Phân loại các chủng vi khuẩn Bacillus bằng ph-Ơng pháp phân tích trình tự nucleotit của gien 16s-ARN - Tăng Thị Chính

63 28(1): 63-67 Tạp chí Sinh học 3-2006 phân loại các chủng vi khuẩn Bacillus bằng ph−ơng pháp phân tích trình tự nucleotit của gien 16s-ARN Tăng Thị Chính Viện Công nghệ môi tr−ờng Tr−ớc những năm 90 của thế kỷ XX, các chủng vi khuẩn(VK) đ−ợc phân loại chủ yếu bằng các khóa phân loại vi sinh vật truyền thống (khóa phân loại của Bergey’s manual); ng−ời ta dựa vào các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào, các đặc điểm sinh lý sinh hóa, khả năng sử dụng các nguồn đ−ờng của các chủng VK để phân loại. Tuy nhiên, việc phân loại bằng ph−ơng pháp này đôi khi không chính xác, đặc biệt là khi phân loại các chủng VK đến loài. Vì các chủng vi sinh vật cùng nhóm th−ờng có rất nhiều đặc điểm giống nhau. Vì vậy, ngày nay, ngoài việc sử dụng ph−ơng pháp phân loại truyền thống, các nhà khoa học còn kết hợp với ph−ơng pháp sinh học phân tử, phân tích trình tự của gien 16S-ARN để phân loại. I. ph−ơnng pháp nghiên cứu 1. Vi sinh vật Chủng E.coli XL1-Blue, plasmit PGEM-T* vectơ mua của h]ng Promega, Mỹ. 2. Hóa chất ProteinazaK, lysozym, clorophoóc, phênol, isoamyl-alcohol, propyl-alcohol,... (Sigma), plasmit extraction Kit và DNA extraction Kit (PREMATT II) của h]ng Bioneer-Mỹ. 3. Ph−ơng pháp a. Tách chiết ADN tổng số Hai chủng VK Bacillus subtilis HA401 và IBT012 đ−ợc nuôi lắc qua đêm trên môi tr−ờng LB lỏng, sau đó ly tâm để thu sinh khối và tách chiết ADN tổng số theo ph−ơng pháp tách chiết ADN [6]. b. Nhân đoạn gien 16S-ARN bằng kỹ thuật PCR Đoạn gien 16S-ARN của các chủng Bacillus đ−ợc nhân bằng kỹ thuật PCR nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự nh− sau: Mồi xuôi GF1: 5’-TAACACATGGAAGTC- GAACG-3’. Mồi ng−ợc GR1: 5’-GGTGTGACGGGC- GGTCTGTACAAG-3’. PCR đ−ợc thực hiện với chu trình nhiệt nh− sau: 94°C: 5’, (94°C: 1’, 55°C: 45’’, 72°C: 1’’) lặp lại 30 chu kỳ; 72°C: 8’. Sản phẩm PCR đ−ợc bảo quản ở 4°C và đ−ợc kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%, nhuộm bản gel với ethidium bromit và xem điện di đồ d−ới ánh sáng của đèn cực tím. Plasmit pGEM-T* đ−ợc mở vòng bằng enzym EcoRI, điểm cắt của enzym EcoRI sẽ mở vòng plasmit để gắn ADN. Các kỹ thuật tái tổ hợp và tách chiết ADN plasmit đ−ợc tiến hành theo Sambrook và cs. [6]. Việc xác định trình tự của gien đ−ợc tiến hành theo ph−ơng pháp chu kỳ nhiệt của h]ng Macrogen-Hàn Quốc. Đọc kết quả trình tự của gien trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI377DNA. Trình tự của gien đ−ợc so sánh tại ngân hàng dữ liệu gien NCBI và số liệu đ−ợc xử lý bằng phần mềm Blast của NCBI. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng Kit DNA PREMATT II của h]ng Bioneer. c. Gắn đoạn gien 16S-ARN vào plasmit pGEM-T* Sản phẩm PCR của gien 16S-ARN tinh sạch: X àl. Công trình đ−ợc hỗ trợ về kinh phí của Ch−ơng trình Nghiên cứu cơ bản. 64 Véctơ: pGEM-T: 1 àl; T4-ADN: 1 àl; đệm gắn: 5 àl; n−ớc khử ion thanh trùng: X àl. Tổng số: 10 àl, giữ ở 14°C trong 16 giờ. d. Biến nạp plasmit vào chủng E.coli XL1-Blue [5] Lấy 100 àl tế bào khả biến của chủng E.coli XL1-Blue bổ sung vào plasmit đ] gắn với sản phẩm 16S-ARN, ủ trong 30 phút ở 0°C. Sốc nhiệt ở 42°C trong 2 phút. Bổ sung 1 ml môi tr−ờng LB ampixilin. ủ trong 1 giờ ở 37°C, sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút; loại bỏ dịch, nhỏ 50- 100 àl/pêtri môi tr−ờng thạch LB-ampixilin-X- gal. Nuôi qua đêm ở 37°C. Tách các khuẩn lạc màu trắng để cấy vào môi tr−ờng LB-ampixilin nuôi lắc qua đêm, ly tâm để thu sinh khối. Tách plasmit bằng Plasmid Extraction Kit của h]ng Bioneer. e. Đọc trình tự nucleotit của đoạn gien 16S- ARN (3) Plasmit