Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống của viên nang CTH hỗ trợ điều trị viêm gan

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 20 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ĐƯỜNG UỐNG CỦA VIÊN NANG CTH HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN Nguyễn Thị Anh Đào*, Phạm Huy Hùng*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Viêm gan là tình trạng tổn thương nhu mô gan, đặc trưng là sự hiện diện của các tế bào viêm. Theo thống kê WHO (World Health Organization) trên toàn cầu có 1,45 triệu người tử vong do viêm gan mỗi năm. Hiện nay hướng về các thuốc có nguồn gốc tự nhiên như Silymarin trong điều trị các bệnh về gan. Viên nang cứng CTH với vai trò là thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý viêm gan, tác dụng dược lý của nó với liều 0.9 g/kg đã được nghiên cứu thực nghiệm có tác dụng trên mô hình tổn thương gan bằng paracetamol. Bài báo này trình bày kết quả độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang CTH trên thực nghiệm. Đối tượng - Phương pháp: Khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang CTH trên thực nghiệm. Độc tính cấp: Chuột nhắt trắng đực, cái giống Swiss albino, nguồn từ Viện Pasteur, 6 – 7 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 g, nuôi ổn định một tuần trước khi thử nghiệm. Thể tích uống 0,2 ml/ 10g thể trọng, dùng một liều duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8 -9 giờ sáng. Chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp số nhân (nếu có) hoặc Dmax. Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận động của chuột trong vòng 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc. Ghi chép các diễn tiến trong thời gian đó. Xác định LD50 theo phương pháp Karber – Behrens (nếu có). Độc tính bán trường diễn: Chuột thử nghiệm được chia thành 4 lô, mỗi lô 20 con (50% đực, 50% cái), có trọng lượng ban đầu tương đương nhau. Mỗi ngày vào giờ nhất định (8 giờ 00 sáng) cho mỗi chuột uống thuốc liên tục trong 60 ngày: Lô chứng (n = 20): uống nước cất; Lô thử 1 (n = 20): liều 0,9 g/kg. Lô thử 2 (n=20): Liều 1,8 g/kg. Lô thử 3 (n=20): Liều 3 g/kg. Thể tích cho chuột uống là 0,1 ml/10 g thể trọng. Chuột ở tất cả các lô được lấy máu trước khi thử nghiệm, sau khi uống thuốc 30 ngày để làm các xét nghiệm về công thức máu: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hemoglobin, hematocrit. Và xác định thông số chức năng gan AST, ALT, các thông số chức năng thận (creatinin, urê) và Glucose máu, lipid máu. Sau khi lấy máu vào ngày thứ 60, chuột được mổ để quan sát đại thể và lấy nội tạng để quan sát vi thể và phân tích vi phẫu. Kết quả: Xác định được D max đường uống của bột thuốc CTH là 30 g/kg chuột nhắt trắng (tương đương 2,55 g/kg người nếu người nặng 60 kg thì có hàm lượng thuốc là 153 g bột thuốc). Viên nang CTH không làm thay đổi các chỉ số sinh hóa: AST, ALT, creatinin máu, glucose máu, số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu, Hct, Hgb, cholesterol, triglycerid, HDL, và acid uric máu sau khi được chia lô cho uống trong 2 tháng trên chuột nhắt trắng. Chỉ ghi nhận triệu chứng ở lô 3 g/kg đi tiêu phân sệt sau 3 tuần uống thuốc. Kết luận: Tìm được Dmax là 30 g/kg chuột, liều CTH được xem có tác dụng dược lý là 0,9 g/kg . Liều D max gấp liều có tác dụng điều trị rất nhiều lần, chứng tỏ ngưỡng an toàn khi dùng thuốc CTH cao, khả năng ngộ độc thuốc