Tài liệu Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong dịch chiết nhân hạt gấc bằng quang phổ UV-Vis: Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
39
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN
TRONG DỊCH CHIẾT NHÂN HẠT GẤC BẰNG QUANG PHỔ UV-Vis
Nguyễn Thu Quỳnh*, Nguyễn Thị Lan Anh,
Bùi Thị Luyến, Nguyễn Duy Thư
Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Nhân hạt gấc (mộc miết tử) là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn
thương, làm vết thương mau lành. Mục đích của nghiên cứu ứng dụng phương pháp đo quang phổ
UV-Vis để định lượng saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc. Nhân hạt gấc được chiết xuất
bằng phương pháp soxhlet với metanol trong 5 giờ. Tiến hành tinh chế bằng phương pháp chiết
lỏng - lỏng với dung môi n-butanol. Dịch chiết được tiến hành phản ứng Rosenthaler với thuốc thử
là axit pecloric và vanilin trong axit axetic băng. Tiến hành quét phổ dung dịch sản phẩm ở dải
bước sóng 400-700 nm. Từ đó lựa chọn được bước sóng hấp thụ cực đại là 555 nm để định lượng
saponin tổng (so sánh chất chuẩn g...
5 trang |
Chia sẻ: quangot475 | Lượt xem: 311 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong dịch chiết nhân hạt gấc bằng quang phổ UV-Vis, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
39
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN
TRONG DỊCH CHIẾT NHÂN HẠT GẤC BẰNG QUANG PHỔ UV-Vis
Nguyễn Thu Quỳnh*, Nguyễn Thị Lan Anh,
Bùi Thị Luyến, Nguyễn Duy Thư
Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Nhân hạt gấc (mộc miết tử) là một vị thuốc rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do chấn
thương, làm vết thương mau lành. Mục đích của nghiên cứu ứng dụng phương pháp đo quang phổ
UV-Vis để định lượng saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc. Nhân hạt gấc được chiết xuất
bằng phương pháp soxhlet với metanol trong 5 giờ. Tiến hành tinh chế bằng phương pháp chiết
lỏng - lỏng với dung môi n-butanol. Dịch chiết được tiến hành phản ứng Rosenthaler với thuốc thử
là axit pecloric và vanilin trong axit axetic băng. Tiến hành quét phổ dung dịch sản phẩm ở dải
bước sóng 400-700 nm. Từ đó lựa chọn được bước sóng hấp thụ cực đại là 555 nm để định lượng
saponin tổng (so sánh chất chuẩn gypenoside XVII, hàm lượng 98,9%). Kết quả thẩm định cho
thấy phương pháp có khoảng tuyến tính nồng độ từ 50 - 150 µg/ml, độ thu hồi đạt 100,2% với sai
số tương đối (RSD) là 1,59%. Phương pháp đo quang phổ UV-Vis đề xuất đạt yêu cầu của phép
định lượng saponin tổng trong nhân hạt gấc.
Từ khóa: mộc miết tử, định lượng, phương pháp, quang phổ UV-VIS.
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Nhân hạt gấc (mộc miết tử) là một vị thuốc
rất quý có tác dụng làm tan các vết bầm do
chấn thương, làm vết thương mau lành. Từ
lâu, nhân dân ta đã biết cách chế dầu từ nhân
hạt gấc theo phương pháp thủ công làm thuốc
dùng trong gia đình, dùng được cho tất cả vết
thương bị bầm dập, tụ máu, bị mụn nhọt, quai
bị, viêm tuyến vú,... ngoài ra còn có tác dụng
chữa trĩ, chữa chai bàn chân. Hiện nay, trên
thế giới có khá nhiều nghiên cứu về ứng dụng
phương pháp quang phổ UV-Vis để định
lượng saponin tổng trong dược liệu [6], [7].
Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam IV chưa có
chuyên luận định lượng saponin tổng trong
dịch chiết nhân hạt gấc bằng phương pháp
quang phổ UV-Vis. Nghiên cứu được tiến
hành với mục đích xác định hàm lượng
saponin tổng trong dịch chiết nhân hạt gấc,
đồng thời xây dựng phương pháp định lượng
saponin trong các chế phẩm có chứa hạt gấc
đang được sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm
nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm
phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều
kiện thực tế nơi làm việc.
*
Tel: 01232 969898
THỰC NGHIỆM
Thiết bị, hóa chất, chất chuẩn
Thiết bị, dụng cụ
Máy quang phổ UV-Vis HALO- RB-10, máy
siêu âm Banson, bộ soxhlet, bếp điện, bộ cách
thủy MEMMER, cân phân tích Sartorius (độ
chính xác 0,0001 g) và các dụng cụ thủy tinh
cần thiết khác.
Chất chuẩn, hóa chất
Chất chuẩn Gypenoside XVII (hàm lượng
98,9%), metanol, n- butanol, ethanol,... (tinh
khiết hóa học).
Đối tượng nghiên cứu và phương pháp
nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Nhân hạt gấc đạt tiêu chuẩn DĐVN IV [2],
được thu hái tại Thái Nguyên.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chiết xuất: Cân khoảng 5 g bột
hạt gấc, đem chiết bằng phương pháp soxhlet
trong 5 giờ hoặc siêu âm trong 1 giờ với
khoảng 250 ml dung môi [3], [4], [5].
Phương pháp tinh chế saponin bằng chiết
lỏng- lỏng: Lấy 25 ml dịch chiết, cô quay
chân không được khoảng 1 - 2 ml dịch chiết
Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
40
đã cô đặc. Chuyển toàn bộ dịch chiết trên vào
bình gạn, tráng bình chiết bằng nước cất (5
ml×2 lần). Thêm vào bình gạn 10 ml dung
môi n-butanol đã bão hòa nước. Lắc 5 phút,
để yên. Gạn phần dịch chiết n-butanol. Chiết
thêm 2 lần, lần lượt với 10 ml và 5 ml dung
môi n-butanol. Lấy toàn bộ dung dịch n-
butanol. Cô quay chân không để thu được
cắn. Hòa tan cắn trong metanol lần lượt với
10 ml - 5 ml - 5 ml và chuyển vào bình định
mức 25 ml và sau đó thêm metanol đến vừa
đủ thể tích [3], [4].
Chuẩn bị dung dịch thử và chuẩn:
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5 g
bột dược liệu, tiến hành chiết soxhlet với
dung môi metanol, chiết trong 5 giờ. Lọc (bỏ
10-20 ml dịch lọc đầu), lấy 25 ml dịch lọc
đem cô quay chân không thu được 1- 2 ml
dịch chiết, thêm 4 - 5 ml nước cất, chuyển
toàn bộ dịch chiết vào bình gạn. Chiết với n-
butanol đã bão hòa nước 3 lần. Cô quay thu
hồi dung môi tới cắn. Hòa tan cắn trong
metanol và thêm metanol đến vừa đủ thể tích
25,0 ml.
- Dung dịch chuẩn: Gypenoside XVII pha
trong metanol nồng độ 0,1 mg/ml.
- Phản ứng màu và đo độ hấp thụ quang: Hút
chính xác 2,0 ml dung dịch trên đem cô cách
thủy đến cắn. Thêm 0,4 ml dung dịch vanilin
5% trong axit axetic băng và 2,4 ml acid
pecloric 70%, đun cách thủy 80°C trong 20
phút. Làm lạnh trong nước đá. Chuyển dung
dịch vào bình định mức, tráng và bổ sung etyl
axetat vừa đủ 10,0 ml. Lắc đều để thu được
dung dịch có màu tím hoa cà [3], [4], [6], [7].
