Tổng hợp dẫn xuất Mono-6-Amino-6-Deoxybetacyclodextrin

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 462 TỔNG HỢP DẪN XUẤT MONO-6-AMINO-6-DEOXY- BETACYCLODEXTRIN Nguyễn Thị Minh Phương*, Hồ Đan Thư*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mở đầu: Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của chúng được sử dụng phổ biến trong các phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE), ...làm tác nhân đối quang phân tách các dược chất là đồng phân quang học. Một trong số đó là mono-6-amino-6-deoxy- betacyclodextrin (M6A- β-CD), được sử dụng rất rộng rãi để làm tác nhân đối quang trong phương pháp điện di mao quản, phân tách thành công đồng phân quang học của nhiều dược chất, nhiều chất lưỡng tính và amino acid như acid glutamic, phenylalanin, threonin và valin, Tiếp nối các công trình trước đây đã tổng hợp được các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl, carboxymethyl và các dẫn chất này đã được ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công một số dược chất quang hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục phát triển và góp phần làm đa dạng hóa tác nhân đối quang để phân tách các đồng phân quang học bằng CE, đề tài: “Tổng hợp dẫn xuất mono-6-amino-6-deoxy-betacyclodextrin” đã được thực hiện. Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp và khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nước dẫn chất mono-6-amino-6-deoxy- betacyclodextrin. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: mono-6-amino-6-deoxy-β- cyclodextrin.Phương pháp nghiên cứu: Thực hiện các phản ứng của tổng hợp M6A- β-CD từ β-CD qua các 3 giai đoạn. Phân lập và tinh chế sản phẩm bằng phương pháp thay đổi dung môi và phương pháp kết tinh lại. Dẫn chất tổng hợp được xác định độ tinh khiết qua việc xác định điểm chảy và góc quay cực riêng. Cấu trúc được xác định qua dữ liệu thu được từ phổ IR, NMR, MS. Khảo sát sự ảnh hưởng đến hiệu suất của một số điều kiện phản ứng ở từng giai đoạn. Kết quả: Đã tổng hợp được mono-6-amino-6-deoxy-β-CD từ β-CD qua giai đoạn tổng hợp dẫn chất trung gian là mono-6-O-tosyl-β-CD và mono-6-azido-6-deoxy-β-CD. Kết luận: Thành công của đề tài tạo tiền đề cho hướng tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản phẩm làm tác nhân đối quang, phân tách đồng phân quang học các nguyên liệu và thành phẩm dược chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản. Từ khóa: mono-6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin, tổng hợp, dẫn chất β-cyclodextrin. ABSTRACT SYNTHESIS OF MONO-6-AMINO-6-DEOXY-BETACYCLODEXTRIN Nguyen Thi Minh Phuong, Ho Dan Thu, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 462 – 467 Background: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives are commonly used as the chiral selectors for analysis of enantiomer drugs by HPLC and capillary electrophoresis (CE). One of these derivatives is mono-6-amino-6-deoxy derivatives of -cyclodextrin, used for the enantioseparation of various anionic, *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liện lạc: ThS. Nguyễn Thị Minh Phương ĐT: 0909810668 Email: [email protected] Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 463 amphoteric substance and amino acids by capillary electrophoresis (CE) such as glutamic acid, phenylalanine, threonine và valine, Some beta-cyclodextrin derivatives as methyl--CD, methoxycarbonyl--CD and carboxymethy-β-cyclodextrin were successfully synthesized by our group. These derivatives were successfully applied for separation of some enantiomer drugs by CE, too. With the desire to develop the selective chiral selectors, this study was carried out to synthesize mono-6-amino-6- deoxy-β-cyclodextrin from β-cyclodextrin. Objectives: The purpose of this process is to synthesize mono-6-amino derivative of -cyclodextrin and