Khảo sát tình trạng di căn thầm lặng của hạch limphô trong carcinôm tuyến ở đường tiêu hóa

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 ** Bộ môn Ngọai tổng quát - Đại học Y Dược TP. HCM KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG DI CĂN THẦM LẶNG CỦA HẠCH LIMPHÔ TRONG CARCINÔM TUYẾN Ở ĐƯỜNG TIÊU HÓA Hứa Thị Ngọc Hà*, Đỗ Đình Công**, Ngô Quốc Đạt* TÓM TẮT 75 trường hợp hạch limphô của các bệnh nhân có carcinom tuyến dạ dày và đại-trưc tràng có kết quả giải phẫu bệnh trên tiêu bản nhuộm HE là không có di căn hạch được nhuộm hóa – mô – miễn dịch bằng phương pháp streptavidin – biotin với kháng thể chống CEA (carcinoembryonic antigen) để xác định có di căn hạch hay không. Kết quả cho thấy có 28% các hạch có hiện diện tế bào dương tính với kháng nguyên CEA. Các tế bào này có hình thái giống tế bào nhẫn hoặc tương bào, sắp xếp đơn lẽ, thành cụm 2-3 tế bào, nằm trong xoang hạch, mạch limphô đến hoặc vỏ bao hạch. Các tác giả đề nghị nên nhuộm hóa mô miễn dịch các trường hợp hạch không di căn trên tiêu bản HE để xác định chính xác tình trạng di căn hạch của bệnh nhân ung thư. SUMMARY STUDY ON OCCULT METASTASIS OF LYMPH NODES IN GASTRO-INTESTINAL TRACT CARCINOMA. Hua Thi Ngoc Ha, Do Dinh Cong, Ngo Quoc Dat * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 9 * Supplement of No 1 * 2005: 135 – 140 We examined 75 cases of gastric and colorectal carcinoma patients which diagnosed no lymph node metastases on hematoxylin and eosin (HE) stain. These lymph nodes were also stained immunohistochemically with streptavidin – biotin method using antibodies against carcinoembryonic antigen (CEA). Results show that 21 cases (28%) had CEA-positive lymph nodes. These cells have morphologic features similar to signet ring cell, histiocyte, plasma cell, arranged separately or 2-3 cells groups. They located in the sinuses, afferent lymph vessel, and capsule of lymph nodes. Conclusion: We suggest that all negative lymph node on HE stain should be stained immunohistochemistry to define occult metastasis of lymph node. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong ung thư đường tiêu hóa, ngoài loại mô học, mức độ xâm nhập các lớp của ống tiêu hóa, thì tình trạng hạch di căn limphô là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng( )5 . Do đó việc xác định hạch có di căn hay không và số lượng hạch bị di căn là rất cần thiết. Thông thường, carcinôm tuyến di căn hạch thường được dễ dàng phát hiện bằng kỹ thuật nhuộm thường quy HE và nhuộm đặc biệt PAS. Các tế bào ung thư di căn đến hạch theo đường mạch limphô đến, đầu tiên khu trú ở các xoang dưới vỏ, cận vỏ và sau cùng thì lan tràn khắp hạch( )11 . Cách sắp xếp của tế bào ung thư trong hạch thường có dạng biệt hóa giống, cao hoặc thấp hơn u nguyên phát, có khi các tế bào ung thư xếp rời rạc, không có cấu trúc tuyến. Với kiểu sắp xếp này rất khó phát hiện bằng phương pháp nhuộm thông thường (nhuộm HE), theo các tác giả Gusterson và Ott( )10 thì phương pháp nhuộm thông thường (HE) chỉ có dưới 1% cơ hội để để phát hiện những ổ tế bào ung thư vú với đường kính khoảng 3 tế bào ung thư trên một mặt cắt( )5 . Trong y văn có nhiều nghiên cứu về tình trạng hạch di căn vi thể * Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP. HCM 135 Ở TP. Hồ Chí Minh có vài cơ sở thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch, nhưng chủ yếu tập trung vào việc xác định nguồn gốc u ác, chưa có nghiên cứu nào về vấn đề di căn vi thể của hạch limphô. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục tiêu: 1. Xác định tỉ lệ hạch di căn thầm lặng. 2. Xác định hình thái, cách sắp xếp và vị trí của tế bào di căn thầm lặng trong hạch limphô. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Hạch limphô của 75 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng và dạ dày có chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm HE và PAS là không có di căn Phương pháp nghiên cứu Mẫu mô hạch được xử lý bằng kỹ thuật giải phẫu bệnh tiêu chuẩn, nhuộm Hematoxylin Eosin (HE), PAS và quan sát vi thể dưới kính hiển vi quang học. Sau đó khối nến được cắt mỏng để xử lý bằng kỹ thuật hóa-mô-miễn dịch với kháng thể chống CEA. Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch Các lát cắt mỏng 3-5 micromét được trải lên phiến kính có tráng albumin. Nhuộm hóa mô miễn dịch (phương pháp Streptavidin-biotin) với kháng thể chống CEA theo quy trình nhuộm sau đây: - Mẫu mô sau khi cắt mỏng được sấy khô ở 370C 12 giờ - Khử nến trong xylen, cồn và nước cất 10 phút - Dung dịch đệm PBS (Phophate Buffered Saline, pH=7,2) 5 phút - Ức chế peroxydase nội sinh bằng hydrogen peroxide 3% 6 phút - PBS 5 phút - Protein Blocking Agent (3 giọt) 15-20 phút - Ủ trong kháng thể thứ I (CEA) 100μl 30 phút - PBS 5 phút - Ủ trong kháng thể II (chống loài kháng thể I) có gắn Biotin (3 giọt) 30 phút - PBS 5 phút - Ủ với phức hợp Streptavidine - peroxydase (3 giọt) 20 phút - PBS 5 phút - Ủ trong Chromogène DAB 500μl 10-15 phút - Rửa nước cất 5 phút - Nhuộm nhân với Hematoxylin để tạo nền tương phản 1 phút - Rửa nước cất 5 phút khử nước tiếp tục bằng cồn làm trong sáng mô bằng xylen Dán lamen bằng Resin Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Nhân tế bào có màu xanh tím của Hematoxylin, nếu có hiện diện kháng nguyên CEA trên tế bào, phức hợp kháng nguyên (CEA) - kháng thể I (chống CEA) – kháng thể II gắn biotin – streptavidine – peroxidase - màu sẽ cho màu vàng nâu. Kết quả âm tính: tế bào chỉ có nhân nhuộm màu xanh tím - Xác định vị trí của các tế bào dương tính với CEA trong hạch: ở trong xoang, trong vỏ bao, trong mạch bạch huyết. - Đánh giá hình dạng các tế bào dương tính với CEA và cách sắp xếp của các tế bào này KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Số ca 75 ca Carcinôm tuyến dạ dày và đại, trực tràng Tỉ lệ các trường hợp dương tính với CEA Tổng số ca dương tính: 21 ca Tỉ lệ ca dương tính: 21/75=28% Vị trí tế bào trong hạch dương tính với 136 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Lượng CEA trong máu của những người hút thuốc và những bệnh nhân có hội chứng bệnh phổi tắc nghẽn, viêm ruột, viêm túi thừa, viêm