có gắn đoạn gien 16S-ARN đ−ợc gửi để đọc trình tự nucleotit tại h]ng Macrogen, Hàn. II. Kết quả nghiên cứu 1. Phân lập Bacillus −a kiềm sinh tổng hợp α-amylaza Các chủng Bacillus −a kiềm sinh tổng hợp α-amylaza đ−ợc phân lập từ các mẫu bùn ở ven biển Cát Bà và Hải Phòng, trên môi tr−ờng tinh bột có thành phần nh− sau: tinh bột tan (Sigma): 0,2%, tripton (Difco): 0,1%, cao men (Difco): 0,2%, KH2PO4: 0,2%, MgSO4.7H2O: 0,1%, CaCl2.2H2O: 0,1%, NaCl: 0,5%, Na2CO3: 1,0% (thanh trùng riêng), thạch: 1,5%, pH = 10, nuôi trong tủ ấm ở 37oC, trong 2 ngày. Chúng tôi đ] tuyển chọn đ−ợc một số chủng Bacillus −a kiềm sinh tổng hợp α-amylaza mạnh; hai chủng HA401 và IBT012 đ−ợc chọn để nghiên cứu phân loại. 2. Phân loại hai chủng Bacillus đã tuyển chọn theo khóa phân loại của Bergey’s manual 1989 [1] Kết quả nghiên cứu các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, tế bào, tính chất nuôi cấy của 2 chủng HA401 và IBT012 đ−ợc trình bày ở bảng 1 và bảng 2. Bảng 1 Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, tế bào của 2 chủng HA401 và IBT012 pH phát triển Chủng VK Màu sắc của khuẩn lạc Bề mặt của khuẩn lạc Kích th−ớc tế bào (àm) Nhuộm gram Tạo bào tử 5,7 6,8 HA401 trắng khô, nhăn 3,0 ì 1,0 gr + + - + IBT012 trắng khô, nhăn 2,3 ì 1,7 gr + + - + Bảng 2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của 2 chủng HA401 và IBT012 Hình thành axit từ: Thủy phân: Chủng VK Glucô Arabino Xylo Mannitol Tinh bột Gelatin Cazein HA401 + + + + + + + IBT012 + + + + + + + So sánh với các đặc điểm phân loại của các chủng chuẩn của các nhóm VK gram+ của khóa phân loại chi Bacillus của Bergey cho thấy 2 chủng VK đ] tuyển chọn đều thuộc chi Bacillus. 3. Tách chiết ADN tổng số, khuếch đại đoạn gien 16S-ARN bằng phản ứng PCR ADN tổng số của 2 chủng HA401 và IBT012 đ−ợc tách và làm sạch bằng ph−ơng 65 pháp tách chiết ADN ribôxôm của các chủng Bacillus. Sau đó, sử dụng cặp mồi GF1 và GR1 đ] thiết kế để khuếch đại đoạn gien 16S-ARN của các chủng Bacillus bằng phản ứng PCR với 50 ng ADN tách từ các chủng Bacillus. Trên điện di đồ, sản phẩm là 1 băng ADN có phân tử l−ợng khoảng 1300 bp nhìn thấy trên gel agaroza 1% (hình1). Hình1. Phổ điện di của sản phẩm PCR 16S- ARN M. thang ADN chuẩn; A, B. sản phẩm PCR của 2 chủng HA401 và IBT012. 4. Tách dòng và biến nạp plasmit vào chủng E.coli XL1-Blue Sau khi khuếch đại đoạn gien 16S-ARN bằng phản ứng PCR, sản phẩm PCR đ−ợc tinh sạch bằng kit DNA PREMATT II. Vectơ pGEM-T* của h]ng Promega là một loại vectơ plasmit tách dòng có kích th−ớc khoảng 2,961 kb, là một vectơ rất dễ gắn các sản phẩm ADN lạ. Phản ứng ghép nối của sản phẩm PCR 16S-ARN với vetơ pGEM-T* diễn ra ở 14oC, là nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzym T4-DNA ligaza gắn các điểm nối trên sợi ADN. Các khả năng bắt cặp có thể xảy ra trong quá trình ghép nối là một đoạn sản phẩm PCR nối với plasmit là tạo ra sản phẩm lai nh− mong muốn, hoặc các sản phẩm ADN tự nối với nhau, hoặc các plasmit tự nối với nhau. Sản phẩm lai này đ−ợc biến nạp vào chủng E.coli XL1-Blue [3, 4]. Các tế bào sau khi biến nạp, đ−ợc cấy trải trên đĩa thạch chứa môi tr−ờng LB có bổ sung ampixilin và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC và sau đó chọn các khuẩn lạc có màu trắng để cấy vào môi tr−ờng LB ampixilin lỏng, nuôi lắc trong 12 giờ ở 37oC. Ly tâm để thu sinh khối, sau đó tách plasmit bằng kit Plasmid Extraction. Plasmit tinh sạch đ−ợc cắt bằng enzym EcoRI để kiểm tra kết quả biến nạp. Kết quả biến nạp của các khuẩn lạc sau khi tách plasmit và cắt bằng enzym EcoRI đ−ợc kiểm tra bằng điện di agaroza 1,0% (hình 2). Kết quả kiểm tra khả năng gắn đoạn gien 16S-ARN vào plasmit của 2 chủng HA401 và