Luận văn Khảo sát hệ vi khuẩn methylobacterium sp. trên lúa (oryza sativa l.) ở Tây Ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * BIỆN TUẤN AN KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN Th.S KIỀU PHƢƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * INVESTIGATING Methylobacterium sp. IN RICE (Oryza sativa L.) AT TAY NINH PROVINCE GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: Assoc.Prof.PhD. BUI VAN LE BIEN TUAN AN MSc. KIEU PHUONG NAM TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em vô cùng biết ơn PGS. TS Bùi Văn Lệ, Th.S. Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em trong suốt thời gian em học ở trường. Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt nghiệp này. Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập. Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay. Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con. Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến trường. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Biện Tuấn An v TÓM TẮT Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh”. Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS Bùi Văn Lệ Th.S Kiều Phương Nam Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon. Là vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có lợi cho thực vật và con người. Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. Được thực hiện qua các bước sau: - Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. - Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm thuần. - Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng. - Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định danh. Các kết quả đạt được: - Thu thập, phân lập và làm thuần 26 dòng vi khuẩn khác nhau thuộc chi Methylobacterium. - Khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được làm thuần và phân bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. - Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng phương pháp PCR và giải trình tự. Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các chủng so với các loài đã công bố. vi - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy PHB. Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh vật trong thời đại ngày nay. Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác. vii MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................... x Dang sách các bảng ........................................................................................................ xi Dang sách các hình-sơ đồ .............................................................................................. xii Phần I: Phần mở đầu ........................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích, yêu cầu .................................................................................................. 2 Phần II: Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 3 2.1. Cây lúa ................................................................................................................. 3 2.1.1. Nguồn gốc phân bố .......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại .......................................................................................... 4 2.1.2.1. Đặc điểm chung ........................................................................................ 4 2.1.2.2. Phân loại .................................................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn ............................................................................................................. 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ......................................................................... 7 2.2.2. Đặc điểm chung ............................................................................................. 12 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố ................................................................ 12 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ...................................................... 13 2.3. Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật ............................................................ 16 2.3.1. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ......................................... 16 2.3.2. Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật ........................................ 17 2.3.3. Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium ...................... 19 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium .................................... 21 2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật ..................................................................... 23 2.4.1. Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống ................................ 23 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................. 24 2.4.2.1. Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử ........................................................... 24 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật ....................... 26 Phần III: Vật liệu và phương pháp ................................................................................ 28 3.1. Vật liệu ................................................................................................................ 28 viii 3.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................................. 28 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................ 28 3.1.3. Hóa chất ......................................................................................................... 28 3.1.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần .......................................................... 28 3.1.3.2. Môi trường giử giống vi khuẩn .............................................................. 29 3.1.3.3. Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn .......................................................................................................... 29 3.1.3.4. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn ...................................................... 29 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR ... 29 3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 30 3.2.1. Lấy mẫu ......................................................................................................... 30 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn ........................................................................................ 31 3.2.3. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 31 3.2.4. Làm thuần ...................................................................................................... 31 3.2.5. Giữ giống ....................................................................................................... 31 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa ......................................................... 31 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào .............................................. 32 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxy ................................................................................ 33 3.2.6.3. Khả năng di động ..................................................................................... 34 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ................... 34 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR ................................. 34 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH .................................................. 37 3.2.6.7. Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn ..................................... 38 3.3. Định danh vi khuẩn ............................................................................................. 38 3.3.1. Tính hệ số tương đồng di truyền .................................................................. 38 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn ................................................................................. 38 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR ............................................................................. 39 3.3.3.1. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 39 3.3.3.2. Các primer sử dụng ................................................................................ 39 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả ........................................................................... 41 3.3.4. Giải trình tự .................................................................................................. 