Xác định, phân loại và xây dựng bản đồ gen của họ dehydrin ở cây quýt (citrus clementina)

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2016-0018 Natural Sci. 2016, Vol. 61, No. 4, pp. 116-121 This paper is available online at Ngày nhận bài: 24/3/2015. Ngày nhận Ďăng: 26/4/2015. Tác giả liên lạc: Cao Phi Bằng, Ďịa chỉ e-mail: phibang.cao@hvu.edu.vn 116 XÁC ĐỊNH, PHÂN LOẠI VÀ XÂY DỰNG BẢN ĐỒ GEN CỦA HỌ DEHYDRIN Ở CÂY QUÝT (Citrus clementina) Cao Phi Bằng1 và Trần Thị Thanh Huyền2 1Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt. Các dehydrin (DHN) thuộc nhóm II của họ LEA. Chúng Ďóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào trƣớc các tác Ďộng bất lợi của môi trƣờng thông qua khả năng giữ nƣớc và bảo vệ các màng sinh học cũng nhƣ các phân tử protein. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phƣơng pháp nghiên cứu in silico, chúng tôi Ďã xác Ďịnh Ďƣợc tổng số sáu gen mã hóa cho các DHN trong hệ gen của cây quýt (Citrus clementina). Sáu DHN của cây quýt Ďều có mang phân mảnh K Ďặc trƣng cho các protein thuộc họ DHN Ďã Ďƣợc báo cáo. Các gen trong họ DHN của cây quýt phân bố ở 5 trong tổng số 9 nhiễm sắc thể. Kết quả phân tích các motif bảo thủ cũng nhƣ phân tích cây phả hệ Ďã chỉ ra rằng các DHN này Ďƣợc xếp vào ba nhóm SKn, KS và YnSKn. Mỗi nhóm gồm có hai gen. Hai gen CclDHN1 và CclDHN6 có thể là sản phẩm của một sự kiện nhân Ďôi phân mảnh nhiễm sắc thể diễn ra sau quá trình phân hóa loài giữa quýt và Arabidopsis. Từ khóa: Dehydrin (DHN), bản Ďồ gen, cây phả hệ, in silico, quýt, xác Ďịnh gen. 1. Mở đầu Quýt (Citrus clementina) là cây thuộc họ Cam, một trong những họ cây ăn quả quan trọng nhất trên thế giới. Theo thống kê, năm 2009, sản lƣợng của các cây trong họ này Ďạt 122,3 triệu tấn (FAO 2009). Ở Việt Nam, thống kê cho thấy sản lƣợng hàng năm của các cây thuộc họ cam, quýt Ďạt khoảng 700 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam 2012). Do có giá trị cao, cây quýt là một trong các cây Ďƣợc lựa chọn làm Ďại diện trong dự án giải trình tự hệ gen các cây thuộc họ Cam [1]. Dehydrin (DHN) mã hóa các protein thuộc nhóm II của họ Late Embryogenesis Abundant protein (LEA) [2]. Chúng Ďóng vai trò quan trọng trong sự trả lời thích nghi của thực vật với các Ďiều kiện bất lợi của môi trƣờng, Ďặc biệt là vai trò bảo vệ tế bào trong quá trình mất nƣớc [2, 3]. Các protein DHN Ďƣợc báo cáo có vai trò quan trọng Ďối với các chồi ngủ và quá trình luyện lạnh của cây gỗ [2]. Các DHN Ďƣợc Ďặc trƣng bởi sự có mặt của ít nhất một trình tự bảo thủ gồm có 15 axit amin giàu lysine, EKKGIM(E/D)KIKEKLPG (phân mảnh K). Phân mảnh K thƣờng phân bố ở Ďầu carboxyl của phân tử protein và có khả năng hình thành cấu trúc xoắn lƣỡng cực, cấu trúc giữ vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác của DHN với các màng sinh học và các protein [2]. Ngoài ra, DHN cũng có thể có các motif bảo thủ khác là phân mảnh Y và phân mảnh S. Phân mảnh Y giàu tyrosine, (V/T)D(E/Q)YGNP, phân bố