Tiến hành định lượng
- Quét phổ dung dịch chuẩn ở dải bước sóng
400 - 700 nm. Đo độ hấp thụ quang ở bước
sóng cực đại.
- Thẩm định phương pháp định lượng: Độ đặc
hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính
xác và độ lặp lại [1].
- Tính toán kết quả: Dựa vào phương trình hồi
quy giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thụ
quang (A), xác định nồng độ của saponin tổng
trong dung dịch thử (µg/ml), từ đó tính ra hàm
lượng saponin tổng có trong mẫu thử (%).
Xử lý số liệu bằng công cụ Excel
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Khảo sát và lựa chọn quy trình chiết xuất
và tinh chế
Cân chính xác khoảng 5 g bột nhân hạt gấc,
tiến hành chiết xuất bằng các phương pháp
soxhlet trong 5 giờ hoặc siêu âm 1 giờ với các
dung môi ethanol 70%, 96% và metanol. Kết
quả lựa chọn được phương pháp chiết soxhlet
với metanol cho hiệu suất chiết và hàm lượng
saponin toàn phần cao nhất.
Tiến hành tinh chế saponin bằng phương pháp
chiết lỏng-lỏng được trình bày ở phần Phương
pháp nghiên cứu thu được saponin toàn phần.
Dịch chiết saponin được dùng để xây dựng và
thẩm định phương pháp định lượng.
Xây dựng phương pháp định lượng
Xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại
Do các saponin ít có các nối đôi, nhất là nối
đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng
sóng ngắn 195-210 nm. Vì vậy để định lượng
được saponin bằng phương pháp đo quang,
cần tiến hành phản ứng Rosenthaler của
saponin với thuốc thử axit pecloric và vanilin
trong axit axetic băng theo phương pháp được
trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu cho
sản phẩm màu tím hoa cà. Sau đó tiến hành
quét phổ dung dịch sản phẩm trên máy đo
quang phổ trong khoảng bước sóng từ 400 –
700 nm. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được
làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa
chất nghiên cứu. Kết quả thu được cực đại
hấp thụ của dung dịch chuẩn tại bước sóng
555 nm. Do vậy, bước sóng 555 nm được sử
dụng để định lượng saponin trong các khảo
sát tiếp theo.
Thẩm định phương pháp
Độ chọn lọc
Tính chọn lọc được đánh giá qua phân tích
mẫu placebo (dung môi chiết) và mẫu chuẩn
(nồng độ gypenoside 0,1 mg/ml).
Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
41
Mẫu placebo được chuẩn bị như sau: cô 25 ml metanol tới cắn, thêm vào đó 25 ml n-butanol, lắc.
Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong vừa đủ 25 ml metanol (với lần lượt 10 ml - 5 ml- 5 ml chuyển
vào bình định mức và thêm metanol đến vừa đủ thể tích).
Tiến hành phản ứng Rosenthaler và đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu placebo với mẫu trắng
là metanol làm phản ứng tương tự. Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Kết quả độ chọn lọc của phương pháp định lượng
STT
Độ hấp thụ
Ảnh hưởng của mẫu placebo (%)
Mẫu chuẩn Mẫu placebo
1 0,418 0,054 12,92
2 0,433 0,054 12,47
3 0,450 0,053 11,77
Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Nồng độ 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml 125 µg/ml 150 µg/ml
Độ hấp thụ quang A 0,285 0,370 0,480 0,570 0,670
Phương trình hồi qui y= 0,0039x + 0,087; R
2
= 0,9988
Độ thu hồi xác định lại
từ đường chuẩn (%)
101,5 96,7 100,8 99,0 99,6
Kết quả cho thấy, tại bước sóng định lượng
(555 nm), mẫu placebo có độ hấp thụ quang,
tuy nhiên độ hấp thụ của mẫu placebo không
đáng kể (< 20%) so với độ hấp thụ của mẫu
chuẩn. Như vậy, phương pháp phân tích đảm
bảo tính đặc hiệu và có độ chọn lọc cao.
