Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ HOÀNG KHIÊM MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG KHIÊM BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006 KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS AND DOG SPERM CAPACITATION Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006 Engineer. NGUYEN VAN UT Ho Chi Minh City 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo. Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi. Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Thủ Đức, ngày 15-08-06 Đỗ Hoàng Khiêm v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ” Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH 3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. 2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại. 3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0 giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). vi MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa 1 .................................................................................................................................i Bìa 2 ............................................................................................................................... ii Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ..........................................................................................................iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii Danh sách các bảng .................................................................................................... viii Danh sách các hình ........................................................................................................ix PHẦN I. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu ................................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu .................................................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng ....................................................................... 3 2.1.1. Cấu tạo ............................................................................................................ 3 2.1.2. Chức năng ....................................................................................................... 4 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng ............................................. 4 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............. 4 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể .................................... 4 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào .............................................................. 6 2.3.1. Bề mặt chai cấy ............................................................................................... 6 2.3.2. Các đặt tính vật lý ........................................................................................... 6 2.3.2.1. pH .......................................................................................................... 6 2.3.2.2. Dung dịch đệm ...................................................................................... 7 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu .................................................................................. 7 2.3.2.4. Nhiệt độ ................................................................................................. 7 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí ........................................................................ 7 2.3.2.6. Độ nhớt ................................................................................................... 8 2.3.3. Tủ cấy .............................................................................................................. 8 2.3.4. Kháng sinh ...................................................................................................... 8 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào ........................................................................ 8 2.4.1. Nguồn nhiễm ................................................................................................... 8 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật ...................................................... 8 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác ....................................................................... 9 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào ................................................. 9 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng ............................................................. 10 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp ............................................................................................. 10 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp ........................................................................................... 11 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue .................. 11 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................... 11 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi ........ 11 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó ........................ 12 2.9. Tinh trùng .............................................................................................................. 13 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng ............................................................ 13 vii 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng ................................................................................... 14 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng .................................................................................. 15 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái ..................................... 16 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó ................................................ 17 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng .......................................... 17 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó ............................................... 19 2.11. Hoạt hóa tinh trùng .............................................................................................. 20 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 23 3.1. Nội dung ................................................................................................................ 23 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 23 3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 23 3.3.1. Nguồn mẫu .................................................................................................... 23 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 23 3.3.3. Hoá chất ........................................................................................................ 24 3.4. Phƣơng pháp .......................................................................................................... 25 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................................................. 25 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ ......................................................... 25 3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm ............................................ 25 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ................................................ 26 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............................................... 28 3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue ...................... 29 3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro ...................................... 30 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm ............ 30 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng ............................................................................... 30 3.5. Xử lí số liệu ........................................................................................................... 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 35 4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ........................................ ..35 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng ................ ..35 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa ............. 37 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng.................................................................................. 37 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng ................................................................................. 38 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................................. 39 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome .......................................... 40 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng .............................................................. 41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 44 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 44 5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 45 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 47 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AR: acrosome reaction BOEC: bovine oviductal epithelial cells BSA: bovine serum albumin DNA: deoxyribonucleic acid DNP: deoxyribonucleoprotein ECS: estrous cow serum EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme linked immunosorbent assay ET: embryo stransfer FBS: phosphate buffered saline FCS: fetal calf serum FGF: fibroblast growth factor HSA: human serum albumin IGF: insulin – like growth factor IVC: in vitro culture IVF: in vitro fertilization IVM: in vitro maturation M II: metaphase II PCR: polymerase chain reaction PDGF: platelet – derived growth factor RNA: ribonucleic acid ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị pH......................................................................................................... 7 Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES ...................................................... 