ở gần Ďầu tận cùng amin và có một bộ phận axit amin giống với motif ở vị trí gắn nucleotide của các protein chaperone ở nhiều loài sinh vật [2]. Phân mảnh S giàu serine, gồm từ 4 tới 10 serine). Dựa vào cấu trúc, các DHN có thể Ďƣợc chia thành 5 phân nhóm: Kn, SKn, KnS, YnKn và YnSKn [2]. Gần Ďây, phân nhóm SKS lần Ďầu tiên Ďã Ďƣợc báo cáo ở trên Ďối tƣợng cây dƣơng [4]. Với vai trò Ďặc biệt quan trọng trong việc bảo vệ tế bào và sự cảm ứng mạnh bởi các Ďiều kiện bất lợi vô sinh cũng nhƣ hữu sinh, các DHN Ďƣợc coi là chỉ thị phân tử của tính chống chịu với các Ďiều kiện bất lợi của môi trƣờng ở thực vật [3]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng tới xác Ďịnh trình tự Xác định, phân loại và xây dựng bản đồ gen của họ Dehydrin ở cây quýt (Citrus clementina) 117 của các DHN trong hệ gen của cây quýt, xây dựng cây phả hệ và phân loại các DHN. Đồng thời lập bản Ďồ gen của các gen trong họ này. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu * Cơ sở dữ liệu Trình tự hệ gen của cây quýt Ďƣợc lấy từ Wu et al [5]. Các trình tự DHN của cây Arabidopsis Ďƣợc lấy từ Hundertmark và Hincha [6]. * Phương pháp Xác định các gen DHN ở cây quýt: Các protein DHN của cây Arabidopsis [6] Ďƣợc dùng làm khuôn dò, chƣơng trình TBLASTN Ďƣợc sử dụng Ďể tìm kiếm các gen tƣơng Ďồng trên dữ liệu hệ gen của cây quýt. Pfam (cơ sở dữ liệu các họ protein [7] Ďƣợc sử dụng Ďể xác nhận sự hiện diện của các vùng bảo thủ trong trình tự protein suy diễn của các ứng viên DHN. Xác định các motif bảo thủ: Phần mềm MEME Ďƣợc sử dụng Ďể tách các motif từ các protein DHN ở cây quýt và cây Arabidopsis [8]. Tạo cây phả hệ: Các trình tự protein DHN của cây quýt và cây Arabidopsis Ďƣợc sắp dãy bằng cách dùng phần mềm MAFFT [9]. Cây phả hệ Ďƣợc xây dựng từ các trình tự protein DHN Ďã sắp dãy nhờ phần mềm MEGA5, dữ liệu Ďƣợc xử lí là tất cả các vị trí và phƣơng pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại [10]. Lập bản đồ gen: Bản Ďồ cƣ trú của gen trên các nhiễm sắc thể Ďƣợc thiết lập nhờ phần mềm MapChart [11]. 2.2. Kết quả và thảo luận * Xác định họ gen DHN trong hệ gen của cây quýt Hệ gen hoàn chỉnh của cây quýt Ďã Ďƣợc tìm kiếm với các protein DHN khuôn dò của cây Arabidopsis nhờ sử dụng chƣơng trình TBLASTN. Tổng số, 6 gen có thể mã hóa cho các DHN Ďã Ďƣợc xác Ďịnh (Bảng 1). Kết quả phân tích vùng bảo thủ nhờ sử dụng Pfam cho thấy chỉ có 4 DHN là CclDHN2, CclDHN3, CclDHN4 và CclDHN5 là các DHN Ďiển hình (PF00257). Hai DHN còn lại là CclDHN1 và CclDHN6 tƣơng Ďồng với nhiều DHN thuộc nhóm KS Ďã Ďƣợc chỉ ra ở nhiều loài thực vật khác dù không tìm thấy vùng bảo thủ Ďặc trƣng PF00257. Bảng 1. Họ DHN ở cây quýt Gen Tên locus Nhiễm sắc thể Vị trí CclDHN1 Ciclev10024637 m.g 3 41697369..41697776 CclDHN2 Ciclev10002349 m.g 5 42490019..42490852 CclDHN3 Ciclev10026675 m.g 7 1699891..1699246 CclDHN4 Ciclev10029952 m.g 8 550850..551472 CclDHN5 Ciclev10029285 m.g 8 5894816..5896074 CclDHN6 - 9 7493081..7493375 Các protein suy diễn