Xác định khoảng tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc của gypenoside XVII
(0,1 mg/ml) pha loãng bằng metanol được các
dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 50
µg/ml; 75 µg/ml; 100 µg/ml; 125 µg/ml; 150
µg/ml. Hút chính xác 1,0 ml mỗi dung dịch
vào 5 ống nghiệm và đem cô đến cắn. Thêm
vào mỗi ống nghiệm 0,4 ml dung dịch vanilin
5% trong axit axetic băng và 2,4 ml axit
pecloric 70%. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ trong
nồi cách thủy ở 80°C trong 20 phút. Ngâm
ống nghiệm trong nước đá, chuyển dung dịch
vào bình định mức, tráng ống nghiệm bằng
etyl axetat và bổ sung etyl axetat vừa đủ 10,0
ml. Lắc đều, đo độ hấp thụ quang của các
dung dịch tại bước sóng 550 nm. Tiến hành
làm song song mẫu trắng.
Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ 50-
150 µg/ml, có mối tương quan tuyến tính giữa
nồng độ saponin chuẩn và độ hấp thụ quang,
hệ số tương quan bằng 0,9988. Độ thu hồi xác
định lại từ đường chuẩn đều nằm trong
khoảng 80 - 120%. Điều này chứng tỏ có sự
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa độ hấp
thụ quang và nồng độ chất khảo sát.
Kết quả khảo sát sự tương quan giữa độ hấp
thụ quang và nồng độ của chất chuẩn được
trình bày ở bảng 2 và hình 1:
Hình 1. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp
thụ quang và nồng độ chất chuẩn
Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được xác định khi
phân tích 06 mẫu song song trong cùng một
điều kiện thí nghiệm. Tiến hành định lượng
06 lần độc lập trên một mẫu thử theo quy
trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn. Tính
hàm lượng saponin toàn phần theo
gypenoside XVII trong mẫu thử theo dược
liệu khô. Kết quả được trình bày trong bảng 3
như sau:
Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
42
Bảng 3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT Lượng cân (g) Độ hấp thụ
quang A
Nồng độ saponin tìm lại theo
đường chuẩn (µg/ml)
Độ thu hồi saponin tìm lại
theo đường chuẩn (%)
1 5,0056 0,612 134,6 89,7
2 5,0060 0,630 139,2 92,8
3 5,0059 0,622 137,2 91,5
4 5,0064 0,626 138,2 92,1
5 5,0063 0,634 140,3 93,5
6 5,0067 0,622 137,2 91,5
TB (%) 91,3
RSD (%) 1,42
Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
STT Lượng thử thêm
vào (µg/ml)
Độ hấp thụ A Lượng tìm lại
(µg/ml)
Độ thu hồi
(%)
Thống kê
1 80 0,391 77,9 97,4
TB = 99,3%
RSD = 1,59%
2 80 0,399 80,0 100,0
3 80 0,400 80,3 100,3
4 100 0,481 101,0 101,0
TB = 101,5%
RSD = 0,96%
5 100 0,487 102,6 102,6
6 100 0,480 100,8 100,8
7 120 0,549 118,5 98,7
TB = 100,2%
RSD = 1,33%
8 120 0,561 121,5 101,3
9 120 0,558 120,8 100,6
Kết quả cho thấy giá trị RSD < 2%. Vậy
phương pháp định lượng đạt yêu cầu độ lặp lại.
Xác định độ đúng
Độ đúng của phương pháp được xác định
bằng cách thêm chính xác 1 lượng dung dịch
thử đã biết hàm lượng saponin vào mẫu
placebo. Lượng thêm vào tương ứng 80%,
100%, 120% so với nồng độ phân tích trong
dung dịch thử. Tại mỗi nồng độ, thực hiện 3
mẫu độc lập, tiến hành định lượng và xác định
lượng tìm lại được so với lượng thêm vào. Kết
quả độ đúng được trình bày ở bảng 4.