9 Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen ............... 19 Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng ................................................................... 20 Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy ................. 35 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng ................................................................... 37 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng .......................................................................... 38 Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ...................................................... 39 Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ............... 40 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................ 42 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy ................................... 36 Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) ............................... 36 Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa ......................................... 41 Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa ............................................ 41 Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng ........................................................................ 43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng ................................................................. 37 Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng ................................................................ 38 Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................ 39 Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome ............................ 40 Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................. 42 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt, thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003): - Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản. - Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao. - Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống. - Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai thác tế bào mầm. Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro (IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn khá thấp (Farstad, 2000). Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện. 1.2. Mục tiêu Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó. 2 1.3. Yêu cầu - Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên khả năng hoạt hóa tinh trùng. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 2.1.1. Cấu tạo Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng. Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. - Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm. Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có lông, tế bào đáy và tế bào trung gian. Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen. Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng. Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng. Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh. Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp đệm của nội mạc tử cung. 4 - Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc. - Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh. 2.1.2. Chức năng 2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng - Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc tiến hành nhờ ba yếu tố: + Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004). + Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự chuyển động của các lông. + Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng (Trịnh Bình và ctv, 2004). - Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng. 2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng vai trò quan trọng. Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn. Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội mạc tử cung. 2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể - Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng đời sinh sản của tế bào. Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 5 - Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi trƣờng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau: Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng. Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết thúc vòng đời tái sản. Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao. Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào. + Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng. Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh. Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005): + Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi 6 trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào. + Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1- 2.10 6 /cm 3 , là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). + Pha dừng (stationary phase): là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số lƣợng tế bào không thay đổi, tức là giai đoạn mà môi trƣờng dinh dƣỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện sự tự hoại tế bào: nhân bị đứt chẻ, trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối (blebs). 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào 2.3.1. Bề mặt chai cấy Sự bám dính và phát triển tế bào có thể cải thiện bằng nhiều cách: dùng chai cấy tái sử dụng tráng phủ một lớp collagen, fibronectin, gelatin… Gelatin thƣờng đƣợc phủ lên bề mặt đĩa nhựa vì có lợi cho sự nuôi cấy tế bào cơ và tế bào biểu mô màng trong (Freshney, 1987). Độ sâu của môi trƣờng: tốt nhất từ 2 – 5 mm ( 0,2 – 0,5 ml/cm2), độ sâu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thấm nhập của oxy xuyên qua môi trƣờng đến tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.2. Các đặc tính vật lý 2.3.2.1. pH Hầu hết các dòng tế bào phát triển ở pH 7,4. pH tối ƣu để phát triển thay đổi rất ít ở những dòng tế bào khác nhau. Phenol red đƣợc bổ sung vào môi trƣờng làm chất chỉ thị pH (Freshney, 1987). Nếu môi trƣờng chuyển dần từ đỏ sang vàng cam là tế bào phát triển tốt, nếu từ đỏ chuyển sang vàng nhạt là môi trƣờng bị nhiễm khuẩn (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 7 Bảng 2.1. Giá trị pH và màu sắc môi trƣờng (nguồn: Freshney, 1987) * dùng phenol red 2.3.2.2. Dung dịch đệm Đệm bicarbonate vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn các dung dịch đệm khác bởi vì ít độc, giá rẻ và thuận lợi cho quá trình trao đổi chất mặc dù khả năng đệm kém ở pH sinh lý. Hepes có khả năng đệm hiệu quả hơn ở pH từ 7,2 – 7,6 và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 10 hoặc 20 mM (Freshney, 1987). 2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến tế bào nuôi cấy. Ở những loài khác nhau thì áp suất thẩm thấu của huyết tƣơng khác nhau. Ví dụ: ở ngƣời khoảng 290 mOsm/kg, ở chuột khoảng 310 mOsm/kg. Trong thực nghiệm, thƣờng điều chỉnh trong khoảng từ 260 – 320 mOsm/kg (Freshney, 1987). 2.3.2.4. Nhiệt độ (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Nhiệt độ giảm sẽ làm giảm sự phát triển nhƣng không làm giảm khả năng sống của tế bào, trừ khi thời gian hạ nhiệt độ kéo dài hơn 3 ngày. - Nhiệt độ gia tăng sẽ làm tăng sự phát triển nhƣng sẽ làm giảm khả năng sống của tế bào. - Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến pH. Ở nhiệt độ thấp, CO2 hòa tan tăng nên làm thay đổi sự ion hóa. 2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí Áp lực bề mặt của môi trƣờng hỗ trợ sự bám dính của tế bào vào đáy bình nuôi cấy nhƣng ít đƣợc ứng dụng. Nuôi cấy ở điều kiện 5% CO2 sẽ tạo bọt khí mà bọt khí có liên quan đến lƣợng protein thoái hóa và nguy cơ nhiễm khuẩn (Freshney, 1987). pH Màu* 6,5 7,0 7,4 7,6 7,8 Vàng Cam Đỏ Hồng nhạt Tím 8 2.3.2.6. Độ nhớt Độ nhớt của môi trƣờng đƣợc quyết định chủ yếu bởi huyết thanh và một phần do sự phát triển của tế bào. Tăng độ nhớt của môi trƣờng với carboxy methyl cellulose hoặc polyvinyl pyrolidone sẽ làm giảm sự hƣ hại của tế bào trong lúc khuấy và xử lí trypsin (Freshney, 1987). 2.3.3. Tủ cấy Số lần mở, sự rung lắc của tủ cấy ảnh hƣởng đến sự phát triển và sự phân bố của tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). 