Ďƣợc dùng làm khuôn Ďể tìm các protein tƣơng Ďồng ở các loài khác (ortholog) có trong cơ sở dữ liệu của NCBI. Phép kiểm tra này khẳng Ďịnh các trình tự tìm Ďƣợc Ďều thuộc họ DHN. Thực vậy, các protein Ďã Ďƣợc báo cáo giống nhất với các CclDHN Ďều là các DHN (Bảng 2). Số lƣợng gen DHN ở cây quýt ít hơn ở cây Arabidopsis [6], cây dƣơng [4] nhƣng nhiều hơn ở cây nho [12]. Các gen mã hóa DHN của cây quýt Ďƣợc phân bố trên 5 trong tổng số 9 nhiễm sắc thể. Trong Ďó, chỉ duy nhất nhiễm sắc thể số 8 có mang hai gen là CclDHN4 và CclDHN5. Còn lại, các nhiễm sắc thể 3; 5; 7 và 9 chỉ mang một gen thuộc họ này. Dựa trên Ďộ tƣơng Ďồng cao, có thể hai gen CclDHN1 và CclDHN6 Ďƣợc hình thành do một sự kiện nhân Ďôi phân mảnh nhiễm sắc thể. Cao Phi Bằng và Trần Thị Thanh Huyền 118 Bảng 2. Các gen tương đồng gần nhất với các DHN của cây quýt có trong cơ sở dữ liệu của NCBI Protein Miêu tả trên NCBI Chỉ số cực đại Chỉ số tổng Mức độ so sánh Giá trị E- value Mức độ tƣơng đồng Kí hiệu Genbank CclDHN1 COR15 [Citrus clementina x Citrus reticulata] 237 237 100% 7E - 79 95% AAQ92310.1 CclDHN2 dehydrin [Citrus x paradisi] 432 432 100% 8 E - 153 99% AAN78125.1 CclDHN3 dehydrin [Jatropha curcas] 120 120 100% 2 E - 32 56% ADT65201.1 CclDHN4 dehydrin 3 [Vitis yeshanensis] > gb|AFI38957.1| dehydrin 3 [Vitis yeshanensis] 81.3 81.3 49% 2 E - 17 57% AEQ19905.1 CclDHN5 dehydrin 4 [Vitis yeshanensis] > gb|AFI38958.1| dehydrin 4 [Vitis yeshanensis] 139 139 98% 1 E - 38 50% AEQ19906.1 CclDHN6 cold stress protein [Citrus trifoliata] 108 108 69% 1 E - 29 86% AAA99963.1 Hình 1. Bản đồ gen của các dehydrin trong hệ gen của cây quýt * Xác định các motif bảo thủ, phân tích cây phả hệ và phân loại các dehydrin Kết quả phân tích motif bảo thủ bằng phần mềm MEME cho thấy, phân mảnh K (trình tự KKG[IFL]M[ED]KIKEKLPG[HG]H, hình 2A) có mặt ở tất cả các DHN của cây quýt với số lần lặp lại khác nhau. Trong Ďó, CclDHN1 và CclDHN6 chỉ có 1 phân mảnh K, CclDHN2 và CclDHN4 cùng có 2 phân mảnh K trong khi 3 phân mảnh K Ďƣợc tìm thấy ở CclDHN3 và CclDHN5. Chỉ một phân mảnh S ([LG]H[RD]S[GN]SSSSSSS[DE][ED][DE], hình 2C) Ďƣợc tìm thấy ở cả sáu DHN của cây quýt, nhƣng vị trí của phân mảnh này lại rất khác nhau, nằm ở Ďầu tận cùng carboxyl của FsDHN1 và FsDHN6 trong khi nằm ở phía Ďầu tận cùng amin của bốn DHN còn lại. Riêng CclDHN4 có mang phân mảnh S không hoàn chỉnh, chỉ với hai axit amin Serine. Phân mảnh Y (DE[YFH]GNP, hình 2B) chỉ Ďƣợc tìm thấy ở CclDHN3 (2 bản sao) và CclDHN5 (3 bản sao). Nhƣ vậy, các DHN của cây quýt có mang các phân mảnh bảo thủ, Ďặc trƣng giống nhƣ ở các DHN của loài khác Ďã Ďƣợc miêu tả [3]. Xác định, phân loại và xây dựng bản đồ gen của họ Dehydrin ở cây quýt (Citrus clementina) 119 Hình 2. Biểu tượng trình tự axit amin của phân mảnh K (A), phân mảnh Y (B) và phân mảnh S (C) Các motif bảo thủ và vị trí của chúng trong phân tử protein Ďƣợc thể hiện rõ hơn qua Hình 3, hình biểu diễn kết quả sắp dãy các CclDHN nhờ sử dụng phần mềm