Ứng dụng kỹ thuật microsattelite dna trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ duchenne

TCNCYH 112 (3) - 2018 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE Đinh Thuý Linh, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh Trường Đại học Y Hà Nội Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất trong nhóm bệnh lý loạn dưỡng cơ do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể X. Chẩn đoán trước sinh các bà mẹ mang thai có nguy cơ sinh con bị bệnh giúp phát hiện các trường hợp thai mắc loạn dưỡng cơ Duchenne. Ứng dung kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. 05 thai phụ mang thai từ 17 - 22 tuần được xác định là người mang gen. Tách chiết DNA từ tế bào ối, máu ngoại vi của bệnh nhân và thai phụ, hoàn thiện và ứng dụng kỹ thuật Microsatellite - DNA để chẩn đoán trước sinh và so sánh kết quả với kỹ thuật phát hiện đột biến gen trực tiếp. Kỹ thuật xác định đột biến trực tiếp và kỹ thuật Microsatellite - DNA có kết quả trùng khớp nhau cho thấy đã hoàn thiện được kỹ thuật Microsatellite - DNA. 1/5 thai nhi được chẩn đoán mắc bệnh, thai phụ được tư vấn và đình chỉ thai nghén. 4/5 thai nhi được chẩn đoán bình thường, tiếp tục theo dõi thai. Từ khoá: loạn dưỡng cơ Duchenne, chẩn đoán trước sinh, Microsatellite DNA I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh lý di truyền thần kinh cơ hay gặp nhất trong nhóm bệnh lý loạn dưỡng cơ với tần suất 1/3500 trẻ trai, nguyên nhân là đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X. Bệnh đặc trưng bởi sự yếu cơ tiến triển, phì đại bắp chân, tăng sinh các tổ chức trong cơ và chậm phát triển trí tuệ. Bệnh nhân thường mất khả năng đi ở lứa tuổi 11 - 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 do các biến chứng của bệnh [1 - 3]. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, vì vậy sàng lọc người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne vẫn đóng một vai trò quan trọng nhằm đưa ra lời khuyên di truyền cho sản phụ và gia đình, giảm tỉ lệ sinh con mắc bệnh. Trong các kỹ thuật di truyền phân tử hiện nay đang được áp dụng để phát hiện đột biến gen dystrophin, kỹ thuật MLPA đã bộc lộ những ưu điểm với khả năng khảo sát cả 79 exon của gen dystrophin, phát hiện được cả đột biến xóa đoạn và lặp đoạn, chiếm khoảng 60 - 65%, trong thời gian 3 - 7 ngày [4; 5]. Tuy nhiên, còn khoảng 35 - 40% cần phải áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen 79 exon để phát hiện đột biến điểm, kỹ thuật giải trình tự gen thường cần nhiều thời gian và giá thành cao. Việc chẩn đoán trước sinh thường được thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột biến trực tiếp trên gen dystrophin dựa vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân [6]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khó khăn do cấu trúc gen lớn hoặc một số gia đình bệnh nhân không có điều kiện kinh tế, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể được áp dụng dựa vào xác định allele đột biến (Linkage analysis) Địa chỉ liên hệ: Đinh Thúy Linh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: [email protected] Ngày nhận: 25/12/2017 Ngày được chấp thuận: 18/3/2018 2 TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC với giá thành rẻ hơn và thời gian nhanh chóng hơn [7] gTrong nghiên cứu này, tiến hành hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA và áp dụng kỹ thuật này để chẩn đoán trước sinh thông qua việc khuếch đại các vùng trình tự lặp lại STR (short tandem repeat) và so sánh với kết quả phát hiện đột biến bằng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen [8 - 10]. Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho các thai phụ được xác định là người mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng - Nhóm chứng: gồm 5 người nam và 5 người nữ bình thường, không có tiền sử gia đình mắc bệnh di truyền. - Nhóm nghiên cứu: 5 gia đình của 5 thai phụ mang thai từ 17 tuần – 22 tuần, có con trai hoặc anh, em trai mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, 5 thai phụ này đã được phân tích gen và xác đinh là người mang gen dystrophin đột biến giống con trai hoặc anh, em trai mình. 2. Phương pháp 2.1. Chọc hút dịch ối Tiến hành vào tuần thứ 17 - 22 của thai kỳ dưới hướng dẫn của siêu âm, tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương hoặc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội. 2.2. Xác định đột biến gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng kỹ thuật MLPA Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng 79 đoạn dò gen dystrophin. Mỗi DNA lai (probe) gồm hai chuỗi oligonucleotid lai đặc hiệu với 79 exon. Kết quả điện di cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng 79 probe đặc hiệu với 79 exon: - Với đột biến xoá đoạn, exon bị xoá đoạn khi đỉnh exon không phát hiện được. - Với đột biến lặp đoạn, kết quả được tính toán dựa vào tỉ lệ RPA (Relative Peak Area) tương ứng với từng exon so với mẫu chứng của người bình thường, exon lặp đoạn khi mà tỉ lệ RPA lớn hơn 1,5. Quy trình kỹ thuật: cho 5 µl DNA cần phân tích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC/5 phút. Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khi cho 3 µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC/16 giờ, 2 đoạn lai của 2 phân tử oligonucleotid sẽ gắn với exon đích đặc hiệu ở vị trí sát nhau. Thêm 32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ ở 54oC/15 phút, enzym ligase nối 2 đoạn oligonucleotid của probe với nhau. Phản ứng nối chấm dứt khi tăng nhiệt độ lên 98oC/5 phút, hỗn hợp được giữ ở 4oC. Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10 µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở 60oC, thêm 10 µl hỗn hợp PCR master, thực hiện chu trình nhiệt: [95oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút] x 35 chu kỳ, 72oC/20 phút. Sản phẩm khuếch đại probe được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân tích kết quả. 2.3. Kỹ thuật Microsatellite DNA Xác định các marker dị hợp tử và alen bệnh mà người mẹ có thể truyền cho con bằng kỹ thuật microsatellite DNA và xác định, kiểu gen và kiểu hình của thai nhi bằng kỹ thuật microsatellite DNA. Kỹ thuật microsatellite DNA sử dụng các cặp mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại các các vùng trình tự lặp TCNCYH 112 (3) - 2018 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lại này và phân tích kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen (automated DNA sequencer). Đối với gia đình loạn dưỡng cơ Duchenne cần khuếch đại 20 vùng trình tự lặp lại đặc hiệu để xác định ít nhất 2 - 3 marker dị hợp tử trên mẫu mẹ (informatic marker). Sử dụng các cặp mồi đã xác định marker dị hợp tử từ đó xác định kiểu gen và kiểu hình thai nhi. Thành phần của phản ứng: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược; 0,5unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O, tổng thể tích 20µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút; {94oC/30 giây, 59oC/60 giây, 72oC/45 giây} x 40 chu kỳ; 72oC/5 phút. Sản phẩm khuếch đại PCR được điện di trên hệ thống sequencing - Beckman coulter. Kết quả được phân tích bằng phần mềm GeneMapper v3.2 software. 2.