Luận văn Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƯỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh -Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu Phản biện 1:…………………………………… Phản biện 2:……………………………………. Luận văn sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Ngày…….tháng………năm 2009 Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------ VŨ THỊ BƢỞI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA VIRUS Y TRÊN KHOAI TÂY TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu, Phó Giám đốc Đại học Thái Nguyên, đã rất tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (trƣờng Đại học Khoa học), các thầy cô giáo, cán bộ khoa sau đại học và khoa Sinh (trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên) đã hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Chu Hoàng Hà, chị Phạm Thị Vân, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Công nghệ Sinh học và các cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-Trƣờng Đại học Sƣ phạm; phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin dành cho những ngƣời thân yêu trong gia đình và bạn bè những lời biết ơn sâu sắc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 9, năm 2009 Tác giả Vũ Thị Bƣởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amine DNA DeoxyribonucleicvAcid RNA Ribonuleic Acid bp Basepair cDNA Complementary DNA CP Coat protein cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonate NXB Nhà xuất bản IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase Kb Kilobase LB Luria and Bertani RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction PVY Potato virus Y PVY N Potato virus Y strain N PVY C Potato virus Y strain C PVY O Potato virus Y strain O PVY NTN Potato virus Y strain (variant) NTN RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên v DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) .............................................................................. Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm ......................... Hình 1.3. Hình dạng của PVY ............................................................. Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVYO, PVYN và các biến thể PVYNTN, PVYNW ........................................................................... Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) ..................... Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm) ............................................................................... Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần 2 với PVY trên cánh đồng khoai tây .... Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) .... Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genome khoai tây ................. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ................................................... Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu ........... Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh .......................................................................................... Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% ....... Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên ...... Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình ........ Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP .......................... Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ........................................................................................... Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP- PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen ...................................................................................... 13 16 16 17 19 21 22 23 24 29 39 41 43 45 46 46 49 50 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 ............................... Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 ............................... Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 ............................... Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây ..................... Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu .............. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .............................................. Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ....................................... Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ........ Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự ........................... Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự .................... Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu ....................................................................................... Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP .................................. Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR ............................ Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc sử dụng để đƣa ra so sánh ............................................................................................. Bảng 3.5. Hệ số giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu với các mẫu trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................ 8 8 9 10 28 32 32 33 35 36 39 40 45 51 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................... Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 1.1. Cây khoai tây .................................................................................. 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây ............................... 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây ................................. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam ............. 1.2. Virus gây bệnh trên khoai tây.......................................................... 1.2.1. Các loại virus khoai tây ................................................................ 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây .............................. 1.3. Virus Y ở khoai tây ......................................................................... 1.3.1. Phân loại ...................................................................................... 1.3.2. Cây chủ ........................................................................................ 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử ...................................................... 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác ...................................... 1.3.5. Lan truyền của PVY ..................................................................... 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây ..................................... 1.4. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới và ở Việt Nam .................. 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới ....................................... 1.4.2. Tình hình nghiên cứu PVY ở Việt Nam ....................................... 1 3 3 3 5 5 6 7 9 14 14 14 16 17 18 20 24 24 27 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ........................................... 2.2.1. Hóa chất ....................................................................................... 2.2.2. Thiết bị......................................................................................... 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .................................................................... 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê .................................................................. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số ........................................... 28 28 28 28 28 29 29 29 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................. 31 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ......................................... 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng ................................. 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ........ 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ............... 2.3.8. Tách chiết plasmid ....................................................................... 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide .................................... 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc .................................... Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm PVY ................................................... 3.2. Kết quả nhân gen, tách dòng cDNA ................................................ 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR ..................................... 3.2.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR.................................................. 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. ...... 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR................. 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu ...... 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen CP-PVY phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu với một số trình tự trong ngân hàng gen .......................................... 3.3.1. So sánh trình tự nucleotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 3.3.2. So sánh trình tự nucleotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen ................................................................................................ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................... TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 33 33 34 34 34 35 36 38 38 40 40 42 43 44 46 47 47 50 55 56 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một cây lƣơng thực chủ lực đứng đầu trong các loại cây lấy củ trên thế giới và đứng thứ 5 trong số các cây lƣơng thực nói chung (chỉ sau lúa mì, gạo, ngô, đậu tƣơng). Củ khoai tây có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn đặc sắc, ngon miệng và có lợi cho sức khoẻ con ngƣời. Củ khoai tây còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp, chế biến thức ăn cho gia súc. Ngoài ra, khoai tây còn là một dƣợc phẩm dùng để chữa trị nhiều bệnh nhƣ khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, say nắng…Với những lợi ích to lớn đó, khoai tây đã đƣợc trồng ở hơn 130 quốc gia và là một nguồn thu lớn cho hàng triệu nông dân [5]. Ở khoai tây, bệnh virus đã trở thành một hiểm họa. Ngƣời ta thấy có ít nhất 38 loại virus trên khoai tây đã đƣợc phát hiện và mô tả, phổ biến là: PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus), PVX (potato virus X), PVA (potato virus A), PVS (potato virus S)…Trong đó, PVY gần đây đƣợc xem là virus gây bệnh nghiêm trọng nhất (Kerlan, 2008) [40]. Chúng làm giảm kích thƣớc, số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng củ khoai tây, gây thiệt hại kinh tế tới 80% thậm chí còn hơn (Kerlan và cs, 2008) [41]. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus trên khoai tây ở nƣớc ta còn rất hạn chế so với các nƣớc Bắc Mĩ và Châu Âu. Do đó, việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ bệnh thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh virus gây ra là hết sức cần thiết. Hơn nữa, những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PVY chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đƣợc bệnh này, lại tốn nhiều thời gian và công sức. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Gần đây, với việc áp dụng những kĩ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus đã thu đƣợc kết quả đáng khích lệ nhƣ cây khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. Tạo cây khoai tây chuyển gen kháng virus đƣợc coi là một biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra. Nhƣng vấn đề đặt ra là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tƣơng đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen đƣợc sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Vì vậy khảo sát tính đa dạng di truyền của gen mã hoá cho protein vỏ virus (coat protein- CP) có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Xuất phát từ những lí do trên, tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu tính đa dạng của virus Y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định sự đa dạng trong cấu trúc gen mã hoá protein vỏ (CP- coat protein) của PVY phân lập từ các mẫu lá khoai tây thu tại một số địa phƣơng thuộc tỉnh Thái Nguyên. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1. Khảo sát, thống kê và xác định tỉ lệ nhiễm PVY trên khoai tây ở Thái Bình, Thái Nguyên, Hƣng Yên, Bắc Giang làm cơ sở cho việc thu mẫu và xác định sự có mặt của virus PVY. 3.2. Tách chiết RNA của virus từ các mẫu khoai tây thu thập đƣợc. 3.3. Nhân gen CP, tách dòng và đọc trình tự gen CP của PVY trong các mẫu khoai tây. 3.4. So sánh trình gen CP của PVY phân lập đƣợc với một số trình tự đã công bố trong ngân hàng gen NCBI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY KHOAI TÂY 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị của khoai tây Cây khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc họ cà (Solanaceae). Khoai tây có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru. Vào thế kỉ XVI, ngƣời Tây Ban Nha xâm chiếm Peru và họ đã đem cây khoai tây về nƣớc trồng. Đến cuối thế kỉ XVI, khoai tây đã đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nƣớc Châu Âu (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây đƣợc du nhập vào nƣớc ta là do một ngƣời Pháp là giám đốc vƣờn bách thảo Hà Nội đem vào trồng thử, và nó nhanh chóng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng. Do ngƣời Pháp là ngƣời đem cây về nƣớc ta và phổ biến cách trồng nên nhân dân ta gọi cây này là “khoai tây” (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12], (Macdec, 1963) [45]. Khoai tây vừa là cây lƣơng thực vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao. Củ khoai tây chứa trung bình 19% hydratcacbon (trong đó 15% tinh bột; 2,2% chất xơ); 0,1% chất béo; 2-3% protein và 79% là nƣớc. Ngoài ra, trong khoai tây còn chứa nhiều loại vitamin và chất khoáng. Ngƣời ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nƣớng cả vỏ cung cấp 844mg kali; 28% khẩu phần sắt hàng ngày; 43% khẩu phần vitamin C; 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác nhƣ niacin, thiamin, folat…. (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Còn theo Bill và Dean (1992), sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein; 3% nhu cầu năng lƣợng; 10% nhu cầu sắt; 19% nhu cầu vitamin B1; 20-50% nhu cầu vitamin C của ngƣời trong một ngày (Bill và cs, 1992) [18]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Khoai tây đƣợc chế biến thành hàng trăm món ăn ngon phục vụ nhu cầu ẩm thực của con ngƣời. Không chỉ vậy, khoai tây còn đƣợc coi là công cụ làm đẹp hiệu quả và dễ sử dụng nhất. Ngoài ra, củ khoai tây cũng còn là nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp, chế biến thức ăn trong chăn nuôi. Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, khoai tây đã đƣợc chế biến thành nhiều sản phẩm thơm ngon, có giá trị dinh dƣỡng cao. Khoai tây cũng đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất cồn, cao su nhân tạo (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1]. Đặc biệt, khoai tây cũng là một dƣợc phẩm. Củ khoai tây có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ khí, kiện tỳ, tiêu viêm. Nó dùng để chữa chứng khó tiêu, đau bụng, viêm loét dạ dày, viêm tuyến nƣớc bọt, say nắng, sốt, bỏng nhẹ, eczema, vết thƣơng…Hoa khoai tây chữa bệnh tăng huyết áp và là nguyên liệu chiết rutin để chữa bệnh. Quả và mầm củ khoai tây ít đƣợc dùng làm thuốc vì dễ gây độc. Trong công nghiệp dƣợc phẩm, chúng đƣợc chiết lấy solanin để làm thuốc giảm đau, chữa đau bụng, đau nhức xƣơng khớp, chữa dị ứng, chống hen, viêm phế quản, động kinh (Hƣơng Tú, 2008) [11]. Trong củ khoai tây có nhiều chất chống oxi hoá, nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hoá, hạn chế sự phát triển của ung thƣ và một số bệnh khác. Các nhà nghiên cứu tại trƣờng Đại học Y Harvard-Mỹ đã phát hiện ra rằng: những ngƣời thƣờng xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thƣ tuyến tiền liệt (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy củ khoai tây rất giàu sterol, giúp tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. Có nghiên cứu cho thấy, khoai tây có tác dụng làm chậm sự tấn công của HIV/ AIDS. Theo dõi trên một nhóm bệnh nhân HIV thấy những ngƣời ăn khoai tây có khả năng sống thêm đƣợc ít nhất 2 năm nữa so với những bệnh nhân không ăn (Vũ Hƣớng Văn, 2007) [12]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học của cây khoai tây Cây khoai tây thuộc loại thân thảo, bao gồm các bộ phận thân, lá, rễ, hoa, quả, hạt. Thân và lá khoai tây có nhiều lông, lá kép lông chim không đối xứng. Hoa cân đối, cánh hoa có gốc dính liền nhau. Nhị đực kết dính thành ống hoặc chóp cụt, nhị cái ở trên và dễ rụng. Cây khoai tây chủ yếu là tự thụ, một số trƣờng hợp giao phấn. Cánh hoa có các màu: trắng, tím- đỏ, tím xanh, xanh thẫm. Quả có hai ô, hạt rất nhỏ có mầm uốn cong. Khoai tây thƣờng đƣợc nhân giống bằng củ. Củ là phần phình to của phần thân cây nằm dƣới đất chứa nhiều chất dinh dƣỡng (Hồ Hữu An và cs, 2005) [1], (Đƣờng Hồng Dật, 2005) [3], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. Ở nƣớc ta, khoai tây địa phƣơng trồng phổ biến ở phía Bắc là giống Thƣờng Tín, và phía Nam là giống Đà Lạt. Các giống nhập nội của Trung Quốc, Đức, Pháp, Hà Lan…hiện đang đƣợc trồng ở nhiều nơi (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2]. Ở đồng bằng sông Hồng, khoai tây chủ yếu trồng ở vụ đông vào tháng 10, 11, thu hoạch tháng 1, 2 năm sau. Ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Đà Lạt trồng muộn hơn một chút khoảng tháng 1, 2 để tránh sƣơng giá vào tháng 11, 12 (Nguyễn Mạnh Chinh, 2005) [2]. 1.1.3. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam Khoai tây đƣợc trồng phổ biến ở 130 nƣớc trên thế giới. Do điều kiện sinh thái, mức độ thâm canh và trình độ sản xuất khác nhau nên năng suất khoai tây chênh lệch rất lớn, từ 7 tấn/ha đến 65 tấn/ha. Tính đến năn 2005, trên thế giới trồng đƣợc 18,57 triệu ha khoai tây, sản lƣợng đạt 320,15 triệu tấn (bằng 60-70% tổng sản lƣợng lúa hay mì). Diện tích khoai tây của thế giới trong những năm gần đây có xu hƣớng giảm nhẹ. Năm 2005, diện tích khoai tây giảm 0,37 triệu ha so với năm 2003; giảm 1,37% triệu ha so với năm 2000. Tuy vậy, năng suất khoai tây trung bình lại có xu hƣớng tăng. Năm 2005, năng suất khoai tây tăng 0,79 tấn/ha so với năm 2000 và tăng 1,32 tấn/ha so với năm 2001 (FAO, 2005) [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Trong những năm gần đây, ở nƣớc ta diện tích trồng khoai tây ngày một tăng, nhƣng tốc độ tăng không cao. Năng suất khoai tây của nƣớc ta chỉ bằng 61,3% năng suất bình quân chung của thế giới, bằng 62,9% năng suất khoai tây của Châu Âu (FAO, 2005) [30]. Nhƣ vậy, khoai tây ở nƣớc ta đã và đang phát triển nhƣng tốc độ mở rộng diện tích và tăng năng suất hằng năm không cao, không ổn đinh. Có thể đƣa ra 2 nguyên nhân quan trọng dẫn đến hiện tƣợng này là: + Thiếu giống có chất lƣợng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu. + Chƣa có biện pháp phòng trừ bệnh đặc biệt là bệnh virus có hiệu quả (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. 1.2. VIRUS GÂY BỆNH Ở KHOAI TÂY Hiện tƣợng thoái hoá khoai tây, do virus gây ra, đã đƣợc mô tả và phát hiện ngay từ thế kỉ XVIII, nhƣng tác nhân gây ra nó phải đến tận thế kỉ XX mới đƣợc xác định. Virus cuốn lá (potato leafroll virus viết tắt là PLRV) là virus đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1916 bởi Quanfer, Vanderlek và O. Botfes. Những virus chủ yếu gây khảm trên khoai tây (potato virus M, potato virus X, potato virus Y, potato virus A) đƣợc xác định trong những năm 1920 và 1930. Những virus quan trọng khác chỉ đƣợc phám phá trong những năm 1950 (tobacco rattle virus, potato virus S) hoặc giữa những năm 1960 (potato mop-top virus) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6], (Kerlan, 2008) [40]. Trong 4 thập kỉ gần đây, ngƣời ta đã phát hiện thấy số lƣợng virus ngày càng gia tăng ở châu Mỹ La Tinh, đặc biệt là trong châu thổ Andean, nơi đƣợc xem là khởi nguồn của khoai tây. Nhiều virus phổ biến ở các cây chủ khác, đôi khi lại nhiễm vào khoai tây. Một số chúng, ví dụ nhƣ virus đốm héo cà chua (tomato spotted wilt virus), gây bệnh cho khoai tây và có thể trở nên nghiêm trọng trong tƣơng lai. Nhiều tác giả cũng lƣu ý rằng, một virus truyền qua con đƣờng tiếp xúc, nhƣ pepino mosaic virus, cho đến nay vẫn chƣa đƣợc phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 hiện trên khoai tây, cũng có khả năng nhiễm vào nhiều cây khoai tây quan trọng và trở thành một hiểm họa trong tƣơng lai. Những ngƣời trồng khoai tây ở nhiều quốc gia đã thừa nhận rằng khoai tây giống ảnh hƣởng lớn tới hiệu quả sản xuất. Chƣơng trình sản xuất khoai tây giống phát triển trong những năm 1940 và 1950. Khoai tây giống đƣợc chứng nhận với mức độ nhiễm virus thấp bây giờ đã trở thành nhân tố chính trong cuộc chiến chống virus. Nhân giống kháng mạnh với virus cuộn lá (potato leafroll virus) đƣợc sử dụng ít nhất là từ những năm 1925 và khả năng kháng virus của nhiều cây dại họ cà đã đƣợc khai thác. Ba kiểu kháng đƣợc mô tả từ những năm 1950 và thông tin di truyền về yếu tố quy định khả năng kháng đƣợc xác định từ những năm 1970. Hiện nay, nhiều gen chống chịu đã đƣợc xác định vị trí trên genome khoai tây, tạo điều kiện cho công tác nhân giống kháng virus dựa trên các chỉ thị phân tử. Hàng loạt những biện pháp mạnh đã đƣợc xác lập để tránh sự xâm nhập của các virus kiểm dịch (Kerlan, 2008) [40]. Sử dụng vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh để tạo cây chuyển gen kháng virus đƣợc xem là biện pháp hữu hiệu và đã thu đƣợc kết quả khá khả quan. 1.2.1. Các loại virus khoai tây Ở khoai tây có ít nhất 38 virus đã đƣợc mô tả (Kerlan, 2008) [40]. Dựa trên mức độ thiệt hại và phạm vi phân bố, virus khoai tây đƣợc phân chia thành 3 nhóm: + Nhóm 1: Gồm những virus gây thiệt hại đáng kể, phân bố tƣơng đối rộng trên thế giới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Bảng 1.1. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 1 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Potato virus Y (PVY) Potyvirus 1931 Rất cao Rộng khắp Potato leafroll virus (PLRV) Polerovirus 1916 Rất cao Rộng khắp Potato virus X (PVX) Potexvirus 1931 Cao Rộng khắp Potato virus A (PVA) Potyvirus 1932 Vừa phải Rộng khắp Potato virus S (PVS) Carlavirus 1952 Vừa phải Rộng khắp Potato virus M (PVM) Carlavirus 1923 Vừa phải Rộng khắp Tobacco rattle Tobravirus 1946 Cao Rộng khắp Potato mop-top virus (PMTV) Pomovirus 1966 Khá cao Chủ yếu ở khí hậu lạnh + Nhóm 2: Gồm những virus chỉ xuất hiện ở Châu Mỹ La Tinh, ít hay không gây thiệt hại về kinh tế. Bảng 1.2. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 2 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Andean potato latent virus (APLV) Tymovirus 1966 Rất thấp Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru Andean potato mottle virus (APMoV) Comovirus 1977 Chƣa biết Chili, Ecuador, Peru, Brazil Arracacha virus B- oca strain (AVB-O) Nepovirus 1981 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato deforming mosaic virus (PDMV) Begomovirus 1985 Cao ở một cây Bắc Brazil Potato rough dwart virus (PRDV) Carlavirus 1995 Rất thấp Argentina, Uruguay Potato virus T (PVT) Trichovirus 1977 Chƣa biết Bolivia, Peru Potato virus U (PVU) Nepovirus 1983 Không có Peru Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 + Nhóm 3: Gồm những virus xuất hiện ở những vùng khác nhau trên thế giới, mức độ thiệt hại không đáng kể hay chỉ cục bộ. Bảng 1.3. Một số virus khoai tây thuộc nhóm 3 Loài Chi Năm đầu tiên đƣợc nói đến Thiệt hại về kinh tế Phân bố Alfalfa mosaic virus (AMV) Alfamovirus 1940 Chỉ cục bộ Hiếm thấy Eggplant mottled Dwarf virus (EMDV) Nucleorhabdovirus 1987 Rất thấp Iran Potato aucuba Mosaic Virus (PAMV) Potexvirus 1961 Thấp Hiếm thấy Potato latent virus (PotLV) Carlavirus 1996 Chƣa biết Bắc Mỹ Potato virus V (PVV) Potyvirus 1986 Thấp Bolivia, Peru, Bắc châu Âu 1.2.2. Đặc điểm chính của bệnh virus trên khoai tây 1.2.2.1. Triệu chứng và thiệt hại Virus gây ra các triệu chứng chủ yếu là: khảm, đốm hay sự đổi màu, bộ lá bị quăn cuộn hay méo mó, sự rụng lá, còi cọc hay biến dạng của cây (Vũ Triệu Mân, 2007) [7]. Các kiểu chết hoại khác nhau có thể xuất hiện trên lá, thân và củ có thể ở cả trong và ngoài. Kích thƣớc, số lƣợng, diện mạo và chất lƣợng của củ có thể bị ảnh hƣởng (Kerlan, 2008) [40]. Theo Vũ Triệu Mân, ở Việt Nam, các bệnh virus ảnh hƣởng lớn tới năng suất củ khoai tây. Trọng lƣợng củ trên khóm giảm, tỉ lệ củ lớn thấp hoặc không có, tỉ lệ củ nhỏ tăng cao. Nhiều củ không sử dụng để làm lƣơng thực hay thực phẩm đƣợc mà phải dùng làm thức ăn gia súc hay loại bỏ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Thiệt hại do bệnh virus khoai tây gây ra đƣợc chú ý nhiều hơn ở ngoài cánh đồng, nhƣng thực ra ngay ở trong kho bảo quản bệnh cũng gây ra thiệt hại. Một số điều tra cho thấy, củ khoai tây thuộc giống Ackersegen bị nhiễm virus Y, X, S, M và virus cuốn lá (PLRV) khi đƣa vào bảo quản đều tăng lƣợng củ thối và giảm khả năng nảy mầm (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Bảng 1.4. Ảnh hƣởng của bệnh virus đến củ khoai tây (tính bình quân 20 khóm mỗi loại hình bệnh). (Theo Vũ Triệu Mân, 1973 -1977) Chỉ tiêu theo dõi Loại hình khóm bệnh Khóm khoẻ Xoăn lùn Cuốn lá Khảm lá Trọng lƣợng củ (g/khóm) 30,0 225,0 240,0 295,0 Tỉ lệ % củ lớn (%) 0,0 9,2 7,7 10,4 Tỉ lệ % củ trung bình(%) 38,0 42,4 56,3 55,8 Tỉ lệ củ nhỏ(%) 62,0 48,4 36,0 30,8 Tác hại của bệnh virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: điều kiện sống (khí hậu, thổ nhƣỡng, biện pháp chăm sóc), cây trồng có khả năng chống chịu khác nhau và loại, chủng virus gây bệnh. Có những vùng ở Tây Âu, virus cuốn lá làm giảm tới 90% sản lƣợng dự thu khi bệnh nặng. Trong khi đó, thiệt hại ở Đông Âu phần lớn lại do virus Y gây ra. Ở Việt Nam, virus cuốn lá gây hại nhẹ, nhƣng virus Y lại gây hại nặng. Nhìn chung, nơi có khí hậu ẩm và lạnh năng suất khoai tây giảm ít hơn so với nơi có khí hậu nóng và khô khi bị bệnh virus. Giống khoai tây kháng virus gồm nhiều loại: kháng cao, kháng trung bình, chịu bệnh. Virus có thể có trong giống chịu bệnh nhƣng cây không có triệu chứng, mặc dù chúng có thể là nguồn lây nhiễm cho những cây khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Ngƣời ta thấy cả khi ngoại cảnh rất phù hợp cho bệnh phát triển, nhƣng năng suất và phẩm chất củ bị ảnh hƣởng rất ít. Nhiều tác giả nhận thấy các cây ở các dòng lai có thể chống virus Y, X, S, M và virus cuốn lá Ở cây khoai tây có một hiện tƣợng đáng chú ý là sự xâm nhiễm hỗn hợp của nhiều virus trên một cây bệnh. Trong trƣờng hợp này, cây bệnh thƣờng có hiện tƣợng thoái hoá rất nặng và thiệt hại về năng suất rất nghiêm trọng (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Sự nhiễm virus và một số bệnh hại khác ở khoai tây có mối quan hệ với nhau và cần xem sự nhiễm virus nhƣ một chỉ tiêu đánh giá sự nhiễm bệnh nấm của cây khoai tây. Bệnh thối trong kho do nấm Fusarium sẽ tăng lên gấp 5 lần khi củ khoai tây bị nhiễm virus X và tăng gấp 6 lần khi củ khoai tây bị nhiễm nhiều virus cùng lúc (X, S, M) (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. 1.2.2.2. Lan truyền của virus khoai tây Các virus khoai tây đƣợc truyền có hiệu quả bởi rệp. Rệp có thể định cƣ ở khoai tây hay di cƣ từ cây trồng, cỏ dại khác. Potato leafroll virus (PLVR) và potato virus Y (PVY) là những virus điển hình cho việc nghiên cứu cơ chế của sự truyền virus qua rệp theo cách bền vững và không bền vững (persistent and nonpersistent) (Vũ Triệu Mân, 2007) [8]. Nhiều virus ít gây thiệt hại đƣợc truyền qua các côn trùng khác, đáng chú ý là rầy xanh đuôi đen, bộ trĩ, ruồi trắng. Potato virus X (PVX) và một số chủng của potato virus S (PVS) đƣợc truyền bởi sự tiếp xúc giữa bộ lá, các mầm, giữa các củ khi cắt và cũng thông qua các dụng cụ nông nghiệp. Một số virus sinh sản trong đất trồng đƣợc truyền bởi giun tròn (tabacco rattle virus) hoặc nấm (potato mop-top virus, tobacco nerosis virus). Nhiều loài virus Andean có thể truyền bởi hạt (true potato seeds) và phấn hoa. Trong hầu hết các trƣờng hợp thì nguồn lây nhiễm là bản thân cây khoai tây (Kerlan, 2008) [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 1.2.2.3. Phƣơng pháp phòng chống bệnh virus khoai tây * Quản lí khoai tây giống Mục đích của công việc này là phân loại chất lƣợng về phạm trù thƣơng mại của khoai tây giống. Tiêu chuẩn này phụ thuộc vào từng nƣớc, tuy nhiên mức độ nhiễm không nên quá 10% với tất cả các virus (Kerlan, 2008) [40]. Quá trình sản xuất khoai tây giống đảm bảo chất lƣợng gồm các bƣớc chính sau: + Nhân giống trong điều kiện mức độ nhiễm virus rất thấp. Ví dụ nhƣ trong ống nghiệm, hay trong nhà kính, ống nhựa ngăn chặn đƣợc vector hay trong những cánh đồng cô lập ở vùng mà khả năng nhiễm virus thấp. + Kiểm tra cánh đồng bao gồm: - Tỉa cây bị bệnh - Diệt tất cả các nguồn lây nhiễm - Có biện pháp xử lí chống lại các vector (sinh vật trung gian truyền bệnh), đặc biệt là các côn trùng + Sử dụng kĩ thuật trồng đặc biệt tính đến ngăn chặn các vector nhƣ tỉa cành khoai tây, trồng cây hàng rào. + Quản lí vụ thu hoạch: Kiểm tra ở phòng thí nghiệm trên diện rộng, thông thƣờng sử dụng ELISA, đôi khi là các kĩ thuật phân tử. * Nhân giống kháng virus Có 3 kiểu kháng virus là: Resistance to infection hay field resistance; hypersensitivity resistance (HR); extrem resistance (ER). Resistance to infection đƣợc di truyền đa gen, đƣợc xác định bởi số củ con cháu bị nhiễm. Nó bao gồm cả sự kháng với virus lẫn với tác nhân truyền bệnh. Mức độ kháng phụ thuộc mạnh vào điều kiện môi trƣờng, thời gian nhiễm, chất tiêm nhiễm và vector. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 HRvà ER đƣợc quy định bởi các gen trội đơn lần lƣợt N và R. ER là một dạng tăng cƣờng của HR (ER is an enhanced form of HR), kết quả là triệu chứng không rõ ràng và không có sự nhiễm vào cơ thể. Ngƣợc lại, HR gây ra những tổn thƣơng chết hoại cục bộ trên các lá đƣợc tiêm và trong hầu hết các trƣờng hợp sự chết hoại này mở rộng tới lá thấp hay cao hơn, tới thân và củ. Mặc dù virus phân bố không đều nhƣng có thể đƣợc phát hiện trong tất cả các cơ quan. Hình 1.1. Các gen kháng (màu xanh) với 4 virus chủ yếu (PVY, PLRV, PVX, PVA) ở khoai tây. (Theo: S. Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp) Các chƣơng trình nhân giống khoai tây resistance to infection của các virus chính đã đƣợc tiến hành từ lâu ở nhiều nƣớc trồng khoai tây. ER cũng đƣợc khai thác cao, đặc biệt là ở các nƣớc mà quy định về khoai tây giống đảm bảo chất lƣợng không đƣợc quản lí thoả đáng. Khả năng bảo vệ chống lại một số virus chính (PVX, PVY, PVA, PVM) quy định bởi gen R đã đƣợc tìm thấy trong một số loài họ cà dại nhƣ: S. stolonniferum, S. andigena, S. chacoense, S. acaule. Những loài này đƣợc sử dụng trong các chƣơng trình nhân giống ngay từ giữa những năm 1940. Gen N có mặt trong nhóm khoai tây cổ bởi vậy nó sát nhập dễ dàng vào cây khoai tây mới. Ngoài ra, khoai tây dễ biến đổi bởi các kĩ thuật di truyền. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Bên cạnh đó, sự kháng bắt nguồn từ mầm bệnh chống lại một số virus chính (PVY, PVX, PMTV) đã đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ (Kerlan, 2008) [40]. * Biện pháp kiểm dịch Các biện pháp kiểm dịch nhằm ngăn chặn nguy cơ xâm nhập của các virus lạ từ một quốc gia hay một lục địa khác. Cho đến bây giờ, chƣa có một loại virus hay chủng nào trong danh sách kiểm dịch truyền ra ngoài vùng khởi đầu của nó. Các kĩ thuật cần thiết cho việc kiểm tra các vật liệu xuất nhập khẩu (củ, cành, hạt, phấn hoa, cây non trong ống nghiệm) đã đƣợc thiết lập. Các virus đƣợc chuẩn đoán bởi các thí nghiệm sinh học trên cây chỉ thị đƣợc chọn lựa, phần lớn kiểm tra bởi ELISA. Các kĩ thuật sinh học phân tử và kính kiển vi điện tử cũng có thể đƣợc sử dụng (Kerlan, 2008) [40]. 1.3. POTATO VIRUS Y 1.3.1. Phân loại Potato virus Y (PVY) thuộc chi potyvirus và họ potyviridae. Đây đƣợc xem là một họ lớn nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế nhất của virus thực vật (Dimitre và cs, 2004) [28], (Tetsuji Ogawa và cs, 2008) [66]. 