evaluate influences of reaction conditions on the yield. Subjects and Methods: The subjects of this study was mono-6-amino derivatives of -cyclodextrin, which was synthesized from β-CD. Purity of the final synthesized product was checked by melting point and specific rotation measurements, and its structure was elucidated by IR, MS, and NMR spectra. Influences of reaction temperature, reaction duration and reactant ratio on the yield were studied. Results: Mono-6-amino-6-deoxy-β-CD was synthesized by a three-step reaction sequence beginning with β-CD. Two intermediate products of this process were mono-6-O-tosyl-β-CD and mono-6-azido-6- deoxy-β-CD. Conclusion: The successful synthesis of mono-6-amino-6-deoxy-β-CD derivative provides a theoretical and experimental basis for further scale-up research. In the future, we are going to develop the application of this selector for separation of enantiomer drugs by capillary electrophoresis. Key words: mono-6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin, synthesis, β-cyclodextrin derivative. ĐẶT VẤN ĐỀ Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của chúng được sử dụng phổ biến trong các phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE),... làm tác nhân đối quang tách đồng phân quang học(1-4,6,8,9), đặc biệt được ứng dụng trong kiểm nghiệm các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Để phân tách các dược chất quang hoạt cần tác nhân đối quang phù hợp với tính chất của dược chất, đôi khi để phân tách được các dạng đồng phân của một chất còn cần phải phối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với nhau. Một trong số tác nhân thường dùng là mono-6-amino-6-deoxy- betacyclodextrin (M6A-β-CD), được sử dụng để làm tác nhân đối quang phân tách thành công đồng phân quang học của nhiều dược chất, nhiều chất lưỡng tính và amino acid như acid glutamic, phenylalanin, threonin và valin,(9-11) So với một số lượng lớn các dược chất quang hoạt rất đa dạng về cấu trúc và tính chất đang có mặt trên thị trường hiện nay thì số lượng các tác nhân quang hoạt được thương mại hóa còn ít, giá thành cao. Chính vì vậy, xu hướng của các nhà nghiên cứu ở các nước hiện nay là tổng hợp nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao và có giá trị kinh tế(7-10). Tiếp nối các công trình trước đây đã tổng hợp được các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl và carboxymethyl, các dẫn chất này đã được ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công một số dược chất quang hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục phát triển và góp phần làm đa dạng hóa tác nhân đối quang để phân tách các đồng phân quang học bằng CE, đề tài: “Tổng hợp dẫn xuất mono-6-amino-6-deoxy- betacyclodextrin” đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp và khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 464 điều kiện trong nước dẫn chất mono-6-amino-6- deoxy-betacyclodextrin. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Beta cyclodextrin (Himedia), p- toluenesulfonyl clorid (Trung Quốc), sodium azid (Merck) và triphenylphosphin (Merck). Trang thiết bị Máy đo phổ IR Bruker (Đức), máy đo phổ NMR Bruker 500 MHz Đức), máy LC- MS Shimazhu (Nhật), máy đo góc quay cực HORIBA-SEO+PA 300 (Nhật). Phản ứng tổng hợp M6A--CD(5,11) Sử dụng phương pháp thay đổi dung môi và phương pháp kết tinh lại để phân lập và tinh chế sản phẩm thu được từ phản ứng. Các dẫn chất tổng hợp được xác định độ tinh khiết qua việc xác định điểm chảy, góc quay cực riêng và sắc ký lớp mỏng (TLC). Cấu trúc được xác định qua dữ liệu thu được từ phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS). Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng ở từng giai đoạn. KẾT QUẢ Tổng hợp mono-6-O-tosyl- β-CD (M6t) từ β-CD Hòa tan 10 g β-CD (8,8 mmol) vào 50 ml pyridin. Làm lạnh bình phản ứng đến 0 oC. Lắp sinh hàn lạnh. Hòa tan 2 g (10,5 mmol) p- toluensulfonyl clorid vào 10 ml pyridin. Nhỏ từ từ dung dịch p-toluensulfornyl clorid vào bình phản ứng trong khoảng 1 giờ. Tiếp tục thực hiện phản ứng ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phản ứng bằng TLC. Thêm vào hỗn hợp sau phản ứng 300 ml aceton kết tinh hoàn toàn sản phẩm. Lọc, rửa phần tủa bằng aceton 3 lần, mỗi lần với 5 ml. Hòa tan kết tủa thu được vào 100 ml nước nóng 60 oC, lọc bỏ tủa. Để nguội dịch lọc ở nhiệt độ phòng để kết tinh lại sản phẩm, lọc thu kết tủa. Kết tinh lại trong nước nóng 3 lần thu được kết tủa trắng không còn mùi của pyridin. Sấy khô sản phẩm thu được ở nhiệt độ 60 oC. Sản phẩm M6t Chất rắn màu trắng, tan được trong nước, không tan trong aceton. Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng 32,4 %. Rf = 0,74 (IPA – EtOAc – Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 465 H2O, 6:1:3). FTIR,  (cm-1): 3296 (OH acol), 2928 (CH alkan), 1022 (C-O-C ether), 1598 (C=C aromatic), 1359 (S=O sulfon), 835 (S-O-Ar). Tổng hợp mono-6-azido-6-deoxy-β-CD (M6az) từ M6t Hòa tan 2 g M6t (1,6 mmol) và 1,56 g NaN3 (24 mmol) trong khoảng 20 ml nước cất. Đun hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ 80 oC và duy trì ở nhiệt độ này trong vòng 24 giờ. Theo dõi phản ứng bằng TLC, vết sản phẩm bắt đầu xuất hiện sau 7 giờ phản ứng, tới khoảng 19 giờ thì không còn vết nguyên liệu. Cô dung dịch thu được sau phản ứng. Cho 40 ml aceton vào để sản phẩm kết tủa hoàn toàn, lọc lấy kết tủa. Hòa tan phần kết tủa thu được trong 5 ml nước cất, kết tinh lại trong 20 ml aceton 3 lần. Sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Sản phẩm M6az: Chất rắn màu trắng, tan được trong nước, không tan trong aceton. Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng 70,35 %. Rf = 0,50 (IPA – H2O – EtOAc – NH3, 5:3:1:0,5). FTIR,  (cm-1): 2106 (N=N=N azid), 2041 (N=N=N azid). Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Thực hiện khảo sát hiệu suất phản ứng với thời gian phản ứng từ 19-24 giờ, nhiệt độ phản ứng từ 60-100 oC và của tỷ lệ mol giữa sodium azid và M6t từ 5:1-25:1, thu được kết quả như sau. Hình 1: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Hình 2: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Hình 3: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa sodium azid và M6t đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Dựa vào kết quả phân tích được thể hiện ở trên, tìm điều kiện để tổng hợp mono-6-azido- 6-deoxy-betacyclodextrin từ nguyên liệu NaN3 và M6t là thực hiện phản ứng trong vòng 21 giờ, ở nhiệt độ 80 oC và tỷ lệ mol giữa sodium azid và M6t là 20 : 1, đạt hiệu suất là 76,85 %. Tổng hợp mono-6-amino-6-deoxy-β-CD (M6A) từ M6az Hòa tan 1 g M6Az (0,86 mmol) và 0,3 g triphenylphosphin (1,15 mmol) vào khoảng 10 ml dimethylformamid, khuấy 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm vào bình phản ứng khoảng 1 ml nước khử khoáng, Đun hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ 60 oC và duy trì ở nhiệt độ này trong vòng 6 giờ. Theo dõi phản ứng bằng TLC. Thêm vào hỗn hợp sau phản ứng 20 ml aceton để kết tinh sản phẩm, lọc thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa vào 10 ml nước khử khoáng lọc để loại bỏ phần không tan, thêm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 466 vào dịch lọc 30 ml aceton để kết tinh lại sản phẩm, lọc thu lấy tủa. Rửa tủa bằng aceton 3 lần, mỗi lần với 5 ml. Sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Sản phẩm M6A: chất rắn màu trắng ngà, tan được trong nước, không tan trong aceton. Hiệu suất sau khi tinh chế khoảng 70,25 %. tnc = 260 – 265 oC.  20D (1%, H2O) = 125. Rf = 0,11 (IPA – H2O – EtOAc – NH3, 5:3:1:0,5). FTIR,  (cm-1): 1658 (N-H amin), 1597 (N-H amin). MS (m/z): [M-H]+ = 1134,38; [M-H]- = 1133,35. 