), r < 1/3d: halo nhỏ (hình 1-3a, b), r = 0: không có halo (hình 1-4a, b), thoái hóa (degradation): không có halo và bắt màu yếu (hình 1-5a, b). Trong đó, trường hợp 1, 2 là những tinh trùng không bị phân mảnh DNA và trường hợp 3, 4, 5 là những tinh trùng bị phân mảnh DNA. Chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng (DNA Fragmentation Index – DFI) được xác định dựa vào công thức sau: DFI = (Số tinh trùng bị phân mảnh DNA/ tổng số tinh trùng đếm được) x 100%. Ngoài điều kiện khảo sát, các bước tiến hành thực hiện theo quy trình tham khảo. Mẫu tinh dịch tươi được xử lý H2O2 2%, ủ trong tối trong 10 phút dùng làm chứng dương để đánh giá khả năng ly giải (H2O2 là tác nhân oxy hóa làm cho DNA tinh trùng bị phân mảnh, sau xử lý DFI ≈100%, toàn bộ tinh trùng không có halo hay chỉ có halo nhỏ). Mẫu bị âm tính giả khi DFI của chứng dương nhỏ hơn 90%, mẫu bị dương tính giả khi có DFI cao hơn DFI của Halosperm ở cả 3 nhóm. Xác định nồng độ pha loãng tinh dịch Pha loãng tinh dịch trong dung dịch PBS về mật độ 105 tinh trùng/ml, 106 tinh trùng/ml và 107 tinh trùng/ml. Mẫu sau pha loãng được trộn trong agarose có điểm đông thấp (low melting agarose) 1% theo tỷ lệ 25 µl mẫu với 50 µl gel rồi trải toàn bộ lên lam kính. Đậy phiến kính 24 x 60 mm. Ghi nhận số lượng tinh trùng trung bình thu được trên 1 vi trường trên vật kính 40X của kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX – 53 tại mỗi nồng độ pha loãng tương ứng. Xác định nồng độ các chất trong dung dịch ly giải Theo quy trình của Fernández(7,6) và một số quy trình khác(11,12) nồng độ các chất trong dung dịch ly giải có sự thay đổi là DTT trong dung dịch ly giải 1 và NaCl trong dung dịch ly giải 2, nồng độ Tris 0.4M, SDS 1%, EDTA 50mM không có sự thay đổi nên chúng tôi khảo sát để tìm ra nồng độ DTT và NaCl tối ưu. Nồng độ DTT trong dung dịch ly giải 1 Theo một số quy trình SCD cải tiến của các nghiên cứu khác(10,12) và cả Fernández cũng cho rằng nồng độ DTT trong dung dịch ly giải từ 0,1 mM đến 2 M(9). Mặt khác, chi phí DTT khi mua ở Việt Nam quá cao, đây là thành phần khiến cho giá thành của xét nghiệm SCD cao, do đó nồng độ DTT được khảo sát ở mức thấp nhất là 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM. Nồng độ NaCl trong dung dịch ly giải 2 Tham khảo nồng độ NaCl một số quy trình khác(9,10), thực hiện khảo sát khoảng nồng độ từ 1 M đến 2 M, với nồng độ thực hiện 1 M, 1.5 M, 2 M. Cải tiến dung dịch ly giải Nhận thấy 2 dung dịch ly giải trong quy trình tham khảo: dung dịch 1 (L1) Tris 0.4 M, DTT 0.8 M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, dung dịch 2 (L2) Tris 0.4 M, NaCl 2 M, SDS 1% pH 7.5 có các thành phần Tris 0.4 M, SDS 1% tương tự và tác dụng tương tự, đồng thời tham Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học 85 khảo quy trình SCD cải tiến khác chỉ có một dung dịch ly giải(9,10,12) nên chúng tôi tiến hành cải tiến dung dịch ly giải và thực hiện các loạt thí nghiệm so sánh hiệu quả ly giải: (1) Xử lý tinh trùng trong cả 2 dung dịch ly giải 1 và 2 theo như quy trình tham khảo, ký hiệu L1L2; (2) tinh trùng chỉ được xử lý trong dung dịch ly giải 1, ký hiệu là L1; (3) tinh trùng chỉ được xử lý trong dung dịch ly giải 2, ký hiệu là L2; (4) tinh trùng xử lý trong dung dịch ly giải 2 có bổ sung DTT 0.4 mM và EDTA 50 mM trong 30 phút, ký hiệu L2DTT. Khảo sát thời gian ngâm ly giải Đánh giá hiệu quả ly giải khi ngâm dung dịch ly giải trong 10 phút, 20 phút, 30 phút. Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải Đánh giá sự cần thiết ngâm dung dịch biến tính trước ly giải. Tiến hành so sánh hiệu quả ly giải khi không thực hiện và thực hiện ngâm dung dịch biến tính HCl 0.08 N trước khi ngâm dung dịch ly giải. Kiểm tra hiệu quả quy trình cải tiến Thực hiện đánh giá tương quan theo ý nghĩa thống kê tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng – DFI xác định bằng quy trình SCD cải tiến và bộ thuốc thử thương mại Halosperm® G2 trên cỡ mẫu là 50 mẫu tinh dịch ở cả 3 nhóm mức độ phân mảnh bằng phần mềm thống kê SPSS ver16. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định nồng độ pha loãng tinh dịch Chọn mật độ 106 tinh trùng/ml, vì trung bình có 12 - 20 tinh trùng/vi trường phù hợp để quan sát và phân tích kết quả tối thiểu 400 tinh trùng/mẫu ở vật kính 40X trên kính hiển vi huỳnh quang (mật độ 105 tinh trùng/ml chỉ có 2 – 5 tinh trùng/vi trường gây khó khăn khi đếm tối thiểu 400 tinh trùng), không có hiện tượng tinh trùng chồng lên nhau (mật độ 107 tinh trùng/ml có trên 50 tinh trùng/vi trường, tinh trùng có hiện tượng chồng lên nhau dễ gây sai lệch đánh giá kết quả) (Hình 2). Hình 2: Hình chụp vi trường từ camera trên kính hiển vi huỳnh quang độ phóng đại 40X của mẫu nhuộm DAPI có nồng độ tinh dịch lần lượt là 107 tinh trùng/ml , 106 tinh trùng/ml , 105 tinh trùng/ml Xác định nồng độ các chất trong dung dịch ly giải Khảo sát nồng độ DTT tối ưu 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 Mm Xét chứng dương: ở nồng độ 0.2 mM, 0.4 mM và 0.6 mM các mẫu đều cho kết quả DFI 100%, nồng độ 0.8mM các mẫu bị âm tính giả vì chỉ cho kết quả DFI < 50%. Xét kết quả DFI của các mẫu: ở nồng độ 0.2 mM kết quả từ quy trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ lệ DFI >50% ở cả 3 nhóm DFI. Ở nồng độ 0.4 mM và 0.6 mM kết quả DFI của mẫu tương đương với Halosperm ở 3 nhóm DFI. Chọn nồng độ DTT 0.4 mM để tiết kiệm hóa chất. Khảo sát nồng độ NaCl tối ưu 1M, 1.5M, 2M Xét chứng dương: ở cả ba nồng độ tất cả các mẫu đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả DFI của các mẫu: ở nồng độ NaCl 1 M kết quả Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 86 từ quy trình SCD của mẫu bị dương tính giả, tỷ lệ DFI >50% ở cả 3 nhóm DFI, nồng độ 1.5 M và 2 M các mẫu đều cho kết quả tương đương giữa quy trình SCD và Haosperm. Để tiết kiệm hóa chất chọn nồng độ NaCl tối ưu là 1.5 M. Cải tiến dung dịch ly giải Xét chứng dương: cả 4 nghiệm thức đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả DFI của các mẫu: ở mẫu chỉ sử dụng L1 hoặc L2 nhận thấy mẫu không ly giải, 100% tinh trùng không có halo, hình thái đầu không nở to. Mẫu ly giải L1L2 và L2DTT trong 30 phút cho kết quả DFI tương đương Halosperm. Vậy dung dịch L2DTT có tác dụng tương tự với việc sử dụng 2 dung dịch ly giải, xét về mặt hóa chất và thao tác thì tiện lợi hơn nên sử dụng dung dịch ly giải kết hợp cho các bước thí nghiệm tiếp theo. Kiểm tra thời gian ly giải mẫu trong dung dịch L2DTT Xét chứng dương: cả 3 thời gian, tất cả các mẫu đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả DFI của các mẫu: mẫu thực hiện ly giải với dung dịch L2DTT 30 phút và 20 phút cho kết quả DFI tương đương với bộ thuốc thử Halosperm®, để tiết kiệm thời gian thực hiện chọn thời gian ngâm ly giải là 20 phút. Khảo sát điều kiện biến tính trước ly giải Xét