Xây dựng quy trình định lượng coixol trong cam thảo nam (scoparia dulcis l., scropulariaceae) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 101 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO NAM (SCOPARIA DULCIS L., SCROPULARIACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phạm Thị Thanh Hương*, Trần Thị Vân Anh* TÓM TẮT Mở đầu: Cam thảo nam (Scoparia dulcis L. Scrophulariaceae) là dược liệu được sử dụng khá phổ biến nhưng tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng vẫn chưa được nâng cao. Đề tài thực hiện nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng coixol (một alcaloid chính trong Cam thảo nam) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao nhằm nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu. Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng coixol trong Cam thảo nam. Áp dụng qui trình đã xây dựng và thẩm định để định lượng coixol trong các mẫu thu hái ở các thời điểm và địa phương khác nhau Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là hàm lượng coixol có trong Cam thảo nam. Nghiên cứu các điều kiện của quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc kí để định lượng coixol trong S. dulcis bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Kết quả: Xác định điều kiện phân tích sắc kí: Cột Cosmosil 2,5 Chlolester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); nhiệt độ cột 35 oC; tốc độ dòng: 0,45 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 1 µl; bước sóng phát hiện: 230 nm; chương trình rửa giải (A: nước, B: ACN) 0-3 phút: 5 % B, 3-14 phút: 5-15 % B, 14-15 phút; 15-90 % B, 15-24 phút; 90 % B. Qui trình định lượng đều đạt các chỉ tiêu đánh giá về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính. Đã áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu Cam thảo nam thu hái ở thời điểm và địa phương khác nhau. Hàm lượng coixol trong các mẫu dao động trong khoảng 0,61 – 2,14 mg/g Kết luận: Đề tài đã xây dựng qui trình định lượng coixol trong Cam thảo nam bằng phương pháp UPLC-PDA làm cơ sở cho việc nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Từ khóa: Cam thảo nam, định lượng coixol, UPLC ABSTRACT QUANTIFICATION OF COIXOL IN SCOPARIA DULCIS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Pham Thi Thanh Huong, Tran Thi Van Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 101-107 Background: Sweet-broom (Scoparia dulcis L., Scrophulariaceae) is used widely as a medicinal herb; however, the quality control standards of S. dulcis have not been improved. Therefore, the aim of this study is to develop a method for the quantification of coixol (a major alkaloid in S. dulcis) by UPLC-PDA Objectives: This research aims to develop and validate a method for the determination of coixol in S. dulcis and apply the method for quantifying of coixol in different materials. Methods: The subject of this study was the content of coixol in S. dulcis. The method for preparation samples and the UPLC chromatographic conditions for determination of coixol in S. dulcis were studied. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Trần Thị Vân Anh ĐT: 0918852989 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 102 Results: A simple UPLC method was developed for quantitative determination of coixol in S. dulcis following chromatographic conditions: Cosmosil 2,5 Cholester column (2,0 ID x 75 mm; 2,5 µm), mobile phase in gradient mode including mixture of water (A) and acetonitrile (B) with the program 0 - 3 min.: 5 % B, 3 - 14 min.: 5 – 15 % B, 14 - 15 min.: 15 – 90 % B, 24 min.: 90 % B, flow rate of 0.45 mL/min., detection wavelength of 230 nm. This procedure meets all requirements of system suitability and quantitative method validation such as linearity, specificity, precision and accuracy. This method was applied for analyzing different S. dulcis samples. The contents of coixol in S. dulcis were in range 0.61 –2.14 mg/g Conclusion: The validated method for determination of coixol in S. dulcis could be used in quality control of herbal materials. Key words: Scoparia dulcis, quantification of coixol, UPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Cam thảo nam (Scoparia dulcis L. Scrophulariaceae) là một dược liệu được sử dụng lâu đời trong y học dân gian ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Brazil, Colombia, Nhật Bảnvới các công dụng như trị tiểu đường, trị loét dạ dày, trị rắn cắn, giảm đau, hạ sốt, làm mát cơ thể(7). Cam thảo nam được sử dụng khá phổ biến, tuy nhiên tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng S. dulcis vẫn chưa được nâng cao. Trong Dược điển Việt Nam V ban hành năm 2018, chuyên luận về Cam thảo nam chỉ dừng ở chỉ tiêu định lượng chất chiết được trong dược liệu(2). Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của S. dulcis khá đa dạng gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau như terpenoid, alcaloid, flavonoid và một số chất khác(6). Trong đó, coixol là một alcaloid chính trong S. dulcis với nhiều tác dụng dược lý đã được chứng minh như hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus HIV, điều hòa bài tiết chất nhầy đường hô hấp, điều hòa thần kinh(1,3,5,6,8). Coixol đáp ứng được tiêu chí của một chất marker có thể sử dụng trong việc tiêu chuẩn hóa dược liệu S. dulcis. Để nâng cao tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng dược liệu, đề tài này được thực hiện nhằm tạo cơ sở cho việc bổ sung chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao trong chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu Cam thảo nam (CTN). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Coixol trong các mẫu CTN (toàn cây) thu hái tại Tp Hồ Chí Minh trong 12 tháng (10/2017- 9/2018), và các mẫu thu hái ở 11 tỉnh vào tháng 3/2018 (HT: Hà Tĩnh, KH: Khánh Hòa, LĐ: Lâm Đồng, ĐL: Đắc Lắc; GL: Gia Lai; TN: Tây Ninh; BD: Bình Dương; ĐN-1: Biên Hòa-Đồng Nai, ĐN-2: Cẩm Mỹ- Đồng Nai; LA: Long An) . Mẫu được xay nhỏ, rây qua rây 0,425 mm và xác định mất khối lượng do làm khô. Thiết bị phân tích Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Acquity UPLC (Waters), đầu dò PDA; cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); cân phân tích Sartorius BP-221S (0,01 mg). Dung môi-hóa chất Acetonitril, methanol đạt chuẩn HPLC (Merck); nước cất 2 lần dùng cho sắc kí lỏng; Chất đối chiếu coixol phân lập từ S. dulcis đạt độ tinh khiết (98,1%). Phương pháp nghiên cứu Khảo sát qui trình chiết xuất coixol từ CTN: khảo sát các yếu tố bao gồm dung môi chiết, thời gian chiết, số lần chiết). Sử dụng mẫu CTN thu hái vào tháng 10/2018 tại TP. Hồ Chí Minh để thực hiện khảo sát. Dựa trên sắc ký đồ kiểm tra pic coixol với mẫu đối chiếu; so sánh diện tích pic coixol giữa các lần thử nghiệm. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 103 Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng coixol trong CTN: thăm dò điều kiện sắc kí (pha động, kỹ thuật rửa giải) với mục đích tách pic coixol hoàn toàn (Rs>1,5) với các pic lân cận trong khi mẫu thử. Qui trình được thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo hướng dẫn của ICH(4). Hàm lượng coixol trong S. dulcis được tính theo công thức: Với : hàm lượng coixol có trong dược liệu (mg/g), : Diện tích pic của mẫu thử (µV x s), : Diện tích pic của mẫu chuẩn (µV x s), Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml), : Độ pha loãng của mẫu đo, : Khối lượng dược liệu (mg), : Độ ẩm dược liệu (%), : Hàm lượng chất đối chiếu (%). Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu Cam thảo nam thu hái tại Tp Hồ Chí Minh trong 12 tháng (10/2017 – 9/2017) và mẫu Cam thảo nam thu hái tạo 12 địa phương vào tháng 3/2018. KẾT LUẬN Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất coixol từ CTN Thăm dò dung môi chiết Cân chính xác 30 mg dược liệu Cam thảo nam vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 1,5 ml dung môi (acetonitril/MeOH 100%/ MeOH-H2O (9:1)/ MeOH-H2O (8:2). Siêu âm 30 phút, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,22 µm, dịch lọc được tiêm vào máy UPLC và phân tích. Kết quả chọn dung môi MeOH chiết được coixol trong mẫu tốt nhất. Thăm dò thời gian chiết Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết, thay đổi thời gian chiết lần lượt là (25 phút/45 phút/65 phút/85 phút) ở nhiệt độ 40 oC. Kết quả chọn thời gian chiết 45 phút là tối ưu. Thăm dò nhiệt độ chiết Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết, chiết ở 45 phút với nhiệt độ thay đổi là (35 oC/40 oC/50 oC/60 oC). Kết quả khảo sát cho thấy chiết ở nhiệt độ 40 oC cho diện tích pic coixol lớn nhất. Thăm dò tỉ lệ dung môi; dược liệu, số lần chiết Chiết mẫu dược liệu với tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 1,5 ml) các lần chiết 1, 2, 3 đều có hiện diện của pic coixol. Để thuận lợi cho việc xử lý mẫu, tăng tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 3 ml), sau khi chiết lần 1 với điều kiện đã chọn, mẫu được ly tâm, bã dược liệu được chiết lần 2 và lần 3 với 2 ml dung môi. Kết quả cho thấy lần chiết thứ 2, pic coixol chỉ chiếm 1,84%. Như vậy có thể chiết kiệt coixol trong 1 lần chiết, thuận tiện cho việc xử lý mẫu. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết coixol từ dược liệu (quy trình xử lý mẫu) trình bày tóm tắt ở Bảng 1. Bảng 1: Kết quả khảo sát các điều kiện xử lý mẫu Dung môi ACN 100% MeOH 100% MeOH 90% MeOH 80% Diện tích pic coixol 176637 267393 2657908 259075 Thời gian chiết 25 phút 45 phút 65 phút 85 phút Diện tích pic coixol 250877 253807 25342 245027 Nhiệt độ chiết 35oC 40oC 50oC 60oC Diện tích pic coixol 277383 281318 244950 234015 Số lần chiết Lần 1 Lần 2 Lần 3 Diện tích pic coixol 64780 (98,15% 1220 (1,84%) Không phát hiện Từ kết quả khảo sát, qui trình chiết coixol được xác định: Cân chính xác 30 mg bột dược liệu CTN cho vào ống nghiệm có nắp 5 ml, thêm chính xác 3 ml methanol 100%, siêu âm 45 phút ở 40 oC. Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc kí, phân tích theo các điều kiện đã chọn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 104 Khảo sát các điều kiện sắc kí tách pic coixol tronng mẫu thử Sau khi tiến hành thăm dò, điều kiện sắc kí được lựa chọn như sau: cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm), nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng: 0,45 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 1μl, bước sóng phát hiện 230 nm, pha động A (H2O), B (ACN), chương trình rửa giải 0 – 3 phút: 5% B, 3 – 14 phút: 5 -15 % B, 14 – 15 phút: 15-90 % B, 15 – 24 phút: 90% B. Cân bằng cột trong vòng 5 phút giữa 2 lần chạy liên tiếp. Kết quả thẩm định qui trình Tính phù hợp hệ thống Tiến hành phân tích 6 lần mẫu CTN chiết theo qui trình trên để kiểm tra tính phù hợp hệ thống. Phép thử chỉ có giá