41 ix 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................ 41 3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ..................................... 42 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin ...................................................... 42 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB ........................................................ 42 Phần IV: Kết quả và biện luận ....................................................................................... 44 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ............................................................................ 44 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 46 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào ....................................... 46 4.2.2. Mối quan hệ với oxy ..................................................................................... 46 4.2.3. Khă năng di động ........................................................................................... 47 4.2.4. Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon ........................................... 47 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GNR .......................................................................... 49 4.2.6. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn ... 50 4.2.7. Đường cong tăng trưởng tế bào ..................................................................... 52 4.3. Kết quả định danh vi khuẩn ................................................................................ 55 4.3.1. Hệ số tương đồng di truyền ........................................................................... 55 4.3.2. Kết quả PCR .................................................................................................. 56 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium .................................. 56 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn ............................... 57 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã công bố ................................................................................................................ 58 4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp .................................. 61 4.4.1. Định tính auxin ............................................................................................... 61 4.4.2. Định tính PHB ................................................................................................ 61 Phần V: Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 62 5.1. Kết luận................................................................................................................. 62 5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 62 Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 63 Phụ luc ........................................................................................................................... 76 x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMS: môi trường MS bổ sung caseine hydrolase CP: môi trường cao thịt-peptone ctv: cộng tác viên DC: đối chứng DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one IAA: indole-3-acetic acid MMS:môi trường methanol mineral salts NCBI: National Center for Biotechnology Imformation OD: optical density PCR: polymerase chain reaction PHB: poly- -hydroxybutyrate PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA RNA: ribonucleotide rRNA: RNA ribosome tRNA: RNA vận chuyển UV: ultraviolet Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza .................................... 6 Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên ......................................... 8 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR ..................... 36 Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần ................................. 44 Bảng 4.2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................ 47 Bảng 4.3: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR .............................................. 49 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn ................ 53 Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền Jaccard.............................................................. 55 Bảng 4.6: Hệ số tương đồng của chủng TN10 với các loài đã công bố ........................ 58 Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các loài đã công bố ......................... 59 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH-SƠ ĐỒ Hình 2.1: Hình thái cây lúa .............................................................................................. 5 Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới kính hiển vi điện tử ....................................................................................... 13 Hình 2.3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB trong quá trình biến dưỡng ............................................................................ 15 Hình 2.4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp. ở cây dương nuôi cấy mô .................. 22 Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA ........................................... 40 Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi 2F và 2R .................................... 40 Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F ..................................................................................... 41 Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MMS ................................................. 45 Hình 4.2: Hình dạng tế bào trong thử nghiệm gram với vật kính 100X ....................... 46 Hình 4.3: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................. 48 Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào ............................. 50 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ............................ 50 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ................................... 51 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn .......................................................... 52 Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R ..................... 57 Hình 4.9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R Và FPGS1509 với 2F .................................................................................... 58 Hình 4.10: Cây phát sinh loài ........................................................................................ 60 Hình 4.11: Kết quả định tính auxin ............................................................................... 61 Hình 4.12: Sự bắt sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang .................... 62 1 Phần I: Phần mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Cây lúa là cây lương thực chủ yếu của các nước châu Á và Việt Nam. Cùng với sự gia tăng dân số trên toàn thế giới thì nhu cầu về lương thực nói chung và nhu cầu lúa gạo nói riêng đang ngày một tăng lên. Vì vậy, một nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải gia tăng diện tích gieo trồng và năng suất lúa. Trong đó, việc gia tăng năng suất là chủ yếu. Để gia tăng năng suất lúa thì việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, việc sử dụng hóa chất để khống chế sự phá hại của sinh vật gây bệnh cũng như để gia tăng sự phát triển của thực vật đem lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất đã và đang làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Bên cạnh đó, lượng khí methan tạo ra do canh tác lúa nước là nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính. Cho nên, kiến tạo một nền nông nghiệp bền vững là xu hướng chung hiện nay của thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này là dùng các nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên để kích thích sự phát triển của thực vật cũng như trong phòng trị bệnh và kiểm soát các tác nhân có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường. Một trong những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng là vi sinh vật. Vì vi sinh vật không những có khả năng tạo ra các chất khác nhau, các hormone góp phần điều chỉnh sự tăng trưởng ở thực vật, mà còn có khả năng tạo ra tính kháng của thực vật với tác nhân gây hại. Ngoài ra, vi sinh vật còn có khả năng biến dưỡng các chất có hại trong môi trường thành chất không có hại và thực vật có thể hấp thu dễ dàng. Vi khuẩn Methylobacterium cũng thuộc nhóm này, đây là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tùy ý có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau và cũng có khả năng kích thích tính kháng cũng như tạo các chất có lợi, các hormon điều hòa sinh trưởng của thực