2.3.4. Kháng sinh - Kháng sinh đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để làm giảm khả năng nhiễm khuẩn. Tuy nhiên với kỹ thuật thao tác vô trùng có thể không cần sử dụng kháng sinh vì có một số bất lợi nhƣ sau (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Tạo điều kiện thuận lợi cho sự đề kháng kháng sinh của vi sinh vật. + Che dấu sự nhiễm khuẩn tiềm ẩn ở mức độ thấp và nhiễm Mycoplasma. + Ảnh hƣởng tế bào động vật hữu nhũ. + Tạo tâm lý chủ quan trong việc thực hiện kỹ thuật vô trùng. + Nhiễm nấm khó đƣợc kiểm soát. - Nồng độ kháng sinh thƣờng sử dụng (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Streptomycine: 100 µg/ml + Penicilline: 100 UI/ml + Gentamycine S: 250 µg/ml 2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào 2.4.1. Nguồn nhiễm (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) Không khí ẩm của tủ nuôi cấy là nguồn nhiễm chính và nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào, thao tác nào. Tác nhân gây nhiễm: vi trùng, nấm men, nấm mốc, Mycoplasma, protozoa… Theo dõi nhiễm: bằng mắt dƣới kính hiển vi. 2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005) - Thay đổi pH đột ngột dẫn đến thay đổi màu sắc của chỉ thị màu trong môi trƣờng. pH giảm rõ trong trƣờng hợp nhiễm trùng. Khi nhiễm nấm men, pH thay đổi ít, trừ khi nhiễm nấm men nhiều. Tăng pH khi nhiễm nấm sợi. 9 - Đục môi trƣờng hoặc cặn ở đáy. - Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, giữa những tế bào có những hạt lấp lánh là môi trƣờng đã bị nhiễm khuẩn, hình tròn có những nụ nhỏ là nấm men. - Nấm sợi: nhiều sợi mảnh, có thể thấy đám đậm độ của bào tử. - Nhiễm Mycoplasma: có những dấu hiệu hủy hoại tế bào. Xác định Mycoplasma bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, PCR, ELISA… 2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác (trích dẫn từ Phan Kim Ngọc, 2002) - Mang găng tay khi thao tác. - Sử dụng áo blouse, khẩu trang và nón che kín tóc. - Hạn chế việc mang vật dụng cá nhân khi thao tác vô trùng. - Trƣớc khi vào phòng thí nghiệm: vệ sinh cá nhân tốt, rửa sạch tay bằng xà phòng, sát trùng bằng javel và cồn, chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ, môi trƣờng cần sử dụng trong suốt thời gian làm việc, khử trùng phòng và tủ cấy bằng tia UV. - Sau khi làm việc trong phòng thí nghiệm: dọn vệ sinh tủ cấy và phòng, sắp xếp các dụng cụ và thiết bị gọn gàng đúng qui định, các dụng cụ đã sử dụng cần đƣợc rửa sạch và sấy khô tại khu vực rửa dụng cụ, tắt các thiết bị không cần sử dụng, rửa sạch tay bằng xà phòng và sát trùng bằng javel và cồn. - Tất cả các mẫu vật, hóa chất dƣ thừa phải đƣợc mang ra khỏi khu vực thao tác và đƣợc xử lý cẩn thận. 2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Freshney, 1987) - Dung dịch đệm: sự lựa chọn dung dịch đệm phụ thuộc vào nồng độ CO2 (bảng 2.2), dung dịch tách mô, lớp đơn tế bào. Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES (nguồn: Freshney, 1987) Pha khí Pha lỏng CO2 HCO3 - HEPES Không khí 2% 5% 4 mM 8 mM 24 mM 10 mM 20 mM 50 mM - Acid amin: nồng độ acid amin quyết định khả năng duy trì nồng độ tế bào tối đa, ảnh hƣởng đến sự sống còn và tỉ lệ phát triển của tế bào. 10 - Vitamin: thông thƣờng chỉ bổ sung vitamin nhóm B vào môi trƣờng nuôi cấy vì những vitamin khác đã có đủ trong huyết thanh. Việc thêm vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy chứa nồng độ huyết thanh thấp là cần thiết. - Muối: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, SO4 2- , Cl - , PO4 3- , HCO3 -… là thành phần chính tạo áp lực thẩm thấu môi trƣờng. Nồng độ muối NaHCO3 phụ thuộc vào nồng độ CO2 trong pha khí. - Glucose: đƣợc bổ sung vào trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào, đóng vai trò là nguồn năng lƣợng chính. - Chất hữu cơ: gồm nucleosides, những chất trung gian trong chu trình acid citric, pyruvate và lipid. Sự bổ sung những chất này cần thiết cho quá trình tạo dòng hoặc duy trì dòng tế bào đặc biệt. - Hormon và các yếu tố tăng trƣởng: gồm insulin, hydrocortisone, PDGF, EGF, FGF, IGF… Insulin giúp hấp thu glucose, acid amin và ảnh hƣởng đến sự phân bào. IGF gắn đặc hiệu với thụ thể của insulin trên bề mặt của tế bào và có tác dụng tƣơng tự insulin. Hydrocortisone làm tăng sự bám dính, thúc đẩy tăng sinh tế bào (Guner và ctv, 1977; McLean và ctv, 1986), ngăn cản sự phân bào (Freshney và ctv, 1980) và tăng sự biệt hóa tế bào. - Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp hormon, yếu tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, acid amin, vitamin, chất khoáng, chất ức chế, ketoacid, glucose và một số chất dinh dƣỡng khác. 2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng 2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp Theo Phan Kim Ngọc (2002), nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu đƣợc trong lần nuôi cấy này gọi là tế bào sơ cấp. Các tế bào sơ cấp thƣờng không thuần nhất vì là hậu duệ của nhiều tế bào ban đầu khác nhau. Nuôi cấy sơ cấp gồm 2 phƣơng pháp: nuôi cấy tế bào từ mảnh mô và nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nuôi cấy tế bào từ mảnh mô là phƣơng pháp nuôi cấy những mảnh mô đã đƣợc cắt nhỏ (1 mm3), trên môi trƣờng thể tích nhỏ với nồng độ huyết thanh cao. Áp lực bề mặt giúp mảnh mô tƣơng đối cố định, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám dính vào bề mặt đáy đĩa và phát triển. Phƣơng pháp này không sử dụng enzyme 11 trypsin nên hạn chế đƣợc nguy cơ tổn thƣơng tế bào, nhƣng tế bào phát triển chậm. Vì vậy, phƣơng pháp này thích hợp cho nuôi cấy các loại tế bào dễ bị tổn thƣơng và tránh đƣợc nguy cơ mất tế bào. - Nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme là phƣơng pháp nuôi cấy những tế bào đã đƣợc tách riêng lẻ nhờ phản ứng của enzyme (trypsin, collagenase,…). Phƣơng pháp này tách đƣợc số lƣợng lớn tế bào trong thời gian ngắn trƣớc khi nuôi cấy nhƣng tế bào dễ bị tổn thƣơng và đòi hỏi khối lƣợng mô nhiều hơn phƣơng pháp nuôi cấy tế bào từ mảnh mô. Nồng độ tế bào trƣớc và sau nuôi cấy đƣợc xác định và số lƣợng đặc trƣng cho từng loại tế bào nuôi cấy. Enzyme trypsin thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp nuôi cấy này với 2 dạng là trypsin ấm và trypsin lạnh. Trypsin ấm mặc dù làm tổn thƣơng tế bào nhiều hơn nhƣng tách tế bào nhanh hơn nên đƣợc ƣa chuộng hơn phƣơng pháp trypsin lạnh. Có thể hạn chế tác động của trypsin làm tổn thƣơng tế bào bằng cách nhũ tƣơng hóa cặn sau khi tách tế bào trong môi trƣờng có bổ sung huyết thanh, lƣu trữ tạm trong điều kiện lạnh hoặc làm tăng độ nhớt của môi trƣờng. 2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp Theo Phan Kim Ngọc (2002), sau khi tế bào nuôi cấy sơ cấp đã phân chia đầy đủ (tế bào một lớp đạt 80% bề mặt giá thể), ngƣời ta xử lý chúng với trypsin hoặc trypsin - EDTA để tách rời các tế bào. Một phần trong số tế bào đó đƣợc dùng để nhân số lƣợng tế bào lên trong lần nuôi cấy tiếp theo đƣợc gọi là nuôi cấy chuyền hay nuôi cấy thứ cấp. 2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue Theo Nigel Jenkins 1999, trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào trƣớc khi đếm. Chất nhuộm này thâm nhập vào màng của những tế bào không còn khả năng tồn tại hoặc phát triển, những tế bào này bắt màu xanh. Vì vậy có thể phân biệt đƣợc chúng với những tế bào còn sống (không bắt màu với chất nhuộm này). Dung dịch trypan blue có nồng độ 2%, đƣợc pha trong PBS (phosphate – buffered saline). Dung dịch trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào với tỉ lệ 1:1, thời gian 2 phút ở nhiệt độ phòng. 2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi Năm 1992, Xu và ctv đã thành công trong việc tạo phôi bò in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa phôi bò và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của bò 12 (bovine oviductal epithelial cells, BOEC). BOEC này đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp nuôi cấy tế bào từ mảnh mô, những mảnh BOEC đƣợc tách bằng cách dùng 2 kẹp vuốt mạnh ống dẫn trứng. Sau một đêm nuôi cấy BOEC trong môi trƣờng nuôi cấy, hình ảnh những mảnh BOEC trông giống nhƣ cấu trúc hình sâu (worm-like). Bởi vì trong mảnh BOEC có một số tế bào chết và tế bào sống đƣợc thấy rất rõ khi quan sát dƣới kính hiển vi, thêm vào đó là sự xuất hiện và chuyển động của những lông rung của BOEC. Đến ngày nuôi cấy thứ ba một số BOEC có khả năng hình thành lớp đơn (monolayer) trông giống nhƣ cấu trúc bóng nƣớc (vesicle-like). Sự tồn tại của BOEC đƣợc xác định qua sự chuyển động của lông rung, lông rung này vẫn đƣợc thấy đến ngày nuôi cấy thứ 10. Một số tế bào bắt đầu bám vào đáy đĩa vào ngày thứ tƣ hoặc thứ năm. Nhƣng chúng không hình thành lớp đơn phân tử (tạo vesicle-like), thậm chí đến ngày thứ 10. Những tế bào và những “bóng nƣớc” (vesicle-like) tồn tại đến 7 tuần nuôi cấy. 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó Năm 2002, Luisa Bogliolo và ctv đã thành công trong việc làm tăng tỉ lệ chín của trứng chó in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa trứng và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó. Những tế bào biểu mô này đƣợc tách bằng cách dùng dao cạo trên bề mặt trong của ống dẫn trứng và chúng đƣợc tạo huyễn dịch trong môi trƣờng nuôi cấy chín trứng với nồng độ xấp xỉ 104 tế bào/ml. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII mà không đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô là 4%. Khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô của đoạn loa và đoạn bóng của ống dẫn trứng, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII tƣơng ứng là 15,6% và 16,7%. 2.9. Tinh trùng 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Theo Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy (2001), quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào mầm (giao tử), biệt hóa chức năng để thụ tinh (phân bào giảm nhiễm) và biệt hóa về cấu trúc để có khả năng di chuyển chủ động. - Sự tạo giao tử: trong giai đoạn đầu của bào thai, các tế bào mầm di chuyển đến tuyến sinh dục đang phát triển. Trong trƣờng hợp sinh tinh, các tế bào này vào 13 trong ống tinh của tinh hoàn. Những tế bào mầm này chƣa trƣởng thành gọi là tinh nguyên bào, sẽ phát triển bằng cách phân bào nguyên nhiễm. Tinh nguyên bào nằm dọc bờ ngoài của ống tinh, gần với các tế bào đệm (tế bào Sertoli). Các tế bào Sertoli tồn tại trong suốt cuộc đời tính dục và số lƣợng của chúng là nhân tố hạn chế việc sản sinh tinh trùng. Trƣớc tuổi thành thục tính dục, các tinh nguyên bào không hoạt động. Từ tuổi thành thục sinh dục trở đi, tinh nguyên bào phân chia liên tục bằng quá trình phân bào nguyên nhiễm tạo nên nhiều tế bào và cung cấp liên tục các tế bào mới (tinh trùng). - Sự biệt hóa về chức năng: một vài tế bào dừng phân chia và biệt hóa thành tế bào tinh trùng nguyên thủy. Mỗi tế bào tinh trùng nguyên thủy trải qua quá trình phân bào giảm nhiễm. Phân chia giảm nhiễm đầu tiên tạo ra 2 tế bào tinh trùng thứ cấp, khi quá trình phân chia giảm nhiễm thứ 2 hoàn thành tạo nên 4 tiền tinh trùng đơn bội. Sự sinh tinh nhạy cảm với điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là sự thay đổi về nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp là khoảng 2 độ dƣới nhiệt độ cơ thể. - Sự biệt hóa về cấu trúc: các tiền tinh trùng biệt hóa thành tinh trùng trƣởng thành. Quá trình biệt hóa này gọi là hiện tƣợng sinh tinh. Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. Độ dài thời gian của quá trình sinh tinh trùng là ổn định cho mỗi loài. 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), nhƣ những tế bào khác, tinh trùng cũng đƣợc bao bọc bởi màng tế bào và cũng có các cấu trúc bên trong (nhân, ty thể…). Cấu tạo gồm 3 phần (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phần đầu chứa vật chất di truyền, phần cổ và đuôi có liên quan đến chức năng vận động. Đầu mang acrosome nổi rõ và đƣợc nối chặt với phần cổ, do đó hiện tƣợng mất đầu trên tinh trùng chó xảy ra với tần số thấp hơn so với ngựa và các loài nhai lại. Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm. 14 - Đầu tinh trùng: dài khoảng 5,6 µm, có 2 phần gồm nhân và thể chóp acrosome. Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là những phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Nhân chiếm 65% thể tích của đầu tinh trùng. Số nhiễm sắc thể trong tinh trùng là đơn bội, không có RNA. Phần trƣớc đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh. - Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, dài 1 µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau của nhân. Tế bào chất ở cổ có chứa 2 trung tử: trung tử gần nằm sát nhân, trung tử xa nằm xa nhân hơn và từ đó bắt nguồn của 9 cặp sợi trục kéo dài đến tận đuôi tinh trùng. - Đuôi tinh trùng: dài khoảng 49,26 - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. Đoạn giữa nằm từ cổ đến vòng nhẫn Jensen, có tiết diện lớn hơn đoạn chính và chót đuôi. Lõi của đoạn giữa và toàn bộ chiều dài của đuôi là một tập hợp bó trục. Tập hợp này gồm 9 cặp vi ống ngoài xếp đồng tâm xung quanh 2 vi ống đơn ở trung tâm và chúng đƣợc bao quanh bằng 9 sợi chắc, dày. Bó trục và những sợi ƣa áp suất của đoạn giữa đƣợc phủ bên ngoài bằng những ty thể. Bọc ty thể chứa các enzyme oxy hóa và oxyphosphoryl hóa. Trong đoạn giữa cũng có nhiều chất dự trữ năng lƣợng: phospholipid, lecithin, plasmalogen… Vì vậy, ty thể đƣợc xem nhƣ nguồn phát sinh năng lƣợng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính là đoạn dài nhất của đuôi tinh trùng, bắt đầu từ vòng nhẫn Jensen kéo dài đến chỗ tiếp giáp với chót đuôi. Khác với đoạn giữa, đoạn này không có bọc ty thể. Một vỏ bọc gồm những sợi chắc phủ bên ngoài đoạn chính và đoạn giữa có vai trò duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi. Chót đuôi là phần tận cùng, ngắn nhất của đuôi. Nó chỉ gồm những sợi của bó trục trung tâm và đƣợc bao bọc bằng màng tế bào. 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn. 15 Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Tinh trùng sống thì luôn luôn chuyển động. Đuôi ngoằn ngoèo uốn khúc chuyển động gây một xung động để tự tiến tới trƣớc. Ngoài ra, tinh trùng có đầu giống hình quả lê nên tự nó chuyển động xung quanh trục của thân nó. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng nƣớc, ngƣợc với trọng lực của giọt tinh dịch. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái Sự vận chuyển của tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái đƣợc ghi nhận gồm 3 giai đoạn (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997): vận chuyển nhanh, thành lập các ổ chứa và phóng thích chậm, kéo dài. Ngay sau khi đƣợc phóng thích, tinh trùng di chuyển nhanh chóng nhờ vào khả năng hoạt động của chúng cũng nhƣ nhờ có hoạt động co rút tăng lên của lớp cơ tử cung và màng treo ống dẫn trứng. Thời gian của giai đoạn vận chuyển nhanh này kéo dài khoảng 2 – 10 phút. Khi di chuyển, tinh trùng đƣợc tách khỏi tinh thanh và hoà vào dịch tiết của đƣờng sinh dục cái. Phần lớn tinh trùng đƣợc giữ lại trong những nếp màng nhầy phức tạp của các hốc trong cổ tử cung, thiết lập những ổ chứa tinh trùng. Ở loài chó, ổ chứa tinh trùng khu trú trong các tuyến nội mạc tử cung. Sau khi đã thiết lập đủ các ổ chứa tinh trùng trong đƣờng sinh dục, tinh trùng đƣợc phóng thích liên tiếp trong thời gian dài. Sự phóng thích chậm rãi này đảm bảo cho tinh trùng có khả năng liên tục tiến vào ống dẫn trứng để thụ tinh trứng. Tốc độ và kiểu hoạt động của tinh trùng đƣợc thay đổi khi tinh trùng 16 vận chuyển qua các bộ phận khác nhau của đƣờng sinh dục cái. Sự tăng hoạt hóa của hoạt động tinh trùng xảy ra chủ yếu trong ống dẫn trứng vào lúc sắp rụng trứng, đƣợc kích thích nhờ dịch của đoạn eo và đoạn bóng của ống dẫn trứng. Trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên. Trong quá trình vận chuyển, một số tinh trùng bị thực bào và bị thất thoát vào trong xoang bụng. Trong thời gian lƣu trú lại nhiều giờ trong đƣờng sinh dục cái, màng tinh trùng trải qua những thay đổi quan trọng nhƣ: những protein cố định trên bề mặt màng sinh chất bằng những mối nối không đồng hóa trị đều đƣợc nới lỏng (theo Villaroya và Scholler, 1987); một số protein cấu trúc (hoặc protein từ dịch hoàn phụ và đƣợc gắn vào màng) bị giảm khối lƣợng phân tử (Esbenshade và Clegg, 1980); các protein có thể di chuyển và phân bố lại một cách cục bộ, hình thành nên những diện tích nhỏ thiếu vắng các protein, là giai đoạn cần thiết cho sự phối hợp áp vào nhau của màng sinh chất và màng ngoài acrosome; cuối cùng là sự thất thoát cholesterol của màng sinh chất và màng ngoài acrosome. Sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid này có khả năng làm rách acrosome. 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng - Vai trò của nƣớc cất: trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch, các chỉ tiêu của nƣớc cất nhƣ khả năng tích ion, tổng vật chất khô, tổng lƣợng vi khuẩn… sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), tinh dịch heo đƣợc pha loãng trong môi trƣờng bảo quản với nƣớc cất khử ion, thẩm thấu ngƣợc và tiệt trùng bằng tia cực tím, đã cho kết quả bảo tồn trên 5 ngày; ngoài ra, hoạt lực và sức sống tinh trùng tốt hơn so với dùng nƣớc cất thƣờng và nƣớc cất khử ion. - Chất điện giải và không điện giải trong môi trƣờng: theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), chất không điện giải (nhƣ các loại đƣờng) có tác dụng làm giảm độ dẫn điện của môi trƣờng, “bảo vệ” cho tinh trùng tránh đƣợc hiện tƣợng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng. Nhờ đó, ngăn ngừa đƣợc hiện tƣợng tụ dính của tinh trùng, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi hơn. Ngoài ra, chất không điện giải còn giữ vai trò chất khử, ngăn ngừa đƣợc sự oxy hóa của oxygen. Khi pha loãng 17 bằng những dung dịch đƣờng thì hạn chế sự sinh sản của các vi khuẩn gây mủ và tăng độ nhớt của môi trƣờng. Chất điện giải là các cation hóa trị 2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho tinh trùng tụ dính lại và cation hóa trị 3, 4 ( Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch đông lại, tinh trùng chết nhanh chóng. Ngƣợc lại, các anion có mối tƣơng quan thuận: anion hóa trị 2 tác động lên tinh trùng tốt hơn so với anion hoá trị 1, còn anion hoá trị 3 lại càng tốt hơn. - Tác động của pH (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): tinh dịch chó có pH hơi toan tính biến động từ 6,5 – 6,8. Ở pH này, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế nên thời gian sống lâu hơn. Nếu môi trƣờng hơi kiềm pH từ 7,0 – 7,5 (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng nên thời gian sống ít hơn. Để môi trƣờng có khả năng duy trì một cách ổn định pH ở mức thích hợp, ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng những chất có năng lực đệm nhƣ: bicarbonate, citrate, phosphate… - Áp suất thẩm thấu (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phụ thuộc vào nồng độ hòa tan của các phân tử và các ion trong môi trƣờng. Theo Iguer và Verstegen (2001) áp suất thẩm thấu của tinh dịch chó dao động từ 290 – 460 mOsm. - Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), vai trò của chất kháng sinh trong môi trƣờng pha loãng tinh trùng là hạn chế tác hại của vi khuẩn. Theo Hoàng Tích Huyền và ctv (2001), kháng sinh penicillin thuộc nhóm β-lactam tạo phức “nhầm” với transpeptidase (phức bền và không phục hồi). Sự tạo phức này làm vi khuẩn không tạo đƣợc vách. Vì vách vi khuẩn Gr + (và một phần của vi khuẩn Gr -) là mạng lƣới dày đặc các peptidoglycan nối với nhau, mà xúc tác cho sự nối peptidoglycan là các enzyme transpeptidase và carboxypeptidase. Nhƣ vậy, penicillin có tác dụng tốt đối với vi khuẩn Gr+. Streptomycin và gentamycin thuộc nhóm amynoglycosid, diệt vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vi khuẩn ở mức ribosome. Streptomycin gắn vào tiểu phần 30S của ribosome và một số aminoglycosid khác có thể tác động lên cả tiểu phần 50S. Aminoglycosid có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩn Gr- và có tác dụng vừa phải đối với tụ cầu. Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), streptomycin có độc tính cao hơn penicillin nên streptomycin có một phần nào đó gây tác hại đến sức sống của tinh trùng. Trong việc bảo quản tinh dịch chó hiện nay các tác giả vẫn thƣờng sử dụng kết hợp 2 kháng sinh là penicillin và streptomycin (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Vì penicillin cản 18 trở tạo vách vi khuẩn, tạo điều kiện để streptomycin dễ thấm qua màng và vào tác động lên ribosome của vi khuẩn (Hoàng Tích Huyền và ctv, 2001). - Vai trò của lòng đỏ trứng: theo Milônanôp (1962), lòng đỏ trứng có lƣợng anion nhiều nên lòng đỏ trứng thƣờng có pH toan tính từ 6 – 6,7. Ông còn nhận định, khi cho citrate natri vào môi trƣờng có lòng đỏ trứng gà sẽ làm tăng độ nhớt của môi trƣờng giúp cho tinh trùng ít bị dao động trong quá trình vận chuyển và tránh sốc khi hạ nhiệt độ. Ngoài ra, lòng đỏ trứng còn có năng lực đệm tốt vì hàm lƣợng PO4 3- rất cao. Lòng đỏ trứng chứa 32% lipid, 16,6% protein, 1% glucid có tác dụng cung cấp dƣỡng chất cho tinh trùng, ngăn ngừa tinh trùng tiêu thụ lipid của bản thân vì trong quá trình sống tiềm sinh tinh trùng vẫn sử dụng lipid trong nguyên sinh chất (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Iguer và Verstegen (2001) đã làm thí nghiệm chứng minh vai trò của lòng đỏ trứng trong việc bảo quản tinh dịch chó. Tinh dịch chó đƣợc bảo quản đến thời điểm hoạt lực còn 50% trong 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 3,2±1; 2,9±2,5; 2,3±0,5 ngày và bổ sung 20% lòng đỏ trứng vào 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 8,5±0,2; 4,5±1,1; 5,2±0,4 ngày. 