Luận văn Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH ------ Nguyễn Hồng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRỊ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii. CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ THANH Tp. HCM, 2006 LỜI CÁM ƠN Trên hết, tơi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm cơ đã giúp tơi hồn thành luận văn, bên cạnh đĩ tơi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu nơi cơ cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học. Tơi chân thành cám ơn thầy cơ ở khoa sinh, khoa hĩa - trường đại học sư phạm tp HCM, thầy cơ ở bộ mơn sinh hĩa - trường đại học khoa học tự nhiên, đã tận tình giúp đỡ tơi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng như thầy cơ cơng tác tại phịng thí nghiệm vi sinh - sinh hĩa, phịng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp HCM, tháng 3 năm 2006 NGUYỄN HỒNG MINH HUY MỤC LỤC Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn. 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh. 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối. 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc. 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh. 1.2. Các nhĩm chất kháng sinh chính cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn. 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn. 1.3. Vai trị của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phịng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng. 1.3.2. Vai trị của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phịng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu: 2.2. Phương pháp: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật. 2.2.1.1. Phương pháp làm phịng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn. 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch. 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật. 2.2.2. Phương pháp hĩa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn. 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích 3 3 3 3 6 10 10 11 13 15 16 19 21 21 22 22 22 30 31 31 40 47 52 52 52 53 53 54 54 thích sinh trưởng thực vật. 2.2.3. Phương pháp hĩa lý. 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh. 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh. 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hĩa học của chất kháng sinh. 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hồ tan trong các dung mơi của chất kháng sinh. 2.2.4. Phương pháp khác. 2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh. 2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi đất. 2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt. 2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. 3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. 3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn. 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh. 3.2.2. Lựa chọn mơi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu: 3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thơng khí: 3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ: 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.4.1. Lựa chọn dung mơi thích hợp. 3.4.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: 3.4.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 55 57 57 57 60 61 61 61 62 62 62 63 63 64 66 72 72 73 76 76 78 80 83 85 89 89 92 95 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 3.5.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên nấm bệnh hại cây trồng: 3.5.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên tuyến trùng hại cây trồng. 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng. 3.6.1. Ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: 3.6.2. Ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên sự phát triển của cây con: Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 98 101 107 107 108 111 1 Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nơng sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền mĩng mơn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hĩa học, … trong đĩ sử dụng thuốc hĩa học để phịng ngừa và ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phịng bệnh cho cây đạt hiệu quả lớn. Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hĩa học cũng như phân hĩa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến mơi trường sống rất lớn. Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ơ nhiễm mơi trường đất, nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn lâu trong đất của các chất hố học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hĩa học đã tạo nên dư lượng lớn khơng cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời gian qua. Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hĩa học cũng như bảo vệ mơi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trị của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái. Bằng các biện pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi sinh vật ở qui mơ lớn và được sử dụng trong cơng tác phịng trừ sâu bệnh. Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng sinh từ các chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính của những chất kháng sinh 2 đĩ đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để cĩ thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như: - Khơng gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây. Ở một số nồng độ thích hợp chúng cịn kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây. - Khơng gây hại cho người và gia súc. - Cĩ hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngồi mơi trường tự nhiên. - Cĩ tác dụng tiêu diệt một cách cĩ chọn lọc vi khuẩn gram dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh. Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã cơng bố patent số 5549889 về lồi Streptomyces dicklowii, lồi cĩ khả năng kháng nấm và tuyến trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học trong nơng nghiệp. Chúng tơi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phịng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng cĩ hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong điều kiện mơi trường Việt Nam, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRỊ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng cĩ nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào khơng chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vơ ti (Amytoz), khơng phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng cĩ những đặc điểm giống nấm mốc hơn như cĩ hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi khơng cĩ vách ngăn. Sự phân hố của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đĩ mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998). Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngồi khơng khí trên bề mặt mơi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình trịn do khuẩn ty phát triển theo hình phĩng xạ tạo thành nhiều vịng trịn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt cĩ mấu lồi, cĩ nếp nhăn hoặc sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn cĩ 3 lớp: lớp ngồi gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì cĩ cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn cĩ thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím. 4 Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong mơi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất cĩ nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho tồn bộ cơ thể nên cịn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty khơng cĩ vách ngăn và khơng bị đứt đoạn. Tuỳ loại mơi trường mà khuẩn ty cơ chất cĩ thể tiết ra mơi trường một số loại sắc tố trong đĩ cĩ sắc tố hịa tan được trong nước cĩ sắc tố hịa tan được trong dung mơi hữu cơ. Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hĩa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng lồi mà cuống sinh bào tử cĩ thể thẳng hay uốn cong, xoắn lị so hay xoắn ốc; chúng cĩ thể mọc đơn, mọc đối, mọc vịng, mọc thành chùm, số vịng xoắn của cuống sinh 5 bào tử cĩ thể từ 5 – 10 vịng, đường kính vịng xoắn cĩ thể thay đổi từ 5 – 7nm. (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường cĩ hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử cĩ các dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tĩc. 6 Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/.../ medium/frontcover.gif ) Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg ) 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý nuơi cấy: Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong mơi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất 7 trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều cĩ mặt của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong mơi trường cĩ pH trung tính. Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử dụng cĩ thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vơ cơ); protein, pepton, cao ngơ, …(nguồn nitơ hữu cơ). 1.1.1.2.2. Khả năng sinh enzym của xạ khuẩn: Enzym là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh vật, nĩ đĩng một vai trị quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật. Enzym khơng những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hĩa trong cơ thể mà cịn xúc tác những chuyển hĩa bên ngồi mơi trường – điều này cĩ ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào cơng nghiệp, nơng nghiệp,… Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như: - Enzym amylaza: thu nhận từ các lồi Streptomyces aureofaciens, Streptomyces diastochromogens, … - Enzym cenllulaza: thu nhận từ các lồi Streptomyces antibioticus, Streptomyces sp. 0143, … - Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces verticillatus var. zynogenes, Actinomyces fradiae, … - Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, … Trong đĩ enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong cơng nghệ thực phẩm – cĩ tác dụng làm mềm thịt. Các chế phẩm được bán trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus); M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998). 8 Ngồi ra người ta cịn chú ý một loại enzym quí ở xạ khuẩn là glucoza izomeraza, enzym này giúp biến đổi đường glucose thành đường fructose với độ ngọt cao hơn. (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) CHO (CHOH)4 CH2OH GLUCOSE IZOMERAZA CH2OH C=O (CHOH)3 CH2OH Glucose Fructose Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuơi cấy của chúng. Thành phần dinh dưỡng của mơi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym, nên để tăng sự tổng hợp enzym thì mơi trường nuơi cấy phải cĩ đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng” tổng hợp enzym, thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp. Thí dụ: trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng là protein đậu nành hay protein động vật. 1.1.1.2.3. Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn: - Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn cĩ khả năng tổng hợp tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật khơng cĩ khả năng tổng hợp. Nên trong cơng nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất chủ yếu là con đường sinh học mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai lồi vi sinh vật người ta quan tâm nhất – các lồi xạ khuẩn đĩ là: Actinomyces olivaceus, Actinomyces griseus, Actinomyces aureopacieus, Actinomyces pradiae, Actinomyces autibioticus, …Đáng kể nhất là xạ khuẩn Actinomyces olivaceus và lồi vi khuẩn Propionibacterium shermanii là những chủng vi sinh vật được sử dụng trong cơng nghiệp sản xuất vitamin B12. - Caroten (tiền vitamin A): khi vào cơ thể người và động vật sẽ chuyển thành vitamin A. Các chủng xạ khuẩn được quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus … 9 1.1.1.2.4. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn: Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng của vi sinh vật được phát hiện từ rất sớm. Năm 1925, Saubert phát hiện auxin trong mơi trường nuơi cấy nấm Rhizopus suinus, Kurosawa (1926) trích ly Gibberellin (GA) từ nấm Fusarium moniliforme. Năm 1926 E.Kurosawa (người Nhật) tìm thấy một lồi nấm mốc tên Gibberella fugikuroi. Ơng chứng minh rằng khi nấm nhiễm vào cây con, chúng làm cây con tăng trưởng với tốc độ cao. Năm 1930 người ta đã phân lập và kết tinh một chất từ Gibberella nay được gọi là gibberellin. Trong vịng 30 năm trở lại đây cĩ hơn 70 chất khác nhau được phân lập từ nấm mốc và nhiều thực vật cĩ hoa cũng được xếp vào nhĩm gibberellin (GAs). Gibberellin thường được sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay acid gibberellic. Cĩ rất nhiều xạ khuẩn trong đất cũng cĩ khả năng sinh tổng hợp Auxin - một dạng phytohoocmon rất cĩ ý nghĩa đối với cây trồng. Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự kiểm sốt sự tăng dài của tế bào. Vì tế bào thực vật cĩ vách bao bọc, nên tế bào chỉ cĩ thể tăng trưởng được khi vách cĩ thể được kéo dài ra. Vách được cấu tạo bởi phần lớn là đường đa mà thành phần chính là cellulose. Ở vách sơ cấp, cellulose hiện diện dưới dạng những sợi dài liên kết với các đường đa khác để tạo ra một mạng lưới. Khi tăng trưởng các liên kết cĩ thể bị đứt tạm thời, do đĩ vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và những vật liệu mới được chen vào. Auxin cĩ vai trị chính trong cả hai quá trình trên. Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều. Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA cĩ thể kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247 10 cĩ khả năng tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces olivochromoferus 1/294 cĩ khả năng tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …( Lê Thị Hoa, 1998) Qúa trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật diễn ra khá phức tạp, bằng phương pháp đồng vị phĩng xạ người ta xác định được IAA cĩ nguồn gốc từ Triptophan (hình 1.5). Hình 1.5: Các con đường hình thành IAA ở vi sinh vật. (theo Lê Thị Hoa,1998) 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh: Cĩ nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều trị bệnh nhưng nhìn chung cĩ thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất cĩ nguồn gốc vi sinh vật và thực vật cĩ tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác một cách cĩ chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp. Chất kháng sinh là một chất hĩa học cĩ hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật 11 và thực vật. Các vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh: - Trên thế giới: Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện vào 1928, và được Abraham, Chain và Florey tinh chế ở dạng ổn định cĩ tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn. Hơn thế nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, cĩ thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn. Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn cĩ minh chứng qua một số patent: patent số 3968204 Hamill, 1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ Actinoplanes philippinensis NRRL 5462; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết kháng sinh A-32887 từ Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL 12525; patent số 4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh A47934 từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri. Đĩ là những patent của Mỹ, Mỹ cũng là một trong những nước sản xuất kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển cơng nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng đã cĩ nền cơng nghiệp sản xuất kháng sinh, ngồi những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh cịn cĩ kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như Biocontrol dưới dạng lỏng cĩ thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển cơng nghiệp kháng sinh, các nhà máy kháng sinh được xây dựng ở Tứ Xuyên, Thượng Hải, 12 Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật. - Ở Việt Nam: chúng ta cũng đã cĩ nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết cũng như nổ lực hợp tác với nước ngồi để sản xuất kháng sinh mặc dù kết quả chưa đáp ứng được so với nhu cầu thực tế. Những cố gắng ấy cĩ thể tổng kết qua các mốc thời gian sau: Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Ðặng Văn Ngữ đã nuơi cấy Pénicillum và dùng dịch nuơi cấy để chữa vết thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xơ (cũ), theo yêu cầu của ta, đã khảo sát và thiết kế cho Việt Nam một nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh, dự định đặt ở Phú Thọ (Bắc bộ), nhưng sau đĩ phải ngưng lại vì chiến tranh mở rộng ra miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng Tetracyclin 5 tấn/năm, trước dự định xây dựng ở Cao Bằng, sau chuyển về Sơn Tây rồi Việt Trì, nhưng do quan hệ giữa hai nước lúc đĩ cĩ trục trặc nên cơng trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Cơng Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộng sự đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các chủng vi sinh vật trong đĩ đặc biệt cĩ xạ khuẩn sinh kháng sinh cĩ nguồn gốc từ đất Việt Nam. Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hố các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh. Từ 1985 đến 1990, trong chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C, Bộ Y tế đã cho nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin. Cũng trong thời gian này (từ 1985 – 1990), Liên Xơ (cũ) thỏa thuận giúp ta xây dựng nhà máy kháng sinh 5 tấn/năm tại Xí nghiệp Dược phẩm TW 24, TPHCM. Cơng việc đang triển khai thì tình hình chính trị ở Liên Xơ cũ chuyển biến khơng thuận lợi, nên cơng trình đình lại vào năm 1992. (theo Nguyễn Duy Cương, 2005). Đến nay, chúng ta cũng đã cĩ một số dây chuyền bào chế kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMC Aseane nhưng nguyên liệu phải nhập từ nước ngồi như: 13 tại xí nghiệp dược 24 tại thành phố Hồ Chí Minh nguyên liệu Ampicinlin và Amocillin từ nguyên liệu trung gian 6-APA nhập từ Belarut; bên cạnh đĩ vào 1999- 2000 tổng cơng ty dược Việt Nam đã chủ trì đề tài “Nghiên cứu cơng nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH và cephalexin từ penicillin G” và đề tài “Nghiên cứu áp dụng cơng nghệ sản xuất các kháng sinh mới, hiệu quả bằng nguyên liệu trong nước”. Gần đây lãnh đạo Tổng cơng ty Hĩa chất và tổng cơng ty Dược đã cĩ văn bản trình chính phủ về hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất 300 tấn/ năm các cephalexin bán tổng hợp thế hệ 1 và thế hệ 3 từ nguyên liệu trung gian 7-ADCA và 7-ACA nhập khẩu. Từ tình hình trên cho thấy sản xuất nguyên liệu kháng sinh trong nước là một nhu cầu hết sức cấp bách đối với chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam. Trong chiến lược phát triển khoa học cơng nghệ Việt Nam từ nay đến 2010 (do thủ tướng Phan Văn Khải ký) đã xác định Việt Nam phải sản xuất kháng sinh và phải sản xuất tự túc 60% thuốc dùng trong nước.(theo www.vinachem.com.vn ). Với tiêu chí trên cho thấy rất cần những cơng trình nghiên cứu và tiến tới sử dụng các chủng vi sinh vật trong đĩ đặc biệt là xạ khuẩn để sản xuất các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn được đặt ra hiện nay. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh: 1.1.2.3.1. Điều kiện nuơi cấy: - Độ thơng khí: yếu tố thơng khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhĩm vi sinh vật hiếu khí nên độ thơng khí để đạt hiệu suất cực đại đĩng vai trị quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh; lượng khơng khí cung cấp vào mơi trường nuơi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thể tích mơi trường /1 phút. - Nhiệt độ: cĩ những lồi xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của mơi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28OC – 30OC (nhiệt độ phịng thí nghiệm). Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18OC – 28OC. 14 - pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của mơi trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh. - Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh khơng chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà cịn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuơi cấy. Điều kiện của mơi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau tùy vào từng chủng và tuổi của bào tử giống. - Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuơi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường được nuơi cấy theo phương pháp nuơi cấy chìm trong nồi lên men cĩ khuấy đảo và sục khí. 1.1.2.3.2. Thành phần mơi trường nuơi cấy: Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào mơi trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vơ cơ. Các vi sinh vật khi đã phát triển trên mơi trường nhân giống và cấy truyền lên mơi trường lên men cĩ nguồn gốc C, N và các thành phần mơi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh các chất khác nhau. - Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc thơng qua các nguồn cacbon khác nhau. Tuỳ thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose, Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng cĩ thể là các loại tinh bột hoặc các chất cĩ thành phần khơng xác định như rỉ đường, đại mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng cĩ hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột. - Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong mơi trường nuơi cấy cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hĩa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 15 như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường địi hỏi cĩ cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vơ cơ trong mơi trường. nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngơ, … nguồn nitơ vơ cơ là: muối amon hoặc nitrat. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Cĩ nhiều quan điểm về chất kháng sinh, cĩ quan điểm cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng cĩ quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong mơi trường sống tự nhiên. Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tĩm tắt như sau: - Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhĩm nucleozit). - Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin). - Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hĩa các chất trao đổi bậc 1, sau đĩ cĩ thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Cĩ thể phân biệt thành 4 dạng: + Chất kháng sinh nhĩm polypeptit theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin. + Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polyme hĩa các đơn vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhĩm macrolit, tetracilin, rifamicin. + Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin. + Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat… 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh: 1.1.2.5.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: 16 Thành tế bào vi khuẩn cĩ cấu tạo từ peptidoglycan gồm các đơn vị murein, đĩ là disacarit pentapeptit (N – acetylglucozamin, acid N – acetyl muramic) gắn với chuổi peptapeptit. Cycloserin cĩ cấu tạo tương tự D – alanin, nĩ cĩ thể cạnh tranh với D – alanin để gắn vào các enzyme alanin – racemaza và D – alanin – D alanin synthetaza ngăn cản sự tạo thành D – alanin – D – alanin. Các chất kháng sinh β – lactam thấm qua thành tế bào dễ dàng gắn lên màng sinh chất: ở đây một số protein cĩ khả năng gắn với chất kháng sinh gọi là PBP (penicillin binding protein) mỗi protein cĩ ái lực riêng với một loại β – lactam ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình sinh tổng hợp murein. 