MAFFT. Hình 3. Sự sắp dãy các dehydrin của cây quýt. (Dấu sao chỉ các axit amin bảo thủ. Các phân mảnh bảo thủ nằm trong ô, nền xám, phân mảnh K chữ in đậm, phân mảnh Y chữ in đậm nghiêng, phân mảnh S chữ in nghiêng) Cây phả hệ Ďƣợc thiết lập từ các protein DHN của cây quýt (Ccl) và cây Arabidopis (At) Ďƣợc thể hiện ở hình 4. Các CclDHN này chỉ phân bố trên ba nhánh chính của cây phả hệ Ďiều này cho phép xếp loại các CclDHN vào ba nhóm. Căn cứ trên cách phân loại của các tác giả khác [4, 6], sáu DHN của cây quýt Ďƣợc xếp vào ba nhóm KnS, SKn và YnSKn. Trong Ďó, hai protein CclDHN1 và CclDHN6 nằm cùng nhánh với DHN thuộc phân nhóm KnS của cây Arabidopsis, nhóm này gồm các DHN không có phân mảnh Y. Hai CclDHN2 và CclDHN4 nằm cùng nhánh với các DHN thuộc phân nhóm SKn, nhóm chỉ có các phân mảnh bảo thủ thuộc S và K, trong Ďó phân mảnh K nằm sau phân mảnh S (hình 3). Cuối cùng, hai protein CclDHN3 và CclDHN5 Ďƣợc xếp vào phân nhóm YnSKn nhờ sự có mặt của phân mảnh Y ở phía Ďầu amin của các protein suy diễn. Phân tích cây phả hệ cũng cho thấy có ít nhất một hiện tƣợng nhân Ďôi gen Ďã xảy ra trong họ DHN của cây quýt, tạo thành cặp gen CclDHN1 và CclDHN6. Kết quả này phù hợp với các hiện tƣợng nhân Ďôi gen DHN Ďã Ďƣợc chỉ ra ở các loài khác [4, 6]. Căn cứ vào vị trí của gen trong cây phả hệ, có thể kết luận sự kiện nhân Ďôi gen CclDHN1 và CclDHN6 xảy ra gần Ďây, sau thời kì biệt hóa loài. Cao Phi Bằng và Trần Thị Thanh Huyền 120 Hình 4. Cây phả hệ được xây dựng từ các DHN của cây quýt và cây Arabidopsis 3. Kết luận Trong công trình này chúng tôi Ďã xác Ďịnh Ďƣợc tổng số 6 gen DHN trong toàn bộ hệ gen của cây quýt. Các gen này tƣơng Ďồng cao với các DHN của nhiều loài thực vật khác. Kết quả phân tích các motif bảo thủ trong các protein suy diễn cho thấy các DHN của cây quýt có mang các motif bảo thủ Ďặc trƣng nhƣ phân mảnh K, phân mảnh Y và phân mảnh S tùy gen. Dựa trên sự có mặt của các motif bảo thủ, kết hợp với phân tích cây phả hệ Ďã chỉ ra rằng các gen này thuộc về ba nhóm KS và YnSKn và SKn. Bản Ďồ gen của họ DHN ở cây quýt Ďã Ďƣợc chúng tôi xây dựng, trong Ďó các DHN phân bố trên 5 trong tổng số 9 nhiễm sắc thể. Đây là những kết quả bƣớc Ďầu có ý nghĩa quan trọng, mở Ďƣờng cho việc nghiên cứu chức năng của các DHN ở loài cây này. Lời cảm ơn. Công trình này Ďƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ chƣơng trình nghiên cứu khoa học cơ bản của Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aleza P, Juarez J, Hernandez M, et al., 2009. Recovery and characterization of a Citrus clementina Hort. ex Tan. 