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối Nuôi cấy theo phương pháp hở tủ ấm 37°C với 5% CO2 và 95% không khí cùng nguồn ẩm. Thời gian trung bình nuôi cấy là từ 7 - 15 ngày. Các tế bào ối thai nhi thu được với số lượng tương đối sau khi nuôi cấy được tách DNA theo phương pháp phenol - chloroform và phân tích gen. Tế bào ối cũng được sử dụng để nhuộm băng G và phân tích karyotype của thai. 3. Đạo đức trong nghiên cứu Những gia đình có bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sẽ được đưa vào nghiên cứu khi đồng ý tự nguyện tham gia. Gia đình và bệnh nhân sẽ được tư vấn và giải thích cụ thể về ý nghĩa, mục đích, qui trình nghiên cứu, quyền được tự do rút khỏi nghiên cứu, quyền được đảm bảo bí mật cá nhân trong quá trình nghiên cứu và về kết quả nghiên cứu. Các thông tin về bệnh nhân, người nhà bệnh nhân và kết quả chẩn đoán hoàn toàn được giữ bí mật, đặc biệt đối với thông tin về giới tính của thai nhi. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả xác định đột biến gen dystrophin đối với bệnh nhân loạn dưỡng cơ Dunchenne Hình ảnh phân tích MLPA tại probe tương ứng với các exon 14 - 43 của mẫu ối cho thấy cường độ tín hiệu của đỉnh cao hơn nhiều so với mẫu người bình thường. Sau khi phân tích dựa trên RPA ta có tỉ lệ RPA tại các exon từ 14 đến 43 của bệnh nhân so với chứng lớn hơn 1,5 trong khi của các exon khác chỉ giao động xung quanh 1. Như vậy cho thấy bệnh nhân có đột biến lặp đoạn các exon từ 14 đến 43. 2. Kết quả xác định marker dị hợp tử, alen bệnh người mẹ truyền cho con và kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho thai nhi bằng kỹ thuật microsatellite DNA Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh lý di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X. Nếu người mẹ là người mang gen bệnh sẽ có khả năng truyền gen bệnh cho con trai với tỷ lệ 50%. Để xác định alen đột biến (allele bệnh -Xb), cần tiến hành kỹ thuật single PCR khuếch đại 20 vùng STR đặc hiệu trên mẫu máu thai phụ và mẫu máu bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne (là em trai hoặc con trai của thai phụ), lựa chọn ít nhất 2 marker dị hợp tử: - Kết quả 2 mẫu có các đỉnh có kích thước tương đương nhau thể hiện alen đột biến (Xb). Kết quả 2 mẫu có các đỉnh không tương đương nhau thể hiện alen bình thường (XB). 4 TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Hình ảnh MLPA (A) và kết quả tính toán (Relative Peak Area) bằng phần mềm coffalyser (B) của mẫu người bình thường và mẫu ối của thai bị bệnh Hình 2. Kỹ thuật Microsatellite trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne Hình 2 là hình ảnh kết quả kỹ thuật Microsatellite ở gia đình bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne 1. 2 marker dị hợp tử được tìm thấy là DSTR 44 và DSTR49. TCNCYH 112 (3) - 2018 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Với marker DSTR 44, ở thai phụ xuất hiện 2 đỉnh có kích thước 181bp và 185bp (hình B), tương ứng với 2 alen nằm trên 2 nhiễm sắc thể X (XBXb). Ở mẹ thai phụ chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích thước 180bp cho thấy đây là alen đồng hợp tử. Ở em trai của thai phụ (là bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne) cũng chỉ có 1 đỉnh kích thước 180bp tương ứng với 1 alen trên nhiễm sắc thể X (XbY), trùng khớp với kích thước 1 đỉnh ở mẫu mẹ thai phụ và thai phụ. Từ kết quả hình ảnh của mẹ thai phụ, thai phụ và em trai thai phụ cho thấy đỉnh kích thước 180bp là đỉnh alen bệnh. Với marker DDTR49, đỉnh mang kích thước 172bp là đỉnh trùng khớp ở mẹ thai phụ, thai phụ và em trai thai phụ (bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne), cho thấy đây cũng là đỉnh alen bệnh. Phân tích kết quả mẫu ối của thai nhi: Marker DSTR44 chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích thước 180bp là alen bệnh, marker DSTR49 chỉ xuất hiện 1 đỉnh có kích thước 180bp là alen bệnh. Kết quả này có thể khẳng định đây là trường hợp thai nam bị bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Kết quả nghiên cứu trên 5 gia đình loạn dưỡng cơ Duchenne: Bảng 1. Kết quả chẩn đoán trước sinh STT Mã số Dạng