Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo haematococcus pluvialis và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp Astaxanthin

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 1008 NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VI TẢO Haematococcus pluvialis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN Đặng Phú Hoàng, Phạm Tú Anh, Nguyễn Đức Bách (*) Học viện Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Haematococcus pluvialis là loài vi tảo nước ngọt có khả năng tổng hợp astaxanthin. Astaxanthin có màu đỏ thuộc nhóm β-caroten có giá rất cao được dùng làm thuốc chống oxy hóa và chất tạo màu tự nhiên trong nuôi tôm, cua và cá hồi. Trong nghiên cứu này các yếu tố ảnh hưởng tốc độ sinh trưởng, vòng đời và khả năng tổng hợp astaxanthin của H. pluvialis được khảo sát. Kết quả đánh giá các môi trường C, RM và BBM cho thấy H. pluvialis sinh trưởng tốt nhất trong môi trường C với mật độ đạt cực đại 27,89×104 tế bào/ml. Bổ sung NaNO3 699,2 mg/l vào môi trường C kích thích tăng sinh khối ở mật độ cao nhất 34,85×104 tế bào/ml. Các hormon thực vật, 1-naphthaleinacetic acid (NAA) và gibberellin (GA3) kích thích sinh trưởng của tế bào. Bổ sung NaCl từ 1 đến 2%, cường độ ánh sáng mạnh và salicylic acid (SA) đã kích thích H. pluvialis chuyển sang giai đoạn bào nang, tổng hợp và tích lũy astaxanthin. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong điều kiện khí hậu thay đổi và diện tích đất nông nghiệp ngày càng thu hẹp, nuôi sinh khối vi tảo đang và sẽ là một lĩnh vực có tiềm năng ứng dụng lớn. Trong số các loài tảo lục, H. pluvialis có khả năng tổng hợp astaxanthin được dùng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và thực phẩm chức năng. Do nhu cầu sử dụng astaxanthin tự nhiên ngày càng tăng nên nhiều nước đã phát triển công nghệ sản xuất chất này từ vi tảo H. pluvialis ở quy mô công nghiệp như Israel, Trung Quốc (Aflalo, 2004). Quy trình nuôi H. pluvialis để thu astaxanthin gồm hai giai đoạn, nhân sinh khối (sinh dưỡng) và cảm ứng tổng hợp astaxanthin (bào nang). Để sản xuất được astaxanthin cần phải chủ động điều khiển cả hai giai đoạn này. Trên thực tế nhân sinh khối H. pluvialis rất khó vì tảo có tốc độ sinh trưởng thấp, dễ tạp nhiễm và nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Đến nay, nhiều nghiên cứu tìm điều kiện để tảo sinh trưởng nhanh, kéo dài giai đoạn sinh dưỡng và kích thích phân chia tế bào. Quá trình tích lũy astaxanthin có thể cảm ứng bởi các điều kiện tăng áp suất thẩm thấu, bổ sung salicylic acid (Boussiba và Voshak, 1991). Xuất phát từ vấn đề trên, nghiên cứu này nhằm xác định môi trường và điều kiện nuôi phù hợp để nhân sinh khối và cảm ứng astaxanthin ở H. pluvialis. Kết quả sẽ là cơ sở để nuôi thử nghiệm ở quy mô pilot ở giai đoạn tiếp theo. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng tảo H. pluvialis được lưu giữ tại Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tảo được được lưu giữ trong môi trường RM, ở nhiệt độ 25°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, chu kì sáng tối 12/12 giờ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát môi trường tối ưu Khi tế bào H. pluvialis ở trạng thái sinh dưỡng (80 - 90% tổng số tế bào) trong môi trường RM, dịch nuôi được ly tâm ở 2500 g trong 5 phút để thu thế bào. Tế bào sau đó được đưa vào 200 ml môi trường C, RM hoặc BBM với mật độ 5×104 tế bào/ml ở bình tam giác ở nhiệt độ 25°C, cường độ chiếu ánh sáng 2 klux, chu kì sáng tối 12/12 giờ. Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau mỗi 2 ngày nuôi, tốc độ sinh trưởng và hình thái được đo và quan sát dưới kính hiển vi. Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. pluvialis được đánh giá qua mật độ tế bào bằng buồng đếm Neubauer. Ảnh hưởng của các yếu tố đến tốc độ sinh trưởng và tổng hợp astaxanthin Trên nền môi trường thích hợp, NaNO3 được bổ sung với hàm lượng khác nhau. Tốc độ sinh trưởng được đánh giá sau mỗi 2 ngày thông qua hàm lượng chlorophyll và astaxanthin. Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng, NAA và GA3 cũng được đến pha sinh trưởng của tảo cũng được khảo sát. Những Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai  1009 yếu tố anh hưởng đến khả năng tổng hợp astaxanthin bao gồm NaCl, salicylic acid và cường độ ánh sáng đã được khảo sát. Mỗi thí nghiệm được bố trí với 3 lần nhắc lại. Xác định hàm lượng chlorophyll và astaxanthin Sinh khối tảo khô được nghiền bằng cát thủy tinh và chiết bằng aceton kết hợp HCl (Sarada và ctv., 2006). Sinh khối khô (25 mg) được nghiền trong cối sứ có cát thủy tinh, bổ sung 5 ml HCl 2N, trộn đều và ủ ở 70°C trong 10 phút. Mẫu sau đó được li tâm 5000 g trong 5 phút. Dịch nổi được hút vào bình định mức. Phần cặn tiếp tục nghiền và bổ sung acetone và li tâm. Cuối cùng dịch được gom lại bình định mức, bổ sung acetone đến 25 ml. Dịch được đo ở các bước sóng 665, 645, 630 và 480 nm. Hàm lượng các sắc tố được tính theo công thức mô tả bởi Strickland và Parsons (1997). Hàm lượng sắc tố (μg/l) = C/V. Trong đó hàm lượng sắc tố được tính bằng µg/l, V là thể tích dịch tảo đem lọc (l), C là giá trị nhận từ các công thức tương ứng sau: Chlorophyll a, C = 11,6 × OD665 - 1,31 × OD645 - 0,14 × OD630 Chlorophyll b, C = 20,7 × OD645 - 4,34 × OD665 - 4,42 × OD630 Carotenoid, C = 4,0 × OD480 Đối với tảo H. pluvialis, hàm lượng carotenoid tổng số của tế bào chủ yếu là astaxanthin hấp thụ ở bước sóng 480 nm. Do vậy, hàm lượng carotenoid ở tảo H. pluvialis được xem chính là hàm lượng astaxanthin (Đặng D.H. và ctv., 2010). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát môi trường tối ưu Khảo sát các môi trường C, RM và BBM cho thấy mật độ tế bào H. pluvialis trong môi trường C đạt cao nhất 27,89 × 104 tế bào/ml vào ngày thứ 20, trong khi ở môi trường RM và BBM mật độ tế bào là 21,32 và 23,35 tại cùng thời điểm (hình 1). Môi trường không làm thay đổi thời gian của các pha ở đường cong sinh trưởng nhưng có sự khác biệt về mật độ tế bào. Đối với một số nghiên cứu RM là môi trường trường thích hợp nhất cho sinh trưởng (Đặng D.H và ctv, 2010). Tuy nhiên, ở một số nghiên cứu khác, BBM được coi là hiệu quả nhất cho sinh trưởng của vi tảo (Domínguez và ctv., 2004). Sự khác biệt này có thể là do các chủng giống. Trong 6 ngày đầu ở cả 3 môi trường, H. pluvialis sinh trưởng ổn định và đạt mật độ cao nhất trong môi trường RM. Sau đó, tảo sinh trưởng mạnh hơn ở môi trường C. Điều này có thể do môi trường RM ban đầu có hàm lượng nitơ cao hơn so với 2 môi trường còn lại. Tuy nhiên sau 6 ngày tảo sinh trưởng tốt nhất trong môi trường C, nguyên nhân có thể do môi trường C chứa tris aminomethane giúp duy trì ổn định pH môi trường. Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng trưởng tế bào và tích lũy carotenoid vì liên quan để khả năng hòa tan của CO2 và khoáng chất. Từ kết quả này, môi trường C được sử dụng để nhân sinh khối, tạo nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 1. Mật độ tế bào tảo trên các môi trường Ghi chú: (?) C; (?) RM; (▲) BBM VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 1010 3.2. Khảo sát vòng đời của H. pluvialis Trong 10 ngày đầu nuôi, 90% các tế bào H. pluvialis ở trạng thái tế bào sinh dưỡng có màu xanh, hình elip, có thể chuyển động. Từ ngày 10 đến ngày 20, tế bào tảo chuyển từ dạng sinh dưỡng sang dạng bào nang, hầu hết tế bào có hình cầu, màu xanh, kích thước tế bào đạt cực đại, mất roi. Sau 20 ngày, tế bào bắt đầu chuyển sang màu đỏ do tổng hợp astaxanthin. Đến ngày thứ 25, khoảng 90% các tế bào tảo bất động, màu đỏ đậm. Quá trình nảy mầm của tảo H. pluvialis được theo dõi khi bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy. Tế bào chuyển từ trạng thái bào nang (màu đỏ) sang tế bào sinh dưỡng (màu xanh) do sự phân giải astaxanthin. Sau 5 ngày, khoảng 80% tế bào ở trạng thái sinh dưỡng và lại bắt đầu nhân đôi duy trì pha sinh dưỡng. Hình 2. Hình thái tế bào qua các giai đoạn dưới kính hiển vi (1) tế bào sau 10 ngày nuôi cấy, (2) từ 10-20 ngày, (3) tế bào ở ngày 25, (4) tế bào sau 5 ngày bổ sung môi trường mới 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến tốc độ sinh trưởng Ảnh hưởng của nitrat Hàm lượng nitrat từ 174,8 mg/l đến 1048,8 mg/l được bổ sung vào môi trường C. Sau 20 ngày, mật độ tế bào cao nhất đạt 37,05×104 tế bào/ml khi môi trường có nồng độ nitrat 699,2 mg/l. Nhìn chung, mật độ tế bào tăng dần tỉ lệ với hàm lượng nitrat bổ sung. Tuy nhiên, ở nồng độ nitrat 1048,8 mg/l, mật độ tế bào chỉ đạt 87% so với mức 699,2 mg/l (hình 3). Điều này có thể do khi nồng độ nitrat quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của vi tảo (Lê T.T. và ctv., 2013). Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ nitrat đến mật độ tế bào (?) 174,8 mg/l; (×) 349,6 mg/l; (▲) 699,2 mg/l; (?) 1048,8 mg/l VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 1011 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng Trên nền môi trường C, NAA và GA3 được bổ sung với các nồng độ khác nhau. Ở ngày thứ 20, mật độ tế bào đạt 49,05×104 tế bào/ml trong môi trường bổ sung 5 ppm NAA và 10 ppm GA3, tăng 75,86% so đối chứng (hình 4). Chất điều tiết sinh trưởng đã kích thích sinh trưởng do làm rút ngắn thời gian pha loãng. Ở mức 10 ppm NAA+ 15 ppm GA3, mật độ tế bào đạt cực đại chỉ ở mức 39,62×104 tế bào/ml, bằng 80,77% so với công thức bổ sung 5 ppm NAA và 10 ppm GA3. Như vậy, khả năng kích thích sinh trưởng của NAA và GA3 không tuyến tính với nồng độ. Điều này có thể do khi nồng độ NAA và GA3 cao sẽ tăng hoạt động của L-aminocycloproane-1-cacboxylic synthase, enzyme điều tiết sinh tổng hợp ethylene, dẫn đến ảnh hưởng đến cân bằng tỉ lệ sắc tố quang hợp. Hàm lượng chlorophyll ảnh hưởng bởi hàm lượng các chất sinh trưởng, ở nồng độ 5 ppm NAA và 10 ppm GA3 tảo có hàm lượng chlorophyll cao nhất 212,61 µg/l. Như vậy, chất điều tiết sinh trưởng NAA và GA3 có khả năng kích thích vi tảo H. pluvialis sinh trưởng và nồng độ 5 ppm NAA + 10 ppm GA3 là hiệu quả nhất. Hình 4. Ảnh hưởng của NAA, GA3 đến mật độ tế bào và hàm lượng chlorophyll (?) 