'Clemenules' haploid plant selected to establish the reference whole Citrus genome sequence. BMC Plant Biology, 9(1), 110. DOI:10.1186/1471-2229-9-110. [2] Rorat T, 2006. Plant dehydrins - Tissue location, structure and function. Cellular, Molecular Biology Letters, 11(4), pp. 536-556. [3] Hanin M, Brini F, Ebel C, Toda Y, Takeda S, Masmoudi K, 2011. Plant dehydrins and stress tolerance: versatile proteins for complex mechanisms. Plant Signaling & Behavior, 6(10), pp. 1503-1509. [4] Liu CC, Li CM, Liu BG, et al., 2012. Genome-wide Identification and Characterization of a Dehydrin Gene Family in Poplar (Populus trichocarpa). Plant Molecular Biology Reporter, 30(4), pp. 848-859. [5] Wu GA, Prochnik S, Jenkins J, et al., 2014. Sequencing of diverse mandarin, pummelo and orange genomes reveals complex history of admixture during citrus domestication. Nature Biotechnology, 32(7), pp. 656-662. [6] Hundertmark M, Hincha DK, 2008. LEA (late embryogenesis abundant) proteins and their encoding genes in Arabidopsis thaliana. BMC Genomics, 9(1), 118. [7] Finn RD, Bateman A, Clements J, et al., 2014. Pfam: the protein families database. Nucleic Acids Res, 42, pp. D222-D230. Xác định, phân loại và xây dựng bản đồ gen của họ Dehydrin ở cây quýt (Citrus clementina) 121 [8] Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW, 2006. MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs. Nucleic acids research, 34(suppl 2), W369-W373. [9] Katoh K, Standley DM, 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol., 30(4), pp. 772-780. [10] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S, 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 28, pp. 2731-2739. [11] Voorrips RE, 2002. MapChart: Software for the Graphical Presentation of Linkage Maps and QTLs. Journal of Heredity 93, pp. 77-78. [12] Yang Y, He M, Zhu Z, et al., 2012. Identification of the dehydrin gene family from grapevine species and analysis of their responsiveness to various forms of abiotic and biotic stress. BMC Plant Biology, 12, 140. DOI: 10.1186/1471-2229-12-140. ABSTRACT Identification, classification and chromosome mapping of the dehydrin gene family in clementine oranges (Citrus clementina) Dehydrins (DHN) are classified as a group II Late Embryogenesis Abundant protein (LEA). These proteins play a crucial role in cellular activity making it possible for cells to survive the adverse effects of environmental stress by means of increased water retention, as well as affording protection to membranes and molecules. In this work, we identified six DHN genes in the whole genome of clementine oranges (Citrus clementina) using the in silico method. All six DHN genes contain the K- segment which is characteristic of all reported DHN proteins. The chromosome map constructed by MapChart show that in clementine oranges, DHN genes are present in 5 out of 9 chromosomes. Based on the results of conserved motif as well as a phylogenetic tree analysis, six clementine DHN genes were identified as belonging to three subgroups, SKn, KS and YnSKn. Each subgroup contains two DHN genes. The two closest genes, CclDHN6 and CclDHN1, might be products of a segment duplication event which occurred after speciation between citrus and Arabidopsis. Keywords: Dehydrin (DHN), chromosome mapping, phylogenetic tree, in silico, clementine, gene identification.