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó - Iguer và Verstegen (2001) khảo sát khả năng bảo quản của 4 môi trƣờng: Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA và Tris – BES (bảng 2.3). Kết quả về thời gian sống và còn khả năng thụ tinh giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Tris – Fructose, EDTA, Tris – BES tƣơng ứng: 13±1; 9,7±0,6; 4±0,6; 3,6±1,1 ngày. Trong môi trƣờng Tris – glucose, ông vẫn thấy tinh trùng sống tới ngày thứ 16 sau khi bảo quản. 19 Bảng 2.3. Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Iguer và Verstegen, 2001) Thành phần môi trƣờng Tris – glucose Tris – fructose EDTA Tris – BES Nhiệt độ bảo quản (OC) 0 – 4 0 – 4 0 – 4 0 – 4 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 6 0,59 Fructose (g) 1,25 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na (g) 1,7 1,7 Nƣớc cất (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg/100ml) 100 100 100 100 Streptomycin (mg/100ml) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,84 6,81 6,84 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 364 464 310 - Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) khảo sát khả năng bảo quản của 4 loại môi trƣờng tris – glucose, glycine, tris – BES và EDTA (bảng 2.4). Kết quả về thời gian sống còn khả năng thụ tinh (t5) giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Glycine, Tris – BES, EDTA tƣơng ứng với thời gian 65,24; 61,97; 25,46; 19,96 giờ. 20 Bảng 2.4. Công thức pha chế 4 môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Thành phần môi trƣờng Tris – Glucose Glycine Tris – BES EDTA Glycine (g) 0,93 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 1,25 0,59 6 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na.1H2O (g) 1,7 1,45 Nƣớc cất 2 lần (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg) 100 100 100 100 Streptomycin (mg) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,8 6,81 6,81 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 - 310 464 2.11. Hoạt hóa tinh trùng Hoạt hóa tinh trùng (sperm capacitation): là quá trình biến đổi đầu tiên của tinh trùng trong quá trình vận chuyển từ tử cung đến ống dẫn trứng. Quá trình này làm cho tinh trùng có khả năng phóng thích enzyme hyaluronidase, một enzyme làm phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng, để tinh trùng có thể tiếp cận và kết hợp với màng trong suốt của trứng (zona pellucida). Vì vậy trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tinh trùng phải đƣợc hoạt hóa (capacitation) trƣớc khi cho kết hợp với trứng đã chín (matured oocyte) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Thuận, 2005). Theo Farstad (2000), môi trƣờng Tyrode cải tiến (Sperm - TALP) thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình hoạt hóa in vitro của tinh trùng bò, chó và cáo. 21 Các yêu cầu của quá trình hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003): do tinh thanh ngăn cản phản ứng hoạt hoá và có chứa một số chất ức chế hoạt động của tinh trùng nên cần đƣợc loại bỏ. Trong môi trƣờng hoạt hóa, cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumin huyết thanh bò hoặc ngƣời (BSA hoặc HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin. Dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol. Sirivaidyapong và ctv (1999) cho rằng nồng độ Ca2+ cao trong môi trƣờng Sperm- TALP-1 sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng chó có phản ứng acrosome (AR) còn sống và di chuyển trong suốt quá trình hoạt hóa ở 37OC. Bởi vì nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng cao sẽ xâm nhập nhanh chóng vào bên trong tế bào (tinh trùng) làm nồng độ Ca 2+ bên trong tế bào tăng đến mức có thể hoạt hóa phản ứng acrosome. Ông chứng minh bằng cách thêm EDTA vào môi trƣờng thì phản ứng acrosome của tinh trùng chó không xảy ra. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ có thể ức chế phản ứng acrosome của tinh trùng. Phản ứng hoạt hoá tinh trùng có tính chất thuận nghịch. Các tinh trùng hoạt hoá có thể trở nên bất hoạt khi cho tinh dịch vào. Hai phƣơng pháp thông dụng nhất dùng trong thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để hoạt hoá tinh trùng là phƣơng pháp “bơi lên” (swim-up) và phƣơng pháp Percoll. Tỉ lệ thụ tinh của các tinh trùng phân tách từ hai phƣơng pháp này là nhƣ nhau, khi các tinh trùng lấy ra theo 2 phƣơng pháp này đều bình thƣờng nhƣ nhau. Một điều quan trọng khi xử lí mẫu tinh dịch trƣớc khi đƣa vào thụ tinh trong ống nghiệm là tinh dịch cần phải đƣợc rửa sạch hoàn toàn để cho các yếu tố ức chế tinh trùng không thể hoạt động đƣợc (trích dẫn từ Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Phƣơng pháp “bơi lên” là phƣơng pháp phổ biến để tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch, đƣợc sử dụng từ những năm 1970 đến nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự di động của tinh trùng trong môi trƣờng. Phƣơng pháp này thích hợp cho mẫu tinh trùng có mật độ cao và di động tốt nhƣng không phù hợp cho mẫu tinh có khả năng di chuyển kém (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Farstad và ctv (1993) đã thành công trong việc tạo phôi in vitro trên loài cáo xanh (Alopex lagopus), trong quá trình hoạt hóa tinh trùng, Farstad đã sử dụng phƣơng pháp “bơi lên” này. 22 Năm 2001, Younglai và ctv đã so sánh tác động làm hƣ hại DNA tinh trùng ngƣời của phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng và phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp. Phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc rửa bằng cách ly tâm. Phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc đƣa trực tiếp vào quá trình “bơi lên” hay không trải qua bƣớc ly tâm để rửa. Tỉ lệ tinh trùng có DNA bị hƣ hại sau khi hoạt hoá bằng 2 phƣơng pháp “bơi lên” này đƣợc so sánh với mẫu tinh dịch ban đầu. Kết quả: sự hƣ hại DNA đều bé hơn 5% trong hầu hết các mẫu và không có sự thay đổi ý nghĩa nào trong mẫu DNA đƣợc quan sát giữa 2 phƣơng pháp “bơi lên” này. 23 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng: + Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt và phƣơng pháp cạo. + So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng, bao gồm phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamell) và phƣơng pháp không sử dụng lá kính. + Nhuộm xác định tỉ lệ tế bào sống và chết sau khi nuôi cấy. - Xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa đến chất lƣợng tinh trùng: + Bảo quản các mẫu tinh dịch trong môi trƣờng Tris-glucose. + Hoạt hóa tinh trùng bằng phƣơng pháp bơi lên. + Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trƣớc và sau hoạt hóa ở các thời điểm bảo quản. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 06-02-2006 đến ngày 06-07-2006 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu Ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập tại lò mổ anh Phƣớc, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. Mẫu tinh chó đƣợc thu tại nhà bác Sáu và nhà chị Hạnh. 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị Eppendorf Ống nhựa (falcon) 15 ml Dao Kéo Găng tay Khay Lọ cồn Đầu lọc 0,2 µm 24 Dây đồng mảnh Kẹp Ống tiêm 1 ml và kim 26 G Đĩa nuôi cấy 35mm Nhiệt kế Bình cách nhiệt Pipette Pasteur Micropipette Buồng đếm hồng cầu Que thuỷ tinh Phiến kính, lá kính Các loại ống đông có chia độ Kính hiển vi Máy li tâm Cân (độ chính xác 0,001) pH kế (độ chính xác 0,01) Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp Tủ cấy Tủ ấm CO2 Tủ bảo ôn ở nhiệt độ 0-10 0 C Kính hiển vi soi ngƣợc 3.3.3. Hoá chất NaCl NaOH HCl Nigrosin-eosin Dầu xem kính Thuốc nhuộm Kovács (1992) Môi trƣờng Tris-glucose Môi trƣờng Sperm-TALP-1 theo Sirivaiddyapong và ctv (1999) Môi trƣờng TCM 199 25 Môi trƣờng PBS Môi trƣờng Hepes – 199 Dầu khoáng Huyết thanh Lòng đỏ trứng Penicillin Streptomycin Gentamycin Kanamycin 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ (Xu và ctv, 1992) - Chọn những chó cái đang giai đoạn lên giống. Hiên tƣợng lên giống đƣợc chuẩn đoán lâm sàng với những đặc điểm nhƣ: âm hộ sƣng lên và có dịch tiết; không có sự xuất hiện của thể vàng trên bề mặt buồng trứng. - Gây chết nhƣng không trụng nƣớc sôi và thui nóng chó. - Dùng dao mổ từ rốn trở xuống 5 cm. - Dùng 2 ngón tay kéo thận ra. - Dùng kéo cắt màng treo của bao buồng trứng gắn vào thận và cắt sừng tử cung. - Thu nhận phức hợp gồm bao buồng trứng và 1 phần sừng tử cung. - Trữ 250 C trong môi trƣờng PBS đƣợc bổ sung FCS 2%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml. - Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. 