1.1.2.5.2. Ức chế tổng hợp protein: - Các chất kháng sinh ức chế tổng hợp protein: Một số chất kháng sinh như cloramphenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S của riboxom, chất này phong bế peptiditranpheraza ngăn cản sự kéo dài mạch polypeptit.(xem hình 1.6) Các chất kháng sinh thuộc nhĩm macrolit như: erythromycin, lincomycin, … ức chế việc giải phĩng acid amin khỏi phức hệ aminocyl – ARNt – ribixom – ARNm. (xem hình 1.6) Tetracilin gắn lên receptor ở cả đơn vị 30S và 50S ức chế quá trình tổng hợp protein. (xem hình 1.6) Puromycin, chất ức chế dịch mã cĩ cấu trúc gần giống với đầu 3’của một tyrocyl – ARNt ở vị trí A, do đĩ nĩ cĩ thể tác dụng với peptidyl – puromycin. Peptidyl – puromycin khơng chuyển sang vị trí P, khơng tham gia vào quá trình vận chuyển, do đĩ khơng tiếp tục quá trình kéo dài chuổi polypeptit và tách ra khỏi riboxom. - Các chất kháng sinh dẫn đến sinh tổng hợp protein bất thường: Một số chất cĩ thể gắn với phần 30S của riboxom làm thay đổi cấu hình khơng gian của tiểu thể này, ảnh hưởng đến việc gắn RNAm vào riboxom làm rối loạn đọc. 17 Ví dụ: Streptomycin tác dụng làm cho codon UUU mã hĩa cho phenyl bị đọc sai thành AUU, mã hĩa cho izolơcin do vậy acid amin phenylalanime bị thay bằng izolơcin.(xem hình 1.6) Hình 1.6: Sự ức chế tổng hợp protein của một số chất kháng sinh. 1.1.2.5.3. Phá hủy màng nguyên sinh chất: Đĩ là các chất kháng sinh như Bacitracin, Polymicin. Polymycin làm phá vỡ lớp phospholipid của cấu trúc màng nguyên sinh chất làm cho các chất khuếch tán ra khỏi tế bào, tế bào sẽ chết. Chất kháng sinh polyen tác động lên thành phần sterol của màng. Màng tế bào vi khuẩn khơng chứa sterol nên thường khơng bị kháng sinh thuộc nhĩm này tác động, ngoại trừ tế bào nấm, tế bào động vật và tế bào người (do cĩ thành phần sterol trên màng). 1.1.2.5.4. Ức chế tổng hợp acid nucleic: Những chất kháng sinh như: mitomycin, actinomycin, mitramycin, … gắn với acid nucleic (DNA, RNA) tạo thành phức hợp bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các phân tử acid nucleoic này. 18 Một số chất kháng sinh chống virus như vidarabin, axiclovir cĩ cấu trúc giống acid nucleoic do đĩ cĩ thể gắn với enzym cần tổng hợp DNA của virus. Rifamycin, novobiocin ức chế RNA polymeraza, flucitocin ức chế timidilatsintetaza, ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp RNA. 1.1.2.5.5. Ức chế cạnh tranh: Những chất kháng sinh này cĩ cấu trúc gần giống với chất trao đổi bình thường (acid amin, coenzym) nên chúng cĩ thể tranh chấp enzym hoặc cĩ thể thay thể chất trao đổi và làm bất hoạt cơ chất này. Ví dụ: ở vi khuẩn, acid folic (vitamin B9) là chất thiết yếu để tổng hợp tạo thymin, chất này được tạo thành qua quá trình chuyển hĩa từ acid paminobenzoic (APAB). Sulfamit do cĩ cấu trúc giống APAB nên cĩ thể thay thế APAB và khơng tạo acid folic. 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh: Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp nên vừa nằm trong tế bào vừa nằm trong dịch nuơi cấy – chúng cĩ thể khơng hồ tan hay hịa tan trong dịch nuơi cấy, do vậy trong tách chiết chất kháng sinh người ta thường tiến hành tách chiết kháng sinh từ tế bào (sinh khối) và từ dịch nuơi cấy. Cĩ nhiều phương pháp khác nhau để tách chiết chất kháng sinh như: - Tách chiết chất kháng sinh bằng phương pháp hấp phụ: hấp phụ nhằm mục đích gắn hợp chất cần thiết cĩ trong dung dịch nước ở nồng độ thấp vào một chất hấp thụ gắn thích hợp. Sau đĩ lại phải giải hấp phụ chất đã gắn ở trên bằng một thể tích nhỏ của một dung dịch khác ở một pH chính xác. Phương pháp này cho phép: cơ lập, tinh chế, cơ đặc sản phẩm cần thu nhận. Trong các phịng thí nghiệm và trong sản xuất cơng nghiệp, người ta sử dụng các chất hấp thụ như than hoạt tính cĩ ưu điểm là ít tính đặc hiệu, ít nhạy cảm với pH và cĩ diện tích tiếp xúc lớn, thường đối với xạ khuẩn người ta sử dụng 2% than hoạt tính trong dịch nuơi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và pH = 7 khuấy 1 giờ và lọc qua giấy lọc. Than hoạt tính được giải hấp phụ bằng dung 19 mơi hữu cơ (aceton) với tỉ lệ 1:3 trong 6 giờ.; ngồi than hoạt tính cịn cĩ Oxit nhơm và Gel silic là 2 chất được nạp vào các cột dùng trong các quá trình phân ly của các sắc tố hay một số steroit. (Nguyễn Đức Lượng, 2001) - Tách chiết kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion: các loại nhựa này là những phân tử của styren trùng hợp với sự cĩ mặt của một lượng nhất định divinyl benzen, sự kết hợp đến 12% divinylbenzen sẽ tạo các cầu nối giữa các mạch trong quá trình trùng hợp, cho phép tạo các mạng polyme làm tăng độ xốp của chúng và làm khung cho nhiều nhĩm hĩa học, tạo ra tính đặc biệt cho mỗi loại nhựa. những nhựa cationit mạnh chứa tới 3 nhĩm sunfonic trong các phân tử benzen làm cho nhựa cĩ tính acid mạnh. Những chất trao đổi ion cenllulotic là những este của cenlluloza, chúng đĩng vai trị của chất trao đổi anion hay cation. Ngồi ra chúng cịn cĩ những tính chất đặc biệt như hút nước, khả năng trao đổi tăng nhanh hơn 5m Eq/g. Đối với tách chiết sản phẩm trao đổi ở xạ khuẩn thường người ta sử dụng 5% nhựa trao đổi ion trong dịch nuơi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và lắc trên máy lắc 2 giờ. Sau khi loại dịch lọc, nhựa trao đổi được rửa bằng nước cất. Giải hấp phụ bằng NH4OH 1N và HCl 1N, sau khi giải hấp phụ đem cơ chân khơng ở 60OC và tủa kháng sinh bằng aceton..(theo Nguyễn Đức Lượng, 2001) - Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung mơi hữu cơ: quá trình tách chiết bằng dung mơi hữu cơ thường được thực hiện qua 2 giai đoạn: đầu tiên là giai đoạn trộn 2 pha nước và dung mơi để tăng bề mặt tiếp xúc, đảm bảo các phân tử của các chất lỏng tiếp xúc chặt chẽ với nhau. thời gian khuấy phải đủ để cho phép khuyếch tán mạnh các sản phẩm phải chiết vào dung mơi hữu cơ; cuối cùng là giai đoạn nhũ dịch sau khi lắng, các dung mơi được dùng bao gồm các chất như sau: các ancol (butanol, isopropanol, propanol.), các este (acetal, butyl, amyl), các ceton (metyl ityl aceton, metylbutyl ceton), các ete (ete izopropilic, dioxan), benzen, phenol, pyridin, dicloetan, clorofoc. Các dung mơi đều phân cực, khi chọn dung mơi hữu cơ, ngtười ta thường quan tâm đến 2 tính chất: độ hồ tan của nĩ trong nước và ái 20 lực của nĩ với chất cần tách chiết, trong đĩ độ hồ tan của dung mơi lại phụ thuộc vào nhiệt độ, ta chọn nhiệt độ sao cho độ hồ tan của dung mơi là nhỏ nhất. 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối: Cĩ nhiều phương pháp tách chiết gồm các phương pháp sau: phương pháp cơ học và siêu âm (dùng thiết bị Edebo,và thiết bị Rogers), phương pháp enzym (sử dụng chính enzym của tế bào phá vở tế bào đối với tế bào nấm men hoặc sử dụng enzym bên ngồi để phá vở những thành phần tương ứng trên thành tế bào của vi sinh vật), phương pháp hĩa lý (gây sốc nhiệt), phương pháp hố học. Với phương pháp tách chiết kháng sinh bằng hĩa học dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh của 1 số hĩa chất, người ta cho 1 số hĩa chất vào như NaCl, Foluen, Cồn … các chất này sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu đủ mạnh để làm tế bào bị vỡ và giải phĩng các chất trong tế bào ra (Nguyễn Đức Lượng, 2001), bên cạnh đĩ, để việc tách chiết kháng sinh đạt hiệu quả cao từ sinh khối địi hỏi khả năng hồ tan của chất kháng sinh trong tác nhân chiết phải lớn, hay khả năng tách chiết phụ thuộc vào độ hồ tan của chất dùng để tách chiết. Trước khi tách chiết, sinh khối cần rửa bằng nước để loại bỏ thành phần mơi trường; các dung mơi dùng để tách chiết cĩ nhiều loại như: etyl acetat, butanol, etanol, metanol, … nhưng trong đĩ aceton là dung mơi cĩ cực thấp nhất thường hay được sử dụng nhiều hơn trong tách chiết chất kháng sinh. 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc: Cũng tương tự như tách chiết kháng sinh từ sinh khối, các chất kháng sinh trong dịch lọc cĩ trọng lượng phân tử thấp thường hồ tan trong nước và dung mơi hữu cơ nên người ta thường lựa chọn dung mơi hịa tan chất kháng sinh mạnh để tách kháng sinh ra khỏi mơi trường dịch lọc; butanol là dung mơi thường được sử dụng. 21 Dù tách chiết kháng sinh từ dịch lọc hay từ sinh khối đều phải trải qua quá trình loại bỏ dung mơi bằng cách cơ chân khơng ở nhiệt độ thường dưới 60OC, sau đĩ làm giảm khả năng hồ tan của chất kháng sinh vào dung mơi bằng cách hạ nhiệt xuống thấp. Chất kháng sinh thu được từ sinh khối và dịch lọc gọi là kháng sinh thơ là nguyên liệu cơ sở cho tinh sạch kháng sinh. 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh: Để tinh sạch chất kháng sinh, người ta cĩ thể thay đổi dung mơi hay chất hấp phụ kháng sinh (than hoạt tính) để loại bỏ các tạp chất cĩ đặc tính hồ tan được trong dung mơi tách chiết trước đĩ. Tuy nhiên, phương pháp tinh sạch chất kháng sinh cĩ hiệu quả cao được thực hiện là bằng phương pháp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng, hay sắc ký lỏng cao áp. 1.2. Các nhĩm chất kháng sinh chính cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn: Cĩ nhiều khố phân loại khác nhau để phân loại chất kháng sinh như: theo cấu trúc hố học, theo vị trí tác dụng, theo phương thức tác dụng, theo phổ tác dụng đối với vi khuẩn. thậm chí trong y học, trong nơng nghiệp, trong hố dược người ta cũng cĩ những cách phân loại kháng sinh khác nhau, trong luận văn này chúng tơi dựa vào khố phân loại của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001; chất kháng sinh cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn được phân chia 12 nhĩm sau: 1.2.1.1. Các kháng sinh β-lactam: Các chất kháng sinh này cĩ khung cơ bản là một vịng betalactam, là một amin vịng 4 cạnh; vịng này được gắn với một vịng thiazolidin tạo thành khung penam (vịng thiazolidin cĩ 5 cạnh no), các cephem (vịng cĩ 6 cạnh chưa no), các penem (cĩ vịng 5 cạnh chưa no), các monobactam (chỉ cĩ vịng betalactam) – đĩ là 4 phân nhĩm trong nhĩm kháng sinh betalactam. Các kháng sinh trong nhĩm này như: Penicilin (hình 1.7), Cephalosporins, … 22 Hình 1.7: Kháng sinh penicilin.(B: vịng betalactm; A: vịng thiazolidin) Các chất kháng sinh trong nhĩm này cĩ tác dụng lên vỏ vi khuẩn, ngăn phản ứng sinh tổng hợp của vỏ này, nên các loại kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ ác dụng kìm vi khuẩn. tuy nhiên ở vi khuẩn gram ( - ) màng tế bào ngồi cùng cĩ 1 lớp lipid, ngăn cản trực tiếp của chất kháng sinh. 1.2.1.2. Các kháng sinh aminoglycosid: Các kháng sinh này cĩ cấu trúc heterosid bao gồm một phần genin thuộc nhĩm aminocyclitol gắn với các phần đường trong đĩ cĩ phần đường amino (osamin). Các genin là những polyol vịng (cyclitol) trong đĩ cĩ 2 nhĩm hydrocyl được thay thế bằng các chức amin hay guanidin. Những kháng sinh thuộc nhĩm này bao gồm: Streptomycin (hình 1.8), Neomycin, Gentamicin, … Hình 1.8: Kháng sinh Streptomycin Các chất kháng sinh cĩ nguồn gốc vi sinh vật thuộc nhĩm này được tách chiết từ mơi trường nuơi cấy của các chủng: Streptomyces, Microspora và Bacillus. Việc chiết aminosid từ mơi trường nuơi cấy thường thực hiện qua 23 trao đổi cation để giữ các kháng sinh cĩ tính base (theo Nguyễn Khang, 2005), với sơ đồ tách chiết sau: Sơ đồ tách chiết 1 aminosid (theo Nguyễn Khang, 2005) 1.2.1.3. Các kháng sinh Macrolide: Là các kháng sinh cĩ heterosid mà genin là một vịng lactor cĩ chứa nhiều nguyên tử (vịng lớn – macrocycle) số lượng các nguyên tử của vịng thường từ 12 – 17 hay nhiều hơn. Người ta cịn xếp cạnh các macrolid này với các chất synergistin và lincosamid. Các kháng sinh là: Erythromycin, Oleandomycin, Azithromycin (hình 1.9), … 24 Hình 1.9: Kháng sinh Azithromycin Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ vịng 14 nguyên tử với nhĩm –N(CH3)2 của đường amin cĩ tác dụng quyết định về kháng sinh gắn vào riboxom của vi khuẩn. 