thấp trong trường hợp dùng quá liều qua đường uống. Sau 2 tháng uống viên nang CTH không làm thay đổi chỉ số sinh hóa trên chuột thử nghiệm, bước đầu đánh giá tính an toàn của viên nang CTH. Từ khoá: viên nang CTH, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn *Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.BS. Nguyễn Thị Anh Đào ĐT: 0984 530 594 Email: [email protected] Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 21 ASTRACT ACUTE AND SEMI-CHRONIC TOXICITY OF ORAL CAPSULES CTH FOR SUPPORTING THE TREATMENT OF HEPATITIS DISEASE Nguyen Thi Anh Dao, Pham Huy Hung, Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 20 – 28 Objectives: Hepatitis is a condition of liver parenchyma lesions, characterized by the presence of inflammatory cells. According to WHO (World Health Organization) statistics globally, 1.45 million people die from hepatitis each year. Currently, using drugs of natural origin such as Silymarin in the treatment of liver diseases is being tendency. A functional food in hard capsule form named CTH to support the treatment of hepatitis diseases has been experimentally studied the pharmacological effect based on the model of paracetamol- induced liver damage. This paper presents the results of acute toxicity and semi-chronic toxicity of CTH capsules in the experiment. Methods: Survey of acute toxicity and semi-chronic toxicity of CTH capsules in the experiment. Acute toxicity: White male and female Swiss albino mice, from Institut Pasteur, 6-7 weeks old, weighing 20 ± 2 g were fed one week before the test. The drinking volume was 0.2 ml/10g body weight, using a single dose per day for the period from 8 -9 am. Mice were divided into plots and the use of drugs at doses in the range LD0 and LD100 divided exponentially (if any) or Dmax. The activity and behavior of mice were followed within the first 72 hours after taken the drug. The progresses and the number of dead mice in each batch during that time were recorded. LD50 value was determined by the method Kärber - Behrens (if any). Semi-chronic toxicity: Mice were experimentally divided into 4 groups, 20 animals (50% male, 50% female) with the same initial weight were put in each group. Every day at a certain time, (8:00 am) each rat was continuously taken the extract for 60 days: control group (n = 20): used distilled water. Group 1 (n = 20): dose of 0.9 g/kg. Group 2 (n = 20): Dose of 1.8 g/kg. Group 3 (n = 20): Dose of 3 g/kg. The volume for mice to drink was 0.1 ml/10 g body weight. Mice in all groups were taken blood before the test, after treated the drug for 30 days to do the tests for blood formula (number of red blood cells (million/mm3), the number of white blood cells (thousand/mm3), hemoglobin (g/L), hematocrit (%), and determination of liver function parameters (AST, ALT), renal function parameters (creatinine, urea) and blood glucose, lipid. After taking blood on the 60th day, mice were operated to observe the whole body and removed organs for microscopic observation and microsurgical analysis. Results: D max of powder orally CTH was 30 g/kg mice (equivalent to 2.55 g/kg in human, 153 g powder in 60 kg persons). CTH capsules did not alter the biochemical indices: AST, ALT, serum creatinine, blood glucose, the number of leukocytes, erythrocytes, platelets, hematocrit, Hgb, cholesterol, triglyceric, HDL, and blood