vật. Theo Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nẩy mầm, gia tăng chiều cao cây lúa non,… trong điều kiện in vitro. Năm 2004, Madhaiyan và ctv đã tiến hành thí nghiệm xử lý Methylobacterium bằng cách trộn với hạt và phun trên lá, kết quả làm gia tăng sự đẻ nhánh của cây lúa, gia tăng năng suất lúa từ 22,1 – 24,1%. Ngoài ra, cũng theo báo cáo này thì các chủng Methylobacterium sp. còn có vai trò giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8 – 23,7%. Từ những cơ sở đó, để có thể hiểu rõ hơn về các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên cây lúa và mối quan hệ của vi khuẩn này với cây lúa. Được sự chấp nhận của Bộ môn Công nghệ 2 Sinh học nên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh” với sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Văn Lệ và ThS. Kiều Phương Nam. 1.2. Mục đích và yêu cầu Mục đích: Định danh và khảo sát một vài đặc điểm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. Yêu cầu: Phân lập, làm thuần và định danh các chủng vi khẩn Methylobacterium sp. bằng phương pháp phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một vài các hợp chất thứ cấp. 3 Phần II: Tổng quan tài liệu 2.1. Cây lúa 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố Cây lúa là loại thực vật được canh tác từ rất lâu. Tuy nhiên, về nguồn gốc của cây lúa trồng chưa được hiểu rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau. Theo một số tác giả thì O. sativa được trồng đầu tiên ở Đông Nam Á, Ấn Độ và Trung Quốc cách đây khoảng 8000 – 15000 năm. Và O. glaberrima được trồng cách đây khoảng 1000 năm trước công nguyên. Trong khi đó, các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất hiện rất sớm cách đây khoảng hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho là lúa trồng xuất hiện cách đây 6000 năm, đối với lúa trồng châu Phi (Oryza glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3500 năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1800 – 1900 năm [1],[23]. Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố rộng, loài O. sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia. Nhưng khoảng 90% lượng gạo được sản xuất và tiêu thụ ở châu Á. Diện tích gieo trồng chiếm khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha). Lúa gạo được trồng từ độ cao bằng mực nước biển đến độ cao 3000m so với mực nước biển. Lúa được trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới. Lúa gạo có thể được trồng trên nhiều loại đất khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn [23]. Những dòng lúa có thể được phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica ( được trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới). Có hai dòng được canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica [1], [2],[23]. 4 2.1.2. Đặc điểm và phân loại. 2.1.2.1. Đặc diểm chung Lúa là loại thực vật cổ xưa, có tính đa dạng di truyền và hình thái hơn một số loại cây trồng khác. Trong ngân hàng gen lúa thế giới (The International Rice Gene Bank) đang giữ khoảng 100000 dòng lúa khác nhau, hầu hết thuộc O. sativa [23]. Lúa trồng O. sativa có kích thước genome lưỡng bội (2n = 24) nhỏ (430 triệu bp). Đây là genome nhỏ nhất trong số tất cả các genome của các cây lương thực khác. Và xấp xỉ 50% genome bao gồm những trình tự lặp lại. Hầu hết các loài Oryza khác cũng có nhiễm sắc thể lưỡng bội, tuy nhiên cũng có vài loài là tứ bội (2n= 48) [1], [23]. Cây lúa trồng châu Á O. Sativa là cây thân thảo, có hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày. Cây lúa mọc thẳng đứng hay mọc nghiên rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nước ngập chân hoặc một phần thân hay trong nước sâu 2 – 4m. Thân cao từ 70 – 150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 – 3m, hay 5 – 6m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẳn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn. Lúa thường tạo thành nhiều nhánh (dảnh lúa tillers), bao gồm cọng và lá có hoặc không có bông (panical). Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lưỡi bẹ và hai thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống dài 15 – 30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím. Lúa có hoa lưỡng tính, là hoa tự thụ phấn. Hoa có sáu nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [1], [2], [23]. 5 Hình 2.1: Hình thái cây lúa [23]. Có ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu lúa quốc tế (International Rice Research Institution, 2002): - Nẩy mầm và sinh trưởng sinh dưỡng. - Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản. - Giai đoạn hạt chín [23] 2.1.2.2. Phân loại. Chi Oryza thuộc bộ Oryzeae của họ Poaceae. Có 12 giống bên trong bộ Oryzeae. Chi Oryza bao gồm khoảng 22 loài trong đó có 20 loài lúa hoang và hai loài lúa trồng là: O. Sativa và O. glaberrima. Oryza sativa được trồng khắp nơi bao gồm châu Á, Bắc và Nam Mỹ, châu Âu, Trung Đông và châu Phi. Còn O. glaberrima được trồng chủ yếu ở các nước Tây Phi [23] 6 Bảng 1.1: Kiểu gen và vùng phân bố của một số loài trong chi oryza [23] Loài oryza Kiểu gen châu Phi Trung và Nam Mỹ châu Á châu Đại Dương O. sativa complex. O. sativa O. glaberrima O. barthii O. glumaepatula. O. longistaminata O. meridionalis O. nivara O. rufipogon. O. officinalis complex O. punctata O. alampuzhaensis O. minuta O. eichingeri O. officinalis O. rhizomatis O. alta O. grandiglumis O. latifolia O. australiensis O. brachyantha O. granulata complex. O. granulata O. meyeriana O. ridleyi complex. O. longiglumis. O. ridleyi. O. schlechteri AA AA AA AA AA AA AA AA BB,BBCC BBCC BBCC CC CC CC CCDD CCDD CCDD EE FF GG GG HHJJ HHJJ ?? + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: AA, BB, BBCC, CC, CCDD, EE, FF, GG, HHJJ: là các kiểu gen; ??: chưa biết kiểu gen; +: có phân bố. 7 2.2. Vi khuẩn Methylobacterium 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tùy ý (pink – pigmented facultatively methylotrophic; PPFM). Chúng là những vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa hợp chất một cacbon như: formate, formaldehyde và methanol. Hầu hết các loài có thể phát triển trên môi trường nutrient agar, một số loài có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung methylamine. Chỉ một loài M. organophilum được cho là có thể sử dụng methan như nguồn cacbon chủ yếu [34] Loài Methylobacterium được mô tả và phân lập đầu tiên do Bassalik năm 1913 từ giun đất và được đặt tên là Baccillus extorquens. Trong giai đoạn trước năm 1960, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau: Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynbacterium, …[34]. Mãi đến năm 1974, Patt và ctv phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả năng sử dụng methan, loài này được xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là M. organophilum. Tuy nhiên, chi này mô tả chỉ dựa trên khả năng sử dụng methan của một loài vi khuẩn duy nhất là M. organophilum nên đã gây nhiều khó khăn cho những nghiên cứu phân loại sau này [34]. Đến năm 1982, Green và Bousfield đã nhận thấy rằng loài M. organophilum có nhiều đặc điểm giống với các loài PPFM đã được công bố trước đây (tuy là chúng không có khả năng sử dụng methan). Tất cả 149 loài đã được nghiên cứu nhờ 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của chúng so với loài M. organophilum cho thấy rằng sự tương đồng giữa chúng là 70%. Từ kết quả này Green và Bousfield đã đề nghị xếp loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34]. Đến ngày 10 tháng 7 năm 2006 đã có 24 loài Methylobacterium sp. được đặt tên dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S khác biệt giữa các loài khác nhau. Trong đó có những loài mới có những đặc điểm đặc biệt như M. chloromethanicum có khả năng sử dụng chloromethane (đặc trưng duy nhất chỉ có ở loài này), M. thiocianatum có khả năng sử dụng thiocyanate hay cyanase là nguồn cung cấp nitrogen,…[63], [99], [104]. 8 Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacetrium đã được đặt tên Số thứ tự Tên loài Công trình công bố 1 M. adhaesivum Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium adhaesivum sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 339-342. 2 M. aminovorans Urakami, Araki, Suzuki And Komagata: Further studies of the genus Methylobacterium and description of Methylobacterium aminovorans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43, 504-513. 3 M. aquaticum Gallego Garcia And Ventosa: Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 281-287. 4 M. chloromethanicum McDonald, Doronina, Trotsenko, Mcanulla and Murrell: Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloromethanicum sp. nov., chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51, 119- 122. 