3.4.1.2. Xử lý ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm (Xu và ctv, 1992) - Dùng kéo tách ống dẫn trứng từ phức hợp gồm bao buồng trứng và một phần sừng tử cung. - Tách mô liên kết, tua viền của ống dẫn trứng. - Rửa ống dẫn trứng trong môi trƣờng Hepes-199 đƣợc bổ sung ECS 10%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml. 26 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng Thí nghiệm 1: so sánh 2 phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Chỉ tiêu quan sát là thời gian thu thập tế bào và khả năng gây nhiễm vi sinh vật của mỗi phƣơng pháp. Sự nhiễm vi sinh vật đƣợc đánh giá thông qua sự đổi màu của môi trƣờng nuôi cấy. a/ Thu thập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp vuốt (squeeze) (Xu và ctv, 1992) Dùng dây đồng mảnh luồn vào trong ống dẫn trứng Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Lộn ngƣợc bề mặt trong của ống dẫn trứng Dùng 2 kẹp vuốt để tách những mảnh biểu mô Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes - 199 Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút) Giữ cặn Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes – 199, trộn đều Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút) Thu nhận tế bào biểu mô ở dạng mảnh nhỏ Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi 27 b/ Phân lập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp cạo (scrape) (Bogliolo và ctv, 2002) Giữ cặn Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes-199, trộn đều Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút) Thu nhận tế bào biểu mô (ở dạng mảnh nhỏ) Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi Cố định ống dẫn trứng lên các đầu ngón tay Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Dùng kéo cắt dọc ống dẫn trứng Mở bề mặt trong của ống dẫn trứng Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes – 199 Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút) Dùng dao cạo nhẹ nhàng để tách những mảnh biểu mô 28 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy ở dạng mảnh (Xu và ctv, 1992). Do đó những tế bào này khó bám vào đáy đĩa nuôi cấy để đƣợc cố định. Để giải quyết nhƣợc điểm này, phƣơng pháp sử dụng lá kính cố định những tế bào này đƣợc đặt ra và đƣợc so sánh với phƣơng pháp không sử dụng là kính. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle – like). a/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính - Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%. - Đánh dấu vị trí bơm tế bào vào đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao) trong 5 phút. - Dùng lá kính đƣợc cắt 1/4 đậy lên vị trí vừa đánh dấu. - Bơm nhẹ nhàng 3 ml môi trƣờng TCM – 199 đƣợc bổ sung ECS 10% lên bề mặt lá kính. - Ghi kí hiệu trên đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao). - Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần. b/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp không sử dụng lá kính - Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri (loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%) chứa 3 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%. - Ghi kí hiệu trên đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao). - Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần. 29 3.4.1.5. Nhuộm xác định tế bào chết và tế bào sống bằng trypan blue (Nigel Jenkins, 1999; Nhan Ngọc Hiền, 2005) Ghi chú: Quy trình này dùng để nhuộm những tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp “sử dụng lá kính”. Công thức tính tỉ lệ tế bào nuôi cấy còn sống tại thời điểm nhuộm: % tế bào sống = (số tế bào sống đếm đƣợc / tổng số tế bào đếm đƣợc)*100% Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút) (bằng môi trƣờng PBS) Giữ cặn và tạo huyền phù Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi Hòa tan dung dịch trypan blue 2% với tỉ lệ 1:1 (2 phút, nhiệt độ phòng) Cho hỗn hợp này vào buồng đếm hồng cầu Quan sát, đếm tế bào sống (màu trắng) và tế bào chết (màu xanh) Hút bỏ 2 ml môi trƣờng bề mặt và dùng kẹp gấp lá kính ra Đĩa tế bào sau một thời gian nuôi cấy Hút 0,5 ml huyễn dịch tế bào vào 0,5 ml môi trƣờng PBS, trộn đều Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút) Quan sát và lắc nhẹ đĩa đến khi tế bào vừa đƣợc tách (3-4 phút) Trung hoà trypsin bằng 1 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10% Giữ cặn, thêm 1 ml trypsin, trộn đều 30 3.4.2. Hoạt hóa tinh trùng Thí nghiệm 3: xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng đến chất lƣợng tinh trùng. Thí nghiệm gồm 2 yếu tố (thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng). Chỉ tiêu quan sát bao gồm các chỉ tiêu đánh giá tình trạng tinh trùng nhƣ: hoạt lực, nồng độ, độ kỳ hình, tình trạng sống còn acrosome và cƣờng độ hoạt động của tinh trùng. 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm (Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) - Thu nhận tinh dịch pha 2 vì pha này có nồng độ tinh trùng cao, ít tinh thanh. - Dùng pipette (1000 µl) hút mẫu tinh vào ống falcon (15 ml, đƣợc gói giấy bạc). - Thêm môi trƣờng tris – glucose vào ống falcon này với tỉ lệ 1:1, trộn đều một cách nhẹ nhàng. - Chia nhỏ mẫu tinh đã pha loãng vào đầy từng ống eppendorf (1,5 ml), nhằm tránh sóng lắc trong quá trình vận chuyển. - Trữ những eppendorf này vào bình đá (0 – 40C). - vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng Với mẫu tinh đã đƣợc pha loãng trong môi trƣờng tris – glucose, chia 3 nhóm và đƣợc khảo sát ở 3 thời điểm tƣơng ứng là 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Mỗi nhóm đƣợc chia làm 2 phần: phần A có thể tích là 0,5 ml và phần B có thể tích là 1 ml. Phần A đƣợc dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng trƣớc khi hoạt hóa. Phần B đƣợc đƣa vào quy trình hoạt hóa tinh trùng và đƣợc đánh giá ngay sau khi hoạt hoá. 31 Tinh trùng đƣợc hoạt hóa theo quy trình sau (Younglai và ctv, 2001; Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001): Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sau (Thái Thi Mỹ Hạnh, 2005) a/ Đánh giá hoạt lực (A) Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40. Dùng pipette hút 1 ml dịch nổi ở phần trên cùng vào eppendorf 1,5 ml Đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng Sau 1 giờ, dựng thẳng ống falcon (nhẹ nhàng, chậm rải) Giữ yên ống falcon 5 phút Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 5 phút) (dùng môi trƣờng Sperm – TALP – 1) Mẫu tinh dịch pha loãng trong môi trƣờng Tris – glucose (1 ml) Thu phần đáy Thêm 1 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1 Bơm nhẹ nhàng 1 ml hỗn hợp này vào đáy của ống falcon chứa 4 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1 Đặt ống falcon vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao) theo một gốc xiên 300 so với mặt phẳng ngang. Trộn đều (nhẹ nhàng) loại bỏ dịch nổi 32 Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37OC khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1. b/ Đánh giá nồng độ tinh trùng (C) Tiến hành: + Dùng lá kính đặt lên buồng đếm hồng cầu. + Pha loãng tinh bằng ống pha loãng hồng cầu, trong dung dịch NaCl 3%, với độ pha loãng 200 lần. + Lắc nhẹ ống pha loãng theo vòng số 8 khoảng 4 – 5 lần. + Loại bỏ 4 – 5 giọt tinh pha loãng ở đầu ống mao dẫn của ống pha loãng. + Nhỏ 0,5 – 1 giọt tinh pha loãng vào buồng đếm hồng cầu. + Đếm đầu tinh trùng ở vật kính 40 trong 80 ô nhỏ, đƣợc đại diện bởi 5 ô lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở chính giữa). Số lƣợng tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với môi trƣờng Tris – glucose đƣợc tính theo công thức: C = n * b * 50.000 Trong đó: C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với môi trƣờng tris – glucose n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn b : Hệ số pha loãng c/ Đánh giá kỳ hình (K) Tiến hành: + Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô. + Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều. + Thêm 1 giọt dung dịch nigrosin – eosin, trộn đều. + Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng tinh trùng trên mặt phiến kính. + Đếm tổng số 200 tinh trùng ở vật kính 40 và tính tỉ lệ kỳ hình. 33 Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thƣờng: đầu có bƣớu, đầu to, đầu nhỏ, 2 – 3 đầu, thân phình to ra, đuôi cong hình móc câu, búi tóc… Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình đƣợc tính theo công thức: %K = (Tổng số tinh trùng kỳ hình / Tổng số đếm đƣợc) * 100% d/ Đánh giá tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome (SC) Sử dụng kỹ thuật nhuộm của Kovács (1992): + Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô. + Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều. + Thêm 1 giọt dung dịch trypan blue, trộn đều. + Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng tinh trùng trên mặt phiến kính. + Để khô tự nhiên (2 – 5 phút). + Đặt phiến kính đã khô này vào dung dịch hãm màu, 2 phút. + Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần. + Nhúng ngập phiến kính đã khô vào dung dịch nhuộm, 4 giờ, 370C. + Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, ngâm trong nƣớc cất 2 phút. + Để khô tự nhiên (2 – 5 phút). + Đậy lá kính, nhỏ một giọt dầu xem kính, đếm tổng số 200 tinh trùng ở vật kính 100 và tính tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên acrosome. Khi quan sát tinh trùng chó, thấy phần đầu tinh trùng bắt màu hồng mịn đều là tinh trùng còn acrosome và phần sau đầu tinh trùng có màu trắng là tinh trùng còn sống. Tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome đƣợc tính theo công thức: % SC = (Tổng số tinh trùng sống còn acrosome / Tổng số đếm đƣợc) * 100% e/ Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng (CĐ) Chỉ tiêu này đƣợc ghi nhận thêm để phản ánh đầy đủ hơn hoạt động của tinh trùng. Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40. Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng dựa trên tốc độ vận động của tinh trùng đƣợc quan sát, ƣớc lƣợng trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng tại thời điểm 0 giờ đƣợc ghi nhận là 1 (cƣờng độ gốc). Tùy vào sự tăng hay giảm cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ở thời điểm bảo quản 0, 24, 34 48 giờ hay trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa, cƣờng độ hoạt động của tinh trùng đƣợc tính bằng công thức: CD = số lần tăng hoặc giảm cƣờng độ hoạt động so với cƣờng độ gốc 3.5. Xử lí số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm F và chi – square trên phần mềm Statgraphics 7.0. 