đột biến Kết quả chẩn đoán trước sinh 1 DMD10 Xóa đoạn exon 46 - 50 Bình thường 2 DMD11 Xóa đoạn exon 49 - 50 Bình thường 3 DMD13 c.3022A > T (p.Cys1008Stop) Bình thường 4 DMD15 Xóa đoạn exon 35 - 43 Bình thường 5 DMD 18 Lặp đoạn 19 - 43 Bệnh lý Kết quả chẩn đoán trước sinh: 1/5 thai nhi được chẩn đoán là thai nhi bệnh lý, 4/5 thai nhi được chẩn đoán là bình thường. Kết quả này tương đồng với kết quả của kỹ thuật phân tích xác định đột biến trực tiếp. Trường hợp thai được chẩn đoán là mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne sau khi được tư vấn kết quả, bệnh nhân quyết định đình chỉ thai nghén. 4 trường hợp thai bình thường được tư vấn giữ thai. IV. BÀN LUẬN Loạn dưỡng cơ Duchenne là một bệnh có tỉ lệ mắc cao nhất trong các bệnh lý di truyền thần kinh cơ với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề. Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện các đột biến gen dystrophin. Trong phát hiện người lành mang gen bệnh, kỹ thuật MLPA ra đời vào năm 2002 đã bộc lộ những ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật di truyền khác với độ chính xác cao khi chỉ cần dùng một cặp primer duy nhất (so với kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi nhiều cặp primer, dễ thất bại khi điều kiện phản ứng bị thay đổi dù rất nhỏ); khả năng khảo sát cả 6 TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 79 exon so với kỹ thuật Multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon nằm trong hai vùng “hot spot” sẽ phát hiện cả những đột biến xóa đoạn nằm ngoài khả năng phát hiện của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên các kỹ thuật như Multiplex PCR hay MLPA chỉ tập trung phát hiện các đột biến xóa đoạn, còn đột biến điểm chiếm tỉ lệ 25 - 30% lại nằm ngoài khả năng phát hiện của các kỹ thuật này. Chính vì vậy, trong chẩn đoán trước sinh, nếu người mẹ mang đột biến điểm gen dystrophin thì sẽ không thể phát hiện được thai nhi có nhận gen bệnh từ mẹ hay không khi sử dụng các kỹ thuật trên. Với kỹ thuật Microsatellite DNA, không những có khả năng phát hiện cả những trường hợp thai nhi mang nhiễm sắc thể có chứa gen dystrop- hin có đột biến điểm từ mẹ mà còn đáp ứng được những yêu cầu của chẩn đoán trước sinh với thời gian trả lời kết quả nhanh và chính xác (chỉ sau 48 – 72h) so với kỹ thuật Southern blotting hay kỹ thuật giải trình tự gen phải mất đến hàng tuần. Các đoạn microsate- llite DNA có tính đa hình cao và dễ dàng khuếch đại (nồng độ DNA chỉ cần khoảng 7pg) được sử dụng sau đó để xác định alen bệnh có thể di truyền cho con. Đồng thời chi phí cho xét nghiệm thấp giúp giảm gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân. Trong kỹ thuật Microsatellite DNA, mỗi bệnh nhân nên được lựa chọn ít nhất 2 - 3 marker dị hợp tử (informatic marker) do trong một số trường hợp có thể xảy ra tình trạng khuếch đại thất bại. Với các trường hợp đó, việc phân tích kết quả của các marker dị hợp tử còn lại sẽ chẩn đoán xác định được thai nhi có hay không mắc loạn dưỡng cơ Duchenne. Từ các kết quả này cho thấy việc xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có đột biến gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne là rất cần thiết, từ đó có thể phát hiện một cách chính xác trong thời gian nhanh nhất các trường hợp thai nhi mắc bệnh để có tư vấn cụ thể cho từng gia đình thai phụ. Hiện nay các bất thường di truyền, đặc biệt là các bất thường nhiễm sắc thể là một trong các nguyên nhân chính gây đa dị tật về hình thái của thai nhi. Trong các bất thường di truyền hiện nay thì hội chứng Down (3 nhiễm sắc thể 21), hội chứng Edwards (3 nhiễm sắc thể 18) hay hội chứng Patau (3 nhiễm sắc thể 13) là các hội chứng hay gặp nhất. Vì vậy, khi chọc hút nước ối, cần lấy nước ối để chẩn đoán các bất thường