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân
tích có độ thu hồi từ 97,4 - 102,6% với giá trị
RSD < 2%. Vì vậy phương pháp phân tích đạt
yêu cầu về độ đúng.
KẾT LUẬN
Qua kết quả nghiên cứu định lượng saponin
trong nhân hạt gấc bằng phương pháp quang
phổ UV-Vis có độ nhạy tốt, có sự tương quan
tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp
thụ quang, độ lặp lại đạt yêu cầu, độ đúng của
phương pháp xây dựng có độ thu hồi cao.
Như vậy phương pháp có thể áp dụng để định
lượng saponin tổng trong nhân hạt gấc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ y tế (2011), Kiểm nghiệm thuốc, Sách đào
tạo dược sĩ đại học, Nxb giáo dục Việt Nam.
2. Dược điển Việt Nam IV (2009), Chuyên luận
gấc (hạt).
3. Nguyễn Thu Hương (2016), Nghiên cứu định
lượng saponin toàn phần trong dược liệu Giảo cổ
lam bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis, Khóa
luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị
Diệp Thanh (2014), “Định lượng saponin toàn
phần trong Giảo cổ lam Gynostemma
pentaphyllum (Thunb.) Makino trồng ở 3 vùng
bằng phương pháp đo quang”, Tạp chí Dược học,
số 2, tr. 54.
5. Nguyễn Thu Quỳnh, Nguyễn Duy Thư, Hoàng
Thị Cúc, Bùi Thị Luyến, Nguyễn Thị Hồng Hạnh
(2018), “Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất
đến chất lượng của cồn thuốc mộc miết tử”, Tạp
chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái
Nguyên, tập 177 (01), tr. 39-43.
6. Han Benyong, Chen Ying, Ren Ying et al
(2014), “Content determination of total saponins
from Opuntia”, Bio Technology An Indian
Journal, 10(18), pp.10400-10404.
7. Yoko Uematsu, Keiko Hirata, Kazuo Saito (2000),
“Spectrophotometric Determination of Saponin in
Yucca Extract Used as Food Additive”, Journal of
Aoac International, 83(6), pp.1451-1454.
Nguyễn Thu Quỳnh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 188(12/1): 39 - 43
43
ABSTRACT
CONTENT DETERMINATION OF TOTAL SAPONINS FROM MOMORDICA
COCHINCHINENSIS BY THE UV-VIS SPECTROPHOTOMETRIC METHOD
Nguyen Thu Quynh
*
, Nguyen Thi Lan Anh,
Bui Thi Luyen, Nguyen Duy Thu
University of Medicine and Pharmacy - TNU
Cochinchina Momordica seed (Moc Miet Tu) is a medicinal herb that has been used in various
Vietnamese traditional medicines for the treatment of bruises, mumps and mammary gland
infections. Objective: To establish for content determination of total saponins in Moc Miet Tu.
Methods: Total saponins was determined by UV-Vis spectrophotometry after extracts of the
sample had been coloured. Results: The Moc Miet Tu was extracted soxhlet in 5 hours by
metanol. The extracts was refined by n-butanol. The quantitative methods was scaned for 400-700
nm wavelength range and choosed 555 nm as the determination of the wavelength. The methods
was linear in the range of 50- 150 µg/ml (r = 0.9988), and the average recovery was 100.2 %; RSD
was 1.59%. Conclusion: The methods is sensitive, reliable, simple and reproducible for the
determination of the contents of total saponins in Moc Miet Tu.
Keywords: Cochinchina Momordica seed, quantitative, method, UV-Vis spectrophotometry.
Ngày nhận bài: 27/8/2018; Ngày phản biện: 04/9/2018; Ngày duyệt đăng: 12/10/2018
*
Tel: 01232 969898
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 70_100_1_pb_7902_2126998.pdf