1.2.1.4. Các kháng sinh polyene macrolide: Các kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ vịng lacton lớn. Theo Berdy (1974) chất kháng sinh này cĩ 3 – 7 dây nối đơi và được chia thành các nhĩm nhỏ: dien, trien, tetraen, pentaen, hexaen, heptaen với cơng thức tổng quát: - CH2-(CH=CH)8-CH2-. Hầu hết các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ nhân amino saccaroza (mycozamin) đính vào vịng lacton bằng liên kết glucozit. Một vài chất kháng sinh thuộc nhĩm phụ heptaen cĩ nhân thơm (4-amino acetophenose) hoặc N-metyl (4-amino acetophenol) liên kết hĩa trị với các nguyên tử cacbon của vịng lớn. Một đặc điểm khác của nhĩm kháng sinh macrolic polyen là sự cĩ mặt rất nhiều các nhĩm hydroxyl trong phân tử của chúng; sự cĩ mặt của các nhĩm này cùng với nối đơi trong cấu tạo phân tử làm cho kháng sinh cĩ tính chất lưỡng tính. Chất kháng sinh ít tan trong ete, rượu nhưng tan trong dung mơi cĩ cực. Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ tác 25 dụng phá vỡ tính thẩm thấu của màng tế bào chất, gắn vào sterol của màng rồi phá hủy làm rối loạn tính thấm. Nhiều chất kháng sinh nhĩm polien cĩ hoạt phổ kháng khuẩn khác nhau, cĩ loại ức chế cả protozoa, tế bào ung thư, tuyến trùng gây bệnh thực vật. các kháng sinh cĩ thể kể như: Rimocidin (hình 1.10), Pimaricin, … Hình 1.10: Kháng sinh Rimocidin 1.2.1.5. Các kháng sinh macrocyclic lactose khác: Chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ chứa vịng lactone lớn nối các aminosacarose. Monorden Hình 1.11: Kháng sinh Monorden 1.2.1.6. Các kháng sinh amino acid và peptide: Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ cấu trúc hĩa học bao gồm các chuỗi acid amin, cơ bản là cấu trúc peptit mạch vịng Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ đại diện là: polymicin, bacimycin, Sinanomycin (hình 1.12), … 26 Hình 1.12: Kháng sinh Sinanomycin 1.2.1.7. Các kháng sinh glycopeptide: Nhĩm kháng sinh này cĩ cấu trúc hĩa học giống như nhĩm peptide gồm các chuỗi acid amin mạch vịng, nhưng cĩ gắn thêm các nhĩm chức glycose. Các kháng sinh thuộc nhĩm này là: Vancomycin (hình 1.13), Bleomycin, … Hình 1.13: Kháng sinh Vancomycin Các kháng sinh thuộc nhĩm này chỉ cĩ tác dụng mạnh với vi khuẩn gram (+) và khơng kháng với những vi khuẩn gram (-) 1.2.1.8. Các kháng sinh Tetracycline: Là các kháng sinh cĩ 4 vịng, những kháng sinh của nhĩm này là dẫn chất của octahydronaphtalen được lấy từ mơi trường nuơi cấy một số lồi Streptomyces. Những chất kháng sinh này cĩ phổ kháng sinh rộng bao gồm các vi khuẩn gram âm, như các kháng sinh: Tetracycline (hình 1.14), Minocycline, … 27 Hình 1.14: Kháng sinh Tetramycin. 1.2.1.9. Các kháng sinh quinone và anthracycline: Là các kháng sinh cĩ cấu trúc 3 vịng anthracene và cĩ gắn các phân tử oxy bởi nối đơi (cấu trúc quinone). Các kháng sinh gồm: Nogalamycin (hình 1.15), Streptonigrin, … Hình 1.15: Chất kháng sinh Nogalamycin. 1.2.1.10. Các kháng sinh ansamycin: Các kháng sinh ansamycin là những kháng sinh phát triển từ nhĩm kháng sinh macrolactam cĩ nguồn gốc vi sinh vật, các kháng sinh này cĩ cấu trúc 1 vịng mà trong đĩ cĩ 1 nhánh aliphatic ansa dưới hình thưc là 1 cầu nối giữa 2 vị trí khơng nằm kế cận của vịng π – system; những kháng này kháng nấm, kháng khuẩn, kháng u. những đại diện cho nhĩm kháng sinh này là những benzenic ansamycin với 17 cacbon và 1 nguyên tử N chuổi ansa (hình 1.16a). 28 Hình 1.16a: Cấu trúc của kháng sinh Ansamycin. Các kháng sinh nguồn gốc từ xạ khuẩn thuộc nhĩm này như: geldanamycin (hình 1.16b), herbimycin A, … Hình 1.16b : 1.2.1.11. Các kháng sinh Nucleoside: Các nhĩm kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ cấu trúc hĩa học dựa trên cấu trúc nucleotic (bao gồm pyrimidin hay purine) nhưng cĩ sự thay đổi trên gốc đường và trên phần baze sự thay đổi này cĩ ảnh hưởng sâu sắc đến tác động sinh học. Các kháng sinh này cĩ khả năng kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u (ung thư). Những kháng sinh nucleoside cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn gồm: tunicamycin, polyoxin, puromycin, … 29 Hình 1.17: chất kháng sinh Tunicamycins 1.2.1.12. Các kháng sinh Polyether: Là các lọai kháng sinh trong cấu trúc cĩ nhiều nối ether (-o- ) Hình 1.18: Chất kháng sinh Nanchangmycin 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn: Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn phải kể sớm nhất là chất kháng sinh Nistatin được thu nhận từ dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces noursei (do Hansen và Brown, 1942) để chữa trị bệnh nấm cho người; về sau người ta đã thu nhận được nhiều chất kháng sinh cĩ nguồn gốc vi sinh vật phần lớn từ mơi trường nuơi cấy xạ khuẩn thuộc chủng Streptomyces; các kháng sinh thuộc nhĩm này phần lớn thuộc nhĩm kháng sinh Macrolit, nhĩm Polien, griseofulvin. Các Macrolit được xếp loại theo 30 kích cở vịng genin, quan trọng nhất là các chất kháng sinh cĩ vịng 14 đến 16 nguyên tử hĩa học. 1.3. Vai trị của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phịng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng: Ở các nước sản xuất nơng nghiệp, bệnh cây đã gây ra những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Các dịch bệnh đạo ơn hại lúa, bệnh bạc lá (do vi khuẩn gây ra), bệnh vàng lụi (do virus gây ra), bệnh khơ vằn (do nấm gây ra), …đã gây tổn thất lớn khơng những về năng suất mà cịn làm mất tính ổn định của giống cây trồng. Theo thống kê của tổ chức lương nơng thế giới cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đở với 100.000 lồi sâu hại khác nhau, 10.000 lồi nấm, 200 lồi vi khuẩn, 600 lồi tuyến trùng và 600 lồi virus gây bệnh; thiệt hại hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên thề giới bị mất trắng. Sau đây là một số bệnh gây thiệt hại lớn phổ biến ở Việt Nam: 1.3.1.1. Bệnh đạo ơn trên lúa (do Piricularia oryzae gây ra): Là bệnh phổ biến ở các nước trồng lúa kể cả ở Việt Nam, tại đồng bằng sơng cửu long, hàng năm thường cĩ 2 thời điểm xuất hiện bệnh nhiều nhất là vào tháng 11 -12 dương lịch và tháng 5 -6 dương lịch. Các huyện Châu thành, Cai lậy, chợ gạo Tiền giang; Phú tân, Chợ mới An giang; Thạnh trị Cần thơ là những nơi thường cĩ bệnh. Bệnh gây thiệt hại cho lúa ở giai đoạn mạ và nảy chồi; nếu nhiễm trể ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân thối cổ gié nên làm đổ gãy, làm hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt. ở Nhật - số liệu từ năm 1953 – 1960 cho thấy sản lượng thất thu hàng năm từ 1,4 – 7,3%, trung bình là 2,98%. Tính riêng năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24,8% trong tổng thất thu do sâu bệnh thiên tai. đối với bệnh thối cổ gié , người ta tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5%. bệnh 31 do nấm Pyricularia oryzae gây ra, vết bệnh là các đốm hoặc vết thương trên lá (Hình 1.19) Hình 1.19: Triệu chứng đốm trên lá của bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra. 1.3.1.2. Bệnh héo vàng cây khoai tây (do Fusarium oxysporum gây ra): Gây thiệt hại lớn ở các nước trồng khoai tây trên thế giới, ở Việt Nam cĩ nơi bệnh gây thiệt hại 40% năng suất (theo Vũ Triệu Mân, 1998). Fusarium oxysporum tấn cơng gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ và củ. Ở gốc cây vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc thân gây hiện thối khơ tĩp lại, thường trên vết bệnh cĩ bao phủ lớp nấm trắng thưa, ngồi ra bệnh cịn gây hại ở củ và mầm củ, củ bị nấm xâm nhập nhìn bề ngồi bình thường nhưng phần thịt củ cĩ nhiều vịng vân vàng hoặc nâu và ăn sâu vào trong củ, khi đĩ gọi là bệnh thối khơ củ khoai tây. 1.3.1.3. Bệnh khơ vằn hại lúa: (do Rhizoctonia solani gây ra) Bệnh phân bố ở diện rộng ở các vùng trồng lúa trên thế giới, ở nước ta bệnh khơ vằn là bệnh nghiêm trọng thứ 2 sau bệnh đạo ơn (do nấm Pyricularia). Phạm vi ký chủ của nấm Rhizoctonia sp. bao gồm trên 180 lồi cây trồng, nấm phát sinh mạnh trong nhiệt độ cao, ẩm độ cao; vị trí gây bệnh là bẹ lá, phiếm lá và cổ bơng. Áp sát mặt nước là nơi phát sinh bệnh đầu tiên - vết lúc đầu là vết đốm hình bầu dục màu lục tối sau lan rộng thành dạng vết vằn 32 (hình 1.20); tương tự ở lá và cổ bơng. Trên vết bệnh ở vi trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hạch nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi lên mặt nước ruộng. H ình 1.20: Vết bệnh khơ vằn trên lá lúa và hạch nấm Rhizoctonia solani. 33 1.3.1.4. Bệnh thối gốc và lở cổ rễ: Bệnh do nhiều loại nấm gây ra: Fusarium sp, Rhizoctonia solani, Pythium, Phytophthora spp., … Trong số đĩ chủ yếu gây hại do 3 chi: Fusarium, Rhizoctonia và Pythium. Chi Fusarium phân bố rộng trong tự nhiên, sống hoại sinh trong đất, trên xác thực vật và ký sinh trên cây. Chúng thường tiết ra chất kích thích sinh trưởng (giberilin) làm cho cây dài ra, lá úa vàng, khơng ra hoa kết quả hoặc tạo ra các độc tố gây hại cho cây trồng như acid furavic, phitonivnin. Lồi Fusarium oxysporum, gây bệnh thối rễ ở cây lương thực, cây nơng nghiệp, rau xanh và cây rừng. Cây bị bệnh thối rể thường chết héo do khơng hút được nước cung cấp cho cây; lồi này cịn gây bệnh mốc sương, bệnh thối khơ, thối ướt ở khoai tây gây thiệt hại cho năng suất cây trồng. Đây là bệnh phổ biến ở nước ta và trên thế giới; bệnh xuất hiện đặc trưng ở rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất, vết bịnh thâm đen làm rễ khơng hút được nước cung cấp cho cây làm cây chết đổ gục trên ruộng. Lúc đầu vết bệnh chỉ là 1 chấm đen sau lan rộng ra rất nhanh bao quanh cổ rễ.(hình 1.21) Hình 1.21: Bệnh lở cổ rể ở cây đậu do Nấm Rhizoctonia sp. 1.3.1.5. Bệnh chết rạp thối rễ (do Pythium sp. gây ra): 34 Pythium làm cây chết nhanh từ lúc 2 lá mầm. Bệnh chết rạp thối rễ phổ biến vào mùa mưa, nhiệt độ tương đối thấp phạm vi ký chủ rộng hại cây con cà chua, ớt, họ đậu (hình 1.22), vải, …bệnh thối rễ thường gây ra do một nhĩm nhiều lồi nấm bao gồm: Pythium, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, … nguồn bệnh tồn tại lâu dài trong đất, chúng sống trên tàn dư cây trồng trong đất, riêng Pythium cĩ khả năng sống ẩn trong đất trồng mà khơng cĩ tàn dư cây trồng. Hình 1.22: Bệnh chết rạp thối rể trên cây đậu do Pythium sp. gây ra 1.3.1.6. Tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1.6.1. Tác hại của tuyến trùng lên cây trồng: Bên cạnh các bệnh do nấm gây nhiều tổn thất đến cây trồng thì một đối tượng động vật khơng xương: tuyến trùng cũng là đối tượng hết sức nguy hiểm cho cây trồng. Tuyến trùng gây hại thực vật (Phytonematodes) phần lớn sống trong đất phá hại bộ rể của cây (xem hình 1.23, 1.24) chúng gây tác hại lớn đến sinh trưởng, năng suất và phẩm chất cây trồng. Chúng tập trung nhiều ở tầng đất canh tác khoảng độ sâu 5 – 20 cm. Tuyến trùng thực vật là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm; chúng cĩ mặt và gây hại trên các loại cây khác 35 nhau trên các loại đất khác nhau trong vườn ươm và trên đồng ruộng; triệu chứng gây hại dễ nhầm lẫn với triệu chứng do các nguyên nhân khác như thiếu chất dinh dưỡng, bệnh virus, cơn trùng … Ở nước ta đã cĩ nhiều thiệt hại do tuyến trùng gây ra: theo Phạm Thị Nhất (1975) khảo sát cĩ 90 – 95% diện tích cà chua bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng ở vùng Gia Lâm và Thanh Trì, Hà Nội làm giảm 50% năng suất thậm chí mất trắng; khảo sát của Nguyễn Bá Khương từ 1976 – 1978 tuyến trùng gây hại trên 32 loại rau, tạo u sưng trên rễ thuốc lá với tỉ lệ 81,5%; khảo sát của Bùi Lạng từ 1978 – 1981 tuyến trùng gây hại trên cây thuốc lá làm giảm 21,7% chiều cao cây và giảm 37,2% tốc độ ra lá. Hình 1.23:Tuyến trùng lây nhiễm vào rễ (theo www.plantaardiy.com) Tuyến trùng tuổi 2 Rể cây 36 Hình 1.24: Tuyến trùng tạo nốt