1.3.2. Cây chủ Phạm vi cây chủ tự nhiên của PVY gồm những cây thuộc 9 họ. Có thể kể đến các cây sau: Khoai tây (S. tuberosum ssp.tuberosum); một vài loài khoai tây địa phƣơng ở Andes nhƣ A. andigena; nhiều cây dại họ cà; hồ tiêu (Capsicum spp.); thuốc lá (Nicotiana spp.); cà chua (Lycopersicon spp.); cà tím (S. melongena); các cây cảnh (Petunia spp., Dahlia spp.); các cây lâu năm (Physalis virginiana, P. heterophyla); một số cây hàng năm hoặc cây tự nhân giống lâu năm. Nhiều cây ở những vùng riêng biệt cũng là cây chủ của PVY nhƣ Cotula australis ở New Zealand hoặc Sorbaria tomentosa ở Himalaya. Cỏ dại thuộc họ cà thƣờng là nguồn lây nhiễm PVY cho cà chua, hồ tiêu. Chúng gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 + S. nigrum và S. dulcamara ở nhiều quốc gia + S. chacoense và P. viscosa ở nam Mỹ + S. Florida, P. gracile, S. aculeatissimum, P. angulata, P. ciliosa và P. floridana ở Floria + P. virginiana và P. heterophyla là những cây chủ qua đông ở bắc Mỹ, S. dulcamara ở phía tây châu Âu hoặc Datura spp. ở các nƣớc địa trung hải là nguồn lây nhiễm PVY cho khoai tây trồng cũng nhƣ khoai tây mọc tự nhiên. Với thuốc lá ở USA, Canada, Italy, những cây cà chua, hồ tiêu, khoai tây nhiễm virus đƣợc xem là nguồn lây nhiễm (Kerlan và cs, 2008) [41]. Khoảng 495 loài cây chủ thuộc 72 chi, 31 họ đƣợc sử dụng để làm các thí nghiệm. Chúng gồm 287 loài thuộc họ Solanaceae; 28 loài thuộc họ Amaranthaceae; 25 loài thuộc họ Fabaceae ; 20 loài thuộc họ Chenopodiaceae và 11 loài thuộc họ Asteraceae. Phần lớn những cây này là những cây chủ tổn thƣơng cục bộ. Từ những năm 1980-1990, Datura stramonium đƣợc chứng minh là miễn dịch hoàn toàn với tất cả các chủng. Một số PVY có thể nhiễm vào cây mô hình Arabidopsis thaliana (Kerlan và cs, 2008) [41]. N. tabacum , N. benthamiana, N. occidentalis nhạy cảm với tất cả các chủng PVY và có thể sử dụng nhƣ các loài chuẩn đoán. Các cây non N. tabacum thƣờng đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm truyền virus qua rệp. Đây cũng là cây chủ thích hợp cho nhân virus. Lƣợng virus thu đƣợc dao động từ 10 đến 25mg (có khi lên tới 40mg) trên 1kg lá thuốc lá . Ngoài ra, lá của cây này là vật liệu nhiễm virus tốt nhất cho việc tích trữ (Kerlan và cs, 2008) [41]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Hình 1.2. Những đốm (mottle) điển hình trên cây thuốc lá N. tabacum cv Xanthi gây ra bởi PVY khoai tây sau 15 ngày tiêm. (Theo: C. Lacroix, IVRA, Pháp) 1.3.3. Hình dạng và cấu trúc phân tử Virion PVY không có vỏ bao, dạng sợi nhỏ, cong queo, dài 730-740nm, đƣờng kính 11-12nm. Nó có một ống trục với đƣờng kính 2-3 nm, và cơ thể đối xứng xoắn ốc. Quá trình lắp ráp các bộ phận và phá vỡ hạt PVY đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ. Hình 1.3. Hình dạng của PVY Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Virion chứa khoảng 6% axit nucleic. Genome của PVY là phân tử RNA dạng thẳng, sợi đơn, chiều dƣơng, có poly A ở đầu 3‟ và liên kết với protein (VPg) ở đầu 5‟ nhƣng không có lipid cũng nhƣ các thành phần khác. RNA của PVY khối lƣợng khoảng 3,1-3,2kDa, dài chừng 9,7kb, trừ đuôi poly A. Trình tự về toàn bộ hệ gen của PVY ở khoai tây, thuốc lá, hồ tiêu, cà chua, cà đen đã đƣợc công bố (Kerlan và cs, 2008) [41]. Cũng nhƣ các potyvirus khác, bộ khung đọc mở của nó quy định một polypeptit lớn, khoảng 3061-3063 aa. Polypeptit lớn này đƣợc cắt thành 10 protein chức năng: P1 (284aa); HC-Pro (456aa); P3 (365aa); 6K1(52aa); CI (634aa); 6K2 (52aa); VPg (188aa); NiaPro (244aa); Nib (521aa); CP (267aa). Có 2 vùng ngoại biên không dịch mã: 5‟ NTR (184aa); 3‟ NTR (326-333aa). Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hệ gen của các chủng PVY0, PVYN và các biến thể PVYNTN , PVYNW (Đƣợc mô phỏng lại của Glais L,Tribodet M và Kerlan C (2002)) 1.3.4. Quan hệ họ hàng với các potyvirus khác PVY có quan hệ xa về huyết thanh với potato virus A (PVA), potato virus V (PVV) và 17 virus khác thuộc chi potyvirus. PVY, pepper mottle virus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 (PepMoV), PVV, pepper yellow mosaic virus, pepper severe mosaic virus, wild potato mosaic virus và Peru tomato virus tạo thành một nhánh cây phát sinh phân biệt với các potyvirus khác kể cả PVA (Kerlan và cs, 2008) [41]. 1.3.5. Lan truyền của PVY Trong tự nhiên, PVY đƣợc truyền bởi rệp và các cơ quan sinh sản sinh dƣỡng của cây nhƣ củ hay cành. Với các cây thuốc lá và cà chua đƣợc trồng ở Bắc Mỹ, PVY đƣợc truyền thông qua sự tiếp xúc giữa cây với cây. Chúng cũng đƣợc truyền bởi sự tiếp xúc giữa các mầm củ khoai tây trong quá trình cất giữ. Ngoài ra, phƣơng thức truyền bởi hạt cũng đƣợc thông báo ở S. nigrum và Nicandra physaloides. Sự lan truyền bởi phấn hoa chƣa từng đƣợc xác định ở bất cứ cây chủ nào. Không giống với các potyvirus khác, PVY có phạm vi rệp truyền bệnh rất lớn. 70 loài rệp thuộc họ Aphidinae đều có thể truyền PVY. Trong đó, Mysus persicae là loại rệp có hiệu quả truyền PVY lớn nhất. Ở khoai tây, loài này cùng những loài định cƣ ở khoai tây trong thời gian dài trên cánh đồng là tác nhân truyền virus chủ yếu. Tuy vậy, những loài di cƣ từ những cánh đồng khác cũng có vai trò đáng kể trong việc truyền PVY. Rệp ngũ cốc, rệp đậu hà lan đƣợc cho là liên quan tới dịch bệnh xảy ra trên cánh đồng khoai tây ở Châu Âu, Bắc Mỹ (Kerlan và cs, 2008) [41]. PVY có phạm vi cây chủ rộng nhƣng cho tới tận bây giờ, ngoài khoai tây chƣa có cây chủ nào đƣợc nhận định nhƣ là một nguồn lây nhiễm đáng kể. Cũng trên khoai tây, có sự khác nhau về hiệu quả truyền PVY giữa các chủng. PVYN có hiệu quả truyền qua rệp cao hơn các chủng khác do thời gian duy trì của chúng trong rệp dài hơn (Kerlan, 2008) [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Hình 1.5. Loài rệp có cánh truyền PVY (Aphis nasturtii) (Theo: B. Chaubet, INRA, Pháp) Rệp truyền PVY theo cách không bền vững (nonpersistent manner). Giai đoạn thu nhận đƣợc và tiêm rất ngắn (vài giây hay vài phút). Vòi của rệp xuyên vào bên trong lớp tế bào biểu bì của cây và đâm thủng màng tế bào chất. Virus đƣợc giữ trong rệp không quá 1 đến 2 giờ. Tuy vậy, ở Aphis nasturtii, thời gian giữ có thể lên tới trên 17 giờ. Thời kì đói của rệp làm tăng hiệu quả của việc truyền virus mặc dù nó không ảnh hƣởng tới số lƣợng các lỗ trích trong suốt thời kì thu nhận đƣợc (Kerlan và cs, 2008) [41]. Tính chất có thể lan truyền của PVY đƣợc quyết định bởi cả hai protein là coat protein (CP) và helper component protein (HC-Pro). Tất cả PVY có thể đƣợc truyền bởi rệp đều chứa bộ ba aa: DAG (Asp-Ala-Gly) trong vùng tận cùng đầu N của CP. Khác với tobacco vein mottling virus, các virus trình tự DAGE cũng có thể đƣợc truyền bởi rệp. PVY là virus đầu tiên đƣợc chứng minh rằng một thành phần của nó trong nhựa cây cần thiết cho sự vận chuyển của rệp. Sự làm mất hoạt tính của HC- Pro liên quan tới việc không giữ đƣợc virion trên vòi rệp. Các virus đƣợc vận chuyển bởi rệp và không đƣợc vận chuyển bởi rệp khác nhau ở một hoặc 2 sự thay thế axit amin: Gly35 cho Asp, Lys 50 cho Glu hoặc Lys50 cho Asn, Ile225 cho Val, Ser355 cho Gly. Lys50 là một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 phần của “LITC motif” có tính bảo thủ (Lys–Ile–Thr–Cys). Thay đổi bên trong hay xung quanh motif này có thể làm mất tính chất có thể truyền bởi rệp của PVY. 1.3.6. Một số đặc điểm của PVY trên khoai tây 1.3.6.1. Thiệt hại PVY gây ra trên khoai tây Ở khoai tây, hiện nay PVY đã trở thành virus nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn về kinh tế. Nó ảnh hƣởng tới hầu hết các cây và gây thiệt hại về sản lƣợng tới 80%, thậm chí còn lớn hơn trong trƣờng hợp bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD). Kết quả nghiên cứu những năm trƣớc, Weideman (1979) cho biết, ở Đức khi bị PVY nặng, khoai tây có thể giảm tới gần 60% năng suất dự thu. Thiệt hại do PVY gây ra trên khoai tây phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố quan trọng nhất là giống khoai tây và chủng virus. 1.3.6.2. Các chủng và các biến thể của PVY khoai tây PVY khoai tây đƣợc chia thành 3 chủng (PVYO, PVYN và PVYC), nhiều biến thể. PVYO, PVYN và PVYC đƣợc phân biệt dựa trên các phản ứng của chúng trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum và trên khoai tây trồng mang các „hypersensitivity gene’ Nytbr và Nc (Kerlan, 2008) [40]. PVY N khác với PVY O và PVY C trong việc gây ra phản ứng chết hoại gân lá của N. tabacum cv Samsun hoặc cv Xanthi. 2aa ở vị trí 400 và 419 trong protein HC- Pro liên quan tới sự cảm ứng phản ứng chết hoại này ở cây thuốc lá. Ngoài ra, các chủng PVY còn đƣợc phân biệt bởi phản ứng trên cây chủ P. floridance. PVY C gây ra sự suy sụp và chết sớm ở loại cây này (Kerlan và cs, 2008) [41]. Các biến thể PVYNTN, PVYNW và PVYN:O cũng khá phổ biến. PVYNW, PVY N:O và phần lớn PVYNTN là sự tái tổ hợp giữa chủng PVYO và PVYN với từ một đến ba điểm tái tổ hợp. PVYNTN đặc trƣng bởi sự gây ra chết hoại củ trên khoai tây. Việc phát hiện ra PVYNTN không có điểm tái tổ hợp đã chỉ ra Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 rằng cấu trúc tái tổ hợp của genome không phải là điều kiện quyết định cần thiết cho kiểu hình chết hoại củ. PVYN W phân biệt với PVYN ở tính chất gây độc và kiểu huyết thanh là O-C. PVYN:O đƣợc mô tả trong những năm 2000 cũng mang một phần thuộc tính của PVYN và PVYO. Một số PVYN:O gây ra sự chết hoại củ (Kerlan, 2008) [40], (Kerlan và cs, 2008) [41], (Tetsuji Ogawa, 2008) [66]. Các chủng PVYO và PVYN phân bố rộng khắp, nhƣng đến nay, PVYN vẫn chƣa thuộc danh sách mầm bệnh kiểm dịch ở Canada và USA. Chủng PVY C ít gặp hơn (ở Pháp PVYC chiếm ít hơn 5% PVY). Biến thể PVYNTN đƣợc tìm thấy trong hầu hết các nƣớc trồng khoai tây kể cả USA và Peru. Còn biến thể PVYNW đƣợc thông báo ở một vài quốc gia và phổ biến ở Poland. Ở Canada và USA cùng thông báo sự xuất hiện của PVYN:O. Hình 1.6. Dấu hiệu so sánh PVY trên Nicotiana tabacum cv Xanthi (sau 15 ngày tiêm): (a) Thuốc lá nhiễm PVYN; (b) Thuốc lá nhiễm PVYO 1.3.6.3. Triệu chứng của bệnh do PVY trên khoai tây Ba chủng (PVYO, PVYN, PVYC) gây ra các triệu chứng khác nhau ở cây khoai tây: + PVY O: Khi lây nhiễm lần đầu (primer), phản ứng của cây với chủng virus này phụ thuộc vào giống khoai tây. Lá cây có thể chết hoại, tạo đốm hay ngả vàng, lá rũ xuống, đôi khi cây non bị chết. Lúc đầu các lá non xuất hiện Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 vết đốm hay vết hình khuyên, sau đó chết và treo trên thân, lá cây giòn (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Khi nhiễm lần hai (secondery), triệu chứng điển hình là khảm, quăn, đốm chết hoại của lá và sự còi cọc của cây. + PVY N gây ra các triệu chứng nhẹ hơn, thƣờng là khảm, đốm trên lá. Đôi khi những vết đốm không rõ ở lần nhiễm đầu tiên. Khi bệnh nhiễm vào cây chậm, triệu chứng ở tán lá có thể không biểu hiện, nhƣng củ thu hoạch ở nhóm cây nhiễm chậm vẫn có thể mang bệnh (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. + PVY C gây ra các sọc chấm trên thân và những đốm nâu xung quanh các mắt