1H-NMR (D2O, 500 MHz): 5,13 (7H, s, H1); 3,91-4,04 (28H, m, H3, H5, H6); 3,62-3,72 (14H, m, H2, H4); 3,11 (1H, br, s, NH2); 2,96 (1H, br, s, NH2). Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện lên hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Thực hiện khảo sát hiệu suất phản ứng với thời gian phản ứng từ 2-6 giờ, nhiệt độ phản ứng từ 20-60 oC và của tỷ lệ mol triphenylphosphin và M6az từ 1:1-5:1, thu được kết quả như sau. Hình 4: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Hình 5: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Hình 6: Đường biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa triphenylphosphin và M6az đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Dựa vào kết quả phân tích được thể hiện ở trên, nhận thấy điều kiện để tổng hợp dẫn xuất M6A từ nguyên liệu triphenylphosphine và M6az là thực hiện phản ứng trong vòng 3 giờ, ở nhiệt độ 40 oC và tỷ lệ mol giữa triphenylphosphin và M6az là 3 : 1. Hiệu suất 83,6 % BÀN LUẬN β-CD là một dạng polymer có nhiều trung tâm bất đối trong phân tử nên rất khó khống chế điều kiện phản ứng để tạo thành 1 sản phẩm thế duy nhất sau phản ứng. Giai đoạn tổng hợp M6t từ β-CD bị ảnh hưởng lượng nước lẫn trong pyridin và độ ẩm β-CD làm cho thời gian phản ứng kéo dài, hiệu suất thấp và tạo ra sản phẩm phụ, cần làm khan pyridin bằng CaH2 và sấy khô β-CD trước khi thực hiện phản ứng để thu được sản phẩm thế mono. Giai đoạn tổng hợp M6az và M6A sản phẩm khó tinh chế được nếu dùng dư nhiều tác nhân tham gia phản ứng vì bị hấp phụ vào vòng β- CD, có thể tinh chế bằng kết tinh lại trong dung môi nhiều lần hoặc dùng sắc ký cột. KẾT LUẬN Đề tài đã xây dựng được quy trình tổng hợp được mono-6-amino-6-deoxy-β-CD từ β- CD qua giai đoạn tổng hợp dẫn chất trung gian là mono-6-O-tosyl-β-CD và mono-6- azido-6-deoxy-β-CD. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 467 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Gyula O, Tibor C, Mária S (2014). Cyclodetrins in chromatography. Eur. Chem. Bull., 3 (1): pp.2-12. 2. József S (2004). Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure and Applied Chemistry, 76: pp.1829-1830. 3. Julianna S, Katalin G (1994). Use of cyclodextrins and cyclodextrin derivatives in high- performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 668: pp.509-517. 4. Manoj MN, Dinesh MS, Parag VJ (2012). The Cyclodextrins: A Review. Journal of Current Pharmaceutical Research: pp.1-6. 5. Moutard S, Perly B, Gode P, Demailly G, Djedaini-Pilard F (2002). Novel glycolipids based on cyclodextrins. J Incl Phenom Macro, 44: pp.317-322. 6. Salvatore F (1996). Identification of chiral drug isomers by capillary Electrophoresis. Journal of chromatography A, 735: pp.77-121 7. Takeo K et al (1976). Synthesis of Heptakis (2-O-methyl-β- cyclodextrin. Die Starke, 28 (7): pp.226-227. 8. Verleysen K, Sabah S, Scriba G, Sandra P (1999). Enantioseparation of Aspartyl Dipeptides by CE: Comparison between 18-Crown-6-Tetracarboxylic Acid and Carboxymethyl-13-Cyclodextrin as Chiral Selector. Chromatographia, 49: pp.215-218. 9. Weihua T, Wayan I M, Siu C Ng, (2005). Synthesis and application of mono-6-ammonium-6-deoxy-β-cyclodextrin chloride as chiral selector for capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 1094 (1-2): pp.187 – 191. 10. Youchang X, Hui M L, Tai SC, Raj R (2007). Acetylation of β-Cyclodextrin Surface-Functionalized Cellulose Dialysis Membranes with Enhanced Chiral Separation. Langmuir, 23 (26): pp.12990. 11. Zhang ZB, Zhang WG, Luo WJ, Fan J (2008). Preparation and enantioseparation characteristics of a novel chiral stationary phase based on mono (6(A)-azido-6(A)-deoxy)- per(p-chlorophenylcarbamoylated) beta-cyclodextrin. Journal of Chromatography A, 1213: pp.162-168. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019