sưng trên rễ cà chua (theo www.plantaardit.com) Qua các dẫn liệu trên cho thấy tác hại ghê gớm của tuyến trùng lên cây trồng. trong quá trình tìm hiểu nguyên nhân gây hại của tuyến trùng, con người đã phát hiện được mối quan hệ hổ trợ giữa hai tác nhân gây hại cây trồng: tuyến trùng và vi sinh vật gây bệnh. Cĩ thể đơn cử một vài thí dụ sau: - Bridge (1978) phân lập từ bệnh vàng lá ở cây tiêu cĩ tuyến trùng Radopholus similis, Meloidogyne incognita và nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani từ những rể cây bị bịnh ở Indonesia. Ơng cho rằng bệnh vàng lá khơng phải do một tác nhân gây bệnh là tuyến trùng hay 1 loại nấm mà do sự tương tác giữa tuyến trùng và nấm. Cùng nhận xét của Bridge, Phan Quốc Sủng (1988) cho rằng bệnh hại rễ do tuyến trùng nốt sưng Radopholus similis và Meloidogyne incognita tác động với Fusarium sp., Rhizoctonia bataticola. - Chi cục kiểm dịch thực vật vùng II (1987) cho rằng tuyến trùng Meloidohyne incognita và nấm Fusarium sp. kết hợp tấn cơng bộ rễ tiêu, sự kết hợp này phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh mà cây cĩ những triệu chứng khác nhau. 37 - Thuốc lá: sau khi nhiễm tuyến trùng M. incognita, M. javanica, M. arenaria thì cũng bị nhiễm Fusarium oxysporum sau đĩ 2 tuần; và nhiễm Alternaria tenuis sau 3 tuần làm 70% số lá bị bệnh (theo Powell và Batten, 1971). - Cây dâu: tuyến trùng M. incognita là nguyên nhân đầu tiên dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm, và virus làm giảm 10 – 12% sản lượng lá dâu (Goviudaian, 1991). Theo khảo sát của Ngơ Thị Xuyên (1991) tuyến trùng nốt sưng xuất hiện trên cây thuốc lá từ tháng 2 đến tháng 6, đáng chú ý là vào tháng 3, 4, 5 khi thời tiết ấm lên đã tạo điều kiện thích hợp cho tuyến trùng sinh sản, lây nhiễm tạo nhiều u sưng gây chết cây, kết hợp với bệnh nấm hoặc vi khuẩn nâng tỉ lệ bệnh của cây thuốc lá lên 90 – 100%, vào những tháng: tháng 7, 8, 9, 11, 12, mật độ tuyến trùng giảm. 1.3.1.6.2. Đặc điểm sinh học của tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne spp) hại cây trồng: Tuyến trùng là lồi động vật nhỏ sống trong đất và trong nước. Chúng thuộc ngành Nemathelminthe. Tuyến trùng cĩ kích thước hơi nhỏ, mắt thường khĩ nhìn thấy được, nhưng cĩ thể quan sát dưới kính phĩng đại từ 7 đến 40 lần. Tuyến trùng cĩ 2 nhĩm hình dạng chính: hình sợi, nhọn ở 2 đầu và hình quả lê. Trong đất cĩ rất nhiều loại tuyến trùng, trong đĩ cĩ cả tuyến trùng hoại sinh (khơng cĩ kim ở đầu, ăn xác bả thực vật) và tuyến trùng ký sinh gây hại cho cây trồng (cĩ mang kim ở đầu để chích hút chất dinh dưỡng từ cây). Tuyến trùng ký sinh gây hại cây trồng cĩ 3 loại: - Ngoại ký sinh: tuyến trùng chỉ bám bên ngồi mơ bị hại, chọc kim vào trong mơ để hút chất dinh dưỡng. - Nội ký sinh: tuyến trùng chui hẳn vào bên trog mơ cây, sống và sinh sản ngay bên trong mơ. Với cách ký sinh này, tuyến trùng nội ký sinh thường làm 38 cho mơ cây sưng phù lên, tạo thành những nốt sưng bất thường (hình 1.25). Vì vậy người ta gọi tuyến trùng loại này là tuyến trùng nốt sưng. Chúng ký sinh ở rễ thì làm cho rể hư hỏng, khơng hút được đầy đủ chất dinh dưỡng từ đất nên cây bị cằn cỗi, lá vàng, rụng lá, cây chết dần. Triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra thể hiện ra rất chậm. Trên cây đa niên, bệnh cĩ thể tiến triển trong nhiều năm trước khi làm chết cây nên rất khĩ nhận biết để phịng trị kịp thời. Loại tuyến trùng này hiện nay được quan tâm nghiên cứu để hiều biết sinh lý và cách phịng chống. a b Hình 1.25: a/ Tuyến trùng Meloidogyne arenaeria trong nốt rể được bổ dọc, chụp qua kính hiển vi nổi. b/ Tuyến trùng Meloidogyne arenaeria nội ký sinh ở rể cây tiêu và đám trứng (nhuộm màu đỏ) do nĩ đẻ ra ở trong mơ của rể cây bệnh. (theo - Bán nội ký sinh: tuyến trùng chui phân đầu vào trong mơ cây, cịn phần thân mình thì cịn bên ngồi mơ cây bị ký sinh. Vịng đời của tuyến trùng nốt sưng phát triển biến thái qua các giai đoạn khá phức tạp; từ giai đoạn trứng đến tuyến trùng tuổi 1, 2, 3, 4 và trưởng thành. Trong các giai đoạn biến thái tuyến trùng tuổi 2 là giai đoạn quan trọng nhất trong chu trình sống của luyến trùng. Ở giai đoạn này tuyến trùng chui ra khỏi trứng và u sưng để đi vào trong mơi trường đất. Từ đây chúng sẽ tìm cách xâm nhập vào rễ cây mới, tiếp tục sống và gây bệnh cho cây. Chính ở giai 39 đoạn tuổi 2 này là thời điểm thích hợp cho chúng ta cĩ thể dùng các biện pháp để ức chế sự lây lan của tuyến trùng. Khi xâm nhập vào cây tuyến trùng tạo vết thương trên rễ cây, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân gây bệnh khác như các loại nấm, virus, … cùng xâm nhập vào cây. Mật số tuyến trùng hiện diện trong đất là điều cần quan tâm, bởi vì khơng phải hể cĩ tuyến trùng ký sinh trong đất là cây trồng sẽ bị thiệt hại, mà chỉ khi nào mật số tuyến trùng đạt đến ngưỡng gây hại thì cây trồng mới bị nhiễm bệnh hay nĩi cách khác: nếu trong đất cĩ ký chủ thích hợp với tuyến trùng và được trồng liên tục trong nhiều năm thì tuyến trùng nhân mật số lên dần cho đến lúc đạt mật số gây hại thì từ đĩ cây trồng sẽ bị hại và càng ngày mức độ thiệt hại càng tăng lên. Chính điều này mà người trồng trọt cần thực hiện canh tác theo phương thức luân canh – hình thức thay đổi ký chủ đối với tuyến trùng, bên cạnh đĩ cĩ một số thuốc hố học trị được tuyến trùng như: Nemagon, DD, Furadan, Mocap, … tuy nhiên bơm thuốc vào trong đất rất khĩ và tốn kém. 1.3.2. Vai trị của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phịng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. 1.3.2.1. Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: Để phịng trừ nấm gây bệnh và tuyến trùng hại cây trồng người ta cĩ nhiều biện pháp trong đĩ biện pháp sinh học được chú ý do biện pháp này sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạt động sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc giảm bớt tác hại do các sinh vật cĩ hại gây ra nhưng khơng gây độc hại cho cây trồng, người và gia súc, khơng gây ơ nhiễm mơi trường. Tuy nhiên biện pháp này cịn ít được nghiên cứu, việc ứng dụng trong sản xuất cịn hẹp, giá thành cao. Biện pháp sinh học để phịng trừ bệnh cây được nghiên cứu ứng dụng theo 3 hướng sau: 40 Sử dụng các siêu ký sinh (ký sinh bậc 2): đĩ là các loại nấm, vi khuẩn, thực khuẩn thể, tuyến trùng ăn thịt…Cĩ rất nhiều lồi nấm sợi cĩ khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng như: Aschersoria sp., Beauveria bassiana, Conidiobolus obrus, Zoophthora radicans … đã được sử dụng để sản xuất các loại chế phẩm diệt sâu hại. Những lồi được dùng phổ biến là nấm Bạch cương – Beauveria bassiana, nấm Lục cương – Metarrhizium anisoplia. Cơ chế gây hại của các lồi nấm này là ký sinh và làm chết nhiều loại cơn trùng gây hại (khoảng hơn 100 lồi cơn trùng) (xem hình 1.26). Một số loại vi khuẩn sống trong đất, phân chuồng như vi khuẩn Achrobacterium, Pseudomonas sống ký sinh trên nấm Fusarium gây bệnh hại cây trồng. Ngồi ra cịn cĩ nhiều loại nấm sống trong đất sống ký sinh trên cơ thể tuyến trùng hại cây. Hình 1.26: Sợi nấm Beauveria sp. mọc trên cơ thể cơn trùng Sử dụng các vi sinh vật đối kháng và chất kháng sinh: các vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế sự hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng các chất kháng sinh do bản thân vi sinh vật đối kháng sinh ra. Một số sinh vật đối kháng được biết: + Nấm Trichoderma harzianum ức chế nấm Botrytis cinerea hại cà chua, nấm Sclerotium rolfii hại lạc: Người ta thấy những điểm ký sinh và sự 41 quấn sợi nấm lên nấm bệnh Rhizoctonia solani (nguyên nhân gây bệnh khơ vằn) (hình 1.27, 1.28) sợi nấm gây bệnh Pythium sp. bị quăn lại và chết từng đoạn khi bị Trichoderma sp. ký sinh và sau đĩ nấm Trichoderma sp. lấn áp và ức chế sợi nấm bệnh. a b Hình 1.27: a/ Nấm Trichoderma sp. ức chế Pythium sp. b/ Nấm Trichoderma sp ức chế Rhizoctonia solani. (www.vertigo.uqam.ca/.../ mathias_de_kouassi.html) Hình 1.28: Nấm Trichoderma harzianum ký sinh trên sợi nấm Rhizoctonia solani + Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans gây bệnh ở rể cây cam quít bị nấm Arthrobotrys dactyloides sống trong đất bắt bằng vịng trịng do chúng tạo ra và giết chết tuyến trùng. 42 Hình 1.29: Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans bị nấm Arthrobotrys dactyloides bắt bằng các vịng trịng do nĩ tạo ra và giết chết tuyến trùng. Sử dụng fitonxit: là chất đề kháng của cây, do cây trồng sản sinh ra, cĩ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Các chất fitonxit được nghiên cứu ứng dụng là từ củ hành, củ tỏi, rau ngải. Cụ thể người ta dùng nước tỏi, nước hành xử lý hạt giống để giảm nguy cơ mắc bệnh cho cây trồng. Xạ khuẩn – vai trị chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn cĩ khả năng ức chế nấm bệnh thực vật. Theo Kamada, khi điều tra vi sinh vật đối kháng trong đất ở Nhật cho thấy nơi nào cĩ nhiều xạ khuẩn thì ở đĩ các lồi Fusarium biến mất nhanh. Thơng thường một lồi xạ khuẩn đối kháng cĩ thể ức chế nhiều lồi nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng các chủng cĩ hoạt phổ rộng phải chú ý tránh xạ khuẩn ức chế luơn cả khu hệ sinh vật cĩ lợi trong vùng rể. Khơng phải tất cả các xạ khuẩn cĩ hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện cĩ hoạt tính trong mơi trường đất Xạ khuẩn ngồi việc chống nấm bằng cách tiết kháng sinh cịn sinh enzym tác động lên hệ vi sinh vật. Ngồi ra, nhiều loại xạ khuẩn cịn sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật cũng như các lồi vi sinh vật cĩ lợi cho đất. 43 Trong số khơng nhiều các chủng xạ khuẩn vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến trùng hại cây trồng, chủng Streptomyces dicklowii là chủng xạ khuẩn được đánh giá cao trong lĩnh vực bảo vệ cây trồng. Chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii cĩ khả năng tiêu diệt hàng loạt các lồi nấm gây bệnh cho cây: Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Pythium sp., Pyricularia oryzea; đồng thời chất kháng sinh này cũng cĩ tác dụng rộng lên các nhĩm tuyến trùng: Ditylenchus, Globodera, Meloidogyne, Tylenchulus,… (Zuckerman, 1996)cụ thể là: - Ức chế sự sinh sản và phát triển của tuyến trùng. - Gây chết tuyến trùng sống ký sinh trong cây và sống tự do trong đất. - Khơng gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của cây trồng. Với ưu thế chất kháng sinh cĩ tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, phần lớn cĩ tác dụng nội hấp, thời gian bán hủy ngắn nên khơng gây ơ nhiễm mơi trường, ngồi ra việc sử dụng những chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh chất kháng sinh vừa ức chế vi sinh vật gây bệnh vừa khơng sợ vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc. Chính vì vậy nhiều quốc gia đã chế tạo nhiều chế phẩm sinh học phịng trừ bệnh cây mà xạ khuẩn đĩng vai trị chính. - MYCOSTOP của Phần Lan (hình 1.30), chế phẩm này cĩ khả năng khống chế các loại nấm gây hại cây trồng như: Fusarium sp, Pythium sp, Phytophthora gây hại lên bộ phận rể cây. chế phẩm trên ở dạng bột bao gồm bào tử và khuẩn ty của chủng Streptomyces được lựa chọn trong mơi trường đất tự nhiên với thành phần chính là Streptomyces griseoviridis chủng 61. Chủng xạ khuẩn này cĩ khả năng cạnh tranh với nấm hại cây trồng về khơng gian sống và thức ăn bằng việc tranh lấy vùng sống quanh rể cây nhưng chúng khơng gây hại cho cây. Những nghiên cứu của nhà sản xuất đã cho thấy Mycostop được cây trồng tiếp nhận và vụ mùa cĩ thể tăng 5 -15%, tác dụng của chế phẩm đến cây trồng cĩ thể thấy rõ sau 3 – 6 tuần sử dụng.(theo www.agbio-inc.com/Mycostop.htm) 44 Hình 1.30: chế phẩm Mycostop - ACTINOVATE Plus/M của Mỹ (hình 1.31), chế phẩm ở dạng lỏng và được sử dụng tưới phun, Actinovate với thành phần chính là Streptomyces lydicus chủng 108 đã khống chế được nấm bệnh hại cây trồng đồng thời chế phẩm trên đáp ứng được yêu cầu của cây trồng trong trường hợp cây bị thiếu hụt khống đa lượng và vi lượng. Hình 1.31: chế phẩm Actinovate. 