trị khi pic coixol và các pic lân cận tách hoàn toàn (Rs>1,5) Kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị RSD % của thời gian lưu và diện tích pic đều <2 %, hệ số đối xứng 0,8≤As≤1,5, hệ số phân giải>1,5 (Bảng 2). Như vậy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Bảng 2: Kết quả thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình Lần tiêm mẫu S Rt N k' As α Rs Lần 1 71216 10,40 19036,37 44,22 1,17 1,25 4,74 Lần 2 73501 10,38 19147,83 44,10 1,16 1,25 5,11 Lần 3 73884 10,40 19176,85 44,24 1,17 1,33 9,07 Lần 4 73706 10,41 19311,4 44,27 1,16 1,33 9,15 Lần 5 73220 10,39 19178,6 44,17 1,12 1,33 9,33 Lần 6 74371 10,391 19063,23 44,18 1,19 1,25 4,66 TB 73316 10,394 19152,38 44,20 1,16303 1,29 7,01 SD 1099,2 0,0138 97,97997 Đạt Đạt Đạt Đạt RSD% 1,499 0,133 0,511581 Yêu cầu RSD 1 0,8 1,5 Độ đặc hiệu Sắc kí đồ mẫu trắng Sắc kí đồ mẫu đối chiếu Sắc kí đồ mẫu thử Sắc kí đồ mẫu thử thêm đối chiếu Hình 1: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 105 Triển khai sắc kí mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu. Quan sát thời gian lưu và diện tích pic của coixol trong các mẫu. Sắc kí đồ mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu đối chiếu coixol, mẫu thử và mẫu thêm chất đối chiếu có pic với thời gian lưu tương ứng với pic coixol, khi thêm chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích pic coixol tăng lên (Hình 1). Phổ UV-Vis của pic coixol trong mẫu thử tương ứng với mẫu đối chiếu; các pic coixol trong mẫu thử, mẫu đối chiếu, mẫu thử thêm chất đối chiếu đều đạt độ tinh khiết khi kiểm tra trên phần mềm Empower. Tính tuyến tính Nồng độ khảo sát từ 1,0 đến 500 µg/mL. Kết quả khảo sát cho thấy phương trình hồi qui y=10586x+5847,5 với hệ số tương quan là R2 = 0,9998 (Hình 2). Theo trắc nghiệm t, hệ số a có ý nghĩa, hệ số b không có ý nghĩa. Theo trắc nghiệm F phương trình tương thích với độ tin cậy 95%. Như vậy phương trình tuyến tính của coixol là ӯ = 10586X. Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 500 5316897 250 2600811 100 1096068 50 553902 25 262399 10 110423 5 58272 1 9479 Hình 2: Tương quan giữa nồng độ và diện tíc pic coixol Độ lặp lại Tiến hành xử lý và sắc ký 6 mẫu thử khác nhau để thẩm định độ lặp lại. Bảng 3 trình bày kết quả thực hiện khảo sát độ lặp lại, RSD của hàm lượng coixol trong 6 mẫu < 2%. Kết quả cho thấy qui trình đạt độ lặp lại. Bảng 3: Kết quả thẩm định độ lặp lại Mẫu Khối lượng mẫu (mg) Diện tích pic Hàm lượng g/mg Mẫu 1 30,0 71388 0,80 Mẫu 2 30,0 71466 0,80 Mẫu 3 300 73542 0,82 Mẫu 4 30,0 70715 0,79 Mẫu 5 30,0 73916 0,82 Mẫu 6 30,0 71766 0,80 TB 72132,17 0,805 SD 1289,162 0,012 RSD% 1,787 1,787 Độ đúng Sử dụng phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch thử ở 3 tỷ lệ nồng độ để thẩm định độ đúng. Bảng 4 trình bày kết quả khảo sát độ đúng Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 99,0 % -106,0 %. Như vậy qui trình có độ đúng cao. Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng % chuẩn thêm vào KL thêm vào (µg) KL tìm thấy (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) Trung bình % 80% 195 197 101,03 100,51 RSD = 2,33 % 195 201 103,08 195 190 97,44 100 % 244 259 106,15 105,46 RSD = 0,97 % 244 254 104,10 244 259 106,15 120 % 295 303 102,71 104,41 RSD = 1,27 % 295 309 104,75 295 312 105,76 Áp dụng qui trình định lượng các mẫu CTN Áp dụng qui trình tiến hành định lượng các mẫu Cam thảo nam thu hái ở Tp. HỒ CHÍ MINH trong 12 tháng (10/2017 -9/2018) và các mẫu Cam thảo nam thu hái ở các địa phương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 106 khác