tụy, viêm gan cấp và mạn, bệnh thận mạn tính cũng không ít hơn như mức CEA của những bệnh nhân có carcinom tuyến đại tràng di căn. Mức CEA trong huyết thanh cũng gia tăng ở những bệnh nhân có carcinom có nguồn gốc không ở phải đại tràng( )21 . CEA Đa số các tế bào cho phản ứng dương tính với CEA nằm trong các xoang limphô dưới vỏ và cận vỏ (>80%), một số ít nằm trong vỏ bao hạch hoặc trong mạch limphô đến (bảng 1). Bảng 1: Vị trí tế bào dương tính với CEA trong hạch Vị trí Trong xoang Mạch limphô đến Vỏ bao Số ca (tỷ lệ) 17 (80,95%) 3 (14,29%) 4 (19,05%) Vị trí CEA trên tế bào Hình thái tế bào Trong tế bào dạ dày bình thường, không ác tính, CEA không biểu hiện, hay biểu hiện ở màng tế bào thượng mô, mặt lót lòng ống( )12 . CEA cũng không biểu hiện ở các tế bào tuyến dạ dày chuyển sản ruột( )24 . Theo Ahnen D( )1 , CEA hiện diện ở trong bào tương dạng hạt nhỏ và trên toàn bộ màng tế bào của các tế bào ác tính. Phần lớn tế bào có nhân tròn hoặc bầu dục, to, có hạt nhân rõ, giống mô bào, đôi khi bào tương nằm lệch về một phía, dạng tương bào. CEA dương tính ở bào tương có dạng hạt nhỏ, hoặc ở màng tế bào. Bảng 2: Hình thái của các tế bào dương tính với CEA Như vậy, trong cấu trúc của hạch limphô bình thường không có loại tế bào nào có phản ứng miễn dịch với CEA nên khi trong hạch limphô có tế bào dương tính với CEA là do từ nơi khác di căn đến có nghĩa là hạch có di căn thầm lặng. Hình thái Giống mô bào, dạng nhẫn Giống tương bào Số ca (tỷ lệ) 18 (85,71%) 11 (52,38%) Cách sắp xếp tế bào Các tế bào sắp xếp riêng lẽ hoặc từng cụm 2-3 tế bào, có 1đ trường hợp sắp xếp thành dạng tuyến. Di căn vi thể Là một khái niệm mới về di căn trong ung thư, ngày càng được khảo sát rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là trong các carcinôm như carcinôm tuyến dạ dày, đại – trực tràng, vú, phổi( , , , , )4 6 10 13 16 ... khái niệm tồn tại những điểm vi di căn dạng tiềm ẩn trong các cơ quan khác nhau như: tủy xương, gan, lách, hạch... chắc chắn là có thật vì bệnh nhân thường diễn tiến đến tái phát ở giai đoạn tiến triển của bệnh ngay cả sau khi cắt bỏ khối u nguyên phát hoặc có dấu hiệu di căn xa ở giai đoạn muộn của bệnh. Khái niệm di căn vi thể đang góp phần làm thay đổi quan niệm về phân giai đoạn ung thư( , , )14 18 20 . Bảng 3: Cách sắp xếp của các tế bào dương tính với CEA Cách sắp xếp Rời rạc Nhóm trên 3 tế bào Dạng tuyến Số ca (tỷ lệ) 15 (66,67%) 7 (33,33%) 1 (1,33%) BÀN LUẬN Kháng nguyên CEA CEA (CarcinoEmbryonic Antigen: kháng nguyên ung thư phôi) là một glycoprotein do Gold và Freeman tìm ra và đặt tên năm 1965( )9 . CEA được tìm thấy ở các carcinom đại tràng, và ruột của phôi thai, nhưng không có ở ruột người lớn. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy ngoài hai vị trí trên, CEA cũng được sản xuất từ các tế bào ở nơi khác như bạch cầu đa nhân trung tính, phế quản, ống tuyến nước bọt, dạ dày, ruột non, đường mật, đại tràng, ống tụy, tuyến tiền liệt, tuyến cổ tử cung, niệu mạc ...và tế bào C của tuyến giáp( )21 . Về tỉ lệ hạch có tế bào dương tính với CEA Tỉ lệ hạch có tế bào dương tính với CEA trong nghiên cứu này là 19 /75 ca chiếm tỉ lệ 28%. Theo một nghiên cứu của các tác giả thuộc Bệnh 137 Về cách sắp xếp tế bào Dạng rời rạc chiếm tỉ lệ cao nhất 66,67%. Điều này giải thích vì tỷ lệ hạch di căn thầm lặng cao, bởi vì với cách sắp xếp tế bào này không đủ xác định tế bào có nguồn gốc biểu mô, mà đó là hình thái của mô bào trong xoang hạch bình thường. Một nghiên cứu khác về hạch di căn thầm lặng ở các bệnh nhân ung thư vú với hỗn hợp kháng thể kháng keratin (AE1/AE3) tại bệnh viện Evanston, Hoa Kỳ( )3 cho kết quả dương tính là 12,8%. Còn đối với các tác giả ở Viện Lugwig và nhóm nghiên cứu ung thư vú quốc tế thì tỷ lệ này là 9%( )13 . Cách sắp xếp nhóm 3 tế bào trong nghiên cứu này chiếm tỷ lệ 33,33%. Theo nhiều nghiên cứu một ổ tế bào di căn hạch tối thiểu có thể thấy được trên nhuộm HE. Tỷ lệ tế bào sắp xếp theo dạng tuyến rất thấp (chỉ có 1 trường hợp, 1,33%) do ở lần cắt đầu tiên để nhuộm HE chưa tới mặt cắt có tế bào ung thư. Verrill và cộng sự trong một nghiên cứu ở Hoa Kỳ cũng phát hiện thêm 12/1453 hạch có tế bào ung thư di căn ở mặt cắt 2 và 3 cách mặt cắt 1 (cắt lần đầu tiên) 100 Richard J. Cote ở Đại học tổng hợp Southern California( )6 nghiên cứu trên các hạch không di căn của bệnh nhân carcinôm tuyến tiền liệt bằng phương pháp phân tử thì tỷ lệ hạch di căn thầm lặng là 8%. Theo các tác giả khác( )5 thì tỉ lệ di căn hạch thầm lặng khoảng 8-30% các trường hợp ung thư vú, đại tràng, phổi, tiền liệt tuyến, melanôm có hạch âm tính trên nhuộm HE . μm( )22 . Như vậy việc cắt lại tiêu bản ở nhiều mặt cắt khác nhau sau lần cắt đầu âm tính cũng cần thiết để phát hiện ra hạch có di căn hay không. Ý nghĩa của tình trạng di căn hạch trong ung thư Về vị trí các tế bào dương tính với CEA trong hạch Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng tình trạng di căn hạch không chỉ là một yếu tố tiên lượng quan trọng, mà còn là một yếu tố quyết định hoá trị sau mổ. Nếu có di căn hạch thì hoá trị sau mổ được chỉ định để ngăn ngừa tái phát, ngược lại nếu kết quả là âm tính thì không cần hoá trị.( , , , )5 14 16 20 Chúng tôi nhận thấy vị trí trong hệ thống xoang của hạch chiếm tỉ lệ cao nhất chiếm 80,95%. Mukai và cộng sự cũng ghi nhận các tế bào ung thư di căn thầm lặng trong các xoang của hạch limphô( )16 . Như vậy cũng phù hợp qui luật vì các tế bào ung thư tới hạch theo đường đi của dịch limphô qua hệ thống mạch limphô đến và lưu thông trong hệ thống xoang của hạch. Vị trí trong mạch limphô và trong vỏ bao hạch chiếm tỉ lệ thấp hơn rất nhiều. . Đối với ung thư đại – trực tràng thì việc có di căn hạch hay không ảnh hưởng đến việc xếp giai đoạn Dukes B hoặc Dukes C, mỗi giai đoạn có cách điều trị và tiên lượng bệnh khác nhau( )15 . Do đó việc xác định có di căn hạch hay không rất có ý nghĩa trong việc chỉ định hoá trị bổ trợ sau mổ cũng như phân giai đoạn bệnh, tiên lượng tái phát . Về hình thái tế bào dương tính với CEA Chúng tôi ghi nhận tế bào di căn trong mô hạch có hình thái giống như mô bào xoang hoặc có dạng nhẫn chiếm tỉ lệ cao nhất (85,71%) và có 52,38% tế bào có dạng tương bào. Do những hình thái không đặc hiệu này nên khó phát hiện di căn trên tiêu bản nhuộm HE. Cần sử dụng các kỹ thuật cao như PCR, nhuộm HMMD, ... mới có thể phát hiện và kết luận một cách chắc chắn. Ở bệnh nhân ung thư vú theo dõi trung bình trong 80 tháng thì di căn xa xảy ra ở 5/11 trường hợp di căn hạch thầm lặng chiếm 45% và 13 trường hợp di căn xa trong 75 trường hợp không có di căn hạch thầm lặng chiếm 17%, như vậy chúng ta thấy rằng khi có di căn thầm lặng thì khả năng di căn xa cao hơn nhiều. Thời gian sống trung bình 5 năm là 90% 138 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Ở bệnh nhân carcinôm tuyến tiền liệt được theo dõi trong 10 năm thì tỉ lệ sống còn ở nhóm có di căn hạch thầm lặng thấp hơn nhóm không có di căn hạch thầm lặng. Tác giả cũng đi đến kết luận việc xác định có tế bào ung thư trong máu , tủy xương, trong hạch là rất quan trọng trong việc xác định chiến lược điều trị phẫu trị, hóa trị, xạ trị( )6 . KẾT LUẬN - Theo nghiên cứu này, nếu chỉ nhuộm HE và PAS thì bỏ sót 28 % trường hợp hạch có di căn. - Đa số các tế bào di căn thầm lặng có hình thái giống như mô bào, nằm trong xoang hạch và sắp xếp riêng lẽ từng tế bào hoặc thành cụm 2-3 tế bào. - Đề nghị khảo sát hóa mô miễn dịch các trường hợp nhuộm HE âm tính để đánh giá chính xác tình trạng di căn hạch của bệnh nhân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahnen D et al (1982): Ultrastructural localization of carcinoembryonic antigen in normal intestinal and colon cancer. Cancer 1982; 49: 2077 – 90. 2. Berner A, Bormer O, Marton PF, Nesland JM (1990): Distribution of the carcinoembryonic antigen CEA in gastric lesions. Immunohistochemical testing of three novel monoclonal antibodies. Histol Histopathol 1990 Apr; 5(2): 199 - 204. 3. Clare SE., Sener SF., Wilkens W., Goldschmidt R., Merkel D. and Winchester DJ.: Prognostic significance of occult lymph node metastases in node-negative breast cancer: Ann Surg Oncol. 1997 Sep;4(6):447-51. 4. Cochran AJ, Wen DR, Morton DL (1988): Occult tumor cell in the lymph nodes of patients with pathological stage I malignant melanoma. Am. J Surg Pathol 12: 612. 5. Cote RJ, Taylor CR (1996): Immunohistochemistry and related marking techniques . In Damjanov I, Linder J: Anderson's pathology, 10TH ed., vol. 1, Mosby: 136-175 6. Cote RJ: Detection and Mechanism of Occult Metastases in Prostate Carcinoma. Reports/CycleI-Clinical-FinalReports.htm 7. Crawfort JM (1999): The gastrointestinal tract. In: Cotran RS, Kumar V, Collins T (ed.): Robbins’ Pathologic basic of disease. 6th ed., WB Saunders Company, 1999: 800-802. 8. Fletcher RH (1986): Carcinoembryonic antigen. Ann. Int. Med 1986; 104: 66-73. 9. Gold P et al. (1970): Position of the Carcinoembryonic antigen of the human digestive system in ultrastructure of tumor cell surface. J Natl. Cancer Inst. 1970; 45: 219-25. 10. Gusterson BA, Ott R (1990): Occult axillary lymph nodes micrometastases in breast cancer. Lancet, 336: 434. 11. Hứa Thị Ngọc Hà (2003): Bệnh hạch limphô. Trong NGUYỄN SÀO TRUNG: Bệnh học các tạng hệ thống. Tái bản lần 4, Nhà xuất bản Y học, 177-194. 12. Hứa Thị Ngọc Hà, Đỗ Đình Công , Nguyễn Thị Hồng Nguyệt (2001): Vị trí của kháng nguyên CEA trên tuyến dạ dày bình thường và ung thư: khảo sát hóa – mô – miễn dịch. Y học TP. Hồ Chí Minh. Phụ bản của tập 5, số 4, Chuyên đề Ngoại khoa: 83-99 13. International (Lugwig Institude) Breast cancer study group (1990): Prognostic importance of occult axillary lymph node micrometastasis from breast cancers. Lancet 335: 1565. 14. Liu ZM, Ye X, Bi WM, Wang MY, Li Y and Chen TW (2002): Detection of occult metastases in lymph nodes from patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Chin Med J 2002;115 (4): 529-531. 15. Mukai M, Clare SE., Sener SF., Wilkens W, Goldschmidt R, Merkel and Winchester DJ. (1997): Prognostic significance of occult lymph node D. metastases in node-negative breast cancer: Ann Surg Oncol. 1997 Sep;4(6):447-51. 16. Mukai M, Sato S, Nakasaki H, Tajima T, Saito Y, Nishiumi N, Iwasaki M, Tokuda Y, Ogoshi K, Inoue H, Makuuchi H (2004): Occult neoplastic cells in lymph nodes sinuses and recurrences of primary breast, lung, esophageal and gastric cancer. Oncol. Reports 11: 81 – 84. 17. Nielsen K, Teglbjaerg PS (1982): Carcino-embryonic antigen (CEA) in gastric adenocarcimas. Morphologic patterns and their relationship to a histogenic classfication. Acta pathol microbiol Immnnol Scand (A). 1982 Nov; 90(6): 393-6. 18. Rosai J (2002): Lymph node involvement. In: Tumors of the intestines (AFIP) 2002 181-188 19. Sato S, Ninomiya H, Kimura T, Komatsu N, Tajima T, Nakasaki H, Makuuchi H (: Predicting recurrence and metastasis of Dukes' A primary colorectal cancer with or without proper muscle invasion. [email protected] tokai.ac.jp 139 20. Trần Nguyên Hà, Võ Ngọc Đức, Đoàn Hữu Nam, Bùi Viết Chí, Phạm Hùng Cường, Phạm Lương Giang (2004): Hóa trị ung thư đường tiêu hóa. Trong Nguyễn Chấn Hùng: Ung bướu học đại cương. Nhà xuất bản Y học, 2004: 262-285 21. True LD: Chapter five: Epithelial membrane antigens In: True LD: Atlas of diagnostic immunohistopathology. JB Lippincott Company, 1990. 22. Verrill C, Carr N J, Wilkinson-Smith E and Seel EH: Histopathological assessment of lymph nodes in colorectal carcinoma: does triple levelling detect significantly more metastases? 23. WU JF (1992): The relationship between carcinoembryonic antigen (CEA) expression and histogenesis of gastric cancer (application of immunohistochemical and mucin histochemical techniques). Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 1992 Jan; 14(1): 13-6. 24. Yachi A, Imai K, Fujita H, Moriya Y, Tanda M, Endo T, Tsujisaki M, Kawaharada M (1984): Immunohistochemical distribution of the antigenic determinants detected by monoclonal antibodies to carcinoembryonic antigen. J Immunol 1984 Jun; 132 (6): 1998 – 3004. 25. Yang GL (1989): Distribution and ultrastructural localozation of carcino-embryonic antigen (CEA) in signet-ring cells of gastric cancer. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 1989 Mar: 11(2): 111-113. 140