chứng dương: mẫu không xử lý biến tính ngâm trong HCl 0.08 N trong 7 phút và có xử lý biến tính đều cho kết quả DFI 100%. Xét kết quả DFI của các mẫu: mẫu không xử lý biến tính bị dương tính giả cho DFI là 100%, mẫu xử lý biến tính cho kết quả DFI tương đương với bộ thuốc thử Halosperm®. Cần xử lý biến tính tinh trùng trước ly giải để biến tính DNA tinh trùng, bộc lộ các đứt gãy. Quy trình SCD cải tiến Phủ một lớp gel LMA 1% mỏng lên bề mặt lam kính, để khô ở nhiệt độ phòng. Pha loãng mẫu tinh dịch trong phosphate buffered saline - PBS đến mật độ 106 tinh trùng/ml. Cho 25 µl tinh dịch pha loãng vào 50µl gel LMA 1% ở 37oC trộn đều và nhỏ toàn bộ lên lam kính, đậy phiến kính 24 x 60 mm lên trên để gel dàn đều. Đặt lam mẫu vào tủ 4oC trong 5 phút. Tháo bỏ phiến kính. Ngâm lam mẫu vào dung dịch HCl 0,08N, trong 7 phút ở nhiệt độ phòng. Chuyển lam mẫu ngâm vào dung dịch ly giải cải tiến, thành phần: Tris 0.4 M, DTT 0.4 mM, NaCl 1.5 M, SDS 1%, EDTA 50 mM, pH 7.5, trong 20 phút ở 22oC. Rửa lam mẫu trong TBE 1X trong 5 phút. Lần lượt rửa lam mẫu trong EtOH 70%, 90% và 100% trong 2 phút/lần rửa. Để lam kính mẫu khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, trải đều 100 µl thuốc nhuộm DAPI 2 µg/ml lên lam mẫu, ủ tối trong 20 phút. Lắc rửa lam kính mẫu trong TBE 1X, để khô tự nhiên khoảng 20 phút trong tối. Phân tích tối thiểu 200 tế bào trên lam mẫu trên kính hiển vi huỳnh quang vật kính 40X, tính DFI theo công thức. Kiểm tra hiệu quả của quy trình SCD mới xây dựng Đánh giá tương quan kết quả DFI giữa quy trình SCD và bộ thuốc thử Halosperm® cho kết quả tương quan dương mạnh có ý nghĩa thống kê với r = 0.97, p < 0.001 (Biểu đồ 1) Biểu đồ 1 Mối tương quan chỉ số DFI giữa quy trình SCD cải tiến và bộ thuốc thử Halosperm KẾT LUẬN Nhóm nghiên cứu phân mảnh tinh trùng thuộc trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản (CGRH) đã thành công trong việc xây dựng quy trình SCD chẩn đoán phân mảnh DNA tinh trùng người. Với các ưu điểm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học 87 như thao tác đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, chi phí hóa chất thấp (chỉ khoảng 1/5 so với giá thành nhập khẩu bộ thuốc thử Halosperm), lại cho hiệu quả tương đương, quy trình SCD có tiềm năng trở thành một xét nghiệm thường quy giúp đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng, cùng với tinh dịch đồ góp phần chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn cho các bệnh nhân vô sinh nam. Bên cạnh đó, hiện tại ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng vẫn chưa có nhiều công bố. Do đó, với quy trình SCD cải tiến chúng tôi có thể mở ra thêm nhiều hướng nghiên cứu về phân mảnh DNA tinh trùng ứng dụng vào các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản trong nước như IUI, ICSI hay trữ lạnh, cũng như tìm ra mối tương quan giữa phân mảnh với tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt, tỷ lệ sinh sống góp phần nâng cao tỷ lệ thành công của các chu trình hỗ trợ sinh sản cho bệnh nhân vô sinh hiếm muộn. Lời cảm ơn: Chân thành cám ơn ThS. BS. Hồ Mạnh Tường đã tạo điều kiện cũng như tìm nguồn tài trợ kinh phí cho việc thực hiện nghiên cứu. Cảm ơn các anh chị em trong Trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe Sinh sản đã hỗ trợ về thời gian, thiết bị để nghiên cứu được hoàn thành. Cám ơn các anh chị kỹ thuật viên hỗ trợ sinh sản ở các bệnh viện Vạn Hạnh, Mỹ Đức, An Sinh đã đóng góp các ý kiến chuyên môn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản. Cảm ơn các bạn tình nguyện viên đã sẵn sàng tham gia cung cấp nguồn mẫu cho nghiên cứu. Và cuối cùng cảm ơn chị Mai, chị An, bé Trang đã bỏ nhiều thời gian, công sức cùng tôi thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Agarwal A, Saleh RA (2002) Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and treatment. Urol Clin North Am, 29: 817-27. 