uric acid in mice after treated independently 3 doses: 0.9 g/kg, 1.8 g/kg, and 3 g/kg in three groups for 2 months. The diarrheal symptom was only observed in the 3 g/kg group after 3 weeks of taking medicine. Conclusion: Dmax was successfully determined being 30 g/kg of mice, the dose 0.9 g/kg of CTH was considered to be effective. D max dose is higher than the effective dose for treatment many times, proving the safety threshold when using CTH is high, the possibility of drug poisoning is low in case of overdose. After 2 months of taking CTH capsules, the biochemical indexes did not change in tested mice, initially assessing the safety of CTH capsules. Keywords: CTH capsules, acute toxicity, semi-chronic toxicity ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan là tình trạng tổn thương nhu mô gan, đặc trưng bởi sự hiện diện của các tế bào viêm(2). Trong điều trị viêm gan, chủ yếu là điều trị nguyên nhân nhưng nếu không ổn định được enzym gan sẽ góp phần dẫn đến nhiều hậu quả Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 22 xấu như viêm gan mạn, xơ gan, ung thư gan. Hiện nay trên thế giới việc kết hợp Y học cổ truyền (YHCT) và Y học hiện đại (YHHĐ) đang được quan tâm. Nên xu thế hiện nay hướng về các thuốc có nguồn gốc tự nhiên như Silymarin đã được sử dụng trong điều trị các bệnh về gan, bao gồm viêm gan virus cấp tính và mãn tính, viêm gan do độc tố hoặc do thuốc, xơ gan và bệnh gan do rượu(3). Viên nang cứng CTH gồm 5 vị thuốc nam: Diệp hạ châu (Herba phyllanthus urinaria), Linh chi (Ganoderma lucidum), Nghệ (Curcumae longae), Đậu xanh (Seenzym vignae aurei), Sâm đại hành (Bulbus eleutherinis subaphyllae) là một sản phẩm đã được lưu hành ở Việt Nam với vai trò là thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý viêm gan. Tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm viên nang CTH đã được nghiên cứu trên thực nghiệm trước đó. Để có thể khảo sát tính an toàn khi dùng thuốc thực hiện tiếp nghiên cứu này với mục tiêu khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đường uống của viên nang CTH. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Viên nang CTH (Diệp hạ châu, Linh chi, Nghệ, Đậu xanh, Sâm đại hành) với tỷ lệ tương ứng: 3:2:2:1,5:1,5 được công ty TNHH TM SX Đông Nam Dược Hồng Vượng cung cấp số ĐK:21055/2014/ATTP-XNCB, ngày sản xuất 27/08/2016, hạn sử dụng 3 năm. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng đực, cái chủng Swiss albino, 4 – 6 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 gram, khỏe mạnh, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống, nuôi ổn định. Hoạt chất và thuốc thử Nước cất, nước muối sinh lý, formalin 10% ngày sản xuất 15/06/2016. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Độc tính cấp(1,4,7) Điều kiện thí nghiệm Thuốc thử nghiệm: lấy từ viên nang hòa tan trong nước cất. Chuẩn bị động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng đực, cái giống Swiss albino, nguồn từ Viện Pasteur, 4 – 6 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 g. Cho chuột nhịn đói 12 giờ trước khi cho uống thuốc. Đường dùng thuốc: đường uống (p.o). Thể tích uống 0,2 ml/10g thể trọng. Số lần dùng thuốc: dùng một liều duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8 -9 giờ sáng. Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều là 6 chuột): khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù cho uống. Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%). Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp số nhân (nếu có) hoặc Dmax. Chỉ tiêu đánh giá kết quả Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận động của chuột trong vòng 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc. Ghi chép các diễn tiến trong thời gian đó. Ghi giờ cho chuột uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thường. Ghi nhận số chuột chết trong từng lô. Xác định LD50 theo phương pháp Karber – Behrens (nếu có). Độc tính bán trường diễn(1,4,7) Chuột thử nghiệm được chia thành 4 lô, mỗi lô 20 con (50% đực, 50% cái), có trọng lượng ban đầu tương đương nhau. Mỗi ngày vào giờ nhất định (8 giờ 00 – 9 giờ sáng) cho mỗi chuột uống thuốc liên tục trong 60 ngày: Lô chứng (n = 20): được cho uống nước cất hàng ngày trong 60 ngày; Lô thử 1 (n = 20): Liều 0,9 g/kg; Lô thử 2 (n=20): Liều 1,8 g/kg; Lô thử 3 (n = 20): Liều 3 g/kg trong 60 ngày. Thể tích cho chuột uống là 0,1 ml/10g thể trọng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 23 Theo dõi và đánh giá kết quả Chuột được cho uống thuốc 1 lần mỗi ngày vào các buổi sáng, đưa thẳng thuốc vào dạ dày bằng kim bơm đầu tù. Trong thời gian đó theo dõi tình trạng chung của chuột về thể trọng (g) (cân chuột hàng tuần). Trong thời gian thử nghiệm, chuột ở tất cả các lô được lấy máu trước khi thử nghiệm, sau khi uống thuốc 30 ngày để làm các xét nghiệm về công thức máu (số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hemoglobin, hematocrit). Và xác định thông số chức năng gan AST, ALT, các thông số chức năng thận (creatinin, urê) và glucose máu, lipid máu. Sau 60 ngày lấy một đợt xét nghiệm tương tự. Sau khi lấy máu vào ngày thứ 60, chuột được mổ để quan sát đại thể và lấy nội tạng để quan sát vi thể. Gan và thận chuột được bảo quản trong dung dịch formol 10% sau đó được phân tích vi phẫu tại khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy. Phương pháp thống kê – xử lý dữ liệu Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Phân tích số liệu bằng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm MS. EXCEL 2013. KẾT QUẢ Độc tính cấp Khi cho chuột uống viên nang CTH ở liều cao nhất, không gây chết súc vật thí nghiệm ở liều uống 30 g/kg chuột tương ứng khi pha 9 viên CTH được 4,5 g bột dược liệu pha trong 3 ml nước, đây cũng là liều đặc nhất có thể bơm qua được kim đầu tù. Quan sát biểu hiện chuột sau uống: nằm im, giảm động sau 30 phút chuột hoạt động bình thường. Sau 24 giờ đến 72 giờ đầu tiên và 2 tuần sau đó không xuất hiện triệu chứng gì khác, chuột sống ăn uống bình thường. Như vậy không xác định được LD50 của bột thuốc, mà ta có được liều Dmax là 30 g/kg chuột. Sau 2 tuần theo dõi, mổ chuột ở tất cả các lô để quan sát đại thể các phủ tạng của chuột. Kết quả tất cả các chuột thực nghiệm không thấy bất kỳ thay đổi nào về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, hệ thống tiêu hóa. Như vậy, bột thuốc CTH không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể cho chuột uống (Bảng 1). Bảng 1. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của bột thuốc CTH Lô thử Số chuột đực (con) Số chuột cái (con) Số chuột chết sau 72h trong lô (con) Phân suất tử vong (%) sau 72h Sơ khởi 2 2 0 0 Xác định 10 10 0 0 Độc tính bán trường diễn Tình trạng chung của chuột Sau 60 ngày, tất cả các chuột thử nghiệm đực và cái ở cả 04 lô (uống nước cất, CTH 0,9 g/kg, CTH 1,8 g/kg và CTH 3 g/kg) hoạt động bình thường, ăn uống được, riêng chuột lô CTH 3 g/kg xuất hiện đi phân sệt sau 3 tuần uống thuốc, phân vàng, các lô còn lại đi phân khô, chặt, lông mượt. không có hiện tượng rụng lông hoặc khô cứng. Tất cả các chuột trong thử nghiệm đều sống bình thường sau 2 tháng uống thuốc. Trọng lượng chuột Bảng 2. Trọng lượng chuột nhắt (g) trong 2 tháng thử nghiệm bán trường diễn (n=20) Lô Trước thử nghiệm (g) Sau 1 tháng (g) Sau 2 tháng (g) % thay đổi sau 2 tháng C 26,78±2,11 29,85±2,88 31,93±3,22 19,23% CTH 0,9 g 27,79±2,98 27,78±2,98 33,75±4,28 21,44% CTH 1,8g 28,79±2,42 29,21±2,42 31,75±5,29 10,28% CTH 3g 28,56±1,91 26,62±3 * 28,98±2,22 1,47% * khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô C (p < 0,05) Lô uống CTH liều 0,9 g/kg và liều 1,8 g/kg tốc độ tăng trọng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với ở lô C sau 2 tháng thử nghiệm (p>0,05) (Bảng 2). Lô uống CTH liều 3 g/kg tốc độ tăng trọng chậm hơn so với lô chứng sau 1 tháng thử nghiệm khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05). Nguyên nhân khi dung thuốc liều cao gấp 3,3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 24 lần liều có tác dụng điều trị xuất hiện chuột đi tiêu phân sệt, phân vàng sau 3 tuần uống thuốc. Như vậy với liều thuốc cao 3 g/kg sẽ xuất hiện triệu chứng đi tiêu phân sệt. Tiếp tục duy trì cho chuột ở lô 3 g/kg uống tiếp sau 2 tháng thể trọng của chuột so với lô chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p >0,05), nguyên nhân có thể do ban đầu dùng thuốc liều cao chuột xuất hiện triệu chứng đi tiêu phân sệt, sau đó bệnh tự giới hạn. Bảng 3. Kết quả huyết học, sinh hóa trong thử nghiệm bán trường diễn Chỉ tiêu khảo sát Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Hồng cầu (triệu tế bào/µl) C 6,11 ± 0,78 6,38 ± 0,86 6,85 ± 0,85 CTH 0,9g 5,62 ± 1,84 7,51 ± 0,49 ** 7,07 ± 0,56 CTH 1,8g 6,85 ± 0,98 7,53 ± 0,61 ** 7,26 ± 0,56 CTH 3g 6,64 ± 0,89 7,65 ± 0,71 ** 7,09 ± 0,71 Hemoglobin (g/dl) C 15,78 ± 1,65 15,98 ± 1,91 16,43 ± 1,69 CTH 0,9g 15,91 ± 2,45 16,63 ± 1,03 16,22 ± 2 CTH 1,8g 16,28 ± 1,86 16,5 ± 1,38 16,25 ± 1,16 CTH 3g 16,25 ± 2,16 16,39 ± 1,08 15,67 ± 2 Hematocrit (%) C 39,43 ± 2,89 39,35 ± 6,17 40,39 ± 6,82 CTH 0,9g 41,51 ± 7,63 46,35 ± 2,65 ** 45,26 ± 3,52 CTH 1,8g 40,87 ± 4,79 46,11 ± 3,97 ** 45,28 ± 3,11 CTH 3g 41,25 ± 4,63 45,55 ± 4,47 ** 42,15 ± 5,35 Tiểu cầu (103 tế bào/µl) C 838,2 ± 277,6 1020 ± 229 1079 ± 168,6 CTH 0,9g 703,3 ± 132 * 833 ± 155 ** 1064 ± 123,4 CTH 1,8g 760,65 ± 164,6 851,4 ± 159,8 * 1170 ± 182,6 CTH 3g 784,8 ± 241 986,3 ± 141,8 1177 ± 172 Bạch cầu (103 tế bào/µl) C 6,97 ± 2,11 7,67 ± 2,21 8,42 ± 2,68 CTH 0,9g 6,41 ± 1,53 9,27 ± 1,63 9,52 ± 1,77 CTH 1,8g 6,31 ± 1,72 9,32 ±2,55 9,61 ± 3,62 CTH 3g 5,91 ± 1,35 7,03 ± 2,33 8,46 ± 3,9 ALT (IU/L) C 34,2 ± 7,67 38,1 ± 14,28 38,65 ± 10,05 CTH 0,9g 33,7 ± 10,17 31,4 ± 18,33 44,7 ± 15,1 CTH 1,8g 31,2 ± 9,06 36,65 ± 10,2 46,6 ± 18,65 CTH 3g 31,7 ± 9,77 39,55 ± 14,58 37,5 ± 11,57 AST (IU/L) C 59,55 ± 8,61 57,1 ± 13,84 63,6 ± 29,1 CTH 0,9g 58,9 ± 8,77 59,3 ± 12,64 73,05 ± 18,43 CTH 1,8g 57,2 ± 13,08 53,95 ± 15,83 63,65 ± 21,39 CTH 3g 57,45± 9,67 66 ± 16.58 55,6 ± 11,5 Cholesterol (g/l) C 70,66 ± 11,73 79,85 ± 10,26 82,86 ± 8,53 CTH 0,9g 75,48 ± 13,97 81,53 ± 12,13 89,06 ± 11,69 CTH 1,8g 76,16 ± 18,56 86,54 ± 11,74 87,86 ± 10,64 CTH 3g 71,71 ± 15,96 88,95 ± 17,4 