Luận văn Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------
---------- TRẦN THỊ THANH HẢO NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU vip3A LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ 2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và hoàn chỉnh luận văn. Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này. Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined. Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined. Mục lục Error! Bookmark not defined. Danh mục các chữ viết tắt Error! Bookmark not defined. Danh mục bảng Error! Bookmark not defined. Danh mục hình Error! Bookmark not defined. 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 4 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 5 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá 7 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7 2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9 2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10 2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19 2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt 19 2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt 20 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 22 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25 3.1.1 Vật liệu 25 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25 3.2 ðịa ñiểm và thời gian: 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung ñiện 31 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) 31 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi: 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37 4.1.1 Thiết kế mồi 38 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39 4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42 4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens bằng xung ñiện 45 4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 46 4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6 - benzyladenine bp Base pair = cặp bazơ Bt Bacillus thuringiensis Cefo Cefotaxime CNSH Công nghệ sinh học cry Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ cs Cộng sự CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm DNA Deoxyribonucleic Acid EtBr Ethidium bromide GM Kan 30 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l GM Môi trường tái sinh chồi gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IBA Indole-3-butyric acid Kan Kanamycin kb kilo base kDa kilo Dalton LB Môi trường theo Luria và Bertani LSD Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) MT Môi trường OD Optical density = mật ñộ quang học PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase RM Môi trường ra rễ RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l RNA Ribonucleic Acid TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển TE Tris HCl - EDTA, pH = 8 Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u v/p Vòng/phút vip Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng diệt côn trùng vir Virulence region = vùng gây ñộc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai ñoạn 2004 - 2008 8 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38 4.2. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit 12 2.2 Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 14 4.1 Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39 4.2 Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.3 Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit 41 4.4 Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 43 4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 44 4.6 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI & SacI 45 4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc chọn lọc 48 4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48 4.9 Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 50 4.10 Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 50 4.11 Mảnh lá ð/C2 trên MT GM 50 4.12 Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 50 4.13 Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 50 4.14 Cụm chồi ð/C2 trên MT GM 50 4.15 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51 4.16 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51 4.17 Cây ð/C trên MT RM Kan 50 51 4.18 Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 51 4.19 Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii 4.20 Cây trong bầu trấu cát 53 4.21 Cây trồng trong bầu ñất 53 4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs 54 4.22b Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp mồi 35S Fs/Rs 55 4.23 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp mồi V2.1/V2.3 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá. Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật. Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]. Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó. Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu. Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A” 1.2 Mục ñích và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu của ñề tài: Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A) 1.2.2 Nội dung nghiên cứu: - Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A. - Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumerfaciens. - Theo dõi, kiểm tra và ñánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ ñối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [16], [20]... Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc ñến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng 6,5 - 8,5 triệu tấn (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng 0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47]. Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana. ðặc trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine... Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc ñóng lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng ñến ñỏ (N. tabacum) hay màu vàng ñến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95%. Mỗi cây có thể cho 200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30% protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống rất lâu [16], [20], [22]. 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá Trong lịch sử, cây thuốc lá ñược trồng ñầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm trước công nguyên và ñược sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh [16], [22]. Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt ñới và Á nhiệt ñới, hương vị ñặc biệt của nó ñã ñược biết ñến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách ñây trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20]. Sử viết về cây thuốc lá bắt ñầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi Christopher Columbus ñặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn ðộ Dương. Các thổ dân ở ñó ñã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi chúng ñược châm hút ñể mời ñoàn thám hiểm [16], [20]. Người Tây Ban Nha bắt ñầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồn hạt giống từ Mexico và sau ñó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn ñảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt ñầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau ñó phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác. Một số tài liệu ñáng tin cậy cho rằng thuốc lá ñược trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia ðịnh, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá ñiếu bắt ñầu ñược sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash ñầu tiên ñược du nhập và trồng thử ở An Khê, ñến năm 1940 trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình... [22]. 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 2.1.2.1. Rễ thuốc lá Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất ñịnh mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt ñất. Rễ trụ ñược hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh ñược phát sinh từ trục của rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40o. Rễ hấp thu ñược phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất ñịnh mọc từ thân, những rễ bất ñịnh ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi ñộ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày ñặc ở lớp ñất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin ñược vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá. 2.1.2.2 Thân cây Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể ñạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều ñốt, mỗi ñốt mang một lá. ðường kính thân ñạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ. 2.1.2.3 Lá thuốc lá Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay ñổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác. ðộ dày, màu sắc lá có thể thay ñổi. Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá bắt ñầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật. Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ. 2.1.2.4 Hoa Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, ñược hình thành do sự phân hoá của ñỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa. Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,.. 2.1.2.5 Quả và hạt Quả thuốc lá ñược hình thành trên ñài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14]. 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua.... Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon)... Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho rằng thiệt hại do bệnh và sâu ñối với thuốc lá khoảng 25 - 30%. Nếu sản lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 ñ/kg thì sâu bệnh hại ñã lấy ñi mất khoảng 100 tỷ ñồng/năm và mỗi phần trăm thu lại ñược từ phần thiệt hại này trị giá hàng tỷ ñồng [9]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích khác như: - Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin. - Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu. - Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm. - Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm. - Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao. - Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá. - Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin. - Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả Phomat Protein trong sữa [5]. 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản xuất ở các vùng từ 45o vĩ Bắc ñến 30o vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55]. Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn ñược sản xuất hàng năm, thuốc lá vàng sấy lò chiếm trên 60%, thuốc lá burley khoảng 15%, thuốc lá oriental gần 10% và một số chủng loại khác [48]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 Bảng 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới giai ñoạn 2004 - 2008 ðVT: ngàn tấn Năm Vàng sấy Burley Oriental Nâu Tổng 2004 3757,1 886,4 350,9 195,9 5190,3 2005 4035,6 771,8 353,1 181,9 5342,4 2006 3948,5 725,3 268,5 182,1 5124,4 2007 3872,6 620,6 237,0 185,5 4915,7 2008 4185,9 743,5 259,0 184,3 5372,7 Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48] Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế giới những năm qua tương ñối ổn ñịnh, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở các nước chịu nhiều áp lực. 2.1.6.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá lá ở Việt Nam Hiện nay, thuốc lá ñược trồng ở nhiều ñịa phương trong cả nước (27/64 tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong ñó thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu ñược trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay chiếm tỷ trọng ñến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội ñịa. Các ñịa phương trồng thuốc lá vàng sấy chủ yếu hiện nay là Cao Bằng, Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, ðắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên. Tổng diện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao ñộng ở khoảng 14 - 16 ngàn ha với sản lượng hàng năm ước ñạt từ 22 - 26 ngàn tấn. Tại khu vực phía Bắc, năng suất ñạt 1,5 - 1,8 tấn/ha. Năng suất bình quân tại các tỉnh phía Nam hiện nay ñạt khoảng 1,8 - 2 tấn/ha [9], [15]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 Bảng 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 Năm 2006 2007 2008 TT ðịa ñiểm DT SL NS DT SL NS DT SL NS I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58 II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82 Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69 Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15] Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha) Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước trong những năm qua tương ñối ổn ñịnh. Theo ñánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương ñối tốt, có thể thay thế ñược nguyên liệu Trung Quốc. Vì vậy việc phát triển sản xuất thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa là một việc làm cần thiết trong giai ñoạn hiện nay. Nó vừa giúp cho ngành sản xuất thuốc lá trong nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công ăn việc làm cho một bộ phận ñông ñảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân sách và tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước. 2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 2.2.1 Khái niệm chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12]. Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng ñịnh tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hoá cho các tính Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 trạng nhất ñịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình ñiều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt ñộng của gen. 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. 2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm - Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn - Chuyển gen nhờ súng bắn gen - Chuyển gen nhờ silicon carbide 2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm 1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây... ðặc biệt là khi nhược ñiểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và ñược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng gây ñược sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới. * ðặc ñiểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium thì A. tumerfaciens ñược sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. Phân loại khoa học: Giới Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A. tumefaciens Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens. (Smith & Townsend, 1907) [52]. A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau ñó sử Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………12 dụng bộ máy thực vật ñể biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần ñiểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi ñó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một ñoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine goi chung là opine. Các chất này không hề có trước ñó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn ñã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền. Hình 2.1. Cấu trúc Ti- Plasmit (nguồn : Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti- plasmit có trong vi khuẩn A. tumerfaciens. Ti-plasmit này có ñặc ñiểm chung như sau: Ti-plasmit là một plasmit ñược cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản ñộc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………13 Trên Ti-plasmit có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là ñoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp opine. ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmit còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt ñộng lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hoá opine [13]. Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá opine trên Ti-plasmit. Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn: Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất ñộc vết thương có bản chất phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương ñồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển ñoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với genom cây chủ. Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumerfaciens sang tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G, F. Các gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS). Tín hiệu hoá học ñược nhận biết ñầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………14 màng tế bào ñể ñáp ứng sự trao ñổi chất của vết thương trên cây. Protein Vir A tự photphoryl hoá ñồng thời làm cho protein Vir G ñược photphoryl hoá (Jin và CS 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H (Ziemienowcz 2001). Hình 2.2. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium (1). Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2). Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật ñặc trưng;(3). Sự hoạt hoá của vùng gen vir; (4). T-DNA ñược tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2; (5). Sự tạo thành phức hợp VirD2-DNA (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir khác, ñi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6). Sự kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục ñi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7). Phức hợp-T thành thục chủ ñộng ñi vào nhân tế bào chủ; (8). T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9). T- DNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10). T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ. Tiếp ñó các protein ñược mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA. Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998). ðồng thời thực hiện chức năng này có các protein Vir C1, Vir C 2 có tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………15 Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào nhân tế bào. ðồng thời protein Vir B4, Vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000). Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên. Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn ñất ñể chuyển các gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây ñộc cho cây. Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4]. Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmit: Ti-plasmit ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung gian) ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit. Plasmit trung gian là một plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược ở Agrobacterium. Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng. Khi cho tương tác hai loại plasmit này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn ñất. Do tần số ñưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10- 7 -10-5) nên vector này ít ñược sử dụng (John Draper, 1882). Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmit) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium. Một plasmit tách Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………16 dòng từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmit này ñược gọi là plasmit hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12]. Thiết kế vector Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium và khả năng tự nhiên của chúng trong việc biến ñổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong muốn vào tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên (T- DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ. Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ các gen tổng hợp opine. Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn DNA mục tiêu. Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli. Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ thị ñể chọn lọc cây và vi khuẩn. Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này ñược gọi chung là các vector. Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm: * Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn. * Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………17 * Vùng kết thúc (terminator). * Vùng gắn gen chuyển vào (MCS). * Vùng chứa gen chọn lọc (ñể tách các tế bào chuyển gen). * Vùng chứa các gen báo cáo ñể biết ñược các gen chuyển vào có thành công không (gus, gfp - gen phát huỳnh quang). Quy trình nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens như sau: Bước 1: Thiết kế vector mang gen. Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli. Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp vào A. tumerfacien. Bước 4: Lây nhiễm A. tumerfaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực vật ñể tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào ñích. Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào ñược biến nạp thành công. Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh. Sau ñó, từ những cây chuyển gen thu ñược cần ñánh giá sự ổn ñịnh di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính ñể thu ñược con cái mang gen mong muốn. ðồng thời ñánh giá tác ñộng của cây chuyển gen ñể ñưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [13]. Sàng lọc cây sau chuyển gen: ðể tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang gen ñược chuyển vào, thông thường trong các nghiên cứu ñều sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ sung những chất mà chỉ có tế bào có tính trạng chọn lọc nhất ñịnh mới có thể sinh trưởng ñược, ñó là những gen kháng kháng sinh. Các kháng sinh ñược sử dung phổ biến ñể chọn lọc các thể biến nạp plasmit tái tổ hợp là ampicilin, chloramphenicol, gentamixin, kanamycin, rifamicin, spectinomycin, tetracycline. Ở hệ biêu hiện là nấm thì gen chỉ thị chọn lọc dựa vào nguồn dinh dưỡng là LEU2, TRP1, URA3, HIS3.... Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………18 2.2.2.3 Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen trên thế giới Công nghệ sinh học phát triển ñã tạo ñiều kiện ñể các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu chọn tạo giống kháng sâu bằng cách chuyển gen mã hoá các ñặc tính mong muốn vào cây trồng. Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen ñầu tiên nhờ vi khuẩn A. tumefaciens vào cây trồng ñầu tiên ñược thực hiện. Năm 1986, các thử nghiệm ñầu tiên trồng cây biến ñổi gen trên ñồng ruộng ở một số quốc gia. Năm 1990, chuyển gen bất dục ñực cho ngô bằng súng bắn gen và thực phẩm biến ñổi gen ñược chấp thuận ở Mỹ lần ñầu tiên. Năm 1994, giống cà chua Flavor Saver mang gen chín chậm, là sản phẩm cây trồng chuyển gen ñầu tiên ñược thương mại hoá. Năm 1998, lần ñầu thành công việc chuyển ñồng thời 10 gen vào một cây. Toàn cầu có 48 giống cây chuyển gen ñược phép thương mại hoá (trong ñó Mỹ có 35 giống) [38]. Năm 1999, chuyển gen cho lúa có giá trị dinh dưỡng cao hơn. Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu lớn hơn 40 triệu ha [11]. Năm 2006 ñược ghi nhận là năm ñầu tiên của thập niên thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015. Năm 2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng 100 triệu ha (250 triệu mẫu Anh), khi lần ñầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3 triệu) tại 22 nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5 triệu nông dân tại 21 nước năm 2005. Tỷ lệ chấp nhận cao chưa từng thấy là minh chứng cho sự thật và sự tin tưởng của hàng triệu nông dân nhỏ và lớn vào cây trồng chuyển gen ở các nước công nghiệp và ñang phát triển [51]. Năm 2007, Hoa Kỳ, Ac-hen-ti-na, Brazil, Canada, Ấn ðộ và Trung Quốc tiếp tục là những nước trồng cây công nghệ sinh học (CNSH) chủ yếu trên thế giới. Hoa Kỳ là nước có diện tích canh tác cây trồng cây CNSH dẫn ñầu thế giới, tuy nhiên tỉ lệ diện tích ñất trồng cây CNSH của Hoa Kỳ so với toàn cầu ñang giảm do diện tích canh tác cây trồng CNSH trên toàn cầu ngày Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………19 một mở rộng [51]. Tám nước dẫn ñầu trồng hơn 1 triệu ha, sắp xếp theo diện tích giảm dần là Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Ac-hen-ti-na (21 triệu ha), Brazil (15,8 triệu ha), Ấn ðộ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha), Paraguay (2,7 triệu ha) và Nam Phi (1,8 triệu ha). ðậu tương CNSH là giống cây chính ñược trồng trong năm 2008 với diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích ñất trồng cây CNSH trên toàn cầu, tiếp theo là ngô CNSH (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông CNSH (15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện tích ñất trồng cây CNSH trên toàn cầu). Hiện nay ñã có 25 quốc gia cho phép trồng cây CNSH và 30 quốc gia khác ñã cho phép nhập khẩu các sản phẩm CNSH sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, ñưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng cây CNSH lên 55 nước. Diện tích trồng tăng 74 lần từ năm 1996 ñến nay ñã khiến cây CNSH nhanh chóng trở thành công nghệ cây trồng ñược ứng dụng nhanh nhất. Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5 tỷ USD với tổng giá trị tích luỹ ñạt 50 tỷ USD từ năm 1996 ñến 2008 [51]. 2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bacillus thuringiensis Shigetane Isiwata, nhà sinh học người Nhật Bản ñã phát hiện ra vi khuẩn này năm 1901 từ ấu trùng tằm bị bệnh. Sau ñó, Ernst Berliner (1911) ñã phân lập vi khuẩn này từ ấu trùng Ephetia kuniella bị bệnh và ñặt tên là Bacillus thuringiensis (Bt), (vi khuẩn ñất ñiển hình ñược phân lập ở vùng Thuringia, ðức) ðến năm 1915, Berliner ñã phát hiện sự có mặt của tinh thể trong Bt nhưng hoạt tính của chúng chưa ñược xác ñịnh. Bảng phân loại Bt: [56] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………20 Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: thuringiensis Bt là vi khuẩn ñược phân lập từ ñất, có khả năng sinh ra các protein thể vùi dạng tinh thể trong quá trình sinh bào tử. Sau ñó ñến những năm của thập kỷ 50, các nhà khoa học mới phát hiện ra cấu trúc tinh thể của các ñộc tố gây tê liệt bộ máy tiêu hoá của côn trùng (Steinhaus, E.A, 1951) [44]. Hannay (1953) [31] ñã phát hiện ra cấu trúc của các tinh thể gây ñộc cho côn trùng và ñặt tên là nội ñộc tố δ. Một số loài vi khuẩn khác cũng có khả năng sinh ra các nội ñộc tố gây chết các loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng và bộ hai cánh. Chúng ñược sử dụng ñể sản xuất thuốc trừ sâu sinh học trong suốt 40 thập kỷ qua (Lambert và Peferoen, 1992). ðã có 67 chế phẩm Bt ñược ñăng ký với trên 450 công thức khác nhau (Shewry và Gutteridge, 1992) [54]. Gen mã hoá nội ñộc tố ñã ñược nhân vô tính từ thập kỷ 80 (Schnepf và Whitley, 1981) [43], ñược chuyển vào cây thuốc lá và cây cà chua (Barton và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) ñể biểu hiện tính kháng côn trùng [54]. Từ ñó cho ñến nay có rất nhiều thành tựu nghiên cứu về cây chuyển gen cũng như các ñộc tố diệt côn trùng. 2.3.2 Các loại protein ñộc tố của Bt 2.3.2.1 Nội ñộc tố δ (cry) và cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt + Phân loại: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………21 Do cấu trúc tinh thể tự nhiên của các protein nên chữ cry ñược sử dụng như thuật ngữ cho các protein và gen. Ban ñầu, các nhà khoa học phân ra 4 nhóm gen ñộc tố theo sự tương ñồng của trình tự gen và loài côn trùng ñặc hiệu (Hofte H và Whiteley HR, 1989) [32]. Các gen cryI mã hoá protein 130 kDa, thường ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea). Các gen cryII mã hoá protein 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh (Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV ñặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera). Sau ñó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng (Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992) Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ñộc tố (gồm 140 gen ñã ñược công bố) ñược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera). + Cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao (môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ñộc tố δ (Hoftey, H. và Whiteley, H.R, 1989) [33]. Mục tiêu chính của ñộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels, 1994) [34], [35]. Các tiền ñộc tố không hoạt ñộng cho ñến khi chúng bị hoà tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa, 1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37], [39], [46]. Các ñộc tố gắn vào chất nhận ñặc hiệu ở trong màng của tế bào biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, ñộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh của tế bào ñể gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao ñổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành ñộc tố sẽ tạo thành các lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ñổi ion nhanh chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22 1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993) [34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn trùng chết ñói hoặc nhiễm trùng ñường tiêu hoá. 2.3.2.2. ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng + Phân loại: Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25], [26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm chính: Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy + Cơ chế tác ñộng của VIP Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21]. 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) [28]. Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần 1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23 thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994). 