củ. Bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD) do PVYNTN và một số PVY N W, PVY N:O đƣợc đặc trƣng bởi những kiểu đặc biệt trên lá và thân (đôi khi là chết hoại lá sồi) sự chết hoại hình vòng và cong trên bề mặt củ. Đầu tiên, nó nhô ra không đáng kể trên vỏ củ, rồi trở nên nâu đen cùng một số vết rạn nứt (Kerlan và cs, 2008) [41]. Hình 1.7. Triệu chứng nhiễm lần hai (secondary) với PVY trên cánh đồng khoai tây: quăn, vàng và nhỏ của lá (Theo: V. Le Hingrat, FNPPPT, Pháp) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Hình 1.8. Triệu chứng của bệnh đốm chết hoại củ khoai tây (PTNRD): (a)Vàng và chết hoại trên lá cơ bản; (b) Kiểu chết hoại lá sồi trên lá trung gian; (c) Triệu chứng điển hình của PTNRD trên củ ở cv Monalisa; (d) Triệu chứng không điển hình gây ra bởi PVYO trên củ ở cv Yukon Gold. (Theo: K. Charlet-Ramage, GNIS-INRA, France (a–c) và R. P. Singh Potato Research Centre, NB, Canada (d)) 1.3.6.4. Biện pháp phòng chống bệnh do PVY gây ra trên khoai tây Các bệnh do PVY gây ra trên khoai tây đƣợc phòng chống dựa trên các biện pháp quản lí khoai tây giống, gây giống kháng bệnh và các quy định về kiểm dịch, đặc biệt là đối với PVYN. Sự sản xuất khoai tây giống an toàn gồm: kiểm tra rệp truyền bệnh, xử lí dầu vô cơ chống lại sự truyền của rệp, trừ cỏ dại, kiểm tra phát hiện virus trong vụ thu hoạch chính bằng sử dụng ELISA trên phạm vi rộng. Nhiều các thí nghiệm sinh học phân tử cũng đƣợc phát triển để phát hiện PVY trong lá, củ và rệp nhƣ lai cDNA (cDNA hybridization), các RT-PCR khác nhau, kĩ thuật microarray. HR và ER lần lƣợt do các gen trội đơn Ny và Ry quy định. Gen Ry (Rysto, Ryadg) ở loài họ cà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 dại, nằm trên nhiễm sắc thể XI và XII, quy định khả năng kháng rộng. Ngƣợc lại, gen Nc, Nytbr nằm trên nhiễm sắc thể thứ IV và Nz lần lƣợt quy định khả năng kháng PVYC, PVYO và PVYZ. Protein NiaPro của PVY liên quan tới việc hoạt động của Ry. Đã tạo đƣợc hơn 20 loại cây trồng chứa Ry đem lại khả năng kháng virus khá bền (Kerlan và cs, 2008) [41]. Ngoài ra, hƣớng nghiên cứu sử dụng vật liệu di truyền có nguồn gốc từ virus để tạo cây chuyển gen kháng virus đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Hình 1.9. Vị trí các gen kháng PVY trên genom khoai tây (Theo: S. Marchadour, FNPPPT-INRA, Pháp) 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PVY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1. Tình hình nghiên cứu PVY trên thế giới Năm 1931, Smith lần đầu tiên phát hiện ra PVY trên khoai tây. Từ đó đến nay, hàng loạt các công trình nghiên cứu về virus này đã đƣợc công bố. Các chủng và các biến thể PVY đƣợc phát hiện, nghiên cứu tỉ mỉ, thiệt hại của bệnh, các phƣơng pháp chuẩn đoán cũng nhƣ các biện pháp phòng chống PVY đƣợc đƣa ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Việc chẩn đoán các chủng PVY đầu tiên dựa vào các thí nghiệm sinh học. Các chủng khác nhau biểu hiện các triệu chứng khác nhau trên cây chỉ thị. Tuy vậy, phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian, nhiều khâu phức tạp, không phù hợp với chuẩn đoán nhanh trên quy mô lớn. Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm quốc tế đã cố gắng phát triển các phƣơng pháp khác để phát hiện, mô tả PVY dựa trên các đặc điểm sinh học, huyết thanh và phân tử của PVY. Từ cuối những năm 1970, những hiểu biết về thuộc tính gây miễn dịch của PVY đã đƣợc sử dụng trong việc nhận dạng virus. Dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể này, nhiều phƣơng pháp chuẩn đoán lần lƣợt đƣợc công bố nhƣ: DAS-ELISA hoặc TAS-ELISA (double-or triple-antibody Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assays); sử dụng kháng thể đơn dòng hay đa dòng (Gugerli và Fries, 1983 [33]; Maat và Huttinga, 1987 [44]; Oshima và cs, 1990 [53]; Sanz và cs, 1990 [60]; Singh và cs, 1993 [62]; Ellis và cs, 1996 [29]); kính hiển vi điện tử hấp thụ miễn dịch immunosorbent electron microscopy (Walkey và Webb, 1984 [70]); chất kết dính nhựa mủ latex agglutination (Berckx, 1967 [16]; Talley và cs, 1980 [65]). Tuỳ theo sự đặc trƣng của những kháng thể đƣợc sử dụng mà sự kiểm tra này có thể có phổ rộng (Health và cs, 1987 [35]; Ellis và cs, 1996 [29]), hay chỉ phân biệt đƣợc giữa PVYN với PVYO hoặc với PVYC (Mc Donald và Singh, 1996 [48]; Boonham và Barker, 1998 [19]; Ounouna và cs, 2002 [54]). Phƣơng pháp huyết thanh nhanh, đáng tin cậy cho việc nhận dạng PVYN và PVYO và phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến để phát hiện virus trong lá cây (Clark và Adams, 1977 [26]) hay trong các mô khác nhƣ củ khoai tây (Vetten và cs, 1983 [69]). Tuy nhiên, gần đây sự nổi lên của các biến thể nhƣ PVYNTN (Le Romancer và cs, 1994 [43]; Kerlan và cs, 1999 [42]) và PVY NW đã cho thấy điểm hạn chế của phƣơng pháp huyết thanh (Chrzanowska, 1991 [25]). Bằng phƣơng pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, đa dòng đã xếp PVYN W vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 nhóm PVY O, mặc dù chúng rõ ràng gây ra triệu chứng chết hoại trên gân thuốc lá. Ngoài ra, phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc PVYNTN và PVYN. Sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử từ đầu những năm 1980 cho phép nghiên cứu tính đa dạng di truyền của PVY. Những nghiên cứu sử dụng bản đồ RFLP của một phần hay toàn bộ genome đã đƣợc tiến hành. Toàn bộ trình tự của PVYN (Robaglia và cs, 1989 [56]; Jakab và cs, 1997 [38]; Abdelmaksoud và Gamal Eldin, 2002 [15]; Nie và Singh, 2003 [51]), PVY O , PVY NTN (Thole và cs, 1993; Nie và Singh, 2003 [51]) đã đƣợc công bố. Hơn nữa, trình tự vùng không dịch mã (NTR) ở đầu 5‟ và đầu 3‟, các gen của PVY đã có sẵn trong ngân hàng gen. Những dữ liệu này cho phép so sánh giữa các trình tự, xác định sự tƣơng đồng hay khác biệt về trình tự giữa các virus. Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng: + Tính biến đổi cao của PVY (trên 28% khác nhau giữa vùng P1 của PVY N và PVY O (Marie-Jeanne Tordo và cs, 1995 [46])). + Sự tƣơng đồng giữa trình tự coat protein (CP) của PVYNW và PVY O. Điều này đã giải thích việc phát hiện PVYNW bởi các kháng thể đơn dòng đặc trƣng của PVYO. + Sự có mặt của 1 (PVYNW) đến 3 (PVYNTN) điểm tái tổ hợp giữa trình tự của PVYN và PVYO trong các biến thể PVY nổi lên gần đây. Nhƣ một sự thay thế cho phƣơng pháp huyết thanh, nhiều thí nghiếm sinh học phân tử đặc hiệu và nhạy cảm đƣợc phát triển dựa trên sự biến đổi trong trình tự PVYN, PVYO hay điểm tái tổ hợp ở bên trong genome nhằm phát hiện đặc hiệu các chủng và biến thể của PVY. Có thể kể đến các phƣơng pháp nhƣ: gel retardation (Rosner và Maslenin, 2001, 2003 [58] [59]; Matousek và cs, 2000 [47]); RT-PCR-RFLP (Glais và cs, 2002 [31]); single-restriction cleavage of PCR products (Rosner và Maslenin, 1999 [57] ); RT-PCR đơn thành phần (Nie và Singh, 2002 [50]; Boonham và cs, 2002 [20]); RT-PCR đa thành phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 (Nie và Singh, 2002 [50]); AmpliDet RNA; competitive fluorescent RT-PCR (Walsh và cs, 2001 [71]) và PCR 3 mồi (Moravec và cs, 2003 [49]). Sử dụng vật liệu di truyền của virus để tạo cây khoai tây chuyển gen là một hƣớng đi mới, đã và đang nhận đƣợc những kết quả khá khả quan. Schubert và cs, 2004 đã tạo thành công khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu virus PVY ở Việt Nam Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về bệnh virus nói chung và bệnh PVY nói riêng trên khoai tây còn rất ít. Việc nghiên cứu mới bắt đầu dừng lại ở phát hiện sự xuất hiện của bệnh, sự phân bố của bệnh trên các cánh đồng khoai tây, tỉ lệ nhiễm, thiệt hại và phản ứng của cây khi bị nhiễm virus. Cũng có những nghiên cứu xác định loại và chủng virus, nhƣng dựa trên các phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng, cây chỉ thị, huyết thanh, kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh Nguyễn Thị Kim Thanh và cs, 1994) [9], (Trần Thanh Thu và cs, 1988) [10], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. Đến nay, vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phân tích, đánh giá đặc điểm di truyền của PVY khoai tây đƣợc công bố (Phạm Thị Vân và cs, 2009) [13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các mẫu lá khoai tây có triệu chứng bị nhiễm bệnh đƣợc thu từ một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu STT Địa điểm thu thập mẫu Kí hiệu 1 Phú Bình – Thái Nguyên Phú Bình 2 Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên 3 Văn Lâm – Hƣng Yên Hƣng Yên 4 Việt Yên - Bắc Giang Bắc Giang 5 Thái Thụy - Thái Bình Thái Bình 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất - Bộ kit tách chiết RNA tổng số của hãng Invitrogen. - Bộ kit tổng hợp cDNA của hãng Fermentas. - Bộ hoá chất sử dụng cho kĩ thuật PCR. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Bioneer. - Các hoá chất thông dụng phục vụ cho các kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ agarose, cồn, X- gal, ampicilin… 2.2.2. Thiết bị Máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và nhiều thiết bị khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại: + Phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-trƣờng Đại học Sƣ phạm; Phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. + Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thí nghiệm công bố trong luận văn đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY đƣợc xác định theo phƣơng pháp thống kê. Trong mỗi khu vực nghiên cứu, lấy ngẫu nhiên 3 lô thí nghiệm. Mỗi lô có 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng bị bệnh trong Xác định tỉ lệ nhiễm, Thu thập mẫu bệnh Tách RNA tổng số Nhân gen CP Tách dòng gen Xác định và so sánh trình tự gen CP Khai thác trình tự trong NCBI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng bị bệnh ở mỗi vùng sẽ đƣợc tính bằng trung bình của tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh trên 3 lô. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số Chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau: - Cân 100mg lá khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA. - Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml. - Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút. - Bổ sung 200µl Chloroform: Isoamyl (24:1). - Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút 500 dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 500µl Isopropanol đã đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa. - Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 700 pha trong DEPC 0,01%. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. - Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40µl H2O đã xử lí DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để RNA tan hết. Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lí DEPC 1% và khử trùng trƣớc khi sử dụng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng: sao mã ngƣợc (reverse transcription) tạo cDNA và PCR để nhân một đoạn gen quan tâm từ cDNA. Kỹ thuật RT-PCR để nhân gen CP đƣợc tiến hành theo hai bƣớc sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA - Bổ sung lần lƣợt các thành phần sau đây vào ống eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lí DEPC 1% hoặc Rnase: Thành phần Thể tích 250ng mồi ngẫu nhiên 2µl 10pg - 5µg RNA tổng số 2µl dNTPs 10mM 2µl - Bổ sung nƣớc DEPC 0,01% tới thể tích 13µl. - Ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá. - Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng: Buffer 5X 4µl DTT 0,1M 1µl Rnase OUT TM (40 đơn vị/µl) 1µl Cloned AMV RT (15 đơn vị/µl) 1µl - Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt nhƣ sau: Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 45 50 3 85 5 4 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Bước 2: Phản ứng PCR Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP. Thành phần, chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10mM) 2 5 Mồi xuôi 1 6 Mồi ngƣợc 1 7 Taq polymerase (1U/1µl) 0,5 8 cDNA 3 Tổng 25 Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 30 3 Gắn mồi 52 50 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarase 1%, rồi đƣợc làm sạch (thôi gel) theo bộ kit của Bioneer và gắn vào vector pBT, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1200bp. - Bổ sung dung dịch QG theo tỉ lệ: Vmẫu:VQG= 1 : 3. - Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột chảy qua cột. - Thêm 750µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE. - Hoà tan DNA trong 30-50µl H2O deion, khử trùng đã đƣợc làm ấm đến 50 0C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng Thành phần phản ứng gắn gen vào vector đƣợc thể hiện ở trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 DNA 13 2 Ligation buffer 10X 2 3 pBT 2 4 PEG 4000 2 5 T4 ligase 1 Tổng 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli. 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Bổ sung 20µl vector đã gắn gen vào ống dựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc ủ 40C trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút và sau đó ủ 40C trong đá 5 phút. Bổ sung 300µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 100mg/l ampicillin, X- gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Kết quả của quá trình biến nạp là tổ hợp của các khuẩn lạc xanh và trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony- PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen CP mong muốn. Thành phần của phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc, nhiệt độ gắn mồi 540C. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid. 2.3.8. Tách chiết plasmid Plasmid đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp TELT. Quy trình: - Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000 vòng/phút trong 7 phút, loại dịch. - Bổ sung 200µl TELT, 10µl lyzozim, khuấy tan để khuẩn tan hết. - Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 950C trong 3 phút, ủ 40C trong 5 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 - Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 700. - Làm khô plasmid bằng máy Speed Vac. - Hoà tan plasmid trong 40µl nƣớc cất khử ion, khử trùng. - Bổ sung 0,1µl Rnase, ủ ở 370C trong 2 giờ. - Tinh sạch plasmid để đọc trình tự. Quy trình tinh sạch plasmid: - Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu:VPB=1:5, mix nhẹ. - Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. - Bổ sung 0,75ml dung dịch NW, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. - Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch NW. Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 30µl H2O deion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1-2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide Trình tự gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR đọc trình tự trên máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 nhƣ sau: Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Dung dịch đệm (5X) 3 2 Mồi 1,275 3 DNA mẫu (~200ng) 7,725 4 BigDye 3 Tổng 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 96 1 phút 1 2 Biến tính 96 10 giây 25 3 Gắn mồi 55 5 giây 4 Kéo dài chuỗi 60 4 phút 5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 30 phút Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng cách bổ sung 5µl EDTA 125mM, 60µl cồn 100% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Tiếp đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để tủa các đoạn DNA, sau đó loại bỏ cồn. Bổ sung 60µl cồn 70% và li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10µl Hi-DiTM Formamide và biến tính ở 950C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc tra vào các giếng của khay đựng mẫu, sau đó điện di trong ống mao quản với polymer PoP-4TM của hãng ABI, Mỹ. Kết quả đƣợc xử lí bằng phần mềm DNAstar. 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng xử lí trình tự gen nhƣ PC GENE, Clustal, DNAstar, BioEdit, Chromas…. Trong các phần mềm kể trên, DNAstar là hệ thống phần mềm tiện dụng nhất, đƣợc tạo ra bởi một nhóm các nhà khoa học Mỹ. Phần mềm này bao gồm nhiều chƣơng trình với các chức năng khác nhau dùng để phân tích và xử lí số liệu trong sinh học phân tử. Việc so sánh và xử lí trình tự gen CP đƣợc tiến hành theo trình tự sau: - So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xuôi và ngƣợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 - So sánh trình tự đầy đủ của gen với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác định gen đƣợc tách dòng là của PVY. - Giải mã trình tự nucleotide sang trình tự acid amine theo một trong các khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu và kết thúc dịch mã. - Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền của 3 trình tự nucleotide của 3 dòng gen CP thu đƣợc với nhau và với trình tự gen CP của các PVY từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới đã đƣợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen (Gen Bank). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM PVY Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG Chúng tôi đã tiến hành điều tra các vùng trồng khoai tây ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam và tiến hành khảo sát ở các địa điểm sau: + Cánh đồng khoai tây thuộc thôn Hành Lạc, thị trấn Nhƣ Quỳnh, huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên. + Cánh đồng khoai tây thuộc làng Khả Lý Hạ, xã Quảng Minh, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang. + Cánh đồng khoai tây tại thôn Thùa Lâm, xã Tiên Phong, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên. + Cánh đồng khoai tây thuộc huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên. + Cánh đồng khoai tây thuộc xã Thụy Ninh, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình. Trong đó, chỉ cánh đồng ở Phổ Yên-Thái Nguyên trồng khoai tây Hà Lan còn các cánh đồng khác trồng khoai tây Trung Quốc. Thời điểm khảo sát là khi khoai tây đã trồng đƣợc 1 tháng rƣỡi đến 2 tháng. Ở mỗi vùng, chúng tôi đã tiến hành phát hiện và xác định tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY. Việc chẩn đoán cây bị bệnh đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Trên từng cánh đồng, chúng tôi lấy 3 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng nhiễm PVY trên từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY trên mỗi cánh đồng đƣợc tính bằng giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm ở 3 lô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu Cánh đồng khoai tây Ký hiệu Triệu chứng nhiễm PVY (%) Phổ Yên-Thái Nguyên Phổ Yên 14,23 ± 2,56 Phú Bình-Thái Nguyên Phú Bình 28,07 ± 3,03 Thái Thụy-Thái Bình Thái Bình 20,03 ± 3,13 Văn Lâm-Hƣng Yên Hƣng Yên 22,56 ± 2,85 Việt Yên-Bắc Giang Bắc Giang 31,71 ± 2,15 Nhƣ vậy, tỷ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY dao động từ 14,23±2,56% đến 31,71±2,15%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra của Trƣơng Văn Hộ và cs (1990) [4]. Trong đó, cánh đồng ở Bắc Giang có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY cao nhất (31,71±2,85%) và ở Phổ Yên-Thái Nguyên có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY thấp nhất (14,23±2,56%). Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Bắc Giang Mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh ở Bắc Giang Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Hưng Yên Mẫu có triệu chứng bị bệnh ở Hưng Yên Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Tuy vậy, phƣơng pháp chuẩn đoán bằng mắt thƣờng dễ có sự nhầm lẫn với các bệnh khác nhƣ bệnh do tuyến trùng, các bệnh sinh lí do dinh dƣỡng hay điều kiện khí hậu gây ra. Ngoài ra, dễ nhầm lẫn virus này với những virus khác do có sự xâm nhiễm hỗn hợp của các virus trên cùng một cây. Do đó, chuẩn đoán chính xác khoai tây nhiễm PVY cần kết hợp với các phƣơng pháp khác nhƣ sử dụng kính hiển vi điện tử, phƣơng pháp huyết thanh hay sinh học phân tử. Trong nghiên cứu này, để xác định các mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY thu đƣợc từ 5 cánh đồng khoai tây trên có chính xác là bị nhiễm PVY hay không, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định trình tự gen CP của PVY. 3.2. KẾT QUẢ NHÂN GEN, TÁCH DÒNG cDNA 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR Chúng tôi đã thu thập một số mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ 5 cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng Yên, Bắc Giang. Sau đó, tiến hành phân lập gen CP của PVY từ các mẫu lá khoai tây này. Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá có triệu chứng nhiễm bệnh (theo quan sát bằng mắt thƣờng) và tổng hợp cDNA từ RNA tổng số này. Gen CP đƣợc nhân lên bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học: Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP Mồi Trình tự PVYCPF1 5‟ GCYTTCACTGAAATGATGGT 3‟ PVYCPR1 5‟GTCTCCTGATTGAAGTTTACA3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Để kết quả nhân gen đƣợc chính xác, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần và có đối chứng dƣơng (+), đối chứng âm (-) khi làm thí nghiệm. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2. Có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng của phản ứng RT- PCR nhƣ: Lƣợng RNA quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp, nhiệt độ gắn mồi chƣa phù hợp…Vì vậy trong quá trình tiến phản ứng cần điều chỉnh hàm lƣợng các thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg 2+…), nhiệt độ gắn mồi, thời gian đối với mỗi bƣớc của chu kì nhiệt…để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh M: Marker DNA 1Kb 1: Hƣng Yên; 2: Bắc Giang; 3: Thái Bình1; 4: Thái Bình2; 5: Phổ Yên; 6: Phú Bình (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-) : Đối chứng âm-thành phần PCR không có RNA Hình 3.2 cho thấy, chỉ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên, Phú Bình-Thái Nguyên và plasmid mang gen PVY là có đoạn gen đƣợc nhân lên với kích thƣớc khoảng 1200bp. Kích thƣớc này phù hợp với tính toán khi thiết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 kế mồi nhân gen. Vì vậy, chúng tôi kết luận đã nhân thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY trên khoai tây từ 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình. Từ kết quả RT-PCR chúng tôi kết luận: - Các mẫu lá đƣợc nghi có triệu chứng bị bệnh PVY thu thập từ Hƣng Yên, Bắc Giang, Thái Bình không chứa PVY. Điều này có thể do khi thu thập mẫu quan sát bằng mắt thƣờng nên nhầm lẫn với các bệnh hay loại virus khác. Nhƣ vậy, phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng để xác định bệnh do PVY gây ra ở khoai tây sẽ không chính xác. - Đã phân lập thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY từ mẫu khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Để đƣa ra kết luận chính xác đoạn gen nhân đƣợc là gen CP từ PVY cần tiến hành tách dòng và đọc trình tự đoạn gen này. 3.2.2. Tinh sạch sản phẩm RT-PCR Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn ra còn rất nhiều sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm…Vì vậy để phản ứng ghép nối đạt đƣợc hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit QIAquick Gel Extraction. Khi nâng nhiệt độ 500C thì agarose tan chảy, DNA đƣợc hoà vào dung dịch QG. Sau khi cho dung dịch vào cột tinh sạch QIAquick spin, DNA đƣợc giữ lại bởi các phân tử có ái lực cao với DNA cố định trên màng lọc của cột tinh sạch, dịch đệm QG và agarose bị loại đi nhờ li tâm. Để loại bỏ hết agarose còn bám trên màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG vào cột lần thứ 2. DNA đƣợc làm sạch bằng đệm rửa PE chứa 80% ethanol và đƣợc hoà tan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 trong dịch đệm EB hoặc nƣớc deion khử trùng. Bằng phƣơng pháp này đã giữ lại với hiệu suất 85% trở lên. Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% (M: Marker DNA 1Kb; 1: Phổ Yên; 2: Phú Bình) Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm thôi gel có hàm lƣợng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Chúng tôi sử dụng vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp. Sản phẩm RT-PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml và IPTG 100M. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất: + Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt. + Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất. Chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc gồm cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt động, enzyme β- galactosidase không đƣợc tạo nên không có quá trình chuyển hoá X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promotor của operon gen LacZ làm cho lac-promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP- PVY nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trƣờng xung quanh. Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ các trƣờng hợp không mong muốn. 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR Tiến hành PCR trực tiếp từ một số khuẩn lạc trắng với cặp mồi pUC18- F1/pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có thể mang gen CP. Chỉ sử dụng cặp mồi này chứ không sử dụng cặp mồi đặc hiệu nằm trong gen vì trong phản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 ứng gắn gen vào vector, một lƣợng lớn gen không đƣợc gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng, do đó khi cấy trải lên đĩa thạch các gen này nằm rải rác trên đĩa thạch và có thể nằm ngay dƣới hoặc xung quanh các khuẩn lạc. Do đó, phản ứng colony-PCR sẽ bị gây nhiễm và kết quả không chính xác Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên M: Marker DNA 1Kb 1-7: Dòng khuẩn lạc số 1-7 (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-1) : Đối chứng âm – dòng khuẩn lạc xanh (-2) : Đối chứng âm – Thành phần PCR không có khuẩn lạc Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR Tên mồi Trình tự pUC18-F1 5 ‟ - GAGGGTTTTCCCAGTCACGA – 3‟ pUC18-R1 5 ‟ - GCGGATAACAATTTCACACA – 3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình M: Marker DNA 1Kb 8-9: Dòng khuẩn lạc số 8-9 Từ kết quả điện di cho thấy, sản phẩm colony PCR từ 9 dòng khuẩn lạc trắng có 7 dòng cho kết quả dƣơng tính đó là các dòng 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9. 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu A B Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ Yên; B: Mẫu Phú Bình) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Chúng tôi chọn khuẩn lạc trắng của dòng 1 và dòng 2 với mẫu Phổ Yên; dòng 8 của mẫu Phú Bình để tách plasmid theo bộ kit của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6. Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen CP. 3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU NGHIÊN CỨU Trình tự nucleotide của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM ® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi và ngƣợc. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá CP của PVY ở khoai tây. Chiều dài gen CP ở 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình đều có kích thƣớc 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá CP của PVY trên khoai tây. 3.3.1. So sánh trình tự nuclotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 Pho Yen TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC Phu Binh TGAATGCTGG TACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 Pho Yen ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 Pho Yen GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC Phu Binh AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 Pho Yen TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 460 470 480 490 500 Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Phu Binh AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 560 570 580 590 600 Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 660 670 680 690 700 Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 Pho Yen GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 760 770 780 790 800 Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT . Pho Yen G Phu Binh G Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Pho Yen YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT ....|....| ....|.. 260 Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ 2 mẫu nghiên cứu có sự sai khác ở 71 vị trí nuleotide. Do đó có thể thấy, mức độ tƣơng đồng giữa 2 trình tự này tƣơng đối thấp (91,1%). So sánh protein suy diễn từ 2 trình tự gen này cho thấy mức độ sai khác là 6,4%. Sự biến động về trình tự nucleotide giữa 2 gen không đồng đều, trong khi có những vùng biến động lớn (nhƣ vùng 2 đến 144) thì có những vùng không biến động một nuleotide nào (nhƣ vùng từ 613 đến 801). Sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự sai khác về acid amin, tuy vậy có những vùng có sự sai khác về nuleotide không dẫn tới sự sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273). 3.3.2. So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen Để thấy đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của PVY, chúng tôi tiến hành so sánh 2 trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình và Phổ Yên với một số trình tự gen PVY khác trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc đƣa ra so sánh Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự gen, lập bảng hệ số tƣơng đồng và biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với 19 trình tự trên. Mã số Chủng (biến thể) Nƣớc Mã số Chủng (biến thể) Nƣớc DQ925437 PVY NTN Hà Nội-Việt Nam U91747 PVY N USA M95491 PVY NTN Hungary X97895 PVY N Switzerland X79305 PVY NTN Austria Z70237 PVY N Polan X92078 PVY NTN Lebanon AF118153 PVY O India AJ890345 PVY NTN Germany AY792597 PVY O China EF016294 PVY NTN UK D12539 PVY O Japan AB205416 PVY N Japan U09509 PVY O Canada AF255660 PVY N Brazil X14136 PVY O Argentina AM268435 PVY N New Zealand X68222 PVY O USA Z70239 PVY O Poland Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen Kết quả phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên, Phú Bình có độ tƣơng đồng khá cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với các trình tự CP-PVY của các chủng PVY đã công bố. Nhƣ vậy, có thể đƣa ra kết luận: đã phân lập đƣợc thành công gen CP của PVY chứ không phải của một loại virus nào khác. Trình tự CP-PVY của mẫu ở Phổ Yên có độ tƣơng đồng từ 89,9% đến 91,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với các trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tƣơng đồng với các trình tự CP của các chủng PVYNTN cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (99,6%) với trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 tự có mã số EF016294. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN. Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tƣơng đồng từ 94,6% đến 98,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; 90,8% đến 91,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY của mẫu ở Phú Bình có độ tƣơng đồng với các trình tự thuộc chủng PVYO cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (98/5%) với trình tự có mã số Z70239. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phú Bình-Thái Nguyên thuộc chủng PVYO. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY phân lập từ Phổ Yên, Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen. Biểu đồ này cho thấy 21 trình tự đƣợc chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm I lại đƣợc chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ I1 gồm các trình tự thuộc chủng PVYNTN và Phổ Yên. Nhóm phụ I2 gồm các trình tự của chủng PVYO và Phú Bình. Theo nghiên cứu của Mohamad Chikh Ali và cs , vị trí acid amine thứ 29 của gen CP-PVY là Gly29 bảo thủ cho các chủng PVY O , PVY C , PVY N W. Trong khi Gln17 và Glu31 lại bảo thủ trong gen CP của PVY N /PVY NTN (Chikh Ali và cs, 2007) [24]. Trình tự acid amine của CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình hoàn toàn phù hợp với nhận định của Chikh Ali. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Bảng 3.5. Hệ số giống và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu so với các mẫu trên ngân hàng NCBI H ệ số k h ác n h au ( % ) Hệ số giống nhau (%) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Đã tiến hành khảo sát, thống kê tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy phƣơng pháp này có độ tin cậy thấp vì dễ nhầm lẫn với các bệnh khác hay những phản ứng của cây trƣớc điều kiện sinh thái khác nhau. 1.2. Đã nhân đƣợc gen CP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu từ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Sản phẩm PCR đƣợc dòng hoá nhờ vector pBT. Đoạn mã hóa dài 801 nucleotide và protein gồm 267 acid amine. 1.3. Trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên có sự sai khác là 8,9%. 