82,25 ± 11,32 Triglycerid (mg/dl) C 108,04 ± 24,29 120,71 ± 22,71 122,36 ± 15,29 CTH 0,9g 119,49 ± 13,51 130,06 ± 21,02 139,96 ± 16,21 CTH 1,8g 114,27 ± 12,26 127,87 ± 10,92 135,37 ± 13,9 CTH 3g 109,79 ± 12,01 129,96 ± 13,97 134,13 ± 15,28 HDL (mL/dL) C 36,01 ± 6,43 48,27 ± 13,35 44,89 ± 10,3 CTH 0,9g 44,4 ± 11,33 ** 56,18 ± 9,05 61,35 ± 7,07 ** CTH 1,8g 46,08 ± 8,65 ** 62,18 ± 8,97 ** 58,48 ± 7,5 ** CTH 3g 38,57 ± 6,79 ** 59,83 ± 9,14 ** 54,67 ± 7,76 ** Creatinin (mg/dl) C 0,39 ± 0,09 0,38 ± 0,12 0,42 ± 0,11 CTH 0,9g 0,38 ± 0,08 0,47 ± 0,1 0,38 ± 0,13 CTH 1,8g 0,32 ± 0,04 ** 0,39 ± 0,08 0,39 ± 0,06 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 25 Chỉ tiêu khảo sát Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng CTH 3g 0,36 ± 0,05 0.44 ± 0.1 0,39 ± 0,13 Acid uric (mg/dl) C 0,6 ± 0,11 0,61 ± 0,08 0,64 ± 0,15 CTH 0,9g 0,53 ± 0,07 0,61 ± 0,04 0,68 ± 0,1 CTH 1,8g 0,59 ± 0,1 0,64 ± 0,03 0,71 ± 0,06 CTH 3g 0,5 ± 0,08 0,65 ± 0,09 0,72 ± 0,16 Glucose (mg/dl) C 59,01 ± 17,8 77,15 ± 19,7 81,28 ± 15,3 CTH 0,9g 60,43 ± 13,67 76,85 ± 13,55 82,48 ± 15,68 CTH 1,8g 62,49 ± 13,52 85,79 ± 12,38 83,96 ± 8,98 CTH 3g 66,18 ± 9,56 77,75 ± 15,6 79,76 ± 10,69 C: Lô chứng (nước cất), CTH 0,9g: Lô uống CTH liều 0,9 g/kg chuột, CTH 1,8g: Lô uống CTH liều 1,8 g/kg chuột, CTH 3g: Lô uống CTH liều 3 g/kg chuột, *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô C (p <0,05), **: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô C (p <0,01) Sau 2 tháng uống thuốc, nồng độ enzym gan AST và ALT của 3 lô CTH với liều 0,9 g/kg, 1,8 g/kg, 3 g/kg khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô C (p >0,05) (Bảng 3). Sau 2 tháng sử dụng thuốc, 3 lô thuốc CTH với liều 0,9 g/kg, liều 1,8 g/kg và 3 g/kg làm tăng HDL khác biệt có ý nghĩa so với lô C (p <0,01). Tại thời điểm T0 (đầu thử nghiệm) khác biệt giữa 3 lô thuốc với nhóm chứng là có ý nghĩa thống kê do việc phân chia lô là ngẫu nhiên. Nên sau 2 tháng HDL của 3 nhóm vẫn tăng so với lô chứng không được xem là có giá trị. Chỉ số HDL của 3 lô cao hơn so với nhóm chứng nhưng các chỉ số vẫn trong giới hạn bình thường. Hai chỉ số cholesterol và triglycerid khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p >0,05). Sau 60 ngày, 3 lô CTH với liều 0,9 g/kg, 1,8 g/kg và 3g/kg các chỉ số sinh hóa creatinine, acid uric và glucose khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô C (p >0,05). Các chỉ số số lượng bạch cầu (WBC), số lượng hồng cầu (RBC), số lượng tiểu cầu (PLT), nồng độ hemoglobin (HGB), phần trăm Hct của chuột thử nghiệm với 3 liều 0,9 g/kg, 1,8 g/kg và 3 g/kg trong 2 tháng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô C (p >0,05). Viên nang CTH không làm thay đổi các chỉ số về công thức máu sau 2 tháng dùng thuốc. Kết quả giải phẫu bệnh trên chuột độc tính bán trường diễn Sau 2 tháng dùng thuốc, cấu trúc vi thể gan, thận chuột ở các lô thử nghiệm từ mức độ bình thuờng tới mức độ viêm nhẹ, viêm trung bình nhưng xét nghiệm về men gan, creatinin vẫn ở mức ổn định bình thường sau 2 tháng uống thuốc. Tuy nhiên, lô chứng cũng bị tổn thương theo mức độ từ nhẹ tới nặng nên không phải do tác dụng phụ của thuốc thử nghiệm (Bảng 4). Bảng 4. Kết quả giải phẫu bệnh mô gan, thận bán trường diễn Mức độ tổn thương Gan Thận C Bình thường 1/4 3/4 Nhẹ 1/4 1/4 Trung bình 1/4 0/4 Nặng 1/4 0/4 CTH 0.9 Bình thường 0/4 1/4 Nhẹ 3/4 3/4 Trung bình 1/4 0/4 Nặng 0/4 0/4 CTH 1.8 Bình thường 0/4 0/4 Nhẹ 3/4 4/4 Trung bình 1/4 0/4 Nặng 0/4 0/4 CTH 3 Bình thường 0/4 1/4 Nhẹ 3/4 3/4 Trung bình 1/4 0/4 Nặng 0/4 0/4 C: Lô chứng (nước cất); CTH 0,9: Lô uống CTH với liều 0,9 g/kg; CTH 1,8: Lô uống CTH với liều 1,8 g/kg; CTH 3: Lô uống CTH với liều 3 g/kg Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 26 Lô C Hình 1. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan phóng đại 200X lô chứng sau 2 tháng Hình 2. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào thận phóng đại 200X lô chứng sau 2 tháng Lô CTH 0.9 Hình 3. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan phóng đại 200X lô CTH 0,9 g/kg sau 2 tháng Hình 4. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào thận phóng đại 200X lô CTH 0,9 g/kg sau 2 tháng Lô CTH 1.8 Hình 5. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan phóng đại 200X lô CTH 1,8 g/kg sau 2 tháng Hình 6. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào thận phóng đại 200X lô CTH 1,8 g/kg sau 2 tháng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 27 Lô CTH 3 Hình 7. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan phóng đại 200X lô CTH 3g/kg sau 2 tháng Hình 8. Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào thận phóng đại 200X lô CTH 3 g/kg sau 2 tháng C: Lô chứng (nước cất); CTH 0,9: Lô uống CTH với liều 0,9 g/kg; CTH 1,8: Lô uống CTH với liều 1,8 g/kg; CTH 3: Lô uống CTH với liều 3 g/kg. BÀN LUẬN Độc tính cấp Qua thử nghiệm độc tính cấp của bột thuốc cho thấy, kết quả liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù cho chuột uống là 30 g/kg chuột. Tương ứng với liều sử dụng trên người là 2,55 g/kg nếu người nặng 60 kg thì tương đương 153g bột thuốc CTH. Ở liều này thuốc rất đậm đặc vừa đủ để có thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Sau khi uống thuốc chuột vẫn bình thường, không thấy có biểu hiện ngộ độc ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ và suốt 2 tuần tiếp theo. Do đó chưa xác định được độc tính cấp và tính được LD50 của cao thuốc trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Tác giả tham khảo liều LD50 của một số dược liệu trong bài thuốc như: các nghiên cứu về độc tính cấp của Linh chi từ thân, sợi, hoặc hỗn hợp cả hai (tỉ lệ 220; 450). Bột Linh chi có trọng lượng khô so với ướt là 1:20. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng bột thân Linh chi được phân loại hầu như là không độc hại (LD50 >5 g/kg BW), và bột sợi được phân loại là tương đối vô hại (LD50 >15 g/kg BW) Diệp hạ châu đã được sử dụng trong thời gian dài mà không báo cáo tác dụng phụ lâm sàng. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chiết xuất Diệp hạ châu không gây độc tế bào trên các tế bào bình thường LD50 của tinh dầu nghệ trên chuột nhắt trắng là 9,2 ml/kg. Như vậy khi dùng riêng rẻ vẫn còn ghi nhận độc tính của dược liệu, và một số tương tác giữa curcumin, methionine, tryptophan với một số tân dược xảy ra khi người dùng với liều cao hơn rất nhiều lần so với điều trị. Kết quả nghiên cứu gợi ý sự kết hợp của các dược liệu sẽ làm giảm tác dụng phụ hoặc độc tính của các dược liệu thành phần. Độc tính bán trường diễn Sau 2 tháng uống viên nang CTH với 3 liều khác nhau 0,9 g/kg, 1,8 g/kg, 3 g/kg so với lô bình thường (nước cất), về trọng lượng liều 0,9 g/kg và 1,8 g/kg tốc độ phát triển bình thường, khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Còn