IBT012 (1, 2 hình 2). Các plasmit trên đ] gắn đ−ợc đoạn gien 16S-ARN, nên khi cắt bằng enzym EcoRI cho 3 đoạn: đoạn có kích th−ớc lớn nhất 2961 bp là ADN của plasmit pGEM-T* khi đ−ợc mở vòng bằng EcoRI. Còn 2 đoạn ngắn hơn, tổng kích th−ớc của chúng t−ơng đ−ơng với sản phẩm PCR của đoạn gien m] hóa 16S-ARN khoảng 1,3 kb. Các plasmit có gắn đoạn gien 16S-ARN đ−ợc gửi đi để xác định trình tự nucleotit tại h]ng Macrogen của Hàn Quốc. Hình 2. Plasmit gắn đoạn gien 16S-ARN cắt bằng EcoRI của 2 chủng HA401 và IBT012 1, 2. plasmit + gien 16S-ARN bị cắt hoàn toàn; 3. plasmit không gắn đ−ợc gien 16S-ARN. 5. Xác định trình tự nucleotit Kết quả đọc trình tự của đoạn gien m] hóa 16S-ARN của 2 chủng HA401 và IBT012 đ−ợc đọc trên máy ABI377DNA và phân tích số liệu bằng phần mềm BLAST của NCBI, đ−ợc trình bày ở hình 3 và hình 4. A B M 2961 bp 1000 bp 500 bp 1 2 3 M 2961 bp 1000 bp 500 bp 66 BASE COUNT 356 a 336 c 434 g 283 t ORIGIN 1 cggccgcggg aattcgattt aacacatgca agtcgaacgg acagatggga gcttgctccc 61 tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa 121 ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa 181 ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 241 cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 301 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 361 gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 421 agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc 481 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 541 attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 601 ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 661 gtgtagcggt gaaatgcgta aagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 721 tctgtaactg acgcttagga accgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 781 agtccacccc ggtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 841 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 901 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 961 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1021 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1081 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1141 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1201 ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1261 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1321 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1381 gcccgtcaca ccaaatcact agtgaattc Hình 3. Trình tự nucleotit của đoạn gien 16S-ARN của chủng Bacillus IBT012 1 tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag 61 cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt gggattggct 121 taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc 181 ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca 241 ccttagagtg cccaactaaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac 301 ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgccc 361 ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 421 cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 481 tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca 541 ctaaggggcg gnaaaccccc taacacttag cactcatcgt ttacggcggg ggactaccag 601 ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgcttctca gcgtcagtta cagaccaaaa 661 gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctttacgc atttcaccgc tacacgtgga 721 attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag 781 ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag ccctttacgc ccaataattc 841 cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 901 tctggttagg taccgtcaag gtaccgccct attcgaacgg tacttgttct tccctaacaa 961 cagagcttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt cagactttcg 1021 tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc 1081 cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt cgccttggtg agccgttacc 1141 tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg gtagccgaag ccacctttta 1201 tgtttgaacc atgcggttca aacaaccatc cggtattagc cccggtttcc cggagttata 1261 ccagtcttac aggcaggcta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa catcagggag 1321 caagctccca tctgtccgtt cgacttgcat gtgttaaatc gaattcccgc ggcc Hình 4. Trình tự nucleotit của đoạn gien 16S-ARN của chủng Bacillus HA401 67 Từ kết quả đọc trình tự của gien 16S-ARN của 2 chủng Bacillus đ] tuyển chọn và so sánh với các dữ liệu của ngân hàng gien của NCBI- Mỹ cho thấy trình tự nucleotit của gien 16S- ARN của chủng IBT012 có 98% t−ơng đồng với trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus subtilis 2633 và trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng HA401 có 97% t−ơng đồng với trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus subtilis 2633. Từ kết quả trên, có thể khẳng định 2 chủng Bacillus −a kiềm HA401 và IBT012 phân lập đ−ợc đều thuộc loài Bacillus subtilis. Trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus subtilis HA401 đ−ợc công bố tại ngân hàng gien NCBI và có m] số AY279207. III. Kết luận 1. Hai chủng VK −a kiềm HA401 và IBT012 đ−ợc phân lập từ các mẫu bùn ở ven biển Cát Bà và Hải Phòng, có khả năng sinh tổng hợp α-amylaza kiềm. Kết quả phân loại bằng việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học cho thấy chúng thuộc chi VK Bacillus. 2. Kết quả phân tích trình tự của gien 16S- ARN của 2 chủng đ−ợc xử lý bằng phần mềm Blast của NCBI cho thấy trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng IBT012 có 98% t−ơng đồng với trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus subtilis 2633 và trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng HA401 có 97% t−ơng đồng với trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus subtilis 2633. Nh− vậy hai chủng VK −a kiềm HA401 và IBT012 đều thuộc loài Bacillus subtilis. 3. Trình tự nucleotit của gien 16S-ARN của chủng Bacillus HA401 đ−ợc công bố tại ngân hàng gien NCBI, có m] số: AY279207. Tài liệu tham khảo 1. Ara K. et al., 1992: Bisci. Biotechnol. Biochem. 56: 62-65. 2. Horikoshi K., 1971: Agric. Biol. Chem., 35: 1783-1791. 3. Igarashi K. et al., 1998: J. Appl. and Envir. Microb., 64(9): 3282-3289. 4. Phillip Gerhardt et al., 1994: Method for genaral and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, D. C. USA. 5. Jeffrey H. Miller, 1992: A short course in bacteriol genetics. A Laboraory Manual and Handbook for E. Coli and related, Cold Spring harbor laboratory press, USA. 6. Sambrook J., Fritsch E. F., T. Maniatis J., 1989: Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboraory. Taxonomy of alkalophilic bacillus strains by analysing the nucleotide sequence of the 16S-rNA gene Tang Thi Chinh Summary Two alkalophilic Bacillus strains HA401 and IBT012, which produced alkaline α-amylase, were isolated from the Catba and Haiphong sea sides. The identification by classical method showed that they belonged to the genus Bacillus. The nucleotide sequence of the 16S-RNA gene of these two strains showed that the one of the strain Bacillus IBT012 had 98% homology with the one of the strain Bacillus subtilis 2633 and the one of the strain Bacillus HA401 had 97% homology with the one of the strain Bacillus subtilis 2633. Therefore, these two isolated strains belonged to the species Bacillus subtilis. The nucleotide sequence of the16S-RNA gene of the strain Bacillus HA401 was submited to the NCBI genbank database with the genbank accession number: AY279207. Ngày nhận bài: 13-05-2005