100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs (1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh (H. armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hoặc cry1A(c). Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan 2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53]. Mới ñây nhất, Thủ tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020. Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm. Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit vector. Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá. Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24 30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A. tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0. Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 3.1.1 Vật liệu - Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau: Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày; thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt. Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước. - Các vật liệu khác: + Các plasmit Plasmit Kích thước (bp) ðặc tính Nơi cung cấp pCR@ 2.1-TOPO 3900 Ampiciline Kanamycine hãng Invitrogen pBI121 13000 Kanamycine Phòng CNTBTV + Nguồn gen vip3A do phòng Công nghệ tế bào thực vật phân lập + Chủng khuẩn: Chủng DH5α (E.coli) và C58 (A. tumerfaciens) 3.1.2 Hoá chất, thiết bị - Các enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI - Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp - Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine.... và các hoá chất thông dụng khác - Thiết bị máy móc: Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy ño pH, bộ ñiện di, máy PCR, bể ổn nhiệt.... Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………26 3.2 ðịa ñiểm và thời gian - ðịa ñiểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 ñến tháng 9 năm 2009 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 3.3.1.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn - Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani) Yeast extract 5g/l Trypton 10 g/l NaCl 10 g/l Bacto agar(cho môi trường ñặc) 15g/l pH 7 - Phương pháp nuôi cấy: Khuẩn giữ trong glycerol ñược lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi lắc 200v/p ở 37oC qua ñêm. Sau ñó cấy ria trên ñĩa petri chứa LB ñặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt ñộ và thời gian thích hợp. - Giữ chủng: Bổ sung glycerol vô trùng ñến nồng ñộ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua ñêm, trộn ñều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và giữ chủng ở ñiều kiện -800C. 3.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmit của vi khuẩn E.coli a. Hoá chất sử dụng: Dung dịch I: - 50 mM glucose - 25 mM Tris HCl pH 8,0 - 10 mM EDTA pH 8,0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………27 Dung dịch II: - 0,2 N NaOH - 1% SDS Dung dịch III: - 60 ml kali acetate 5M - 28,5 ml H2O Dung môi loại protein: - Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1) - chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - TE 0,01M pH 8,0 b/ Quy trình: - Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua ñêm ở 37oC, 200 v/p. - Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf loại 2 ml và ñem ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4oC ñể thu tế bào. - Cặn ñược hoà trong 100 µl dung dịch I . - Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, ñảo nhẹ nhàng - Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, ñảo nhẹ nhàng - Thêm 550 µl dung dịch Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 : 24 : 1), ñảo nhẹ nhàng - Ly tâm 12.000 v/p, 4oC, 15 phút. - Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) - Bổ sung 1ml cồn tuyệt ñối và 10 µl 3M Sodium acetate, ñể lạnh -200C trong 3 giờ sau ñó ly tâm 12.000v/p trong 15 phút ñể thu DNA - Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 40 µl TE 0,01M, giữ ở -200C Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………28 - Bổ sung RNase vào mẫu ñến nồng ñộ cuối cùng là 100 µg/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiết lại bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa bằng cồn 100% - ðiện di trên gel agarose 0,8% ñể xác ñịnh ñộ sạch của DNA. 3.3.1.3 Phương pháp ñiện di DNA trên gel agarose Các ñoạn DNA có khối lượng và ñiện tích khác nhau ñược tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng ñiện trường có ñiện thế và cường ñộ thích hợp a. Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch ñệm TAE 1X (Tris HCl, EDTA ...); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, ñệm tra mẫu 10X. b. Quy trình: - Chuẩn bị gel agarose: cho 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc ñều và ñun cho agarose tan hoàn toàn, ñể nguội ñến khoảng 50 - 60oC, ñổ dung dịch vào khay ñiện di có cài sẵn răng lược, ñể gel ñông cứng, rút lược và ñặt bản gel vào bể ñiện di, ñổ dung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm - Tra mẫu và ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với ñệm tra mẫu 10X theo tỷ lệ 1: 10, mix ñều và tra vào giếng, chạy ñiện di với thang DNA chuẩn ñể xác ñịnh trọng lượng phân tử DNA - Nhuộm bản gel: bản gel ñược lấy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút trong dung dịch nước có chứa EtBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh ñược chụp bằng máy soi gel. 3.3.1.4 Tinh sạch DNA từ bảng gel agarose a. Dụng cụ và hoá chất: - Cột thôi gel; eppendorf; tip các loại... - Dung dịch QG (solubilization buffer), dung dịch PE (washing buffer), dung dịch EB (elution buffer) hoặc nước cất khử ion .. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………29 b. Tiến hành: ðiện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy ñoạn gel chứa ñoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ 1Vmẫu : 3VQG và ủ trong 50oC trong 15 phút. Sau khi gel tan hoàn toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực ñại trong 1 phút và loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 1 phút. Bổ sung tiếp 750 µl dung dịch PE vào cột, ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút. Sau ñó ly tâm cực ñại 1 phút, ñổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút ñể loại bỏ hết PE. Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 µl nước cất. 3.3.1.5 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn Các vector ñược xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng: + Với một enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,5 - ðệm 10X riêng của enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme (10 U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 + Với hai enzyme Thành phần Thể tích (µl ) - H2O 5,0 - ðệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme 1,0 - DNA plasmit 3,0 - Enzyme 1 (10U/l) 0,5 - Enzyme 2 (10U/l) 0,5 - Tổng thể tích phản ứng 10,0 Phản ứng ñược ủ ở 37oC trong 3 -5 giờ. Sản phẩm cắt ñược kiểm tra bằng ñiện di trên gel agarose 0,8%. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………30 3.3.1.6 Phản ứng ghép nối ñoạn gen với vector: ðoạn DNA cần nối ghép và vector ñã ñược mở vòng ñược trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử. T4 ligase ñược cho vào phản ứng với nồng ñộ 1 ñơn vị/10µl phản ứng. Hỗn hợp phản ứng ñược trộn theo thứ tự: Thành phần Thể tích (µl ) - H20 1,5 - ðệm T4 ligase 10X 1,5 - ðoạn gen cần gắn 7,0 - Vector ñã mở vòng 3,0 - r ATP 1,0 - T4 ligase 1,0 - Tổng thể tích 15,0 Phản ứng ñược ủ qua ñêm ở 14oC 3.3.1.7 Biến nạp DNA plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ñược tiến hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất hoặc ñiện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN có thể chui vào. a. Chuẩn bị tế bào khả biến: Chủng khuẩn ñược cấy ria trên môi trường LB ñặc và nuôi qua ñêm ở 37oC, sau ñó lấy một khuẩn lạc ñơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37oC qua ñêm. Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 37oC khoảng 3 giờ cho ñến khi OD 660nm ñạt từ 0,6 - 0,8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm ñã giữ lạnh trên ñá và ly tâm 6000 v/p, 10 phút. Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl 2 0,1M . Chia vào mỗi ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung thêm 50 µl glycerol 60%, làm ñông nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -80 oC. Sau ñó, các tế bào ñược phục hồi trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………31 môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp ñược phát hiện trên môi trường thích hợp. Cấy trải lên ñĩa môi trường LB không có kháng sinh ñể kiểm tra. b. Biến nạp DNA plasmit vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt. - Bổ sung 5 µl ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 µl tế bào khả biến ñã ñể trên ñá 30 phút, giữ trên ñá 30 phút. - Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong ñá 5 phút. - Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ. - Cấy trải dịch tế bào lên trên ñĩa LB ñặc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua ñêm ở 37oC. 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung ñiện - Chuẩn bị tế bào A. tumefaciens khả biến trong các cuvet ñã khử trùng. - ðặt các ống cuvet ñã khử trùng vào ñá. - Bổ sung 5 µl plasmit tái tổ hợp vào 100 µl ñựng sẵn tế bào A. tumefaciens khả biến - ðảo nhẹ, ñặt trong ñá trong 5 phút, chuyển dịch sang ống cuvet mới - Xung ñiện: 2,5kw; 25 µF và 400 Ω trong 4 - 5 µ - Chuyển ngay ống dịch vào ñá, sau 5 phút, bổ sung 1 ml môi trường YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bào sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong 28oC trong 1 giờ - Cấy trải 100 µl tế bào vào ñĩa chứa môi trường chọn lọc và nuôi từ 24- 48 giờ. 