với liều 3 g/kg uống sau 3 tuần chuột xuất hiện tiêu phân sệt, phân vàng không đóng khuôn xuất hiện ở cả lô đực và cái., nguyên nhân do ban đầu dùng thuốc liều cao chuột xuất hiện triệu chứng đi tiêu phân sệt, sau đó bệnh tự giới hạn, chuột tăng trọng bình thường trở lại. Điều này có thể được giải thích trong thành phần bột thuốc CTH có chứa 15% đậu xanh, đậu xanh có tính hàn theo y học cổ truyền đặc tính thanh nhiệt trừ thử, chỉ khát, lợi niệu, giải các loại độc. Chủ trị: Tả lỵ, phù thũng, ngộ độc các chất và thuốc, thử Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 28 nhiệt và khát nước Nên khi dùng với liều cao hơn bình thường có thể xuất hiện triệu chứng tiêu phân sệt, bệnh tự giới hạn do liều lượng đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp trong bài thuốc. Các xét nghiệm sinh hóa enzym gan AST, ALT, creatinin máu, glucose máu, công thức máu gồm số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, Hct, cholesterol máu, triglycerid, HDL, acid uric, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô bình thường sau 2 tháng sử dụng thuốc(5,6). Kết quả giải phẫu bệnh mô gan, thận của 4 lô ghi nhận mức độ tổn thương ở chuột từ nhẹ đến trung bình và nặng rải rác ở cả 3 lô thuốc liều 0,9 g/kg, 1,8 g/kg, 3g/kg cũng giống như lô chứng, kết quả tổn thương gan nặng lại rơi vào nhóm chứng còn 3 lô thuốc không ghi nhận. Kết hợp xét nghiệm sinh hóa chức năng gan, thận nằm trong giới hạn bình thường. Kết quả giải phẫu bệnh gửi tại khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Chợ Rẫy sử dụng bộ đánh giá mức độ tổn thương trên người quy ra mức độ tổn thương trên chuột nên phần nào việc đánh giá rất khó khăn. Trường hợp này nguyên nhân tổn thương ở gan, thận chuột không phải do nguyên nhân uống thuốc, vì nhóm chứng (nước cất) bị tổn thương nặng nhất. KẾT LUẬN Độc tính cấp đường uống của bột thuốc CTH trên chuột nhắt trắng: Xác định được Dmax đường uống của bột thuốc CTH là 30 g/kg chuột nhắt trắng (tương đương 2,55 g/kg người nếu người nặng 60 kg thì hàm lượng thuốc là 153 g bột thuốc). Độc tính bán trường diễn của bột thuốc CTH trên chuột nhắt trắng: Viên nang CTH không làm thay đổi các chỉ số sinh hóa: AST, ALT, creatinin máu, glucose máu, số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu, Hemoglobin, Hematocrit cholesterol, triglycerid, HDL, và acid uric máu sau khi được cho uống với 3 liều tương ứng 0,9 g/kg, 1,8 g/kg, 3 g/kg trong 2 tháng trên chuột nhắt trắng. Chỉ ghi nhận triệu chứng ở lô 3 g/kg đi tiêu phân sệt sau 3 tuần uống thuốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn dược liệu (2008). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh, pp.2-5. 2. Châu Ngọc Hoa (2012). Bệnh học nội khoa. Nhà xuất bản Y học, pp. 181- 188. 3. Dixit N, Baboota S, Kohli K, Ahmad S, Ali J (2007). “Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhanceenzymt approaches”. Indian J Pharmacol, 39(4):172 -179. 4. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học, pp.50 -57. 5. Đỗ Đình Hồ (2004). Sổ tay xét nghiệm hóa sinh lâm sàng. Nhà xuất bản Y học, pp.27-45. 6. Nguyễn Thế Khanh và Phạm Tử Dương (2005). Xét nghiệm sử dụng trong lâm sàng. Nhà xuất bản Y học, pp.681. 7. Tunon MJ, Culebras JM, Gallego JG (2009). “An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure”. World J Gastroenterol, 15(25):3086 -3098. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019