5 M. dichloromethanicum Doronina, Trotsenko , Tourova , Kuznetsov and Leisinger: Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. a novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane. Syst. Appl. Microbiol., 2000, 23, 210-218. 6 M. extorquens Bousfield and Green: Reclassification of bacteria of the genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) emend. Green and Bousfield 1983. Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35, 209. 7 M. fujisawaense Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and 9 M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. 8 M. goesingense Idris, R., Kuffner, M., Bodrossy, L., Puschenreiter, M., Monchy, S., Wenzel, W.W., and Sessitsch, A. "Characterization of Ni-tolerant methylobacteria associated with the hyperaccumulating plant Thlaspi goesingense and description of Methylobacterium goesingense sp. nov." Sys. Appl. Microbiol. (in press as of 20 February 2006). 9 M. hispanicum Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 281-287. 9 M. isbiliense Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium isbiliense sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla, Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 2333-2337. 10 M. jeotgali Aslam,Z. and Lee,S.T. Submitted (02-APR-2006) Biological Sciences, KAIST, Daejeon. 305-701, S. Korea 11 M. lusitanum Doronina, Trotsenko, Kuznetsov, Tourova And Salkinoja-Salonen: Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 773-776. 12 M. mesophilicum Green and Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 13 M. nodulans Jourand, Giraud, Béna, Sy, Willems, Gillis , Dreyfus And De Lajudie: Methylobacterium nodulans sp. nov., for a group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume root- nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 2269-2273. 14 M. organophilum Skerman, Mcgowan And Sneath (editors): Approved Lists 10 of Bacterial Names. Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, 225- 420. Patt, Cole and Hanson: Methylobacterium, a new genus of facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic Bacteriology, 1976, 26, 226-229.] 15 M. podarium Anesti, Vohra, Goonetilleka, McDonald, Straubler, Stackebrandt, Kelly and Wood. Molecular detection and isolation of facultatively methylotrophic bacteria, including Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot microflora. Environ. Microbiol. 6 (8), 820-830 (2004) 16 M. populi Van Aken, Peres, Lafferty Doty , Yoon And Schnoor: Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides x nigra DN34). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 1191- 1196. 17 M. radiotolerans Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 18 M. rhodesianum Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. 19 M. rhodinum Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 20 M. specialis Chưa xuất bản. 21 M. soumiense Doronina, N.V., Trotsenko, Y.A., Kuznetsov, B.B., Tourova, T.P. and Salkinoja-Salonen, M.S. 11 "Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic bacteria." Int. J. Syst. Evol.Microbiol. (2002) 52:773-776. 22 M. thiocyanatum Wood, Kelly, McDonald, Jordan, Morgan, Khan, Murrell and Borodina:A novel pink-pigmented facultative methylotroph, Methylobacterium thiocyanatum sp. nov., capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources. Arch. Microbiol., 1998, 169, 148-158. 23 M. variabile Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium variabile sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an aquatic environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 1429-1433. 24 M. zatmanii Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau [41]: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae 2.2.2. Đặc điểm chung 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng trong tự nhiên, hiện hiện ở nhiều môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, bề mặt lá cây, nốt sần rễ thực vật, ở hạt, thực phẫm, mỹ phẫm, môi trường bệnh viện, dung dịch ngâm xác động vật, có ở miệng và bề mặt da người, trong máu bệnh nhân nhiễm HIV [9], [11], [25], [29], [30], [31], [34],[94]. Sự hiện diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật rất đa dạng chúng đã được phân lập từ hơn 100 loài thực vật khác nhau, từ dương xỉ và các loại rêu đến thực vật 12 hạt trần và thực vật hạt kín. Hirano và Upper (1992), tìm thấy Methylobacterium chiếm hơn 90% của hệ vi khuẩn hiếu khí trên cây Phaseolus vulgaris trong suốt các mùa khác nhau. Năm 1978, Austin và Googfellow đã phân lập Methylobacterium từ lá cây Lolium perenne. Pirttila và ctv (2000), đã chứng minh rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. hiện diện bên trong chồi của cây thông (Pinus sylvestris) hay nằm trong các bó mạch của cây họ cam chanh (Citrus). Vi khuẩn Methylobacterium còn hiện diện trên hạt. Vi khuẩn PPFMs định cư trên bề mặt lá ở dạng kết hợp lại và trong giữa các tế bào biểu bì Omer và ctv (2004). Sự định cư của vi khuẩn Methylobacterium trên rễ cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau [9], [13], [14], [47], [59], [60], [72], [76], [89]. Vi khuẩn Methylobacterium là những vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do vậy, vi khuẩn này được phân lập từ môi trường có oxy hòa tan. Ngoài ra, Methylobacterium còn có khả năng kháng với Cl – nên vi khuẩn này còn hiện hiện trong nước máy [29], [30], [31], [37]. 13 Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá (A, C) và tế bào (B) vi khuẩn Methylobacterium 0. 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 – 1 x 1 – 8 m. Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những dạng bất thường khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng. Vi khuẩn Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng [34],[86]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực. Tuy nhiên, vài loài thì không. Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi. Vi khuẩn Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng đậm hay đỏ cam, một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng vi khuẩn Methylobacterium không tan trong nước và là hợp chất carotenoid. Ở môi trường lỏng, nuôi cấy tỉnh vi khuẩn Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, đều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc. Chúng có phản ứng oxydase dương tính yếu, catalase âm tính hay dương tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn. 14 Methylobacterium sp. là những vi khuẩn dị hóa sinh dưỡng có khả năng sử dụng các hợp chất methyl. Do vây, tất cả các loài có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde ở nồng độ thấp, formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng hợp chất methylamine chỉ có một loài duy nhất là M. organophilum có thể sử dụng methan là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng. Ngoài ra, M. chloromethanicum có thể sử dụng chloromethane và M. thiocinatum có thể sử dụng thiocinate. Một số loài có khả năng lên men lactose, có phản ứng LDC, Urease dương tính. Một số loài có khả năng sinh indole và một số loài có khả năng khử nitrate thành nitrite [10], [24], [25], [29], [30], [31], [34], [41], [57]. Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài vi khuẩn Methylobacterium đều theo chu trình serine. Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – – hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số chất khác [10], [24], [55], [58], [61], [68],[84], [90]. chú thích: 1, crotonyl-CoA reductase 2, L-crotonase 3, NADH-linked acetoacetyl-CoA reductase 4, D-crotonase. 5, b-ketothiolase 6, NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase 7, PHB synthase 8, PHB depolymerase 9, -hydroxybutyrate dehydrogenase 10, acetoacetate–succinyl-CoA transferase. Hình 2.3: Sự gắn kết giữa chu kỳ serine và chu kỳ PHB trong quá trình biến dưỡng [52]. 15 Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium biến thiên từ 25 – 300C. Một vài loài có thể phát triển ở nhiệt độ 370C hay 510C. Đa số các loài đều tăng trưởng trong khoảng pH trung tính, một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH từ 4 – 10 [34]. Vi khuẩn Methylobacterium có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl- , tia UV, phóng xạ ion, và nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong chi Methylobacterium đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine và tetracycline. Trong đó, tetracycline có ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium. Ngoài ra, các loài Methylobacterium sp. có khả năng đề kháng với nhiều chất kháng sinh như: cephalothine, acid nalidicic, penicyline, bacitracine, carbenicillin, colestin sulfate, polymycine B và nitrofurantoin [29], [34], [37], [102]. Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp nguồn cacbon và năng lượng của chủng vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylamine, serbactae,…Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6- trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7tetrazicine hay high- melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro-1,3,5-triazine hay royal explosive),…Do vậy, có thể phân biệt các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn này [9],[25], [28], [34],[58],[89]. Một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có bacterochlorophyll trong vài điều kiện nuôi cấy đặc biệt, từ đó cho thấy khả năng tự dưỡng của một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. [34]. 2.3. Sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật 2.3.1. Sơ lƣợc về tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật. Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, và đây là mối quan hệ rất phức tạp. Trong mối quan hệ đó, vi sinh vật có thể là tác nhân có lợi và cũng có thể là tác nhân có hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Sự định cư của vi sinh vật trên thực vật rất đa dạng có thể trên thân, lá, rễ và cả ở cơ quan sinh sản như hoa, quả, hạt. [9],[13], [14], [17], [18], [19], [21], [33], [32], [35], [38], [43], [44],… Theo Hirano và ctv (1983), cho rằng lá là nơi hổ trợ cho sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật và phần lớn trong số đó là vi sinh vật gây bệnh. Pseudomonas 16 syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38]. Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97]. Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48]. Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại 17 tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro. 2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật. Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 104 – 107 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 10 5 cfu/gram [40], [59], [60]. Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72]. Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo (cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B12 (cyanocobalamine) và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata [39], [40], [51], [84]. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả 18 năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61]. 2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là: - Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây. Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion. Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93]. - Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật. Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72]. - Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật. Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM. Urease rất cần thiết trong quá trình biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61]. - Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B12 hoặc những hợp chất tương tự. Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh rằng việc bổ sung vitamine B12 nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84]. 19 Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà còn diễn ra ở cả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như in vitro [24], [71]. Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71]. Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation) của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT), được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như 20 cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và 19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58]. Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng. Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành lactaldehyde. Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100]. 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB (Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson- Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện 21 giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65]. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2. Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4- Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89]. Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar (P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88]. Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn 22 nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, - carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt. Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101]. 2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống. Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật. - Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, … - Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,… Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97]. 23 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium [41] Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Methylamine + + + + + + + – – + – + + + - Trimethylanine – – – + – – – – – + – – – – + Acetate + + + + + + + + – + + + + + + Citrate – – – – – – + + + – + + + + + + + + – + + Glutamate – – + + – – + + + + + + + + + + + + – + + Glucose + – – – – – + + + – + + – – – + + – – – + Arabinose – – – – – – + + + – + + – – – – – – – + + Fructose + + – + + + + – – + – + – + + + + – + – + Betaine + – + – + – + + – + – nd + + + Tartrate v – – V – – – v Serbacate – – – – – + v + + Ethanol + + + + + V + v + nutrient agar v + + + + + – + + Methane – v – – – – – – chú thích: 1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M. rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M. mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M. chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum; 17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019. +:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi. 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền) 2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,.... Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại. + Sử dụng mẫu dò (probes) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là 24 một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang. + Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [4], [67], [95]. Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. Nguyên tắc của phương pháp PCR Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng. + Giải trình tự (sequencing) [5]. Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố. Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng: - Phương pháp Maxam và Gilbert Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau. - Phương pháp Sanger Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA - Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp) Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật. Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng 25 duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt. Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý: - Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu) - Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn 0,5%. Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra, trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68]. 26 Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu thí nghiệm  Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh  Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.  Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ  Máy hấp vô trùng autolave  Máy lắc tròn 100 vòng/phút  Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen)  Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine  Bộ điện di ngang Mupid-EX (Advance)  Máy đo quang phổ RNA/DNA Gene Quantpro  Kính hiển vi (Olympus)  Eppendorf, Pippette,… Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh. 3.1.3. Hóa chất 3.1.3.1. Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34]. Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS): - K2HPO4 1,2g - KH2PO4 0,62g - CaCl2.6H2O 0,05g - MgSO4.7H2O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl3.6H2O 1mg - (NH4)2SO4 0,5 g - CuSO4.5H2O 5 g - MnSO4.5H2O 10 g - Na2MoO4.2H2O 10 g 27 - H3BO3 10 g - ZnSO4.7H2O 70 g - CoCl2.6H2O 5 g - Nước cất vừa đủ 1000ml - pH 7 Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Sau đó, để nguội và bổ sung methanol vào với nồng độ 0,1 – 0,2%. Đối với môi trường rắn thì bổ sung agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Không cần bổ sung vitamine hay các nhân tố tăng trưởng bởi vì các chủng PPFM hầu như không cần thiết trong quá trình tăng sinh. 3.1.3.2. Môi trƣờng giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp. Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34]. - Agar 15g - Glycerol 10g - Peptone 10g - Nước vất vừa đủ 1000ml 3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34] Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon. 3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6]. Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1, 100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS. Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5% NaCl, pH = 6,5. 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR. 28 3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm Lấy mẫu Tăng sinh vi khuẩn Phân lập Làm thuần Xác định hình thái Kiểm tra sinh lý, sinh hóa Chiết tách DNA Thực hiện PCR Giải trình tự Xử lý kết quả Kết luận 3.2.1. Lấy mẫu Mẫu được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít (huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất. Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ. 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc. 29 Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu dùng pippet hút 100 l môi trường tăng sinh cho vào môi trường rắn để tiến hành phân lập vi khuẩn 3.2.3. Phân lập vi khuẩn - Đối với mẫu đất chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10–1, 10 –2,… 10– 6. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn. - Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l - Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi trường rắn - Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi khuẩn nuôi ở nhiệt độ 300C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc hồng đặt trưng để làm thuần. 3.2.4. Làm thuần. Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần. 3.2.5. Giữ giống. Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol 50% trong điều kiện đông lạnh. 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau: 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7] Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật. Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp: + Phương pháp String test - Thử nghiệm String [15] 30 Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng vách tế bào vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với KOH. String dương (dương tính) khi giữa que cấy và dung dịch có sợi nhầy mảnh, tức là vi khuẩn Gram âm, ngược lại khi String âm thì vi khuẩn là Gram dương. + Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, ngược lại thành phần lipid của chúng lại thấp hơn. Iod được thêm vào như một chất cắn màu để tạo thành hợp chất crystal violet-iodine bền với cồn. Giai đoạn này là giai đoạn cố định màu. Ở giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn gram âm bị cồn hòa tan dẫn đến chất nhuộm ban đầu bị hòa tan vào dung môi. Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Do đó, vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu. Vi khuẩn gram âm sau khi nhuộm có màu hồng đỏ còn vi khuẩn gram dương có màu tím. Tiến hành: - Cho sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch để khô tự nhiên. - Hơ mặt dưới của lam trên ngọn lửa 2 – 3 lần (tránh để tiêu bản quá nóng). - Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính trong một phút. - Đổ bỏ dịch Crystal violet và rửa bằng nước cất. - Phủ dung dịch lugol để một phút sau đó đổ bỏ lugol và rửa nhẹ bằng nước. - Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây. - Rửa lại bằng nước. - Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng nước. - Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên. - Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt dầu 31  Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi cấy trên môi trường CMS. + Đo kích thước tế bào Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo kích thước tế bào. 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử nghiệm IDS14GR. + Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn. Phương pháp thử: - Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam. - Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng. Kết quả: Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất hiện, âm tính khi không có bóng khí. + Thử nghiệm oxidase: Nguyên tắc: nhằm xác định hoạt tính cytochrome oxidase trong các loài sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong khoảng một phút. 3.2.6.3. Khảo sát khả năng di động Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi khuẩn trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR) 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn. Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do đó, khi sử 32 dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự thay đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Ở pH trung tính thì màu môi trường là xanh lá cây, acid là màu vàng và màu xanh dương khi pH kiềm. Phản ứng dương khi màu môi trường thay đổi so với màu môi trường đối chứng âm (màu xanh lá cây, không cấy vi khuẩn). Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc thuần phân lập được. Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập. Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở 7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate 1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng. Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L- glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose, manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk). 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR. Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty Nam Khoa. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm: + Khả năng lên men glucose (MR) Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều hơn các vi sinh vật khác. + Khả năng khử nitrate Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả 33 năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H+ trong hô hấp kị khí để oxy hóa các hợp chất hữu cơ NO3 - + 2e - + 2H +  NO2 - + H2O. + Khả năng sinh tổng hợp galactosidase (thử nghiệm ONPG, o-nitrophenyl-β -D- galactopyranoside) Nhằm xác định sự có mặt của enzyme β-galactosidase có ở vi sinh vật nhờ sự hiện diện của cơ chất ONPG. Khi vi khuẩn có enzyme này thì nó sẽ phân cắt ONPG làm giải phóng nitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích: Phân biệt vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose. + Khả năng tạo urease Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo ra hai phân tử ammonia do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường + Khả năng tạo phenylalanine deaminase (PAD) Nhằm xác định sự hiện diện của enzyme PDA ở vi khuẩn và khử nhóm amine của phenylalanine. + Khả năng sử dụng citrate Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường. + Khả năng thủy giải Esculin Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật. + Khả năng sinh H2S Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng sinh H2S từ các acid amin chứa lưu huỳnh tạo chất tủa màu đen. + Thử nghiệm Voges – Proskauer Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose. + LDC (lysin decarboxylase) Mục đích: Phát hiện vi khuẩn có khả năng phân giải lysin trong môi trường bằng cách khử nhóm carboxyl nhờ enzyme lysin decarboxylase. + Khả năng sử dụng malonate 34 Nhằm khảo sát khả năng của vi khuẩn sử dụng sodium malonate làm nguồn cacbon. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, và làm biến đổi màu môi trường. + Khả năng sinh indole Mục đích: Khảo sát khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường tạo nhân indole Tất cả các hóa chất của phản ứng sinh hóa được tẩm trong các đĩa giấy, sau đó cho vào các giếng được đánh số. Khi sử dụng lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường thạch, huyền phù vào nước muối sinh lý, sau đó cho 200μl dịch huyền phù này cho vào mỗi giếng ủ 36 giờ và đọc kết quả theo bảng sau: Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14GNR. Stt Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Dương tính Âm tính 1 Lên men glucose Không vàng Tím 2 Khử nitrate 1 giấy tìm nitrate đỏ Vàng lợt 3 Galactosidase Không Vàng không màu 4 Urease Không đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng 5 PDA 1 giọt FeCl3 xanh lá đậm Vàng lợt 6 Citrate Không xanh biển Xanh lá/vàng 7 Esculin Không Đen Không 8 Sinh H2S Không Đen Không 9 Sinh indole Kovac Chuyển màu đỏ Không đổi màu 10 Voges – Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt naphthol Đỏ Vàng nhạt 11 Sử dụng malonate Không Xanh biển Vàng/ xanh lá 12 LDC Không Tím Vàng 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH Bao gồm các thí nghiệm: + Xác định đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào [3], [6], [7] Vi khuẩn nuôi cấy sau 48 giờ sau đó pha loãng thành các độ đục khác nhau có OD lân cận 0,1, 0,2; 0,4; 0,5. 35 Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10-5; 10-6; 10-7. Từ mỗi độ pha loãng cấy 0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP. Ủ 300C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300. Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: Ndi = A x 10 x di. Trong đó: - Ndi: số lượng tế bào ở độ pha loãng di - A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. - d: số lần pha loãng i. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm excel. + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 400C và đo OD ở bước sóng 610nm sau ba ngày. + Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày ghi nhận độ đục OD610nm. 3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi khuẩn tiết ra. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 250C trong môi trường CMS và tiến hành đo OD610nm 4 giờ/lần trong vòng 48 giờ. 3.3. Định danh vi khuẩn Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau: 3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng 36 LM2, TS7, TN10 và TD15 với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố thì việc tính toán hệ số di truyền Jaccard là cần thiết. Hệ số di truyền Jaccard được tình theo công thức sau: Sj = a/(a +b). Trong đó: a: tổng số các đặc điểm tương đồng của hai loài sinh vật b: tổng số các đặc điểm khác biệt giữa hai loài sinh vật. Hệ số Sj thay đổi trong khoảng từ 0 – 1 (0% - 100%). Nếu hai loài sinh vật có hệ số Sj lớn hơn 0,8 (80%) thì chúng có khả năng cùng một loài. 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn Quy trình ly trích DNA bộ gen của các chủng Methylobacterium sp. theo quy trình của Rogers S.O. và ctv (1994), quy trình CTAB [78]. Bao gồm các bước sau:  Ly tâm thu sinh khối.  Bổ sung 600 l CATB nóng, vortex, ủ 650C trong 60 phút.  Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút  thu dịch nổi.  Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1).  Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút  thu dịch nổi.  Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ.  Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C  thu tủa.  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu tủa DNA.  Rửa tủa bằng 250 l cồn 700.  Phơi mẫu cho khô cồn.  Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.  Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 370 trong 60 phút.  Giữ ở 40C Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD260nm/OD280nm. Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli. 37 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR. 3.3.3.1. Thành phần cho một phản ứng PCR.  Buffer 10X ................................................. 2,5 l  Mg++ 25mM ................................................ 1,5 l  dNTP 2mM ................................................. 2,5 l  Mồi xuôi (FPGS6 hay 2F) 10pmol/ l ........ 1 l  Mồi ngược (FPGS1509 hay 2R) 10pmol/ l 1 l  DNA khuôn ................................................. 0,5 l  Taq polymerase 1U/ l ................................ 0,5 l  Nước ............................................................ vừa đủ 25 l 3.3.3.2. Các primer sử dụng [9], [68] FPGS1509: 5` ... AAGGAGGGGATCCAGCCGCA...3`. FPGS6: 5`... GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG ...3` 2F: 5`... GATCGGCCCGCGTCTGATTAG ...3`. 2R: 5`... CCGTCATTATCGTCCCGGACA ...3`. Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA. Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau: - Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234bp. Với chu trình nhiệt như sau: 38 Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R. - Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và 1200base. Với chu trình nhiệt như sau: Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả. Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng PCR được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút. Sản phẩm điện di được ghi nhận bằng cách nhuộm ethidiumbromide và chiếu dưới đèn UV(ultra-violet). 3.3.4. Giải trình tự. Nhằm định danh chính xác và chi tiết hơn các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được, nên chúng tôi tiến hành giải trình tự để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ). Trình tự DNA của sản phẩm PCR của vi khuẩn được đọc bằng phương pháp PCR trực tiếp tại Hàn Quốc. Trình tự DNA được đọc theo hai chiều xuôi và ngược. 39 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200 base được pha loãng với nước cất khử ion sau đó tiến hành phản ứng PCR cho mẫu pha loãng này nếu kết quả dương tính thì gởi mẫu pha loãng này để giải trình tự. 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự. Kết quả giải trình tự được xử lý độ chính xác bằng phần mềm fastPCR, so sánh với trình tự trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST, so sánh độ tương đồng của trình tự của các chủng so với các chủng đã công bố bằng phần mềm CluxtalX và dựng cây sinh loài bằng phần mềm Treeview. 3.4. Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chất thử cấp của vi khuẩn Theo các nghiên cứu của các tác giả trước cho rằng các loài Methylobacterium sp. có khả năng tổng hợp một số hợp chất có lợi nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn đã định danh. Mục tiêu này được tiến hành qua các thí nghiệm: 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin [16]. Mục tiêu: Sàn lọc các chủng có khả năng tổng hợp auxin để có thể ứng dụng chúng trong nuôi cấy in vitro và làm chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp và chế phẩm vi sinh cho cây lúa Phương pháp tiến hành: Khuẩn lạc nuôi trên môi trường MS có bổ sung 1% methanol cho giấy lọc vô trùng in trên bề mặt các khuẩn lạc vi khuẩn (sau 5 ngày nuôi cấy), ủ tiếp 2 ngày. Sau đó dùng những tấm giấy này áp lên tấm giấy lọc có thấm thuốc thử Salkowski (2,03g FeCl3.6H2O hoà tan trong 500ml nước và 300ml acid H2SO4 đậm đặc) hoặc Salkowski cải tiến (0,05 M FeCl3 trong dung dịch HClO4 35%) sấy 15 phút quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu tím xanh (với thuốc thử salkowski cải tiến). 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB [8]. Mục tiêu: Theo công trình nghiên cứu của J. U. Ackermann và ctv (1995), Trâm (2006), cho rằng một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng sinh tổng hợp nhựa sinh học (PHB) nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng đã phân lập nhằm sàng lọc sơ bộ các chủng có khả năng tổng hợp PHB. Vi khuẩn thí nghiệm: Bốn chủng vi khuẩn đã định danh trong thí nghiệm sinh hóa, sinh ly ở trên. 40 Phương pháp tiến hành: Lấy 1 – 2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn (có OD600 khoảng 0,1) đặt lên tấm lam sạch. Hơ qua ngọn lửa đèn cồn nhiều lần để cố định tế bào trên lam. Nhuộm tế bào đã được cố định bằng một giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 10 phút ở 550C. Sau khi nhuộm xong, phẩm thừa được rửa sạch bằng nước máy với bình xịt tia mạnh và sau đó rửa lại lần nữa với dung dịch acid acetic 8% trong 1 phút, dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho một giọt nước lên lam đậy lamen lại. Mẫu sau khi xử lý được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 460nm. Ở bước sóng ánh sáng này, các hạt PHB trong tế bào được nhuộm sẽ có màu cam sáng trên nền tế bào màu đen. 41 Phần IV: Kết quả và biện luận. 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần Trong hai phương pháp phân lập vi khuẩn từ lá là Leaf print và tăng sinh chúng tôi nhận thấy rằng số khuẩn lạc thu được trong phương pháp tăng sinh nhiều hơn so với phương pháp Leaf print. Vì trong phương pháp Leaf print có sự nhiễm nấm cao. Theo Maliti (2000), cũng dùng phương pháp Leaf print để phân lập các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa nhưng có bổ sung kháng sinh thì kết quả của phương pháp Leaf print cao hơn phương pháp tăng sinh. Từ đó, chúng tôi có thể khẳng định rằng để phân lập vi khuẩn Methylobacterium không bổ sung kháng sinh thì phương pháp phân lập qua quá trình tăng sinh là tốt nhất. Đối với các khuẩn lạc hình thành từ thí nghiệm Leaf print trên lá chúng tôi chọn tất cả các khuẩn lạc để làm thuần và các kuẩn lạc hình thành trên môi trường tăng sinh, môi trường nước và đất chúng tôi chỉ tiến hành chọn một số khuẩn lạc tiêu biểu để làm thuần. Trong tổng số ba loại mẫu: đất, nước và lá của ba vùng khác nhau đã phân lập và làm thuần được tổng số 26 dòng vi khuẩn và được tóm tắt trên bảng 4.1. Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần. Số thứ tự Vùng phân lập Mẫu phân lập Ký hiệu 1 Trảng bàng (TB) Nước BN20 2 TB Nước BN21 3 TB Lá BS16 4 TB Lá BS17 5 TB Lá BS18 6 TB Đất BD11 7 TB Leaf print LB5 8 Truông mít (TM) Nước TN10 9 TM Nước TN12 10 TM Nước TN13 11 TM Lá TS6 12 TM Lá TS7 13 TM Lá TS8 14 TM Lá TS9 15 TM Leaf print (LP) LM1 42 16 TM LP LM2 17 TM LP LM3 18 TM LP LM4 19 TM Đất TD15 20 Gò dầu (GD) Nước GN19 21 GD Nước GN25 22 GD Lá GS22 23 GD Lá GS23 24 GD Lá GS24 25 GD Đất GD14 26 GD Đất GD26 Hình 4.1: Hình dạng tế bào quan sát dưới kính lúp. Tuy nhiên, các khuẩn lạc có nhiều đăc điểm giống nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để phân nhóm sơ bộ các khuẩn lạc vi khuẩn này. 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào. Các chủng trong thí nghiệm có hai chủng bắt màu gram âm là TS7 và TD15 và phản ứng dương trong thử nghiệm String. Còn hai chủng LM2 và TN10 tùy vào thời gian thử nghiệm mà có thể bắt màu gram âm hay gram dương. Tuy nghiên, hai chủng này khi thử nghiệm gram bằng phương pháp String thì điều cho phản ứng dương. Từ đó chúng tôi cho rằng các hai chủng TS7 và TD15 là vi khuẩn gram âm còn hai chủng LM2 và TN10 là vi khuẩn gram âm biến đổi. Kết quả này phù hợp với những kết quả của các công trình nghiên cứu của Green (1992); Gallego (2005), đã công bố [34], [37] 43 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn trong thử nghiệm Gram vật kính 100X. 4.2.2. Mối quan hệ với oxy: Trong thí nghiệm khảo sát mối quan hệ với oxy của các chủng phân lập được. Trong tổng số 26 khuẩn lạc (chủng) vi khuẩn đều cho phản ứng catalase dương tính. Từ đó, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được là vi khuẩn hiếu khí. Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu của Green (1992), trước đây [34]. 4.2.3. Khả năng đi động Kết quả thử nghiệm khả năng di động trong bốn chủng kiểm tra đều có khả năng di động (mọc lan ra khỏi đường cấy). Từ đó chúng tôi cũng có thể kết luận răng bốn chủng có roi (hay tiêm mao). 4.2.4. Kết quả khả năng sử dụng các chất cung cấp nguồn cacbon Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Arab in o se F ru cto se eth an o l m eth y lam in e trim eth y lam in e B etain e serb acate G lu tam ate A cetate n u trien t ag ar C atalase C itrate M an n ito l M alto se S u cro se LM1 – – + + – + – – + + + + + + + LM2 – – + + – + – – + + + + + + + 44 LM3 – – + + – + – – + + + + + + + BS16 – – + + – + – – + + + + + + + BS17 – – + + – + – – + + + + + + + BS18 – – + + – + – – + + + + + + + BN21 – – + + – + – – + + + + + + + TS9 + – – – – – – – – + + + + + + BD11 + – – – – – – – + + + + + + + TN12 + – – – – – – – + + + + + + + TN13 + – – – – – – – + + + + + + + TD15 + – – – – – – – + + + + + + + GN19 + – – – – – – – + + + + + + + GS22 + – – – – – – – + + + + + + + GS23 + – + + – – – – + + + + + + + GD26 + – + + – – – – + + + + + + + TN10 + + + – – – + + – + + + + + + GD14 + + + – – – + + – + + + + + + LM4 – + – – – + – + – + + – + + + LB5 – + – – – + – + – + + – + + + TS6 – + – – – + – + – + + – + + + TS7 – + – – – + – + – + + – + + + TS8 – + – – – + – + – + + – + + + GS24 – + – – – + – + – + + – + + + GN25 – + – – – + – + – + + – + + + BN20 – + – – – + – + – + + – + + + Từ các thử nghiệm sinh hóa này chúng tôi tiến hành phân nhóm các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau. Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công bố. Có tất cả 4 nhóm và bốn đại diện cho bốn nhóm được sử dụng trong tính toán hệ số tương đồng là: LM2, TS7, TN10, TD15. 45 Hình 4.3: Kết quả khảo sát khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Chú thích: 1: arabinose, 2: betaine, 3: citrate, 4: glucose, 5: ethanol, 6: fructose, 7: glutamate, 8: acetate, 9: methylamine, 10: serbacate, 11: trimethylamine, 12: lactose, DC: đối chứng âm. 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GRN Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác. Kết quả bộ thử nghiệm định danh IDS 14GNR được tóm tắt trên bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14GNR. LM2 DS7 DS15 DN10 Oxydase + + + + ONPG – – + – Nitrate – – – – Citrate + – + + Indole + + + + PAD – – – – Malonate – – – – LDC + + + + Di động + + + + Glucose – – – + 46 Esculin – – – – Urease + + – + H2S – – – – VP – – + – 4.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của vi khuẩn Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào. Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 300C. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho ba chủng LM2, TS7, TD15 là 250C và chủng TN10 là 300C. kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Green và ctv (1992), [34]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của các dòng vi khuẩn được biểu diễn trên hình Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn. y = 1.2566x + 7.165 R 2 = 0.9814 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OD lo g (N /m l) 47 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của vi khuẩn. Trong khi đó, từ biểu đồ (hình 4.6) chúng tôi nhận thấy rằng các chủng đều có thể tăng trưởng tốt trong khoảng pH 5,0 – 7.5, tối ưu trong khoảng 6,5 – 7. Chủng TS7 có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ aicd đến trung tính. Ngược lai, chủng TD15 lại có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ acid đến pH hơi kiềm. 4.2.7. Đƣờng cong tăng trƣởng Dựa vào đường cong tăng trưởng (Hình 4.7)chúng tôi nhận thấy rằng các chủng tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy. Và theo Green và ctv (1992), thì vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium tăng trưởng chậm. Thời gian để vi khuẩn tăng trưởng tới pha ổn định có thay đổi giữa các dòng vi khuẩn. Dòng LM2 là 32 giờ, dòng TS7 là 40 giờ, dòng TN10 là 44 giờ và dòng TD15 là 36 giờ. Từ những dữ liệu này chúng tôi cho rằng thời gian tốt nhất để thu hoạch tế bào là sau 24 giờ. 48 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng được tóm tắt trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn. LM2 TS7 TN10 TD15 Acetate + - - + Arabinose - - + + Betaine + + - - Catalase + + + + Citrate + - + + Di dộng + + + + Esculine - - - - Ethanol + - + - Fructose - + + - Glucose - - + - Glutamate - + + - H2S - - - - Indole + + + + Lactose - - - + 49 LDC + + + + Malonate + + + + Maltose + + + + Manitol + + + + Methylamine + - - - Nitrate - - - - Oxidase + + + + PAD - - - - Serbacate - - + - Sucrose + + + + Trimethylamine - - + - Urea + + - + Kích thước khuẩn lạc 1 – 3mm 1 – 3mm 1 - 3mm 2 – 5mm Kích thước tế bào 0,99-1,45µm 0,99-1,98µm 0,99-2,19µm 1,32-2,64µm Màu sắc khuẩn lạc Pl Pl Pr P Hình dạng khuẩn lạc Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Nhiệt độ tối ưu (t0C) 25 25 30 25 pH tối ưu 6,5 6,5 6,5 6,5 Gram biến đổi Âm biến đổi Âm Chú thích: +: có sử dụng hay dương tính, -: không sử dụng hoặc âm tính, Pl: hồng nhạt, P: hồng, Pr: hồng đỏ. 4.3. Định danh vi khuẩn 4.3.1. Hệ số tƣơng đồng di truyền-Jaccard. Bảng 4.5: Hệ số tương đồng Jaccard từ 0 – 1 của các loài. Thứ tự Loài LM2 TS7 TN10 TD15 01 M. aminovorans 0,600 0,600 0,400 0,400 02 M. aquaticum 0,333 0,667 0,667 0,167 03 M. chloromethanicum 0,889 0,556 0,222 0,667 04 M. dichloromethanicum 0,778 0,545 0,273 0,364 05 M. extorquens 0,750 0,583 0,167 0,500 50 06 M. fujisawaense 0,333 0,333 0,667 0,583 07 M. hispanicum 0,667 0,667 0,667 0,333 08 M. isbiliense 0,833 0,500 0,500 0,667 09 M. lusitanum 0,727 0,545 0,273 0,727 10 M. mesophilicum 0,333 0,333 0,667 0,417 11 M. nodulans 0,667 0,333 0,500 0,667 12 M. organophilum 0,455 0,545 0,455 0,455 13 M. populi 0,667 0,667 0,333 0,500 14 M. radiotolerans 0,500 0,333 0,583 0,500 15 M. rhodesianum 0,727 0,636 0,273 0,545 16 M. rhodinum 0,545 0,455 0,636 0,545 17 M. suomiense 0,727 0,545 0,273 0,545 18 M. thiocynatum 0,400 0,333 0,500 0,500 19 M. variabile 0,333 0,667 0,667 0,167 20 M. zatmanii 0,667 0,583 0,333 0,667 21 1019 0,462 0,385 0,769 0,385 22 LM2 1,000 0,615 0,615 0,615 23 TS7 0,615 1,000 0,462 0,462 24 TN10 0,615 0,642 1,000 0,385 25 TD15 0,615 0,642 0,385 1,000 Từ hệ số tương đồng Jaccard chúng tôi có thể kết luận rằng chủng TS7 có quan hệ gần với bốn loài: M. variabile, M. populi, M. hispanicum và M. aquaticum. Chủng TD15 có quan hệ gần với loài M. hispanicum. Chủng LM2 rất có thể thuộc loài M. chloromethanicum. Chủng TN10 có quan hệ gần với chủng 1019, loài M. variabile, M. fujisawaense, M. aquaticum, M. hispanicum. M. mesophilicum. Tuy nhiên, kết quả định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào. Nên việc định danh vi khuẩn đã phân lập bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết. 51 300 base 234 base 4.3.2. Kết quả PCR 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium Khi khuếch đại DNA bộ gen bằng cặp mồi 2R và 2F các chủng điều tạo ra đoạn DNA đăc trưng khoảng 234base. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv (1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài ra, ở chủng E.coli đối chứng âm không có đoạn DNA đặc trưng. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium. Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2