1.4. So sánh trình tự đoạn mã hoá của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với các mẫu đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy hệ số sai khác dao động từ 0,04% đến 10,7%. 1.5. Đã xác định đƣợc PVY phân lập từ Phổ Yên thuộc chủng PVYNTN, còn PVY phân lập từ Phú Bình thuộc chủng PVYO. 2. ĐỀ NGHỊ Tiếp tục đánh giá sự đa dạng cấu trúc gen CP của PVY phân lập từ các khu vực khác để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen kháng PVY ở khoai tây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Vũ Thị Bƣởi (2009), “Xác định trình tự gen mã hoá protein vỏ của virus Y trên khoai tây và đánh giá sự đa dạng di truyền của virus này”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 56(8), Nxb Đại học Thái Nguyên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kĩ thuật thâm canh, NXB Lao động Xã hội, tr 12- 13. [2] Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Khoai tây (Solanum tuberosum), [3] Đƣờng Hồng Dật (2005), Cây khoai tây và kĩ thuật thâm canh tăng năng suất, NXB Lao động Xã hội. [4] Trƣơng Văn Hộ, Trịnh Quốc Mỵ, Nguyễn Văn Đĩnh, P. Vander Zaag (1990), “Điều tra về bảo quản khoai tây giống ở đồng bằng Bắc Bộ”, Một số kết quả nghiên cứu khoai tây (1986- 1990), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 77- 82. [5] [7] Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus khoai tây, Nxb Khoa học và Kĩ thuật. [8] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội. [9] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội. [10] Nguyễn Thị Kim Thanh, Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1994), “Một số kết quả về việc tạo củ giống khoai tây trong ống nghiệm in vitro”, Kết quả nghiên cứu khoa học trồng trọt 1992- 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [11] Trần Thanh Thu, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988), “Tạo củ bi khoai tây sạch virus bằng kĩ thuật nuôi cấy mô in vitro” , Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp. [12] Hƣơng Tú ( 2008), Vị thuốc từ củ khoai tây, http:// www.ykhoanet.com. [13] Vũ Hƣớng Văn (2007), Khoai tây đâu chỉ là thực phẩm, http:// www.suckhoe360.com. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 [14] Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân lập và so sánh trình tự gen mã hoá cho protein vở (CP) của PVY ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông hồng, Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 1(31), tr 85-91. [14] Trƣơng Quang Vinh (2007), Phân tích đa hình ADN và ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật vào việc nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên. Tài liệu nƣớc ngoài [15] Abdelmaksoud H.M., Gamal Eldin A.S. (2002), The complete nucleotide sequence of the Potato virus Y strain N-Egypt, unpublished (GenBank Accession number: AF522296). [16] Berckx R. (1967), “Methodische untersuchungen uber den serologischen nachweis pflanzenpathogener viren mit dem bentonitflockungstest, den latex- text und dem bariumsulfat test”, Phytopathologische Zeitschrift, 58, 1–17. [17] Bhat A.I., Varma A., Pappu H.R., Rajamannar M., Jain R.K., Praveen S. (2004), Accession AF118153, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [18] Bill B., Dean (1992), “Managing the potato production system”, Food product press, An impuin of Haworth pess, New York, London, Nozwood (Australia), pp. 31-32. [19] Boonham N., Barker I. (1998), “Strain-specific recombinant antibodies to potato virus Y potyvirus”, J. Virol. Methods, 74 (2), 193–199. [20] Boonham N., Walsh K., Preston S., North J., Smith P., Barker I. (2002), “The detection of tuber necrotic isolates of Potato virus Y, and the accurate discrimination of PVY(O) PVY N and PVY C strains using RT-PCR”, J. Virol. Methods, 102 (1–2), 103–112. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 [21] Bravo-Almonacid F., Mentaberry,A.N. (2006), Accession X14136, Potato virus Y (PVY) mRNA for viral coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [22] Chachulska A.M., Chrzanowska M., Robaglia C., Zagorski W. (1996), Accession Z70237, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [23] Chachulska,A.M., Chrzanowska,M., Robaglia,C., Zagorski,W. (1996), Accession Z70239, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [24] Chikh Ali M. et al., (2001), Virus gense, 35 : 359-367. [25] Chrzanowska M. (1991), “New isolates of the necrotic strain of potato virus Y (PVY N ) found recently in Poland”, Potato Res, 34, 179–182. [26] Clark M.F., Adams A.N. (1977), “Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunoassay for the detection of plant viruses”, J. Gen. Virol, 34, 475–783. [27] Dhar A.K., Singh R.P., Boucher A. (2002), Accession U91747, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds, coat protein region. ncbi.nlm.nih.gov. [28] Dimitre S. Mollov, Christian A. Thill* (2004), “Evidence of Potato Virus Y Asymptomatic Clones in Diploid and Tetraploid Potato-breeding Populations”, Potato Res (2004), 81:317-326 317. [29] Ellis P., Stace-Smith R., Bowler G., Mackenzie D.J. (1996), “Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y”, Plant Pathol, 18, 64–70. [30] FAO (2005), FAO statistic database. [31] Glais L., Kerlan C., Robaglia C. (2001), “Variability and evolution of potato virus Y, the type species of the Potyvirus genus”, Plant Viruses as Molecular Pathogens, Food Products Press, The Haworth Press Inc., New York. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 [32] Gow L.J., Boonham N., Barker I., Foster G.D. (2006), Accession EF016294, Potato virus Y strain NTN isolate v942490, complete genome. ncbi.nlm.nih.gov. [33] Gugerli P., Fries P. (1983), “Characterization of monoclonal antibodies to potato virus Y and their use for virus detection”, J. Gen. Virol, 64, 2471–2477. [34] Ha C., Revill P., Harding R.M., Vu M., Dale J.L. (2008), Accession DQ925437, Potato virus Y isolate PVY-VN/P2 polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [35] Health R., Sward R.J., Moran J.R., Mason A.J., Hallam N.D. (1987), “Biological characterization of six Australian isolates of potato virus Y and their serological detection by ELISA”, Aust. J. Agric. Res, 38, 395–402. [36] Hidaka M., Yoshida Y., Masaki H., Namba S., Yamashita S., Tsuchizaki T., Uozumi T. (2008), Accession D12539, Potato virus Y gene for polyprotein, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [37] Inoue-Nagata A.K., Fonseca M.E.N., Lobo T.O.T.A., de Avila A.C., Monte D.C. (2001), Accession AF255660, Potato virus Y isolate PVY-NBR polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [38] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (1997), “Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605: a Swiss necrotic isolate of potato virus Y”, J. Gen. Virol, 78 (12), 31. [39] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (2005), Accession X97895, Potato virus Y genes encoding viral polyprotein. ncbi.nlm.nih.gov. [40] Kerlan C (2008), Potato Viruses, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved. [41] Kerlan C, Moury B (2008), Potato virus Y, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 [42] Kerlan C., Tribodet M., Glais L., Guillet M. (1999), “Variability of potato virus Y in potato crops in France”, J. Phytopathol, 147, 643– 651. [43] Le Romancer M., Kerlan C., Nedellec M. (1994), “Biological characterization of various geographical isolates of potato virus Y inducing superficial necrosis on potato tubers”, Plant Pathol, 43, 138–144. [44] Maat D.Z., Huttinga H. (1987), “Serology”, Viruses of Potatoes and Seed-Potato Production, Pudoc, Wageningen, NL. [45] Macdec P. (1963), “Tuber forming substances in the potato”, The Growth of the potato, pp. 121- 130. [46] Marie-Jeanne Tordo V., Chachulska A.M., Fakhfakh H., Le Romancer M., Robaglia C., Astier-Manifacier S. (1995), “Sequence polymorphism in the 5 NTR and in the P1 coding region of potato virus Y genomic RNA”, J. Gen. Virol, 76, 939–949. [47] Matousek J., Ptacek J., Dedic P., Schubert J. (2000), “Analysis of variability of P1 gene region of N strain of potato virus Y using temperaturegradient gel electrophoresis and DNA heteroduplex analysis”, Acta Virol, 44 (1), 41–46. [48] Mc Donald J.G., Singh R.P. (1996), “Host range, symptomatology, and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that share properties with both the PVY N and PVY O strain groups”, Am. Potato J, 73, 309–315. [49] Moravec T., Cerovska N., Boonham N. (2003), “The detection of recombinant, tuber necrosing isolates of Potato virus Y (PVY NTN ) using a three-primer PCR-based in the coat protein gene”, J. Virol. Methods, 109 (1), 63–68. [50] Nie X., Singh R.P. (2002), “A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of Potato virus Y by uniplex and multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 104 (1), 41–54. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 [51] Nie X., Singh R.P. (2003), “Specific differentiation of recombinant PVY (N:O) and PVY (NTN) isolates by multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 113 (2),69–77. [52] Ohshima K., Sako K., Hiraishi C., Nakagawa A., Matsuo K., Ogawa T., Shikata E., Sako N. (2008), Accession AB025416, Potato virus Y gene for coat protein, partial cds, isolte: TND6. ncbi.nlm.nih.gov. [53] Oshima K., Inoue A.K., Ishikawa Y., Shikata E., Takashi H. (1990), “Production and application of monoclonal antibodies specific to ordinary strain and necrotic strain of potato virus Y”, Ann. Phytopathol. Soc. Jpn, 56, 508–514. [54] Ounouna H., Kerlan C., Lafaye P., Loukili M.J., ElGaaied A. (2002), “Production of monoclonal antibodies against synthetic peptides of the N- terminal region of Potato virus Y coat protein and their use in PVY strain differentiation”, Plant Pathol, 51, 487–494. [55] Revers F., Le Gall O., Candresse T., Le Romancer M., Dunez J. (1995), Accession X92078, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov [56] Robaglia C., Durand-Tardif M., Tronchet M., Boudazin G., AstierManifacier S., Casse-Delbart F. (1989), “Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA”, J. Gen. Virol, 70, 935–947. [57] Rosner A., Maslenin L. (1999), “Differentiating PVYNTN by unique single-restriction cleavage of PCR products”, Potato Res, 42, 215–221. [58] Rosner A., Maslenin L. (2001), “Differentiating PVY(NTN) from PVY(N) by annealing to reference RNA transcripts”, J. Virol. Methods, 97 (1–2), 125–131. [59] Rosner A., Maslenin L. (2003), “Tagging of viral RNA transcripts with strain-specific oligonucleotides: characterization and application”, J. Virol. Methods, 110 (1), 105–109. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 [60] Sanz A., Cambra M., Perez de San Roman C., Miguet J.G., Cort´es E., Gorris M.T., Vela C. (1990), “Preparation of