2. Agarwal A, Tsarev I, Erenpresis J, Sharma R (2012) Sperm chromatin assessment. Textbook of Assisted Reproductive Techniques. Volume 1: Laboratory Perspectives, 4th edition, 75-95. 3. Enciso M, Sarasa J, Agarwal A, Fernandez JL, Gosalvez J (2009) A two-tailed Comet assay for assessing DNA damage in spermatozoa. Reprod Biomed Online, 18: 609-16. 4. Erenpresis J, Spano M, Erenpreisa J, Bungum M, Giwercman A (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects. Asian J Androl, 8: 11-29. 5. Evenson Donald, Lorna Jost (2000) Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Methods in Cell Science, 22: 169 – 189. 6. Fernández JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosálvez J, Enciso M, LaFromboise M, De Jonge C (2005) Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test. Fertil Steril, 84: 833-842. 7. Fernández JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG (2003) The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. J Androl, 24: 59–66. 8. García-Peiró A, Martínez-Heredia J, Oliver-Bonet M, Abad C, Amengual MJ, Navarro J, Jones C, Coward K, Gosálvez J, Benet J (2011) Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm. Fertil Steril, 95: 105–109. 9. Gosalvez B, Fernandez JL, Goyanes V (2006) A method for determination of DNA fragmentation in animal sperm cell. European patent application, EP1710320A1: 1–30. 10. Gutiérrez R, Bécquer P, Pandolfi. A, Cuevillas G, Pupo J, Hernández EW, Riverón G, Pereira N, Cuétara E (2007) DNA damage measurement using a modified protocol of sperm chromatin dispersion test. Pharmacologyonline, 1: 14- 19. 11. Kazim RC, Jeanine TG, Marie L, Christopher JDJ, Douglas TC (2006) Comparison of Chromatin Assays for DNA Fragmentation Evaluation in Human Sperm. Journal of Andrology, 27: 1, 53 – 59. 12. Li-hong Z,Yi Q,Ke-hua W,Qiuju W, Guozhen T, Lei-guang W (2010) Measurement of sperm DNA fragmentation using bright-field microscopy: comparison between sperm chromatin dispersion test and terminal uridine nickend labeling assay. Fertility and Sterility, 94: 3, 1027 – 1032. 13. Manicardi GC, Bianchi PG, Pantano S, Azzoni P, Bizzaro D, Bianchi U (1995) Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility. Biol Reprod, 52: 864 - 7. 14. Ribas – Maynou, Garcia, Abad (2012) Alkaline and neutral comet assay profiles of sperm DNA damage in clinical groups. Hum Reprod, 27(3): 652 - 8. 15. Schoor RA (2002) Prostatitis and male infertility: evidence and links. Curr Urol Rep, 3(4): 324 - 329. 16. Tomlinson MJ, White A, Barratt CLR, Bolton AE, Cooke ID (1992) The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes. Hum Repord, 7(4): 517 - 522. 17. Zini A, Kamal K, Phang D, Willis J, Jarvi K (2001a) Biologic variability of sperm DNA denaturation in infertile men. Urology, 58, 258 - 261. Ngày nhận bài báo: 02/09/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 05/09/2016 Ngày bài báo được đăng: 10/10/2016