35 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: so sánh hai phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng Tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó đƣợc thu thập 7 lần với tổng số là 14 đĩa (2 – 3 ống dẫn trứng/đĩa): 7 đĩa đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp vuốt và 7 đĩa đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp cạo. Cả hai phƣơng pháp này đều thu thập đƣợc tế bào biểu mô ống dẫn trứng dƣới dạng mảnh mô nhƣ Xu và ctv (1992) đã mô tả. Số đĩa bị nhiễm vi sinh vật đƣợc thu nhận từ phƣơng pháp vuốt ít hơn phƣơng pháp cạo, tƣơng ứng là 0% và 14,3% (một đĩa có môi trƣờng chuyển sang màu vàng). Do kích thƣớc ống dẫn trứng của chó rất nhỏ (đƣờng kính 0,5 – 0,8 mm), gây trở ngại thao tác trong phƣơng pháp cạo nhƣ dễ cạo phạm vào lớp đệm của tầng niêm mạc và lớp cơ trơn của tầng cơ nên khi thao tác cạo đòi hỏi phải đặt mẫu lên các đầu ngón tay để làm điểm tựa và phải đặt cận mắt (sát cửa tủ cấy) làm tăng khả năng nhiễm vi sinh vật. Ngoài ra, trong phƣơng pháp vuốt, tiến hành vuốt theo chiều dọc của ống dẫn trứng, còn phƣơng pháp cạo chỉ cạo cục bộ từng phần của ống dẫn trứng nên thời gian thực hiện của thao tác vuốt nhanh hơn thao tác cạo, tƣơng ứng là 30 giây và 60 giây. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ở ngoài môi trƣờng dinh dƣỡng càng lâu thì càng bất lợi cho khả năng tồn tại của tế bào. Vì vậy phƣơng pháp vuốt cho khả năng thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng tốt hơn phƣơng pháp cạo. 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng Sau khi thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng, nuôi cấy theo 2 phƣơng pháp: sử dụng lá kính (lamelle) và không sử dụng lá kính. Kết quả xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle - like) đƣợc trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy Phƣơng pháp Số đĩa có xuất hiện “bóng nƣớc” Số đĩa không có xuất hiện “bóng nƣớc” Tỉ lệ % đĩa có xuất hiện “bóng nƣớc” p Sử dụng lá kính 2 5 28,6 0,0021 Không sử dụng lá kính 0 7 0 36 Bảng 4.1 cho thấy phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng sử dụng lá kính và phƣơng pháp không sử dụng lá kính có sự khác biệt rất ý nghĩa (p < 0,01) khi xét chỉ tiêu có hay không có sự xuất hiện của cấu trúc “bóng nƣớc” mà Xu và ctv (1992) đã mô tả. Cấu trúc “bóng nƣớc” bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 3 nuôi cấy (hình 4.1) giống nhƣ kết quả mà Xu và ctv (1992) đã ghi nhận. Nhƣ vậy, tỉ lệ đĩa nuôi cấy đạt chỉ tiêu đánh giá của phƣơng pháp có sử dụng lá kính (28,6%) cao hơn phƣơng pháp không sử dụng lá kính (0%). Những mảnh tế bào biểu mô đƣợc lá kính cố định sẽ giảm dao động trong quá trình di chuyển và quan sát đĩa dƣới kính hiển vi, do đó lá kính có thể đóng vai trò nhƣ một giá đỡ tế bào. Hơn nữa, trọng lực lá kính sẽ tạo áp lực bề mặt giúp một số tế bào tiếp xúc với đĩa có khả năng bám tốt hơn. Để chứng minh cho sự tồn tại của tế bào ống dẫn trứng chó gắn liền với sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”, đĩa có xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” đƣợc nhuộm trypan blue vào ngày thứ 14 nuôi cấy. Kết quả nhuộm cho thấy: bên cạnh những tế bào chết trong đĩa vẫn còn những tế bào có khả năng tồn tại (hình 4.2) và tỉ lệ tế bào sống trung bình là 44%. Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) (x 200) Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy (x 400) 37 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa lên chất lƣợng tinh trùng 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng Hoạt lực của tinh trùng dƣới tác động bởi 2 yếu tố: thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hoá đƣợc trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Hoạt lực 0,72 ± 0,08 0,78 ± 0,08 0,65 ± 0,06 0,75 ± 0,06 0,53 ± 0,05 0,77 ± 0,05 n 6 PTG 0,0017 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,0057 Ghi chú: n: số lần lập lại PTG: xác suất sai lầm của yếu tố thời gian bảo quản PPƢ: xác suất sai lầm của yếu tố phản ứng hoạt hóa PTG – PƢ: xác suất sai lầm của sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Ho ạt Lự c Trước hoạt hoá Sau hoạt hoá Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng Kết quả bảng 4.2 cho thấy hoạt lực của tinh trùng ở các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) có khác biệt rất ý nghĩa (PTG < 0,01). Hoạt lực của tinh trùng 38 giảm dần theo thời gian bảo quản, kết quả này phù hợp với ghi nhận của Thái Thị Mỹ Hạnh (2005). Hoạt lực của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng có sự khác biệt rất cao (PPƢ < 0,001). Hoạt lực của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa cao hơn trƣớc khi hoạt hóa, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng thu đƣợc sau quá trình hoạt hóa là những tinh trùng có khả năng bơi lội tốt (Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa rất có ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,01). Nhƣ vậy, yếu tố thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng Nồng độ tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Nồng độ (x 10 6 /ml) 130 ± 36,68 9,83 ± 2,91 130 ± 36,68 2,77 ± 1,30 130 ± 36,88 1,58 ± 0,87 n 6 PTG 0,2323 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,2323 0 20 40 60 80 100 120 140 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Nồ ng độ (x 10 00 00 0/m l) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng 39 Kết quả bảng 4.3 cho thấy nồng độ của tinh trùng thay đổi không có ý nghĩa (PTG > 0,05) giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, nồng độ của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa có khác biệt rất cao (PPƢ < 0,001). Nồng độ của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng, kết quả này phù hợp với kết quả của Younglai và ctv (2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, bảo quản trong 48 giờ không ảnh hƣởng đến nồng độ của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Kỳ hình (%) 16,08 ± 3,11 6,18 ± 0,78 16,08 ± 3,11 6,93 ± 2,07 16,08 ± 3,11 6,18 ± 1,63 n 6 PTG 0,9118 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,9118 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Kỳ h ìn h (% ) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Bảng 4.4 cho thấy tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thay đổi không ý nghĩa (PTG > 0,05) giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, tỉ lệ tinh trùng 40 kỳ hình sau phản ứng hoạt hóa đã giảm rất ý nghĩa (PPƢ < 0,001) so với trƣớc phản ứng, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng kỳ hình thƣờng có khả năng bơi lội kém hoặc không có khả năng bơi lội nên phần tinh trùng thu đƣợc sau quá trình hoạt hóa ít có tinh trùng kỳ hình. Tƣơng tự trƣờng hợp thụ tinh in vivo, trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản không ảnh hƣởng đến tỉ lệ kỳ hình của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome Tỉ lệ tinh trùng sống còn nguyên acrosome cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa, đƣợc trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Sống còn acrosome (%) 80,75 ± 3,82 36,38 ± 8,48 74,33 ± 4,89 26,38 ± 3,80 67,42 ± 5,02 27,8 ± 5,28 n 6 PTG 0,0001 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,1879 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Số ng cò n ac ro so m e ( % ) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome 41 Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome giảm dần theo thời gian bảo quản (PTG < 0,001). Kết quả này phù hợp với kết luận của Thái Thị Mỹ Hạnh (2005). Ngoài ra, tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome sau phản ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng (PPƢ < 0,001)(hình 4.3 và hình 4.4). Nồng độ Ca 2+ cao trong môi trƣờng Sperm – TALP – 1 sẽ làm tăng phản ứng acrosome của tinh trùng (Sirivaidyapong và ctv, 1999). Thêm vào đó, sự hiện diện của thụ quan cholesterol (BSA) làm mất sự ổn định màng tinh trùng (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Hai nguyên nhân này có lẽ liên quan đến dẫn liệu của Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997); theo tác giả sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid của màng sinh chất và màng ngoài acrosome có khả năng làm rách màng acrosome. Do đó sau khi hoạt hóa, tinh trùng có thể bị rách màng acrosome (hình 4.4). Điều này có lẽ trở thành cở sở cho việc phóng thích enzyme hyaluronidase để phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng trong quá trình thụ tinh. Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, bảo quản trong 48 giờ không ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống và còn nguyên vẹn acrosome của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa. Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm Hình 4.4 Tinh trùng nhuộm (x 1000) trƣớc phản ứng hoạt hóa (x 1000) sau phản ứng hoạt hóa có màng acrosome không đồng nhất (mũi tên) 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6. 42 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Cƣờng độ hoạt động 1 ± 0,00 6,33 ± 1,03 0,94 ± 0,02 4,4 ± 0,81 0,88 ± 0,03 2,95 ± 0,51 n 6 PTG 0,0000 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,0000 0 1 2 4 5 6 7 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Cư ờn g độ Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Kết quả bảng 4.6 cho thấy cƣờng độ hoạt động của tinh trùng thay đổi rất ý nghĩa (PTG < 0,001)giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) . Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng cao nhất ở mốc thời gian là 0 giờ và giảm dần theo thời gian bảo quản. Có lẽ tinh trùng đã tiêu tốn năng lƣợng khá nhiều cho việc di chuyển trong môi trƣờng bảo quản. Tinh trùng có đặc tính luôn chuyển động về phía trƣớc (Trần Tiến Dũng, 2002). Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng thay đổi rất ý nghĩa(PPƢ < 0,001). Sau phản ứng hoạt hóa cƣờng độ hoạt động của tinh trùng đƣợc cải thiện. Trong môi trƣờng Tris – glucose, sự hiện diện của lòng đỏ trứng và citrate natri làm tăng độ nhớt của môi trƣờng nên làm hạn chế hoạt động của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Do đó cƣờng độ hoạt động của tinh trùng trong môi trƣờng Tris – glucose thấp hơn trong tinh nguyên và trong môi trƣờng 43 Sperm – TALP – 1. Ngoài ra pH của môi trƣờng Tris – glucose hơi toan tính (6,82) nên sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Ngƣợc lại pH của môi trƣờng Sperm – TALP – 1 hơi kiềm tính (7,21) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Sự tƣơng tác giữa thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa rất ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,001). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến cƣờng độ hoạt động của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. Tóm lại, thí nghiệm 3 cho thấy chất lƣợng tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian khảo sát 0 giờ là tốt nhất. Tinh trùng đƣợc hoạt hóa ngay sau khi pha loãng có hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). Do đó, khi thụ tinh in vitro nên chọn tinh trùng đƣợc hoạt hóa ngay sau khi pha loãng. Tuy nhiên, để kết luận đƣợc chính xác hơn, cần chọn cả 3 mẫu tinh trùng đƣợc hoạt hóa ở các mốc thời gian bảo quản 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành thụ tinh in vitro. Tỉ lệ phôi 2 tế bào đƣợc tạo ra từ quá trình thụ tinh này là chỉ tiêu quyết định trong việc đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau khi hoạt hóa ở các mốc thời gian bảo quản khác nhau (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Trong quá trình khảo sát 5 chỉ tiêu nêu trên, một đặc điểm khác của tinh trùng cũng đƣợc quan sát. Tinh trùng có đặc tính tiếp xúc với vật lạ (Trần Tiến Dũng, 2002). Do đó trƣớc khi hoạt hóa, tinh trùng chỉ tiếp xúc với vật lạ (nếu có) mà không tiếp xúc với nhau. Tuy nhiên, sau khi hoạt hóa thì tinh trùng thƣờng hay tiếp xúc lẫn nhau (hình 4.5). Các cation hóa trị 2 trong môi trƣờng Sperm – TALP – 1 (Ca2+ với nồng độ cao, Mg 2+) làm mất điện tích bề mặt tinh trùng nên tinh trùng tụ dính lại (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Những tinh trùng trƣớc phản ứng hoạt hóa không tụ dính với nhau, có lẽ do bề mặt của chúng có cùng điện tích. Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng (x 400) 44 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt xảy ra ngắn hơn và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công là 28,6%, cao hơn so với phƣơng pháp không sử dụng lá kính (0%). - Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng hoạt hóa ngay sau khi pha loãng là tốt nhất. 5.2. Đề nghị - Tiến hành thêm nhiều thí nghiệm để nâng cao tỉ lệ thành công khi nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Thụ tinh in vitro đối với tinh trùng vừa đƣợc bảo quản và hoạt hóa. - Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với noãn và phôi, nhằm nâng cao tỉ lệ trứng chín và làm tăng chất lƣợng của phôi đƣợc nuôi cấy trong điều kiện in vitro. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm. Nxb Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Tƣờng Anh, 2002. Sự đa dạng, sự sinh sản và phát triển của động vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 3. Trịnh Bình, Phạm Phan Dịch, Đỗ Kính, 2004. Mô học. Nxb Y Học, Hà Nội. 4. Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh, 2002. Sinh sản gia súc. Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội. 5. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh in vitro và PCR xác định giới tính trên heo. Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 6. Phan Trƣờng Duyệt, Phan Khanh Vy, 2001. Thụ tinh trong ống nghiệm. Nxb Y Học, Hà Nội. 7. Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005. Khảo sát khả năng khai thác tinh trên chó và khả năng bảo quản của một số môi trường pha chế tinh. Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 8. Hoàng Kim Giao, 2003. Công nghệ cấy truyền phôi ở gia súc. Nxb Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội. 9. Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Huỳnh, 2001. Sinh lí học người và động vật. Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 10. Nhan Ngọc Hiền, 2005. Xây dựng quy trình nuôi cấy nguyên bào sợi phù hợp điều kiện Việt Nam. Đề tài nghiên cứu khoa học, trung tâm đào tạo bồi dƣỡng cán bộ y tế Tp. Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005. Sinh học phân tử và tế bào – cơ sở khoa học của công nghệ sinh học. Nxb Giáo Dục. 12. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông, 2001. Dược lí học. Nxb Y Học Hà Nội. 13. Phan Kim Ngọc, 2002. Giáo trình thực tập cơ sở công nghệ sinh học động vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 14. Nguyễn Văn Thuận, 2005. Tài liệu giảng dạy môn công nghệ sinh học trong chăn nuôi. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 46 TIẾNG ANH 15. Bogliolo L., Zedda T. M., Ledda S., Leoni G., Naitana S., Pau S., 2002. Influence of co-culture with oviductal epithelial cells on in vitro maturation of canine oocytes. Preprod. Nutr. Dev 42: 265-273. 16. Farstad W., 2000. Current state in biotechnology in canine and feline reproduction. Animal Reproduction Science 60: 375-387. 17. Farstad W., 2000. Assisted reproductive technology in canid species. Therigenology 53: 175-186. 18. Fartad W., Hyttel P., Grondahl C., Krongenes A., Mondain-Monval M. and Hafne A.L., 1993. Fertilization in vitro of oocytes matured in vivo in the blue fox (Alopex lagopus). Journals of Reproductive & Fertility 47: 219-226. 19. Freshney I. R., 1987. Culture of animal cells – a manual of basic technique. Alan R. Liss, Inc., New York. 20. Iguer-ouada M. and Verstegen J.P., 2001. Long-term preservation of chilled canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders. Theriogenology 55: 671-684. 21. Jenkins N., 1999. Animal cell Biotechnology methods and protocols. Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. 22. Sirivaidyapong S., Cheng F. P., Marks A., Voorhout W. F., Bevers M. M. and Colenbrander B., 2000. Effect of sperm on the acrosome reaction in canine sperm. Theriogenology 53: 789-802. 23. Xu K. P., Yadav B. R., Rorie R. W., Plante, Betteridge K. J. và King W. A., 1992. Development and viability of bovine embryos derived oocytes matured and fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviducal epithelial cells. J. Reprod. Fert 94: 33-43. 24. Younglai E.V., Holt D., Brown P., Jurisicova A. and Casper R.F., 2001. Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation. Human Reproduction 16 (9): 1950-1953. 47 PHỤ LỤC 1. So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ông dẫn trứng Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance --------------------------------------------------------------------- 11.6667 1 6.36300E-4 9.45000 1 2.11149E-3 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent --------------------------------------------------------------------- Lambda 0.22222 0.00000 0.28571 Uncertainty Coeff. 0.20119 0.27061 0.16011 Somer's D 0.38356 0.28571 0.58333 2. Khảo sát hoạt lực tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.HL - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN .0600000 2 .0300000 7.941 .0017 B:XULITK.HOAT_HOA .1600000 1 .1600000 42.353 .0000 INTERACTIONS AB .0466667 2 .0233333 6.176 .0057 RESIDUAL .1133333 30 .0037778 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) .3800000 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 3. Khảo sát nồng độ tinh trùng Trắc nghiệm về sự đồng nhất của các biến lƣợng: Chi-Square Goodness-of-Fit Test ---------------------------------------- Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square ---------------------------------------- 1345 677 660 8 677 660 1345 677 660 2 677 674 1360 677 689 1 677 675 ---------------------------------------- Chi-square = 4018.62 with 5 d.f. Sig. level = 0 Chuyển đổi số liệu sang căn bậc hai của số liệu và trắc nghiệm về sự đồng nhất các biến lƣợng của số liệu mới: Chi-Square Goodness-of-Fit Test ---------------------------------------- Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square ---------------------------------------- 7 5.3 .501 4 5.3 .501 ---------------------------------------- Chi-square = 1.00194 with 1 d.f. Sig. level = 0.316841 48 Kết quả phân tích biến lƣợng cho số liệu đã chuyển đổi: Analysis of Variance for XULITK.ND4 - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.TG 5.60527 2 2.80264 1.536 .2323 B:XULITK.HH 751.94102 1 751.94102 412.056 .0000 INTERACTIONS AB 5.6052716 2 2.8026358 1.536 .2323 RESIDUAL 52.920717 29 1.8248523 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 811.66562 34 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error 4. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Analysis of Variance for XULITK.KH - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 1.12500 2 .56250 .093 .9118 B:XULITK.HOAT_HOA 838.10250 1 838.10250 138.001 .0000 INTERACTIONS AB 1.1250000 2 .5625000 .093 .9118 RESIDUAL 182.19500 30 6.0731667 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1022.5475 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 5. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrrosome Analysis of Variance for XULITK.SC - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 780.097 2 390.049 13.158 .0001 B:XULITK.HOAT_HOA 17406.404 1 17406.404 587.199 .0000 INTERACTIONS AB 104.84722 2 52.423611 1.768 .1879 RESIDUAL 889.29333 30 29.643111 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 19180.642 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 6. Khảo sát cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.CD - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 18.49181 2 9.24590 27.951 .0000 B:XULITK.HOAT_HOA 117.90340 1 117.90340 356.428 .0000 INTERACTIONS AB 16.123472 2 8.0617361 24.371 .0000 RESIDUAL 9.9237500 30 .3307917 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 162.44243 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error.