nhau vào tháng 3/2018 (kết quả trình bày ở Hình 3 và Hình 4). Hình 3: Khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu Cam thảo nam thu hái trong 12 tháng tại TP. Hồ Chí Minh Hình 4: Hàm lượng coixol trong các mẫu CTN thu hái ở các địa phương khác nhau (3/2018) BÀN LUẬN Khảo sát hàm lượng coixol trong CTN theo thời gian thu hái cho thấy có sự thay đổi, từ tháng 12 - tháng 3, hàm lượng coixol dao động trong khoảng 1,9 -2,4 mg/g, từ tháng 4 hàm lượng coixol trong mẫu bắt đầu giảm, trong khoảng tháng 5 - tháng 10 hàm lượng coixol thấp < 1,0 mg/g Thời điểm thu hái thường được hướng dẫn trong các tài liệu là: mùa xuân đến mùa hạ(2), qua kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng coixol ở trong mẫu S. dulcis cao trong khoảng tháng 12-3, vì vậy có thể đề xuất việc thu hái S. dulcis nên tập trung vào thời gian này Khảo sát hàm lượng coixol theo địa điểm thu hái tại 12 tỉnh cho thấy hàm lượng coixol trong các mẫu S. dulcis dao động trong khoảng 0,46 - 2,14 mg/g. Hàm lượng coixol cao nhất với mẫu thu hái ở tỉnh Bình Dương (2,14 mg/g), thấp nhất ở tỉnh Gia Lai (0,46 mg/g). Như vậy, hàm lượng coixol trong S. dulcis thay đổi theo vùng địa lý thu hái. Các mẫu thu hái Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 107 ở các tỉnh phía Nam (Bình Dương, Đồng Nai, Long An, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP. Hồ Chí Minh) có hàm lượng cao hơn các tỉnh Tây Nguyên (Đắc Lắc, Gia Lai). KẾT LUẬN Qui trình định lượng coixol trong CTN được xây dựng và đã được thẩm định đạt các yêu cầu tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Qui trình cũng đã được áp dụng khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu CTN thu hái ở TP. Hồ Chí Minh trong 12 tháng và mẫu thu hái ở các tỉnh. Kết quả cho thấy hàm lượng coixol trong CTN cao nhất vào tháng 12-tháng 3, và trong các mẫu khảo sát hàm lượng coixol thay đổi trong khoảng 0,61 – 2,14 mg/g Đề tài góp phần tạo cơ sở cho việc nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm CTN. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ali A, Haq FU, Arfeen Q, Sharma KR, Adhikari A, Musharraf SG (2017), “Sensitive Quantification of Coixol, a Potent Insulin Secretagogue, in Scoparia dulcis Extract using High Performance Liquid Chromatography combined with Tandem Mass Spectrometry and UV Detection”, Biomedical chromatography, 31(10). 2. Bộ Y tế (2018), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 1096-1097. 3. Hayashi T, Gotoh K, Ohnishi K, et al. (1994), “6-Methoxy- 2-benzoxazolinone in Scoparia dulcis and its production by cultured tissues”. Phytochemistry, 37(6), pp.1611-1614. 4. International Conference on Harmonization (ICH), Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology, May 1997 5. Jae H, Jiho L, Su R, Park H (2014), “Suppressive effects of coixol, glyceryl trilinoleate and natural products derived from Coix lachryma-jobi var. ma-yuen on gene expression, production and secretion of airway MUC5AC mucin”, Archives of Pharmacal Research, 38(5), pp.620-627. 6. Mishra MR, Behera RK, Jha S, et al. (2011), “A brief review on phytoconstituents and ethnopharmacology of Scoparia dulcis Linn. (Scrophulariaceae)”, International Journal of Phytomedicine, 3(4), pp.422-438 7. Report TD (2002), “Technical Data Report for Vassourinha (Scoparia dulcis)”, Austin, Texas: Sage Press. 8. Sharma KR, Adhikari A, Hafizur RM, et al. (2015), “Potent insulin secretagogue from Scoparia dulcis L. of nepalese origin”, Phytotherapy Research, 29(10), pp.1672-1675. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019