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 ) Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy cây thuốc lá chuyển gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………32 Môi trường Thành phần cơ bản MS Môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog 1962) Tái sinh chồi (GM) MS + 1 mg/l BAP + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Ra rễ (RM) MS + 0,1 mg/l IBA + 30g/l Sacrose + 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc chồi (GM Kan 50) GM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan+ 8g/l agar. pH = 5,8 Chọn lọc cây (RM Kan 50) RM + 400 mg/l cefo + 50 mg/l kan + 8g/l agar. pH = 5,8 Quy trình tái sinh cây thuốc lá từ mảnh lá 3.3.3.1 Tạo dịch huyền phù A.tumerfaciens Chủng vi khuẩn A.tumerfaciens có chứa vector quan tâm bảo quản trong glycerol trong ñiều kiện lạnh sâu (-80oC) ñược cấy sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC qua ñêm, sau ñó cấy vạch trên môi trường LB ñặc có kháng sinh thích hợp, nuôi trong ñiều kiện tối, 28oC trong 2 ngày. Chọn một khuẩn lạc tròn, ñều, ñứng ñộc lập ñể cấy chuyển sang 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc 200 v/p, 37oC trong 7 - 8 giờ, hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua ñêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong ñiều kiện 37oC. Dịch khuẩn thu ñược có OD660nm từ 0,6 - 1 là ñủ ñiều kiện ñể biến nạp 3.3.3.2 Biến nạp Từ những cây thuốc lá invitro, chọn những lá bánh tẻ, cắt các mảnh lá có kích thước khoảng 1cm2 và ñặt trong môi trường tái sinh ña chồi (GM) Môi trường tái sinh ña chồi (GM) Môi trường ra rễ (RM) Môi trường trấu cát (1: 1) Mảnh lá thuốc lá (MS) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………33 trong 2 ngày. Sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên GM, các mảnh lá ñược chuyển sang môi trường MS lỏng (khoảng 5 ml), ñổ dịch huyền phù vi khuẩn vào bình chứa các mảnh lá và lắc nhẹ nhàng. Sau 10 phút gắp các mảnh lá lên giấy thấm vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường GM , ñồng nuôi cấy 2 ngày, sau ñó cấy chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh ña chồi chọn lọc GM Kan 30. 3.3.3.3 Chọn lọc chồi sau biến nạp Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 cấy chuyển sang môi trường tái sinh ña chồi có bổ sung kháng sinh thích hợp ñể tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh. 3.3.3.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi ñộc lập, có 2 - 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (RM Kan 50). Sau 3 tuần, từ những cây tái sinh hoàn chỉnh và phát triển tốt trên môi trường ra rễ chọn lọc tiếp tục cấy chuyển sang môi trường ra rễ chọn lọc lần 2 ñể thu cây hoàn chỉnh. 3.3.3.5 Ra cây trên giá thể trấu cát: Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm ñể ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu ñất trong nhà lưới. 3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Sau khi trồng vào bầu ñất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá ñể phân tích cây chuyển gen. 3.3.4.1 Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá thuốc lá a. Hoá chất sử dụng: Thành phần dung dịch ñệm Shorty buffer: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………34 1. 0,2 M Tris - HCl, pH = 9,0 2. 0,4 M LiCl 3. 25 mM EDTA 4. 1% SDS 5. Nước de ion b. Quy trình - Nghiền mẫu lá trong Eppendorf loại 2 ml bằmg Nitơ lỏng thành dạng bột mịn - Bổ sung 500 µl dịch ñệm “Shorty buffer” - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Hút 350 µl dịch nổi chuyển sang Eppendorf loại 1,5 ml có chứa sẵn 35 µl iso-propanol - Mix bằng cách ñảo ngược các ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút - Loại dịch nổi - Bổ sung 700 µl cồn 70%/ống - Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút - Loại bỏ dịch nổi - Làm khô bằng không khí - Bổ sung 50 µl nước ñề ion, lắc nhẹ cho mẫu tan 3.3.4.2 Phản ứng PCR - Thành phần 1 phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất hai lần 10,3 ðệm (10X) 2,0 MgCl2 2,0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………35 dNTPs 1,6 Taq polymerase 0,5 Primer F 0,8 Primer R 0,8 DNA mẫu 2,0 Tổng 20,0 - Chương trình thực hiện phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt ñộ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 2 Biến tính 94 * 3 Bắt cặp * * 4 Kéo dài 72 * 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Từ bước 2 ñến bước 4 thực hiện 35 chu kỳ Ghi chú: *các thông số thay ñổi theo cặp mồi ñặc hiệu Các thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, lặp lại 3 lần, mỗi thí nghiệm bao gồm 50 mẫu. Thí nghiệm ñược ñặt trong ñiều kiện ánh sáng ñiện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt ñộ trong phòng duy trì ở mức 26oC. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………36 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi ∑ số mảnh lá tái sinh ña chồi Tỷ lệ mảnh lá tái sinh ña chồi (%) = x 100 ∑ số mảnh lá biến nạp ∑ số cụm chồi tiếp tục tái sinh ña chồi Tỷ lệ cụm chồi tái sinh (%) = x 100 ∑ số cụm chồi sau biến nạp ∑ số chồi ra rễ Tỷ lệ cây ra rễ (%) = x 100 ∑ số chồi ñưa vào chọn lọc ∑ số cây sống sót Tỷ lệ cây sống sót (%) = x 100 ∑ số cây ñưa ra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………37 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A ðể tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen vip3A, việc thiết kế vector mang gen vip3A ñể chuyển vào cây trồng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo cây chuyển gen. Sơ ñồ 4.1: Sơ ñồ thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A Gen vip thuộc nhóm gen mã hoá protein Vip (vegetative insecticidal protein) (protein có trọng lượng phân tử 80 - 90 kDa) xuất hiện trong pha sinh trưởng sinh dưỡng và sinh sản của chu trình phát triển của vi khuẩn Bt, gây 35S gus NOST BamHI SacI S¶n phÈm PCR vip3A vip3A BamHI SacI Bam HI & SacI BamHI SacI 35S NOST BamHI SacI T4 ligase 35S NOST vip3A Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………38 ñộc với hầu hết côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptea), ngoài ra còn gây ñộc ñối với một số côn trùng bộ cánh cứng (Coleoptera) và hai cánh (Diptera). Trong nhóm gen vip thì gen vip3A ñược ñặc biệt quan tâm nghiên cứu vì chúng mã hóa cho các protein có hoạt lực diệt sâu mạnh cùng với phổ hoạt ñộng rộng. Protein Vip3A có thể kháng cả một số côn trùng thuộc bộ cánh vảy mà protein Cry hầu như không có tác dụng. Gen sử dụng trong thí nghiệm là kết quả phân lập của nhóm nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện công nghệ sinh học. Gen mã hóa cho protein có kích thước 2369 bp, mã hoá 793 axít amin, ñược công bố trên ngân hàng gen quốc tế (mã số AJ971413). 4.1.1 Thiết kế mồi ðể nhân thành công một gen, ñiều kiện ñầu tiên là có cặp mồi ñặc hiệu của gen ñó. Cặp mồi ñặc hiệu V2.1 và V2.2 ñược thiết kế ñể nhân gen vip3A dựa trên cơ sở trình tự gen vip3A ñã ñược công bố (phụ lục 2). Ngoài ra mồi V2.3 ñược thiết kế thêm ñể kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong cây sau khi chuyển gen. Các mồi này có những trình tự và thông số cần thiết thể hiện trên bảng 4.1. Bảng 4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A STT Trình tự mồi Tm %GC Vị trí gắn V2.1 5'-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3' 61oC 42,8 1 - 20 V2.2 5'-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3' 62,5oC 42,8 2350-2370 V2.3 5'-GGAGAGCCATCCTTTTTTACTT-3' 55oC 40,9 579 - 605 Trên cặp mồi nhân vip3A ñược thiết kế thêm ñiểm cắt của 2 enzyme giới hạn là BamHI và SacI ñể phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này. Mồi xuôi (V2.1) gắn từ vị trí 1 ñến vị trí 20, mồi ngược (V2.2) gắn từ vị trí số 2370 về vị trí số 2350, mồi ngược V2.3 gắn từ vị trí 605 về vị trí số 579. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………39 GGATCC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn BamHI GAGCTC: ñiểm cắt của enzyme giới hạn SacI 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR Theo lý thuyết, nếu ta cung cấp cặp mồi ñặc hiệu thì sẽ nhân chính xác ñược ñoạn gen nằm giữa hai mồi ñó. Cặp mồi ñược thiết kế ñể nhân toàn bộ gen vip3A có kích thước 2370 bp, nếu phản ứng PCR xảy ra ñặc hiệu thì theo lý thuyết sẽ thu ñược băng duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR cho thấy ñoạn DNA mã hoá protein Vip3A ñã ñược nhân lên một cách ñặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất có kích thước khoảng 2,4 kb, phù hợp với kích thước gen vip3A dự kiến. Sản phẩm PCR sau ñó ñược tinh sạch theo bộ Kit thôi gel (Gel purification Kit) của hãng Bioneer và ñiện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch. Kết quả ñược thể hiện trên hình 4.1. Hình 4.1: Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 1: marker 2: Tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A Ảnh chụp cho thấy một băng duy nhất có kích thước 2,4 kb, không có 2,4 kb 2,0 kb 2,5 kb 1 2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………40 vạch phụ chứng tỏ sản phẩm sau tinh sạch ñạt yêu cầu ñể dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng Sản phẩm tinh sạch PCR ñược gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR@ 2.1-TOPO của hãng Invitrogen ñược cung cấp ở dạng mạch thẳng có bazơ thiamin nhô ra ở ñầu 3'. Do ñặc tính của Taq - polymerase nên sản phẩm PCR có ñến hơn 70% là có thêm bazo Adenin ở ñầu 3' do vậy việc liên kết giữa gen và vector có hiệu quả cao. Phản ứng nối ghép ñược ủ qua ñêm ở nhiệt ñộ 14oC ñể thu plasmit tái tổ hợp. 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Sản phẩm của phản ứng ghép nối ñược biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α theo phương pháp sốc nhiệt (Cohen và cộng sự, 1972), sau ñó ñược cấy trải trên môi trường LB ñặc có bổ sung ampicillin (100 µg/l), X- gal (100 µg/l) và chất cảm ứng IPTG 0,1M, nuôi qua ñêm. Kết quả ñược thể hiện trên hình 4.2. Hình 4.2 : Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Trên ñĩa nuôi cấy thu ñược cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Khuẩn lạc xanh là do trong vector pCR@ 2.1-TOPO có chứa gen lacZ, nếu hoạt ñộng bình thường sẽ tổng hợp enzyme β - galactosidase và dưới sự cảm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………41 ứng của IPTG chuyển hoá cơ chất X - gal thành hợp chất có màu xanh. ðó là những vi khuẩn không có ñoạn DNA ngoại lai chèn vào. Khuẩn lạc trắng là do gen lacZ ñã bị ñoạn gen DNA ngoại lai chèn vào giữa nên không tổng hợp ñược enzyme β - galactosidase và ñây có thể là những khuẩn lạc có thể chứa plasmit tái tổ hợp. 