nhiễm sắc thể ở thai nhi song song cùng với việc chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở thai nhi. V. KẾT LUẬN Kỹ thuật Microsatellite - DNA được ứng dụng thành công trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD: 1/5 thai nhi được chẩn đoán là thai nhi bệnh lý, thai phụ đã được tư vấn và quyết định đình chỉ thai nghén, 4/5 thai nhi được chẩn đoán là bình thường. Lời cám ơn Nhóm nghiên cứu xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Gen-protein - Trường Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội đã giúp đỡ nhóm trong quá trình nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bushby, K (2010). Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurol, 9(2), 177 - 189. TCNCYH 112 (3) - 2018 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2. Kneppers, A. L., Ginjaar, I. B and Bakker, E (2004). Duchenne and Becker muscular dystrophy. Methods Mol Med, 92, 311 - 341. 3. Mendell R.J., Griggs C.R (1991). “Muscular dystrophin”, Harrison’s principles of internal medicine, 12th edition, 2112 - 2118. 4. Hwa H.L., Chang Y.Y., Chen C.H et al (2007). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification identification of deletions and duplications of the Duchenne muscular dystro- phy gene in Taiwanese subjects. J Formos Med Assoc, 106, 339 - 346. 5. Lai K.K., Lo I.F., Tong T.M et al (2006). Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification (MLPA). Clin Biochem, 39, 367 - 372. 6. Prior TW, Bridgeman SJ (2005). Ex- perience and Strategy for the Molecular Test- ing of Duchenne Muscular Dystrophin. JMD, 7 (3), 317 - 325. 7. Ta MH, Tran TH, Do NH et al (2013). Rapid method for targeted prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in Vietnam. Taiwan J Obstet Gynecol, 52(4), 534 - 539. 8. Matsuo M (2002). Duchenne and Becker muscular dystrophy: from molecular diagnosis to gene therapy. IUBMB Life, 53, 147 - 152. 9. Hussey N.D., Donggui H., Froiland D.A., Hussey D.J et al (1999). Analysis of five Duchenne muscular dystrophy exons and gen- der determination using conventional duplex polymerase chain reaction on single cells. Mol Hum Reprod, 5(11), 1089 - 1094. 10. NguyễnThị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn. Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 66(1), 29 - 35. Summary APPLICATION OF MICROSATTELITE DNA FOR PRENATAL DIAGNOSIS OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is caused by the mutation of the dystrophin gene on the X chromosome. It is the most common genetical neuromuscular disease among muscular dystrophy diseases affecting 1/3500 of male children. Prenatal diagnosis on pregnant women carrying the gene will provide a chance to diagnose DMD among fetus. Applying Microsattelite DNA technique in DMD prenatal diagnosis. 05 pregnant gene-carrier women at 17 - 22 weeks of gestation were tested. DNA from the amniococco cells and peripheral blood of the patients and pregnant women were extracted and analyzed by Microsatellite-DNA technique and prenatal diagnosis technique through amplifying short tandem repeat sections; the results are then compared with those obtained from the direct mutation diagnosis technique. Since the direct mutation diagnosis analysis technique and the Microsatellite-DNA technique provided the same results, we are confident that Microsatellite-DNA technique for DMD prenatal diagnosis had been perfected. 1/5 fetus was diagnosed with the disease, and pregnancy was suspended. 4/5 fetus were diagnosed to be normal and the pregnancy was continued. Microsatellite DNA has proven to be a promising and effective technique in DMD prenatal screening in Vietnam. Keywords: Duchenne muscular dystrophy, prenatal diagnosis, Microsattelite DNA