1.3.2.2. Sử dụng kháng sinh trong lĩnh vực bảo vệ thực vật: Ở Trung Quốc, chất kháng sinh “120” từ chủng Streptomyces hygroscopicus đã phịng chống cho 330 triệu ha cây trồng và làm giảm bệnh từ 50 – 98,9% tuỳ theo từng loại bệnh. Ở Nhật Bản, người ta đã cĩ các chế phẩm chống bệnh đạo ơn và khơ vằn rất cĩ hiệu quả như : - Validacin (Validamycin A): C20H35NO13 là chất kháng sinh từ Streptomyces hygroscopicus var. limoneus. Thuốc ở dạng bột dễ hút ẩm, chúng tan được trong nước và nhiều dung mơi hữu cơ; thuốc được dùng để trừ 45 nấm Rhizoctonia solani hại khoai tây, bệnh khơ vằn hại lúa. Dạng chế phẩm Validacin 3L dùng 1,5+ 1,7 lít/ha trừ bệnh khơ vằn, 1,7+ 2lít/ha trừ bệnh khơ vằn ngơ, để trừ bệnh khơ vằn cổ bơng lúa cần phun thuốc trước khi lúa trổ 5 + 7 ngày. Hình 32: Chế phẩm Kasumin - Kasumin (Kasugamycin): (hình 1.32) C14H28ClN3O10 là chất kháng sinh của Streptomyces kasugaensis. Thuốc ở dạng tinh chế, tan trong nước. Thuốc được sản xuất thành dạng dung dịch 2%, dạng bột thấm nước 2% và 5%, dạng hạt 2% và dạng hỗn hợp cĩ tên là Kasuran 50WP (5% Kasumin +75,6% CuOCl = 45% Cu.) pha nước ở nồng độ 0,1% để phịng trừ bệnh phấn trắng, bệnh thối dưa chuột, dưa hấu, một số bệnh vi khuẩn và nấm hại chè, cam, chanh, cà chua, khoai tây; Kasurabcide (1,2% kasumin + 20% Fthalide) dạng bột thấm nước dùng 1,5kg/ha trừ đạo ơn, đốm sọc, vi khuẩn hại lúa. (Vũ Triệu Mân, 1998) (theo www.fedearroz.com) 46 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu: 2.1.1. Các chủng vi sinh vật: - Streptomyces dicklowii (do phịng thí nghiệm bộ mơn vi sinh trường Đại học sư phạm tp.HCM cung cấp). - Vi sinh vật kiểm định: nhận từ trường Đại học Y tp.HCM. ● Bacillus subtilis.(hình 2.1) ● Streptococcus sp.(hình 2.1) ● Echerichia coli (hình 2.1) Bacillus subtilis Echerichia coli Streptococcus sp. Hình 2.1: Các vi khuẩn kiểm định - Các chủng nấm gây bệnh cây trồng: nhận từ trung tâm nghiên cứu sản xuất hĩa chất nơng dược, thành phố HCM. ● Rhizoctonia solani. ● Fusarium oxysporum. ● Pythium sp. ● Sclerotium sp. ● Colletotrichum sp. 2.1.2. Các thiết bị: ● Máy lắc trịn – Gerhardt ● Cân điện – Sartorius. ● Máy đo pH – Hanna. 47 ● Tủ ấm – Memmert. ● Máy ly tâm – Hettich. ● Máy cơ chân khơng – Heidolph (Germany) ● Nồi cách thủy. 2.1.3. Các mơi trường sử dụng trong đề tài: Mơi trường Gauze – 1(g/l) – MT1: Tinh bột tan 20g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g KNO3 1,0g NaCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường Gauze – 2(g/l) – MT2: Peptone 5g Glucose 10g Cao thịt 5g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường khoai tây (g/l) – MT3: khoai tây 300g Glucose 50g H2O 1000ml Cách làm : khoai tây cắt hạt lựu nấu với nước cất sau đĩ lọc lấy dịch trong ; bổ sung nước cho đủ 1000ml. Mơi trường Czapek – dox (g/l) – MT4: Saccarose 30g NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường phân giải tinh bột (g/l) – MT5: Tinh bột tan 10g KH2PO4 1g 48 Peptone 5g MgSO4.7H2O 5g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường phân giải Protein – mơi trường Frazie (g/l) – MT6: Gelatin 20g NaCl 3g K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g Saccarose 0,05g Peptone 0,25g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường phân giải Cellulose (g/l) – MT7: CMC 20g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g NaNO3 3,5g Cao nấm men 0,1g K2HPO4 1,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường ISP1 (g/l) – MT8: Trypton 5g Cao nấm men 3g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường ISP4 (g/l) – MT9: Tinh bột tan 10g CaCO3 2g K2HPO4 1g FeSO4.7H2O 0,001g MgSO4.7H2O 1g NaCl 1g (NH4)2SO4 2g ZnSO4.7H2O 0,001g MnCl2.7H2O 0,001g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường cơ sở (g/l) – MT10: 49 Dung dịch muối cơ sở: K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 1,5g NaCl 1,5g CaCO3 3g H2O 450ml Dung dịch muối vết: CuSO4 0,064g FeSO4.7H2O 0,11g MnCl2.7H2O 0,79g ZnSO4.7H2O 0,15g H2O 100ml Cách pha lấy 0,1ml dung dịch muối vết vào 30ml dung dịch muối cơ sở, sau đĩ bổ sung nước cất cho đủ 50ml. Mơi trường vi khuẩn kiểm định – MPA (g/l) – MT11: Cao thịt 3g Peptone 10g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường A – 4 (g/l) – MT12: Glucose 10g NaCl 5g Bột đậu tương 10g CaCO3 1g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường A – 4H (g/l) – MT13: Glucose 15g Bột đậu tương 15g NaCl 5g CaCO3 1g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường A – 12 (g/l) – MT14: Tinh bột tan 10g Rỉ đường 10g 50 Bột đậu tương 10g K2HPO4 2g CaCO3 1g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Mơi trường khoai tây glucose agar – PGA (g/l) – MT15: Khoai tây 300g Glucose 50g Agar 20g H2O 1000ml Nước muối sinh lý 0,8% - MT16: H2O 1000ml NaCl 8g Mơi trường nước chiết khoai tây – MT17: Khoai tây 300g Glucose 50g Nước cất 1000ml Dung dịch lugol: Iot 2,5g KI 5g H2O 1000ml Thuốc thử Salkowski: FeCl3 0,5M 15ml H2SO4 98% 300ml H2O 500ml Mơi trường khảo sát khả năng sinh IAA: sử dụng mơi trường ISP4 bổ sung 0,1g/l L-Triptophan. Thuốc thử Ninhydrin: Ninhydrin 0,1g Nước cất 100ml 51 Thuốc thử fehling: - Dung dịch A: CuSO4 35g H2SO4đđ 6ml Thêm nước đến 1000 ml - Dung dịch B: NaOH 33% 375ml C4H4O6KNa 200g Thêm nước cất đến 1000 ml - Pha dung dịch A và dung dịch B theo tỉ lệ 1:1 2.2. Phương pháp: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật: 2.2.1.1. Phương pháp làm phịng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn: Đặt vào đĩa petri một miếng giấy lọc đã tẩm ẩm nước cất vơ trùng, để miếng lam vơ trùng lên đĩa petri sau đĩ đặt miếng thạch cĩ kích thước 5mm x 5mm (mơi trường MT1) cuối cùng dùng que cấy đầu trịn cấy xạ khuẩn (lấy từ ống giống thạch nghiêng) lên 4 cạnh đứng của miếng thạch, xong, đậy miếng lamen lên miếng thạch nuơi ở nhiệt độ phịng sau 2 – 3 ngày đem quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x100, thị kính x10. 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch: Nguyên tắc: Để xác định hoạt tính kháng sinh người ta dựa vào sự khuếch tán kháng sinh trong thạch. Chổ nào cĩ chất kháng sinh khuếch tán thì nơi đĩ vi khuẩn kiểm định bị ức chế bởi chất kháng sinh sẽ khơng mọc được và sẽ tạo thành vịng vơ khuẩn. Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng hiệu số giữa đường kính vịng vơ khuẩn và đường kính lỗ đục. Hoạt tính kháng sinh = (D – d) mm 52 D: đường kính vịng vơ khuẩn. d: đường kính lổ đục (d = 8mm) Phương pháp: Mơi trường MT11 sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45OC cho dịch nuơi cấy vi khuẩn kiểm định vào (với lượng 2ml giống/200ml mơi trường) lắc đều và đổ ra đĩa petri (15ml/đĩa). Dùng khoang lá đục lỗ thạch, xong nhỏ dịch nuơi cấy xạ khuẩn vào lổ thạch; giữ đĩa thạch ở nhiệt độ thấp 4OC trong 3 – 5 giờ, lấy ra để ở nhiệt độ phịng, sau 24 giờ, thu kết quả. 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối sinh vật: Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov [3], sinh khối được xác định dựa vào trọng lượng khơ tuyệt đối. Lấy 100ml dịch lên men lọc qua giấy lọc sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi, rửa sạch hệ sợi xạ khuẩn lần lượt bằng dung dịch HCl 1N và nước cất. Sấy khơ ở 80 - 100oC tới trọng lượng khơng đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch giữa trọng lượng tờ giấy lọc cĩ sinh khối và trọng lượng tờ giấy lọc khơ đã cân trước đĩ. 2.2.2. Phương pháp hĩa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn: - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải tinh bột: Nguyên tắc: tinh bột khi gặp thuốc thử Lugol (cĩ thành phần Iot) sẽ bắt màu xanh đậm. Nên chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh enzym phân giải tinh bột sẽ làm cho mơi trường khơng bắt màu nơi tinh bột bị phân giải và ngược lại sẽ cĩ màu xanh đậm khi enzym chưa khuếnh tán đến phân hủy tinh bột. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT5, sau 5 ngày nuơi cấy trong nhiệt độ phịng ta dùng Lugol nhỏ vào xung 53 quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt mơi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải tinh bột được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc. - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Cellulose: Nguyên tắc: Cellulose khi tác dụng với thuốc thử Lugol sẽ bắt màu đỏ huyết. Nên chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh enzym phân giải Cellulose sẽ làm cho mơi trường khơng bắt màu với thuốc thử Lugol nơi Cellulose bị phân giải và chổ cĩ sự hiện diện của Cellulose sẽ bắt màu với Lugol và cĩ màu đỏ huyết. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT7, sau 6 ngày nuơi cấy trong nhiệt độ phịng ta dùng Lugol nhỏ vào xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt mơi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải Cellulose được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc. - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Protein: Nguyên tắc: Protein (gelatin) sẽ bị kết tủa khi tác dụng với acid TCA 10% làm cho mơi trường hĩa đục. Nên khi xạ khuẩn cĩ khả năng phân giải được protein thì khi nhỏ TCA 10% thì nơi khơng cĩ hiện diện Protein sẽ khơng tủa và ngược lại nơi cĩ sự hiện diện Protein sẽ tạo tủa làm cho mơi trường cĩ màu trắng đục. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đĩ chấm một điểm ở giữa đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT6, sau 6 ngày nuơi cấy trong nhiệt độ phịng ta dùng TCA 10% nhỏ vào xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt mơi trường để yên 54 trong vài phút; quan sát và đo đường kính vịng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải Protein được tính bằng hiệu số của đường kính vịng phân giải và đường kính khuẩn lạc. 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật (ß – indole acetic acid (IAA)): IAA là một kích thích tố sinh trưởng đối với thực vật thuộc nhĩm auxin. Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tơi chọn phươngpháp hĩa học để phát hiện IAA thơng qua thuốc thử Salkowski cải tiến (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3 - một thành phần của thuốc thử Salkowski cải tiến). 2.2.2.2.1. Định tính IAA: hay phương pháp xác định nhanh khuẩn lạc sinh IAA. Chủng xạ khuẩn được cấy vạch trên mơi trường ISP4 cĩ bổ sung L- triptophan ( 0,1g/l). Đặt khoang giấy lọc vơ trùng lên trên vết cấy, sau đĩ nuơi cấy trong nhiệt độ phịng với thời gian là 5 ngày; đến ngày thứ 5 lấy khoang giấy lọc ra đặt lên mặt thạch một khoang giấy lọc khác đã bảo hịa trong thuốc thử Salkowski cải tiến. Nếu vùng giấy lọc ứng với vết cấy xạ khuẩn chuyển sang màu hồng nhạt thì chủng xạ khuẩn đĩ cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA. 2.2.2.2.2. Định lượng IAA: Xác định hàm lượng IAA thơ và các hợp chất tương tự - dựng đồ thị chuẩn IAA: - Nguyên tắc: IAA và các hợp chất tương tự tác dụng với thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu vàng nhạt đến hồng đậm phụ thuộc vào hàm lượng IAA thơ và các hợp chất tương tự mà bắt màu với thuốc thử. - Dựng đường chuẩn: Pha IAA tinh khiết ở các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml ở mơi trường kiềm. ở mỗi nồng độ IAA nĩi trên, lấy 2ml cho vào các ống nghiệm 55 chứa 8 ml thuốc thử Salkowski cải tiến, so màu ở bước sĩng 530 nm. Đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD và nồng độ IAA để vẽ đường chuẩn. - Xác định hàm lượng IAA thơ trong dịch nuơi cấy: Chủng xạ khuẩn được nuơi trong mơi trường ISP4 nuơi cấy lắc ở tốc độ 200 vịng/phút trong thời gian 5 ngày. Sau đĩ thu dịch nuơi cấy qua ly tâm ở tốc độ 4500 vịng/ phút trong 15 phút, lấy dịch trong. Nhỏ 2ml dịch nuơi cấy sau ly tâm vào ống nghiệm chứa sẳn 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Lắc đều, để yên trong 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sĩng 530nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuơi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µmIAA/ml. 2.2.3. Phương pháp hĩa lý. 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh: Xạ khuẩn được nuơi lắc (200 vịng/phút) trên mơi trường MT3 (pH = 7). Sau 96 giờ lấy dịch nuơi cấy ly tâm 3000 vịng/phút, trong 5 phút loại bỏ sinh khối đem đun ở các ngưỡng nhiệt độ: 40OC, 60OC, 80OC, 100OC kéo dài ở các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút. Làm nguội và xác định hoạt tính kháng sinh. 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh: Ở đây, chúng tơi trình bày phương pháp tách chiết kháng sinh bằng dung mơi hữu cơ. Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp cĩ thể nằm trong sinh khối và trong dịch nuơi cấy; vì vậy để tách chiết các kháng sinh trong sinh khối và dịch nuơi cấy xạ khuẩn thì cần phải lựa chọn dung mơi thích hợp cho từng phương pháp tách chiết kháng sinh. - Ở phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối: khảo sát trên các dung mơi: Aceton, Etyl acetat, Etanol, Metanol, n- Butanol, Izo-probanol. 56 - Ở phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuơi cấy: khảo sát trên các dung mơi : n-Butanol, n-Probanol, Toluen, Clorofooc. Trên cơ sở kiểm tra họat tính kháng khuẩn của kháng sinh thơ sau khi tách chiết bởi phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá dung mơi nào cĩ khả năng tách chiết kháng sinh nhiều nhất sẽ được lựa chọn cho qui trình tách chiết kháng sinh, áp dụng cho cả 2 phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối và dịch thể. Trong qui trình tách chiết kháng sinh cĩ những đặc điểm tách chiết như sau: Sau khi kết thúc quá trình nuơi cấy xạ khuẩn, các quá trình biến đổi vẫn tiếp tục xảy ra trong dịch nuơi cấy sẽ làm biến đổi những sản phẩm sau nuơi cấy thành những dẫn xuất, để tránh hiện tượng này chúng tơi bổ sung vào dịch nuơi cấy HCl 10% đến pH = 3,0 – 3,5 trong dịch nuơi cấy. Sau đĩ tách sinh khối ra khỏi dịch nuơi cấy qua ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút. Lúc bấy giờ, chúng ta sẽ tiến hành tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối và dịch thể như sau: - Phương pháp tách kháng sinh từ sinh khối: phần sinh khối sau khi tách khỏi dịch nuơi cấy được tiến hành rữa bằng nước cất 2 lần, cho dung mơi vào khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 45OC kéo dài 30 phút – pH = 7,0 sau đĩ tách sinh khối bằng ly tâm (3000 vịng/phút trong 5 phút) thu dịch lọc. Dịch lọc được cơ chân khơng cịn lại 1/3 sau đĩ làm giảm sự hồ tan của chất kháng sinh ở điều kiện nhiệt độ = 4OC làm chất kháng sinh tủa, thu chất kháng sinh tủa bằng phương pháp ly tâm rồi đem thử họat tính kháng sinh. - Phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuơi cấy: dịch chiết sau khi tách sinh khối được chỉnh pH = 7,0 – 8,0 bằng NaOH 1N rồi cho dung mơi dùng tách chiết kháng sinh vào với tỉ lệ 4: 6 (dung mơi : dịch nuơi cấy sau khi tách sinh khối), đưa tịan bộ vào bình lĩng để tách lớp, thu lớp dung mơi cĩ kháng sinh hịa tan đem cơ chân khơng cịn 1:15. Tương tự như phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối, kháng sinh tủa ở nhiệt độ = 4OC cĩ bổ sung thêm aceton, việc bổ sung aceton (hay etanol) nhằm làm giảm sức căng 57 bề mặt giữa chất hồ tan (chất kháng sinh) và dung mơi làm cho sự tủa chất hồ tan trở nên dễ dàng hơn. Kháng sinh thơ được đem kiểm tra họat tính kháng sinh. - Tinh sạch kháng sinh: để lọai bỏ các tạp chất cĩ đặc tính hịa tan được trong dung mơi tách chiết giống như chất kháng sinh người ta dùng phương pháp: thay đổi dung mơi tách chiết. Cĩ thể hiểu chất kháng sinh thơ gồm: chất kháng sinh và một số tạp chất cĩ tích chất tương tự chất kháng sinh, hồ tan được trong butanol. Hồ chất kháng sinh thơ cần làm tinh sạch vào metanol (là dung mơi tách chiết tốt kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii) rồi thu kháng sinh bằng phương pháp tủa ở nhiệt độ thấp (4OC); cuối cùng hồ chất kháng sinh vào aceton (là dung mơi phân cực giống như metanol nhưng aceton cĩ độ phân cực thấp nhất và thu kháng sinh tinh khiết ở dạng tủa. Qui trình tách chiết được trình bày tĩm tắt như sau: 58 Hình 2.2: Sơ đồ tách chiết kháng sinh (Lê Gia Hy, 1995) 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hĩa học của chất kháng sinh: Nguyên tắc: dùng những phản ứng hố học để phân biệt các nhĩm chức trong chất kháng sinh, việc xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hố học của chất kháng sinh được tiến hành bằng cách dựa vào những phản ứng màu đặc trưng để xác định qua đĩ cĩ thể sơ bộ phân loại chất kháng sinh theo cấu trúc. (Lê Ngọc Thạch, 2002) - Xác định vịng lacton trong cấu trúc của chất kháng sinh qua phản ứng với acid H2SO4đđ : cho chất kháng sinh vào ống nghiệm cĩ sẳn 4ml H2SO4đđ với sự hiện diện của vịng lacton sẽ làm cho dung dịch cĩ màu đỏ thẩm. 59 - Xác định nhĩm –OH bằng phản ứng màu với H3PO4đđ : nếu phản ứng cĩ màu chứng tỏ chất kháng sinh cĩ vịng macrolid. - Xác định nhĩm chức amin bằng phản ứng màu đặc trưng với Ninhydrin: cho chất kháng sinh đã tinh sạch vào ống nghiệm cĩ sẳn 4ml ninhydrin, đun nĩng. Nếu cĩ hiện diện acid amin và liên kết peptid thì sẽ xuất hiện màu xanh tím. Cĩ thể giải thích hiện tượng này như sau: nếu cĩ hiện tượng dezamin hĩa oxyhĩa và decacboncyl hĩa . Lúc đĩ sẽ tạo thành NH3, CO2, và aldehyt tương ứng. Do cĩ xuất hiện NH3 sẽ xảy ra phản ứng diceto-oxy-hydrinden (pH lớn hơn 4) tạo phức mới, phức này tiếp tục chuyển sang dạng enol và kết hợp thêm một NH3 để tạo chất cĩ màu tím xanh (tím Ruheman). - Xác định nhĩm đường hay nhĩm aldehyde bằng phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử Fehling: nguyên tắc các aldehyde dễ dàng bị oxy hố bởi thuốc thử Fehling. Cho vào ống nghiện 2ml dung dịch Fehling A (cĩ màu xanh dương) và 2ml dung dịch Feling B (khơng màu)lắc đều sau đĩ cho chất kháng sinh tinh sạch vào và đun cách thủy vài phút. Nếu cĩ hiện diện các nhĩm aldegyde sẽ cĩ phản ứng khử Cu++ thành Cu+ , dung dịch cĩ màu đỏ gạch kềt tủa dưới đáy ống nghiệm. - Xác định nhĩm chức phenol ( )bằng phản ứng màu đặc trưng với FeCl3: nguyên tắc đa số phenol tạo thành phức chất cĩ màu với FeCl3. Cho dung dịch FeCl3 5% vào 5ml dung dịch cĩ chất kháng sinh cần xác định đun sơi nhẹ và xem màu của dung dịch, mỗi loại phenol cho màu khác nhau. Như vậy nếu phản ứng cĩ sự thay đổi màu sắc thì cĩ sự hiện diện của nhĩm chức phenol trong cấu trúc phân tử của chất kháng sinh. - Với KMnO4 để xác định nối đơi C = C (Alken): theo tính chất của các nhĩm hữu cơ thuộc nhĩm Alken, Alken làm phai màu dung dịch KMnO4 trong nước. Cho chất kháng sinh cần xác định vào từ từ và lắc thật mạnh với dung dịch KMnO4 1% trong nước. Nếu phản ứng cĩ sự phai màu tím của KMnO4 tức là chất kháng sinh cần xác định cĩ ít nhất 1 nối đuơi C = C. 60 - Kết quả chất kháng sinh cĩ vịng lacton khơng, để loại bỏ trường hợp thuộc nhĩm β – lactam, ansamycin, polyether và aminoglycosid; và xác định các nhĩm chức để cĩ sự lựa chọn cuối cùng chất kháng sinh khảo sát thuộc nhĩm nào . 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hồ tan trong các dung mơi của chất kháng sinh: Chuẩn bị 9 ống nghiệm cho vào mỗi ống nghiệm 5ml các dung mơi cần khảo sát là: Metanol, Dimetylfocmamit, Butanol bảo hịa nước, Benzol, cồn tuyệt đối, cồn 70%, Ethel, Clorofoc và nước cất. Sau đĩ cho chất kháng sinh vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và quan sát độ hịa tan của chất kháng sinh vào từng dung mơi. 2.2.4. Phương pháp khác: 2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh: Đem rễ cây bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng rửa sạch, để ráo nước cắt rễ thành từng đoạn 1 – 2 cm, cho vào đĩa petri đồng thời cho nước cất vào xăm xấp với khối rể, dùng kim mũi mác và kim mũi nhọn xé các nốt sưng cho vở ra tạo điều kiện cho tuyến trùng chui ra khỏi mơ rễ. Quan sát tuyến trùng dưới kính hiển vi trên lame ở vật kính x10. Dưới kính hiển vi, phân biệt các dạng hình thái khác nhau của tuyến trùng cái, trứng, tuyến trùng đực. 2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi đất: Cho 20ml nước cất vào 10g đất bị nhiễm tuyến trùng, trộn đều để yên trong 1 phút. Lấy dịch ở phần trên quay ly tâm 3000 vịng/phút trong 3 phút, phần cát mịn và tuyến trùng bị đẩy xuống đáy ống nghiệm, đổ bỏ phần nước bên trên, tiếp tục cho nước vào ống ly tâm khuấy tan phần cát mịn và ly tâm lần 2 với 3000 vịng/phút trong 30 giây, phần cát mịn kéo về đáy ống nghiệm tuyến trùng nổi bên trên, lấy phần nước bên trên cho vào đĩa petri, quan sát dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại 10 x10.(tuyến trùng tuổi 2) 2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt: 61 Các loại hạt đậu khác nhau được đem loại bỏ những hạt hư lép hay hạt nhiễm nấm bệnh; xong, cho ngâm trong các dung dịch nước cĩ pha dịch nuơi cấy xạ khuẩn ở các nồng độ: 0%, 1%, 2%, 10%, 50%, 100%; sau 18 giờ vớt ra đem ủ trong đỉa petri cĩ lĩt giấy lọc thấm nước cĩ pha dịch nuơi cấy xạ khuẩn ở các nồng độ trên. Sau 2 ngày quan sát kết quả: tỷ lệ hạt nảy mầm – thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con: Xạ khuẩn sau khi được nuơi cấy 120 giờ tách bỏ sinh khối, dịch nuơi cấy sau đĩ được pha lỗng đến các nồng độ: 1%, 2%, 10%, 50% và 100%. Ngâm hạt lúa Jasmine 85 vào các dịch đã pha, sau 18 giờ vớt các hạt lúa ra và đặt vào đĩa petri cĩ lĩt giấy lọc đã thấm dịch nuơi cấy ở các nồng độ trên, đĩa đối chứng là hạt ngâm trong nước lã và ủ trên giấy lọc cĩ thấm nước lã; các đĩa trên được ủ trong nhiệt độ phịng sau 5 ngày đo chiều dài của mầm và rễ. 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii: 3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: 3.1.1.1. Hình thái đại thể: Xạ khuẩn sau khi nuơi cấy điểm trên mơi trường Gauze 1(MT1) trong 7 ngày, quan sát thấy: khuẩn lạc của xạ khuẩn cĩ hình trịn với đường kính khuẩn lạc là 8mm. Bề mặt của khuẩn lạc mịn, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phĩng xạ tạo thành nhiều vịng trịn đồng tâm sau 5 ngày khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn thay đổi màu sắc từ màu trắng đến màu xám. Rìa khuẩn lạc khơng thẳng và cĩ màu sáng hơn trên khuẩn lạc, khuẩn ty khí sinh cĩ màu xám.(hình 3.1) Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.1.1.2. Hình thái vi thể: Trên mơi trường MT1, xạ khuẩn được nuơi cấy bằng phương pháp phịng ẩm, trong 2 ngày – tiến hành quan sát hình thái hệ sợi khuẩn ty và cuống sinh bào tử, dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại với vật kính x10, x100, kết quả nhận thấy: xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ hệ sợi khuẩn ty phân nhánh khơng cĩ vách ngăn (hình 3.2), cuống sinh bào tử dạng xoắn lị xo (từ 2 63 – 8 vịng xoắn) và được xắp xếp theo kiểu đối xứng đơn trên khuẩn ty khí sinh (hình 3.3). Hình 3.2: Hệ sợi khuẩn ty Hình 3.3: Cuống sinh bào tử 3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau: Mục đích của thí nghiệm là nhằm xác định đặc điểm sinh trưởng của chủng Streptomyces dicklowii trên các loại mơi trường theo Zuckerman (1996) và qua đĩ lựa chọn mơi trường thuận lợi cho những khảo sát ban đầu về đặc điểm sinh lý sinh hĩa của chủng Streptomyces dickowii. Sau thời gian 5 ngày nuơi cấy trên các loại mơi trường: MT1 (Gauze – 1) mơi trường chuẩn của xạ khuẩn, MT4 (Czapek – dox) mơi trường nuơi cấy nấm mốc, MT 15 (nước chiết khoai tây, glucose, agar - PGA); chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ đặc điểm nuơi cấy được ghi ở bảng 3.1 và hình 3.4: Bảng 3.1: Đặc điểm nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii trên các loại mơi trường. 64 Mơi trương nuơi cấy Khả năng sinh trưởng Màu khuẩn ty khí sinh Màu khuẩn ty cơ chất Màu sắc tố hịa tan MT 1 +++ Xám Trắng Khơng MT 4 + Xám trắng Trắng Khơng MT 15 +++ Xám hồng Vàng nâu Vàng Chú thích: +++: sinh trưởng mạnh, ++:sinh trưởng trung bình, +: sinh trưởng yếu Czapek – dox Gauze – 1 PGA Hình 3.4: Hình dạng khuẩn lạc của S. dicklowii trên các loại mơi trường. Nhận xét: - Chủng Streptomyces dicklowii thể hiện sự phát triển khác nhau trên các loại mơi trường khác nhau, trong đĩ trên mơi trường Gause-1 và PGA là phát triển tốt, do chủng Streptomyces dicklowii sử dụng hiệu quả nguồn cacbon ở mơi trường Gause-1 là tinh bột và mơi trường PGA là glucose, bên cạnh đĩ chủng S. dicklowii này cũng sử dụng tốt nguồn nitơ KNO3 trong mơi trường Gause-1. - Chủng Streptomyces dicklowii cĩ màu sắc của khuẩn ty khác nhau và khả năng sinh sắc tố ra bên ngồi mơi trường cũng khác nhau trên các loại mơi trường khác nhau; trong 3 loại mơi trường khảo sát chỉ cĩ ở mơi trường PGA chủng S. dicklowii cĩ sinh sắc tố hồ tan màu vàng, mơi trường này rất đơn giản gồm nước chiết khoai tây và glucose nhưng chủng Streptomyces dicklowii phát triển mạnh, điều này chứng tỏ những địi hỏi về nhu cầu dinh dưỡng của chủng xạ khuẩn S. dicklowii là khơng cao. 65 - Streptomyces dicklowii là chủng xạ khuẩn cĩ sức sống mạnh chỉ cần nuơi cấy trên mơi trường thạch trong 24 giờ là cĩ thể quan sát được khuẩn lạc hoặc vết cấy (so với các chủng xạ khuẩn khác cần thời gian 1 tuần hay hơn). Từ những ưu điểm về khả năng sinh trưởng tốt trên mơi trường PGA của chủng Streptomyces dicklowii và thành phần mơi trường PGA dể tìm giá thành mơi trường khơng cao nên chúng tơi đã chọn sử dụng mơi trường này cho một số thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hĩa của chủng Streptomyces dicklowii tiếp sau này. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 3.1.3.1. Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinb trưởng của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuơi cấy xạ khuẩn trên mơi trường MT1, kết quả ghi nhận ở bảng 3.2: Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Nhiệt độ Đặc điểm sinh trưởng Màu khuẩn ty khí sinh Màu sắc tố hoà tan 30OC 35OC 40OC 45OC 50OC +++ +++ ++ + - Xám Xám Xám trắng Xám trắng - Không Không Không Không Không Chú thích: +++: sinh trưởng mạnh. ++: sinh trưởng trung bình. +: sinh trưởng yếu. _: khơng sinh trưởng. Từ bảng 3.2 cho thấy: nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii là 30OC – 35OC, ở 40OC - 45OC xạ khuẩn vẫn phát triển tuy khơng mạnh, ở 45OC phát triển rất kém và ở 50OC xạ khuẩn hồn tồn khơng phát triển được. 3.1.3.2. Khảo sát khả năng chịu muối: 66 Đây là đặc điểm phân loại đến lồi của chi Streptomyces. Chủng xạ khuẩn được nuơi trên mơi trường ISP-1(MT8) cĩ bổ sung muối ở các nồng độ khác nhau, sau 5 ngày ghi nhận kết quả ở bảng 3.3: Bảng 3.3: Khả năng chịu muối của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Nồng độ NaCl Đặc điểm sinh trưởng Màu khuẩn ty khí sinh Màu sắc tố hoà tan 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 10% +++ +++ +++ ++ + - - - - - Xám trắng Xám trắng Trắng Trắng Trắng Trắng - - - - Không Không Không Không Không Không Không Không Không Không Chú thích: +++: sinh trưởng mạnh. ++: sinh trưởng trung bình +:sinh trưởng yếu. _: khơng sinh trưởng Từ kết quả trên cho thấy chủng Streptomyces dicklowii chỉ phát triển tốt ở nồng độ muối đến 4%, nồng độ muối trên 4% chủng xạ khuẩn phát triển rất kém và hầu như khơng phát triển ở nồng độ muối cao (trên 5%); điều này phù hợp với kết quả cơng bố của Zuckerman, 1996 về chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.1.3.3. Khảo sát khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử: 67 Mơi trường sống tự nhiên của chủng Streptomyces dicklowii là mơi trường đất với nhiều thành phần dưỡng chất khác nhau nhưng cơ bản vẫn là các thành phần Cellulose, Protein, ... là những hợp chất cĩ phân tử lượng lớn. Để khảo sát khả năng sử dụng những hợp chất này của Streptomyces dicklowii chúng tơi tiến hành tìm hiểu khả năng sinh các enzym phân hủy các cao phân tử nĩi trên. Sau 7 ngày nuơi cấy trên mơi trường MT5, MT6, MT7 để khảo sát khả năng sinh enzym phân giải các hợp chất cao phân tử như: hydratcacbon (tinh bột tan, CMC) protein (gelatin) của chủng Streptomyces dicklowii. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.4, hình 3.5. Bảng 3.4: Khả năng sinh enzym phân giải các hợp chất cao phân tử Vịng phân giải (mm) Cơ chất Vịng phân giải khuẩn lạc Hiệu suất phân giải(mm) Tinh bột tan 12,5 6 6,5 CMC 21,5 6,5 15 Gelatin 35 4,5 30,5 a b c Hình 3.5: Khả năng phân giải tinh bột (a), gelatin (b) và CMC (c) của chủng S. dicklowii. Qua bảng 4, hình 5 cho thấy: chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii sinh nhiều loại enzym khác nhau để phân hủy các hợp chất cao phân tử khĩ tiêu cơ bản như các dạng hydratcacbon: tinh bột, cellulose (CMC), protein 68 (gelatin). Trong đĩ đáng lưu ý là khả năng phân giải gelatin của chủng này đạt hiệu suất phân giải rất cao (trên 30mm), với khả năng sinh enzym phong phú của chủng Streptomyces dicklowii cho thấy tính thích nghi cao với mơi trường cĩ các hợp chất cao phân tử khĩ phân hủy của chủng này. 3.1.3.4. Khảo sát khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật: Auxin là nhĩm chất kích thích sinh trưởng thực vật, trong đĩ acid indol acetic (IAA) là 1 loại auxin cơ bản được con người quan tâm nghiên cứu nhiều. Auxin khơng bền vững dưới tác dụng của ánh sáng và bị phân hủy trong mơi trường acid hay dưới tác dụng của các chất oxy hĩa. Cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của vi sinh vật nĩi chung và xạ khuẩn nĩi riêng cho thấy IAA là một kích thích sinh trưởng thực vật được nhiều xạ khuẩn sinh tổng hợp. Xuất phát từ thực tế này, chúng tơi tiến hành xác định khả năng sinh IAA của chủng Streptomyces dicklowii, trước tiên chúng tơi tiến hành xác định nhanh khả năng sinh IAA bằng phương pháp sử dụng thuốc thử Salkowski cải tiến: chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cấy vạch trên đĩa petri chứa mơi trường MT19 (ISP4 cĩ bổ sung tryptophan); sau 5 ngày nhận thấy vùng giấy lọc tương ứng với vết cấy xạ khuẩn xuất hiện màu hồng nhạt với thuốc thử Salkowski cải tiến, thuốc thử Salkowski cải tiến cĩ phản ứng màu hồng đặc trưng khi tiếp xúc với IAA. Điều này chứng tỏ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ sinh IAA. Để xác định rõ hơn khả năng sinh IAA của chủng Streptomyces dicklowii, chúng tơi tiến hành xác định hàm lượng IAA thơ trong dịch nuơi cấy bằng phương pháp so màu với tia UV ở λ = 530 nm. ● Lập đồ thị chuẩn: Sử dụng 5 ống nghiệm cĩ chứa dung dịch IAA với các độ pha lỗng theo cơng thức ở sơ đồ sau: 69 Ống nghiệm số: 1 2 3 4 5 6 Nồng độ IAA 10µg/ml 2ml Nồng độ IAA 20µg/ml 2ml Nồng độ IAA 30µg/ml 2ml Nơng độ IAA 40µg/ml 2ml Nồng độ IAA 50µg/ml 2ml Nước cất 2ml Thuốc thử Salkowki cải tiến 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml Sau đĩ đem các dung dịch nĩi trên so màu bằng tia UV ở bước sĩng λ = 530 nm; (Với ống nghiệm thứ 6 là ống đối chứng cho dung dịch nước cất) Đồ thị chuẩn được lập như sau: File Name: MINHHUY Created: 02:07 09/03/2005 Data: Original Wavelength: 530.0 Slit Width: 2.0 Multi-Point Working Curve Conc = k1 A + k0 k1 = 66.94 k0 = -0.162 Chi-Square: 0.01176 Number of Points: 6 Std Conc. Abs. 1 0.0000 0.000 2 10.000 0.178 3 20.000 0.299 4 30.000 0.420 5 40.000 0.575 6 50.000 0.784 ● Xác định hàm lượng IAA thơ trong dịch nuơi cấy: 70 Xạ khuẩn được nuơi cấy trên mơi trường dịch thể ISP4 cĩ bổ sung tryptophan trên máy lắc 200 vịng /phút trong 5 ngày, sau đĩ ly tâm lấy 2ml dịch trong, cho 8ml thuốc thử Salkowki cải tiến vào ống nghiệm chứa 2ml dịch nuơi cấy nĩi trên đem so màu bằng tia UV ở bước sĩng λ = 530 nm, từ đường chuẩn ta xác định được hàm lượng IAA thơ của dịch nuơi cấy xạ khuẩn là: 9,223µg IAA/ml mơi trường dịch nuơi cấy Từ kết quả trên cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ khả năng sinh IAA với hàm lượng khơng cao lắm. Tuy vậy với hàm lượng IAA trong dịch nuơi cấy ở độ pha lỗng nhất định cũng đã cĩ tác dụng kích thích sự sinh trưởng phát triển của cây trồng. Kết quả này đã được chúng tơi kiểm chứng ở mục 3.5.3. 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh là đặc tính của hơn 70% các lồi xạ khuẩn, các chất kháng sinh cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn cĩ khả năng kháng nấm gây bệnh cho người, động vật, cây trồng, một số chất kháng sinh cĩ khả năng kháng được các loại tuyến trùng sống ký sinh gây bệnh cho cây. Trong đĩ chi Streptomyces là chi xạ khuẩn sinh chất kháng sinh mạnh nhất và cũng là chi xạ khuẩn được tập trung nghiên cứu nhằm tìm những chất kháng sinh mới trong y học, nơng nghiệp và ứng dụng chúng trong các chế phẩm vi sinh vật … 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh: Để xác định hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii chúng tơi sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (theo Nguyễn Đăng Đức, 1986) với Streptomyces dicklowii nuơi trong mơi trường dịch thể MT3 (gồm nước chiết khoai tây và glucose), vi khuẩn kiểm định gram dương (Bacillus subtilic, Streptococcus sp.) và vi khuẩn gram âm (Echerichia coli) nuơi trên mơi trường kiểm định MPA (MT11). Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.5 và hình 3.6: 71 Bảng 3.5: Thử hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên vi khuẩn kiểm định. Đường kính vô khuẩn (mm) Vi khuẩn kiểm định D1 D2 D3 Hoạt tính kháng sinh ( – d)mm Bacillus subtilis 29 27 28 28 20 Streptococcus sp. 21 20 20 20,5 12,5 Echerichia coli 0 0 0 0 0 Chú thích: D: đường kích vơ khuẩn(mm). : đường kính vơ khuẩn trung bình, d: đường kính lỗ đục (8mm) Hình 3.6: Thử hoạt tính kháng sinh lên vi khuẩn kiểm định. Qua kết quả ở bảng 3.5, hình 3.6 cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ khả năng sinh kháng sinh. Kháng sinh của chủng này cĩ khả năng ức chế chọn lọc, cụ thể ức chế mạnh vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilic, Streptococcus sp. và khơng ức chế vi khuẩn thuộc gram âm Echerichia coli. 3.2.2. Lựa chọn mơi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii: Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn là nguồn cacbon, nitơ và các yếu tố khống vi lượng. vì vậy để cĩ một mơi trường thích hợp cho các nghiên cứu về sau chúng tơi tiến hành lựa chọn trên các loại mơi trường nuơi cấy với nguồn cacbon là glucose (mơi trường A-4, A- 72 4H, Gauze-2, PGA), tinh bột (mơi trường Gauze-1, A-12); nguồn nitơ là bột đậu tương (mơi trường A-4, A-4H, A-12), cao thịt và peptone (mơi trường Gauze-2) sau đĩ thử hoạt tính kháng sinh với vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilic. (các loại mơi trường khảo sát trên là dịch thể khơng cĩ agar) Kết quả được trình bày ở bảng 3.6, hình 3.7. Bảng 3.6: Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho chủng Streptomyces dicklowii. Vòng kháng sinh (mm) Môi trường pH sau Sinh khối (g/l) D1 D2 Hoạt lực kháng sinh ( - d)mm A - 4 6,5 17,2 25 25 25 17 A – 4H 6,8 20,1 21 22 21,5 13,5 A - 12 6,7 19 23 23,5 23,25 15,25 Gauze I 6,9 12,9 22 22 22 14 Gauze II 7,0 20,4 14 15 14,5 6,5 Nước chiết khoai tây 6,2 17 28 28 28 20 Chú thích: D: đường kích vơ khuẩn(mm). : đường kính vơ khuẩn trung bình, d: đường kính lỗ đục 73 0 5 10 15 20 25 A-4 A-4H A-12 Gauze 1 Gauze 2 MT17 MƠI TRƯỜNG LÊN MEN Si nh k hố i ( m g) 0 5 10 15 20 25 H oạ t l ự c kh án g si nh (m m ) Sinh khối Hoạt lực kháng sinh Biểu đồ 3.1: Sinh khối (mg) và hoạt tính kháng sinh (mm) của xạ khuẩn trên các loại mơi trường. Mơi trường A–4 Mơi trường A-4H Mơi trường A-12 Mơi trường Gauze-1 Mơi trường Gauze-2 Mơi trường PGA Hình 3.7: Lựa chọn mơi trường thích hợp tạo kháng