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp Việc kiểm tra xem các khuẩn lạc có chứa các plasmit tái tổ hợp hay không là việc rất quan trong ñể chọn vật liệu chính xác cho các thí nghiệm tiếp theo. Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc trắng, nuôi lỏng và tách chiết DNA plasmit, ñiện di trên agarose 0,8%, sau ñó cắt kiểm tra bằng hai enzyme BamHI và SacI. Kết quả ñiện di sản phẩm cắt thể hiện trong hình 4.3. Hình 4.3: Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit 1: Marker 2 - 11: Các plasmit tách từ khuẩn lạc trắng ñược cắt bằng BamHI và SacI : 12: Plasmit tách từ khuẩn lạc xanh ñược cắt bằng EcoRI 13: Plasmit tách từ khuẩn lạc trắng ñối chứng không cắt Các plasmit tái tổ hợp ñược tách từ khuẩn lạc trắng sau khi ñược cắt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………42 bằng hai enzyme giới hạn BamHI và SacI cho ra hai băng DNA có kích thước khác nhau, băng trên có kích thước khoảng 3,9 kb, là kích thước của vector pCR@ 2.1-TOPO, băng ở phía dưới có kích thước khoảng 2,4 kb, tương ñương với kích thước sản phẩm PCR của gen vip3A. Như vậy chứng tỏ ñiểm cắt hai enzyme BamHI và SacI ñã có mặt trong hai ñầu ñoạn gen vip3A. Khuẩn lạc xanh ñược cắt bằng enzyme EcoRI thì cho một băng duy nhất có kích thước 3,9 kb. Như vậy có thể kết luận việc nối ghép sản phẩm PCR và vector tách dòng ñã ñạt kết quả mong muốn. Chọn một dòng khuẩn lạc dương tính ñã ñược kiểm tra chính xác trình tự gen vip3A ñể làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A Vector pBI121 có kích thước 13,0 kb ñược thiết kế dựa trên cấu trúc của vector pBIN19, một vector chuyển gen vào thực vật. Vector pBI121 mang một vị trí cắt duy nhất của BamHI và SacI ở hai ñầu gen gus (phụ lục 3) Plasmit tái tổ hợp cũng có vị trí cắt duy nhất của hai enzyme giới hạn BamHI và SacI nên chúng tôi tiến hành cắt ñồng thời vector pBI121 và plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI và SacI. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt của pBI121 sẽ có hai băng tương ứng với kích thước khoảng 11,2 kb và 1,8 kb (kích thước của gen gus). Sản phẩm cắt của plasmit tái tổ hợp sẽ có hai băng khoảng 3,9 kb (tương ứng với kích thước của vector pCR@2.1 gốc) và 2,4 kb (kích thước của gen vip3A). Kết quả ñiện di thể hiện trên hình 4.4. ðường chạy số 2 là kết quả cắt của plasmit tái tổ hợp tương ứng với kích thước khoảng 3,9 kb và 2,4 kb. ðường chạy số 3 là sản phẩm cắt của pBI121, chỉ xuất hiện hai băng có kích thước tương ứng là 11,2 kb và 1,8 kb. Như vậy kết quả cắt enzyme hoàn toàn phù hợp với dự ñoán theo lý thuyết, chứng tỏ kết quả cắt enzyme tốt. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………43 Hình 4.4: Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 1: Marker 2: Vector tách dòng 3: Vector pBI121 Trên sản phẩm cắt của pBI121 thôi và tinh sạch ñoạn gel có kích thước 11,2 kb (vector pBI121 ñã loại bỏ gen gus). Trên sản phẩm cắt của vector tái tổ hợp thôi và tinh sạch ñoạn gel có kích thước 2,4 kb (gen vip3A). Hai sản phẩm này sẽ ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối bằng enzyme T4 ligaza và biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α, cấy trải trên môi trường LB ñặc có bổ sung kháng sinh Kan nồng ñộ 25 mg/l và ủ ở 37oC qua ñêm. Chọn ngẫu nhiên 14 dòng khuẩn lạc mọc trên ñĩa môi trường có kháng sinh chọn lọc, tách plasmit, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ñặc hiệu nhân gen vip3A nhằm tìm ra chính xác dòng khuẩn lạc mang vector pBI121 tái tổ hợp mong muốn. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR ñược thể hiện trên hình 4.5. Kết quả trên hình 4.5 cho thấy chỉ có duy nhất dòng số 13 xuất hiện băng có kích thước 2,4 kb, tương ứng với kích thước của gen vip3A chứng tỏ dòng số 13 mang cấu trúc vector pBI121/vip3A tái tổ hợp. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………44 Hình 4.5: Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 1: marker; 2 - 15: 14 dòng khuẩn lạc Tách plasmit của dòng số 13 ñể dùng làm vật liệu tiến hành phản ứng cắt kiểm tra bằng BamHI và SacI. Kết quả ñiện di sản phẩm cắt của dòng khuẩn lạc số 13 ñược thể hiện trên hình 4.6. Trên ñường chạy số 2 xuất hiện hai băng: một băng có kích thước 11,2 kb (kích thước của pBI121 ñã cắt gen gus); một băng có kích thước 2,4 kb (kích thước gen vip3A), phù hợp với dự ñoán lý thuyết. Từ những kết quả trên có thể kết luận chính xác dòng khuẩn lạc số 13 mang vector pBI121 tái tổ hợp mong muốn. Dòng khuẩn lạc này ñược giữ chủng ñể làm vật liệu cho các nội dung thí nghiệm tiếp theo. Như vậy vector chuyển gen pBI121 tái tổ hợp mang gen vip3A ñã ñược thiết kế tthành công, ñặt tên là pBI121/vip3A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………45 Hình 4.6: Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzyme BamHI & SacI 1: Marker; 2: pBI121 /vip3A cắt bằng BamHI & SacI 4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens bằng xung ñiện Chuyển gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens là phương pháp phổ biến ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống cây trồng. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương pháp chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens. Sau khi thiết kế thành công vector mang gen vip3A, vector mang gen vip3A ñược biến nạp vào vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58. Plasmit tái tổ hợp ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn mang vector pBI121/vip3A, sản phẩm ñược biến nạp vào tế bào khả biến của vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58 bằng phương pháp xung ñiện. Sản phẩm sau khi biến nạp ñược nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Một số dòng khuẩn lạc dương tính tiếp tục ñược kiểm tra sự có mặt của vector mang gen vip3A bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn tương tự bước kiểm tra trong E.coli. Chọn một dòng khuẩn lạc dương tính (A.tumerfaciens/C58/vip3A) làm nguyên liệu chuyển gen vip3A vào mảnh lá thuốc lá. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………46 4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58 chứa vector pBI121/vip3A cũng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo ñược cây chuyển gen. Hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian tái sinh từ mô lá ñến cây hoàn chỉnh ngắn (khoảng 3 tháng) và tỷ lệ tái sinh cao [8] nên quy trình tạo cây thuốc lá chuyển gen ñã ñược nghiên cứu nhiều. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng theo quy trình chuyển gen quan tâm vào cây thuốc lá thông qua A.tumerfaciens theo phương pháp Topping cải tiến (Topping, 1998) (phụ lục 4). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………47 Sơ ñồ 4.2: Sơ ñồ chuyển gen vip 3A vào thuốc lá thông qua A.tumerfaciens Dịch huyền phù vi khuẩn Tái sinh ña chồi Ra rễ (Mảnh lá ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn) Biến nạp Mảnh lá thuốc lá trong môi trường GM trước khi biến nạp Trồng cây trong bầu ñất Ra cây bầu trấu : cát Vi khuẩn trên môi trường LB ñặc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………48 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Dòng khuẩn lạc A.tumerfaciens dương tính mang gen vip3A ñược nuôi hồi phục ñể thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen. Khuẩn lạc mọc tốt trên môi trường có kháng sinh chọn lọc (hình 4.7). Hình 4.7. Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc chọn lọc Hình 4.8. Dịch huyền phù vi khuẩn Dịch huyền phù vi khuẩn thu ñược có giá trị ño OD660nm = 0,75, ñủ ñiều kiện ñể biến nạp vào mảnh lá thuốc lá (hình 4.8) Sau biến nạp, các mảnh lá ñược ñồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường GM và chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 30. Sau 3 tuần các cụm chồi ñược tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50. Những chồi phát triển tốt sẽ ñược tách ra và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50 một lần nữa. Sau ñó chồi ñược cấy chuyển sang môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng qua các giai ñoạn khác nhau thể hiện trong bảng 4.2. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………49 Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn (%) Công thức Mảnh lá Cụm chồi Ra rễ Kan 50 (lần 1) Ra rễ Kan 50 (lần 2) Giá thể trấu : cát Bầu ñất CTTN 77,7 82,3 73,3 81,8 93,3 88,1 ð/C1 0,0 0,0 0,0 0,0 - - ð/C2 93,3 96,7 96,7 96,6 100,0 100,0 LSD5% 6,9 3,4 4,6 4,9 CV% 6,1 2,8 4,0 4,1 Ghi chú: CTTN: công thức thí nghiệm ð/C1: mẫu không biến nạp cấy trên MT có bổ sung kháng sinh chọn lọc ð/C2: mẫu không biến nạp cấy trên MT không bổ sung kháng sinh Giai ñoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh ña chồi sau biến nạp Ở CTTN, số mảnh lá tái sinh ña chồi trên môi trường chọn lọc GM Kan 30 khá cao (77,7%) (hình 4.9). Theo lý thuyết những dòng tái sinh ñược trên môi trường có kháng sinh Kan là do trong genom của chúng có mang gen kháng Kan. Do vậy có thể tạm kết luận ñây là những mẫu ñã biến nạp thành công vì có sự tồn tại của gen kháng Kan trong tế bào mảnh lá nên các mảnh lá tiếp tục tái sinh ña chồi trên môi trường GM có kháng sinh Kan trong khi ở ð/C1 các mảnh lá không tái sinh ña chồi, vàng dần và chết (hình 4.10) chứng tỏ trong tế bào của các mảnh lá không biến nạp không chứa gen kháng Kan nên chúng không thể tái sinh trên môi trường có kháng sinh này còn ð/C 2 có tỷ lệ mẫu phân hóa thành cụm chồi trên môi trường GM là 93,3% (hình 4.11). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………50 Hình 4.9: Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 Hình 4.10: Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 Hình 4.11: Mảnh lá ð/C2 trên MT GM Giai ñoạn chọn lọc cụm chồi sau biến nạp: Những cụm chồi ở CTTN ñược cắt nhỏ và chuyển sang môi trường tái sinh ña chồi GM Kan 50 ñể tiếp tục chọn lọc còn những cụm chồi ở ð/C2 ñược dùng làm vật liệu cho ð/C 1 và ð/C2 ở giai ñoạn chọn lọc cụm chồi. Số cụm chồi tiếp tục phân hoá trên môi trường chọn lọc (GM Kan 50) ñạt 82,3% , các cụm chồi còn lại phân hoá chậm và vàng dần (hình 4.12). Như vậy có thể ở những cụm chồi không tiếp tục phân hóa là do các gen kháng Kan ñược chuyển vào nhưng không tiếp tục phiên mã nên không tái sinh trên môi trường chọn lọc trong khi ð/C1 100% các cụm chồi phân hóa chậm hoặc ngừng phân hoá ,vàng dần và chết (hình 4.13) còn ð/C2 có tỷ lệ mẫu tái sinh trên môi trường là 96,7 % (hình 4.14). Hình 4.12: Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 Hình 4.13: Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 Hình 4.14: Cụm chồi ð/C2 trên MT GM Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………51 Giai ñoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh: Những chồi khỏe sẽ ñược tách ra và chuyển dang môi trường ra rễ (RM Kan 50) ñể tạo cây hoàn chỉnh. Số chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh và sinh trưởng tốt trên môi trường RM chọn lọc lần 1 (Kan 50) ñạt 73,3% , trên môi trường RM chọn lọc lần 2 (Kan 50) ñạt 81,8%, phần còn lại không ra rễ, sinh trưởng chậm hoặc ngừng sinh trưởng (hình 4.15, 4.16 và 4.18) trong khi ð/C1 có 100% chồi không ra rễ, vàng dần và chết (hình 4.17 và 4.19) còn ð/C2 có 96,55% chồi tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Hình 4.15: Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) Hình 4.16: Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) Hình 4.17: Cây ð/C trên MT RM Kan 50 Hình 4.18: Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 Hình 4.19: Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………52 Như vậy có thể kết luận việc chuyển gen và chọn lọc cây sau chuyển gen invitro ñã ñược hoàn thành. Giai ñoạn ra cây vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1) Từ những dòng chọn lọc trên môi trường RM (Kan 50), chọn ngẫu nhiên 22 dòng thuốc lá chuyển gen ñể ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1: 1). ðây là bước chuyển cây từ giai ñoạn cung cấp các ñiều kiện sống tối ưu trong phòng sang giai ñoạn cây tự tổng hợp, ñồng hóa và dị hóa các chất từ ñiều kiện tự nhiên ñể phục vụ cho các hoạt ñộng sống của mình. Bước chuyển cây ra giá thể ñược coi như bước trung gian ñể cây cây thích nghi từ từ với ñiều kiện ngoại cảnh và ra rễ mới. Với ñặc ñiểm hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những ñốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (91,3%), hệ rễ mới phát triển mạnh, chứng tỏ sự thích nghi của cây với ñiều kiện ngoại cảnh khá tốt (hình 4.20), là tiền ñề ñể có những cây khỏe mạnh khi cây sống trong ñiều kiện ngoại cảnh mới. Giai ñoạn trồng ra bầu ñất: ðây là giai ñoạn cây ñược chuyển sang ñiều kiện tự dưỡng trong ñiều kiện ngoại cảnh mới. Sau 14 ngày chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu ñất ñặt trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại ñất là 90 % (tương ñương với ð/C) (hình 4.20) chứng tỏ cây thích nghi tốt với ñiều kiện ngoại cảnh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………53 Hình 4.20: Cây trong bầu trấucát Hình 4.21: Cây trồng trong bầu ñất Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu ñất ñã hoàn thành. 4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen Xác ñịnh xem gen ñược chuyển vào có tiếp tục phiên mã và hoạt ñộng trong cây hay không bằng cách kiểm tra sự có mặt của gen câu trúc mang gen vip3A chuyển vào bằng phản ứng PCR với cặp ñoạn mồi ñặc hiệu. Sơ ñồ 4.3: Các bước kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong chuyển gen PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một ñoạn DNA trong một thời gian ngắn. ðây là phương pháp thường ñược dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen vì ñộ tin cậy cao. Theo lý thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi ñặc hiệu thì sẽ nhân chính xác ñược ñoạn gen nằm giữa hai mồi ñó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây ñã ñược chuyển gen, nếu cho kết Nhuộm bản gel ðiện di Tách chiết DNA Mẫu lá PCR Chụp ảnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………54 quả ñặc hiệu với cặp mồi ñó thì ta có thể kết luận rằng cây ñó ñã mang ñoạn gen cần chuyển. Vào giai ñoạn 30 ngày sau trồng, khi cây ñã mọc ra lá mới và phát triển bình thường thì tiến hành thu mẫu lá non của 22 dòng thuốc lá chuyển gen ñể tách chiết DNA tổng số. Các mẫu DNA ñược kiểm tra với cặp mồi 35S Fs/Rs. Cặp mồi 35S Fs/Rs ñược thiết kế nhân ñoạn gen có kích thước 314 bp. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá chuyển gen ñược thể hiện trong hình 4.22 a,b. Hình 4.22 a: Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp mồi 33S Fs/Rs Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………55 Hình 4.22 b: Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp mồi 35S Fs/Rs M: marker; 1-22: các dòng thuốc lá chuyển gen ñ/c (-) : mẫu lá cây không chuyển gen ñ/c (+): plasmit tách từ khuẩn A.tumerfaciens C58/vip3A Toàn bộ 22 dòng thuốc lá chuyển gen (100%) ñều cho một băng duy nhất ở vị trí khoảng 300 bp, phù hợp với kích thước tính toán ban ñầu chứng tỏ trong các dòng thuốc lá chuyển gen ñều có sự có mặt của promotor 35S có trong cấu trúc vector pBI121/vip3A ñược thiết kế trong nghiên cứu. Các mẫu ñược kiểm tra lại bằng cặp mồi ñặc hiệu ñể nhân gen vip3A.. Cặp mồi ñược thiết kế nhân ñoạn gen từ vị trí 1 ñến vị trí 605. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng với cặp mồi V2.1/V2.3 ñược thể hiện trong hình 4.23. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………56 Hình 4.23: Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp mồi V2.1/V2.3 M: marker 1kb; 1-22: các dòng thuốc lá chuyển gen; ñ/c (-): cây không chuyển gen; ñ/c (+): plasmit tách từ chủng khuẩn A.tumerfaciens/C58/vip3A Có 19/22 dòng thuốc lá (86,4%) cho một băng duy nhất ở vị trí khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết. Ba dòng còn lại không cho băng như dự kiến, có thể do quá trình trao ñổi chất và tự nhân lên của tế bào có ñột biến hoặc xảy ra hiện tượng trao ñổi chéo, ñứt gẫy, ñột biến... nên gen vip3A chuyển vào không còn nguyên vẹn, cặp mồi không tìm ñược vị trí ñể bắt cặp vào nên ñoạn gen dự kiến không ñược nhân lên. Như vậy gen vip3A ñã ñược chuyển thành công và tiếp tục phiên mã trong 19/22 (86,4%) dòng thuốc lá chuyển gen ñược lựa chọn ngẫu nhiên ñể kiểm tra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………57 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Thiết kế thành công vector chuyển gen pBI121/vip3A mang gen kháng sâu vip3A dưới sự ñiều khiển của promoter 35S. 5.1.2 ðã tạo ra trên một trăm dòng thuốc lá chuyển gen mang gen vip3A sống sót trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Kan 50. Tỷ lệ tái sinh ña chồi của mảnh lá thuốc lá sau biến nạp ñạt 77,7%, của cụm chồi ñạt 82,3%. Tỷ lệ tái sinh thành cây hoàn chỉnh ñạt từ 73,3% ñến 81,8%. Trong 22 dòng thuốc lá chọn ngẫu nhiên ñể ra cây: Tỷ lệ sống sót của cây khi ra bầu trấu : cát (1:1) ñạt 91,3%, khi trồng ra chậu ñất ñạt 90%. 5.1.3 Kiểm tra sự có mặt của gen vip3A trong 22 dòng thuốc lá ñược chọn lọc ngẫu nhiên với 2 cặp mồi ñặc hiệu là 35S Fs/Rs và V2.1/V2.3: - Toàn bộ 22 dòng thuốc lá chuyển gen (100%) ñều có mặt của promotor 35S trong cây ở thế hệ T0. - 19/22 dòng thuốc lá chuyển gen (86,4%) có mặt gen vip3A trong cây ở thế hệ T0. 5.2 Kiến nghị - ðề tài có tiến hành ñánh giá tính kháng sâu của một số dòng thuốc lá chuyển gen trên ñối tượng sâu xanh hại thuốc lá nhưng do một số ñiều kiện khách quan nên chưa thu ñược kết quả cuối cùng. Do ñó trong thời gian tới cần tiếp tục ñánh giá tính kháng sâu và ñánh giá tính ổn ñịnh di truyền ở các thế hệ sau của các dòng thuốc lá mang gen vip3A thu ñược. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………58 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1. ðái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994). Công nghệ gen và công nghệ sinh học dùng trong nông nghiệp hiện ñại. NXB Nông nghiệp. 2. Vũ Thị Bản, ðào ðức Thức, Chu Hoàng Hà. Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá. Báo cáo khoa học 2007 3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997). Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. 4. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003). Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. NXB Khoa học và kĩ thuật. 5. Bộ môn cây công nghiệp Trường ñại học nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Giáo trình giảng dạy cây thuốc lá. 6. Nguyễn Liên Chi, Nguyên Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989. Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) và mô lá cây cà úc bằng vi khuẩn A.tumefaciens . Tạp chí di truyền 1/1989 7. Lê Việt Hùng, 1994: Thực trạng sản xuất nguyên liệu thuốc lá vàng ở một số tỉnh phía Bắc: Những suy nghĩ từ khía cạnh kinh tế. Tạp chí Công nghiệp nhẹ t. 10 (trang 105-108). 8. Trần ðăng Kiên, Nông Văn Hải, Vũ ðức Quang, Trần Thị Vui, ðào Thị Xuân. Nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh. Báo cáo ñề tài khoa học 1999. . 9. Hoàng Tự Lập và cs. Giáo trình thi nâng ngạch viên chức Tổng công ty Thuốc lá Việt Nam năm 2008 - 2009. 10. Trần Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Xuân Tú, 1994. Nghiên cứu biến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………59 nạp một số gene chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasid vector. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 11. Nguyễn ðức Thành, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Diệu Muội, 1994. Nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 12. Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. NXB NN - Hà Nội. 13. Nguyễn Quang Thạch. Bài giảng công nghệ sinh học thực vật. ðại học Nông nghiệp Hà nội. 14. Lê ðình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996. Trồng và chế biến thuốc lá. NXB T/p Hồ Chí Minh 15. Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá: Dự báo sản xuất và tiêu dùng thuốc lá ñến 2010 (báo cáo nội bộ). B.TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 16. Akehurt B. C. 1981: Tobacco. Longman group Ltd., New York. 764 pp. 17. Berliner E (1915) [About the sleep sickness of the Ephestia kühniella Zell. and its vector Bacillus thuringiensis.] Z Angew Entomol, 2: 29–56 (in German). 18. Carozzi, N.B., Warren, G.W., Desai, N., Jayne, S.M., Lotstein, R., Rice, D.A., Evola, S. and Koziel, M.G. (1992). Expression of a chimeric CaMV35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein in transgenic tobacco. Plant Molecular Biology 20: 539-548. 19. Chen, J.J., Yu, J.X., Tang, L.X, Tang, M.J., Shi, Y.X. and Pang, Y. (2003) Comparison of the expression of Bacillus thuringiensis fulllength and N-terminally truncated vip3A gene in Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology 9: 310-316 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………60 20. Collins W. K ; Hawks S. N. Jr.: Principles of the Flue - cured Tobacco Production. N. C. State University 2nd Ed. 1993. 300. 21. Crickmore, N., Ziegler, D.R., Fietelson, J., Schnepf, E.,Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J. and Dean, D.H. (1998). Revision of the nomenclature for Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Review 62:807-813. 22. Davis D. L.; Nielsen M. T. 1999: Tobacco Production, Chemistry and Technology. B Blackwell Science. 467. 23. English, L. and Slatin, S.L. (1992). Mode of action of δ-endotoxins from Bacillus thuringiensis: A comparison with other bacterial toxins. Insect Biochemistry and Molecular Biology 22:1-7. 24. Estruch, J.J., Carozzi, N.B., Desai, N., Duck, N.B., Warren, G.W. and Koziel, M.G. (1997). Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nature Biotechnology 15:137-141. 25. Estruch, J.J., Warren, G.W., Mullins, M.A, Nye, G.J., Craig, J.A. and Koziel, MG. (1996) Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5389-5394. 26. Estruch, J.J., Warren, G.W., Mullins, M.A., Nye, G.J., Craig, J.A. and Koziel, M.G. (1996). Vip3A, a novel bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proceedings, National Academy of Sciences, USA 93:5389-5394. 27. Federici, B.A. (1998). Broad-scale leaf pest-killing plants to be true test. California Agriculture 52:14-20. 28. Fischhoff, D.A., Bowdish, K.S., Perlak, F.J., Marrone, P.G., MvCormick, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………61 S.M., Niedermeyer, J.G., Dean, D.A., Kusano-Kretzmer, K., Mayer, E.J., Rochester, D.E., Rogers, S.G. and Fraley, R.T. (1987). Insect tolerant tomatoplants. BioTechnology 5:807-812. 29. Gill, S.S., Cowles, E.A. and Pietrantonio, F.V. (1992). The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annual Review of Entomology 37:615-636 30. Girard, C., Le-Metayer, M., Zaccomer, B., Bartlet, E.,Williams, I., Bonade-Bottino, M., Pham-Delegue, M.H. and Ouanin, L. (1998). Growth stimulation of beetle larvae reared on a transgenic oilseed rape expressing a cysteine proteinase inhibitor. Journal of Insect Physiology 44:263-270. 31. Hannay CL (1953) Crystalline inclusions in aerobic spore-forming bacteria. Nature (Lond),172: 1004. 32. Höfte H & Whiteley HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev, 53: 242-255. 33. Hoftey, H. and Whiteley, H.R. (1989). Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiology Review 53:242-255. 34. Knowles, B.H. (1994). Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal δ-endotoxins. Advances in Insect Physiology 24:275-308. 35. Knowles, B.H. and Dow, J.A.T. (1993). The crystalendotoxin of Bacillus thuringiensis: Models for their mechanism of action on the insect gut. Bioassays 15:469. 36. Kota, M., Daniell, H., Varma, S., Garczynski, S.F., Gould, F. and Moar, W.J. (1999). Overexpression of the (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt- resistant insects. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96:840-1845. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………62 37. Lee, M.K., Milne, R.E., Ge, A.Z. and Dean, D.H. (1992). Location of Bombyx mori binding receptor on Bacillus thuringiensis delta endotoxin. Journal of Biological Chemistry 267:3115-3121. 38. McLaren, J.S. (1998). The success of transgenic crops in the USA. Pesticide Outlook 9:36-41. 39. Milne, R. and Kaplan, H. (1993). Purification and characterisation of a trypsin like digestive enzyme from spruce budworm (Christoneura fumiferana) responsible for the activation of δ-endotoxin from Bacillus thuringiensis. Insect Biochemistry and Molecular Biology 23:663-673. 40. Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B., McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed,G., Biever, D. and Fischhoff, D.A. (1993). Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles. Plant Molecular Biology 22:313-321. 41. Reed S. M. 1993: Use of stomatal size to distinguish between haploid and dihaploid tobacco plants. Tobbaco Sciences 37: 84-86. 42. Riba G. et Silvy C 1992: Combattre les ravageurs des cultures: Enjeux et perspectives. Institute National de la Recherche Agronomique. Paris. 43. Schnepf, H.E. and Whitley, H.R. (1981). Cloning and expression of Bacillus thuringinesis crystal protein gene in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 78:2893-2897. 44. Steinhaus, E.A. (1951). Possible use of Bacillusthuringiensis Berliner as an aid in the biological control of the alfalfa caterpillar. Hilgardia 20:350-381. 45. Svab, Z. and Maliga, P. (1993). High frequency plastid transformation in tobacco by selection for an acd A gene. Proceedings of National Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………63 Academy of Sciences USA 90:913-917. 46. Tojo, A. and Aizawa, K. (1983). Dissolution and degradation of δ- endotoxin by gut juice protease of silkworm, Bombyx mori. Applied and Environmental Microbiology 45:576-580. 47. Tso, T. C. 1990: Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant. IDEALS, Inc. USA. 753 p. 48. Universsal leaf tobacco company, INC 2008 supply and demand report 49. Warren, G.W. (1997) Vegetative insecticidal proteins: novel proteins for control of corn pests. In Advances in Insect Control, the Role of Transgenic Plants ed. Carozzi, N.B. and Koziel, M. pp. 109-121. London: Taylors & Francis Ltd. 50. Yu, C.-G., M. A. Mullins, G. W. Warren, M. G. Koziel, and J. J. Estruch. 1997. The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. Applied and Environmental Microbiology 63:532-536 C. CÁC TRANG ðIỆN TỬ 51. Báo cáo tóm tắt số 39-2008 của ISAAA, Hiện trạng cây trồng CNSH/cây trồng chuyển gen trên toàn cầu năm 2008. 52. 53. 11174 Cần có quy chế cụ thể cho cây trồng chuyển gen ở Việt Nam 54. 55. 56. 57. 58. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………64 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Nhóm Hóa chất Hàm lượng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4 180,54 KH2PO4 170 ða lượng CaCl2 332,02 H3BO3 6,2 MnSO4 22,3 ZnSO4 8,6 KI 0,83 Na2MoO4 0,25 CuSO4 0,025 CoCl2 0,025 Na2EDTA 37,3 Vi lượng FeSO4.7H2O 27,8 Glysin 2 Nicotinic acid 0,5 Myo-Inositol 100 Pyridoxine HCl 0,5 Vitamin Thiamine HCl 0,1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………65 Phụ lục 2: TRÌNH TỰ GEN vip3A LOCUS AJ971413 2370 bp DNA linear BCT 19- MAY-2005 DEFINITION Bacillus thuringiensis vip3A gene for vegetative insecticidal protein. ACCESSION AJ971413 VERSION AJ971413.1 GI:66351675 KEYWORDS vegetative insecticidal protein; vip3A gene. SOURCE Bacillus thuringiensis ORGANISM Bacillus thuringiensis Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus cereus group. REFERENCE 1 AUTHORS Pham,N.B., Le,N.H., Pham,T.T., Chu,H.H. and Le,B.T. TITLE Cloning and sequence analysis gene encoding the vegetative insecticidal protein (VIP3A) of some Vietnamese B. thuringiensis strains JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 2370) AUTHORS Pham,N.B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2005) Pham N.B., Plant Cell Technology, Institute of Biotechnology (IBT), Hoang Quoc Viet Str. 18, Cau Giay, Hanoi,10000, VIET NAM FEATURES Location/Qualifiers source 1..2370 /organism="Bacillus thuringiensis" /mol_type="genomic DNA" /strain="BTAB51" /db_xref="taxon:1428" /country="Viet Nam" gene 1..2370 /gene="vip3A" CDS 1..2370 /gene="vip3A" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="vegetative insecticidal protein" /protein_id="CAI96522.1" /db_xref="GI:66351676" /db_xref="GOA:Q4VYT0" /db_xref="InterPro:IPR003305" /db_xref="InterPro:IPR008927" /db_xref="InterPro:IPR008979" /db_xref="UniProtKB/TrEMBL:Q4VYT0" /translation="MNKNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGG DLTLDEILKNQQLLNDISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLND VNNKLDAINTMLRVYLPKITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEISDKLDIINVNV LINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETSSKVKKDGSPADILDELTELTELAKS VTKNDVDGFEFYLNTFHDVMVGNNLFGRSALKTASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLI Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………66 VLTALQAKAFLTLTTCRKLLGLADIDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPN YAKVKGSDEDAKMIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVI YGDMDKLLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITKIDFTKKMKTLRYEVTANFYDSSTGEI GLNKK