0 ppm NAA + 0 ppm GA3; (?) 5 ppm NAA + 10 ppm GA3; (×) 10 ppm NAA + 15 ppm GA3; (▲) 15 ppm NAA + 15 ppm GA3. 3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng tổng hợp astaxanthin Ảnh hưởng của NaCl Khi tảo đạt mật độ 30,62×104 tế bào/ml trong môi trường C, NaCl được bổ sung với các nồng độ 0% (đối chứng), 1% và 2%. Trong 4-6 ngày đầu, mật độ tế bào giảm gần như nhau ở các môi trường. Ở nhiều nghiên cứu, NaCl được coi là một trong những tác nhân cảm ứng tạo nang và kích thích tổng hợp astaxanthin (Boussiba và Voshak, 1991; Sarada và ctv., 2002; Lưu T.T. và ctv., 2012). Đi kèm với tăng tổng hợp astaxanthin, hàm lượng chlorophyll giảm khi bổ sung NaCl. Ở nồng độ 2%, hàm lượng chlorophyll giảm còn 102,06 µg/l so với 177,04 µg/l (đối chứng). Ở nồng độ muối 1%, hàm lượng chlorophyll giảm còn 134,33 µg/l. Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên mật độ tế bào và hàm lượng astaxanthin (?) 0 %; (?) 1 %; (▲) 2 % 1011 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 1012 Ảnh hưởng của salicylic acid SA được bổ sung vào môi trường C ở các mức 0 (đối chứng), 25 và 50 mg/l. Sau 6 ngày thí nghiệm, kết quả cho thấy khi bổ sung 25 mg/l SA, mật độ tế gần như không đổi so với đối chứng nhưng ở mức 50 mg/l SA, mật độ tế bào giảm liên tục còn 37,4% sau 12 ngày. Ở mức 25 mg/l SA mật độ tế bào giảm nhanh xuống còn 69,4% ở ngày 12 (hình 6). Hàm lượng chlorophyll ở hai công thức bổ sung SA 25 và 50 mg/l hầu như không thay đổi sau 6 ngày thí nghiệm. Sau 12 ngày, hàm lượng chlorophyll giảm xuống còn 70% so với ngày đầu tiên ở cả 2 mức thí nghiệm nhưng hàm lượng astaxanthin đạt 68,55 và 82,94 µg/l ở nồng độ SA 25 và 50 mg/l. Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ SA lên hàm lượng chlorophyll (?) 0 mg/l; (?) 25 mg/l; (▲) 50 mg/l Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng Kết quả cho thấy không có sự khác biệt ở cường độ chiếu sáng 2,0 hoặc 3,5 klux đến khả năng tổng hợp astaxanthin. Hàm lượng astaxanthin trong tế bào được tích lũy khi chiếu sáng 5 klux nhưng mật độ tế bào giảm. Không có sự khác biệt giữa cường độ chiếu sáng 3,5 klux và 2,0 klux đến hàm lượng chlorophyll và astaxanthin. So với cường độ chiếu sáng 2 klux hàm lượng astaxanthin đạt 227,57 µg/l, tăng 315,12% khi chiếu sáng 5 klux, đồng thời hàm lượng chlorophyll chỉ còn 84,25 µg/l, giảm 69,03 %. Như vậy NaCl, SA và ánh sáng tác động nhanh tới vi tảo, tuy nhiên, khả năng tích lũy astaxanthin dưới tác động của ánh sáng sẽ đơn giản nhưng hiệu quả hơn so với sử dụng NaCl và SA. Hình 7. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến mật độ tế bào và hàm lượng astaxanthin (?) 2,0 kLux; (?) 3,5 kLux; (▲) 5,0 kLux. VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 1013 IV. KẾT LUẬN Trong điều kiện thí nghiệm, H. pluvialis sinh trưởng tối nhất trong môi trường C với mật độ tế bào đạt cực đại là 27,89×104 tế bào/ml. Muối nitrat và chất điều tiết sinh trưởng NAA, GA3 kích thích tế bào tăng sinh. Khi bổ sung NaNO3 699,2 mg/l cho mật độ cao nhất đạt 34,85×104 tế bào/ml. Tương tự, bổ sung 5 ppm α-NAA và 10 ppm GA3 kích thích tảo sinh trưởng. Muối NaCl, salicylic acid và ánh sáng cường độ mạnh kích thích tảo chuyển sang bào nang. Kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để áp dụng vào quy trình nhân nuôi H. pluvialis trong điều kiện thử nghiệm pilot. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ nguồn đề tài trọng điểm cấp Học viện 2014- 2016. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng D.H., Đinh Đ.H., Nguyễn T.T., Hoàng T.L.A. (2010). Lựa chọn môi trường tối ưu để nuôi trồng vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin. Tạp chí Sinh học, 32(2): 43-53. 2. Lê T. T., Lưu T. T., Đinh T. N. M., Hoàng T. L. A., Ngô T. H. T., Nguyễn C. H., Đặng D. H. (2013). Ảnh hưởng của nồng độ nitrat lên sinh trưởng của vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tạp chí Sinh học, 35(2): 219-226. 3. Lưu T. T., Đinh Đ. H., Đinh T. N. M., Ngô T. H. T., Hoàng T. L. A., Đặng D. H. (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối lên sinh trưởng và khả năng tích lũy astaxanthin của vi tảo Haematococcus pluvialis làm cơ sở bước đầu cho quy trình nuôi cấy 2 pha. Tạp chí Sinh học, 34(2): 213-223. 4. Aflalo C., Meshulam Y., Zarka A., Boussiba S. (2007). On the relative efficiency of two- vs. one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis. Biotechnology and Bioengineering, 98(1): 300-305 5. Boussiba S., Vonshak A. (1991). Astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis. Plant and Cell Physiology, 32: 1077-82. 6. Domínguez A. R.-Bocanegra, Legarreta I. L., Jeronimo F. M., Campocpsio A. T. (2004). Influence of environmental and nutritional factors in the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology, 92: 209-214. 7. Sarada R., Tripathi U., Ravishankar G. A. (2002). Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions. Process Biochemistry, 37: 623-627. 8. Strickland J. D. H., Parsons T. R. (1977). A practical handbook of seawater analysis. Fisheries research board of Canada, 167: 311 pp. ABSTRACT Study on mass rearing of Haematocuccus pluvialis and effective factors on astaxanthin synthesis Đang Phu Hoang, Pham Tu Anh, Nguyen Duc Bach: ndbach@vnua.edu.vn Fresh water microalgae Haematococcus pluvialis is able to produce high content of astaxanthin, which is widely used as antioxidant in pharmacy and natural colorant in farming of shrimp, crab and salmon. The study is to determine optimal medium for biomass production and factors influenced the life cycle of H. pluvialis. Investigation of media C, RM and BBM showed that H. pluvialis grew well in medium C with the density of 27.89×104 cells/ml. Adding of NaNO3 at 699.2 mg/l obtained the best growth rate and maximal density was 34.85×104 cells/ml. Plant growth hormones, 1-naphthaleinacetic acid (NAA) and gibberellin (GA3) increased the growth of H. pluvialis while NaCl, SA or high light intensity induced the red cyst cells coupled with astaxanthin production. It suggested that light intensity would be important factor for cyst formation and astaxanthin production. Keywords: astaxanthin, microalgae Haematococcus pluvialis, Người phản biện: TS. Trịnh Xuân Hoạt 1013 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai