Luận văn Khảo sát ảnh hưởng của tia gamma và chất điều hoà sinh trưởng ba đến sự biến đổi kiểu hình của cây gloxinia (sinningia speciosa) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** ÔNG THỊ HỒNG VÂN NỘI DUNG 1: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TIA GAMMA VÀ CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG BA ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI KIỂU HÌNH CỦA CÂY GLOXINIA (Sinningia speciosa) IN VITRO. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ TẠO CỦ IN VITRO CỦA CÂY GLOXINIA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NỘI DUNG 1: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TIA GAMMA VÀ CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG BA ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI KIỂU HÌNH CỦA CÂY GLOXINIA (Sinningia speciosa) IN VITRO. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ TẠO CỦ CỦA CÂY GLOXINIA IN VITRO LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. TRẦN THỊ DUNG ÔNG THỊ HỒNG VÂN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY *** 000 *** CONTENT 1: SURVEY EFFECTS GAMMA RADIATION AND BA GROWTH PROMOTING SUBSTANCE ON MUTATION OF GLOXINIA (Sinningia speciosa) IN VITRO. CONTENT 2: SURVEY TUBER IN VITRO OF GLOXINIA GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student PhD. TRAN THI DUNG ÔNG THỊ HỒNG VÂN TERM: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Trần Ngọc Hùng, cử nhân Lƣu Phúc Lợi, kỹ sƣ Nguyễn Thị Thu Hằng, cử nhân Trần Thị Bích Chiêu, kỹ sƣ Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Các bạn Trần Anh Tuấn, Huỳnh Chấn Khôn, Nguyễn Thị Ngọc Trang, Lê Hồng Thủy Tiên, Lê Đăng Khoa và các bạn khoa Nông Học thực hiện đề tài ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể lớp CNSH28 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Cám ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2006 Ông Thị Hồng Vân iv TÓM TẮT ÔNG THỊ HỒNG VÂN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. "NỘI DUNG 1: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TIA GAMMA VÀ CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG BA ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI KIỂU HÌNH CỦA CÂY GLOXINIA (Sinningia speciosa) IN VITRO. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ TẠO CỦ CỦA CÂY GLOXINIA IN VITRO" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Dung Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Đại Học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tƣợng cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) in vitro. Nội dung 1: Các chồi Gloxinia in vitro đƣợc tác động bởi: tác nhân vật lý (bức xạ γ), tác nhân hóa học (BA), tác nhân vật lý kết hợp với tác nhân hóa học để tạo những biến dị. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:  Đối với tác nhân vật lý thì liều xạ 2 krad, 3 krad và 4 krad cho kết quả tốt nhất, cây sinh trƣởng tốt và có biến dị.  Đối với tác nhân hóa học thì BA sử dụng ở nồng độ 4 mg/l có số chồi cao, cây tăng trƣởng tốt, có khả năng sống sót ngoài tự nhiên và tạo đƣợc 1 số biến dị.  Đối với tác nhân vật lý kết hợp với tác nhân hóa học thì liều xạ 2 krad và nồng độ BA từ 0 – 4 mg/l đƣợc xem là thích hợp để tạo biến dị, đồng thời cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn những cây khác. Nội dung 2 Các chồi Gloxinia in vitro đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng KH2PO4 thay đổi và cƣờng độ chiếu sáng thay đổi. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:  Đối với nồng độ KH2PO4 thay đổi thì KH2PO4 = 340 mg/l thích hợp nhất cho sự tạo củ ở cây Gloxinia in vitro.  Đối với cƣờng độ chiếu sáng thì cây Gloxinia in vitro sinh trƣởng tốt nhất, tỷ lệ tạo củ cao nhất, kích thƣớc củ và trọng lƣợng củ lớn nhất khi cây đƣợc chiếu sáng ở 3000 lux. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................ iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các hình ......................................................................................................... ix Danh sách các bảng ......................................................................................................... x Phần 1. Mở đầu .............................................................................................................. 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu .............................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3. Giới hạn đề tài .......................................................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................ 4 Nội dung 1 ....................................................................................................................... 4 2.1. Tình hình sản xuất hoa kiểng trên thế giới và ở Việt Nam ...................................... 4 2.1.1. Tình hình sản xuất hoa kiểng trên thế giới ................................................. 4 2.1.2. Tình hình trồng hoa cây cảnh ở Việt Nam ................................................. 5 2.2. Giới thiệu về cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) ............................................... 7 2.2.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 7 2.2.2. Đặc tính sinh học của họ Gesneriaceae ...................................................... 8 2.2.3. Đặc điểm của cây Sinningia speciosa ........................................................ 9 2.2.4. Điều kiện ngoại cảnh của cây Sinningia speciosa .................................... 11 2.2.5. Kỹ thuật trồng cây Sinningia speciosa ..................................................... 11 2.2.6. Kỹ thuật nhân giống cây Sinningia speciosa ........................................... 13 2.3. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................... 13 2.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 13 2.3.2. Ứng dụng .................................................................................................. 13 2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy đốt đơn thân ......................................................... 14 2.3.4. Phƣơng pháp nhân chồi bên ..................................................................... 14 2.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .............. 15 vi 2.4.1. Chất điều hoà sinh trƣởng ........................................................................ 15 2.4.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng ........................................ 16 2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................... 18 2.5.1. Muối khoáng ............................................................................................. 18 2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon .................................................................. 19 2.5.3. Vitamin ..................................................................................................... 20 2.5.4. Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định .......................................... 20 2.5.5. Độ pH và agar ........................................................................................... 21 2.5.6. Các điều kiện vật lý ......................................................................................... 21 2.6. Một số nghiên cứu về nhân giống cây hoa Gloxinia .............................................. 21 2.7. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật .................................. 22 2.7.1. Khái niệm bức xạ ...................................................................................... 22 2.7.2. Bức xạ Gamma ......................................................................................... 22 2.7.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) .................................................................. 22 2.7.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion hóa trên cơ thể sống .............................. 22 2.7.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa ................................................... 23 2.7.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ ................................. 24 Nội dung 2 .................................................................................................................... 26 2.8. Sơ lƣợc về sự tạo củ ............................................................................................... 26 2.8.1. Khái niệm về củ ........................................................................................ 26 2.8.2. Sự hình thành củ ....................................................................................... 26 2.8.3. Phân loại củ .............................................................................................. 27 2.8.4. Các chất dự trữ trong củ ........................................................................... 27 2.8.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố lên quá trình tạo củ ........................................ 27 Phần 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................... 32 Nội dung 1 ..................................................................................................................... 32 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................. 32 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 32 3.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 32 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu.............................................. 32 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy ................................................................. 32 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................. 33 vii 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ ................................................................... 33 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 34 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy .................................................................. 34 34.2. Nội dung thí nghiệm .................................................................................. 34 Nội dung 2 ..................................................................................................................... 41 3.5. Môi trƣờng nuôi cấy tạo củ in vitro ........................................................................ 41 3.6. Bố trí thí nghiệm tạo củ in vitro ............................................................................. 41 3.7. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 42 Phần 4. Kết quả và thảo luận ..................................................................................... 43 Nội dung 1 ..................................................................................................................... 43 4.1. Ảnh hƣởng của tia γ đến sự sinh trƣởng và biến đổi kiểu hình cây hoa Gloxinia in vitro ............................................................................................................................ 43 4.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro............................................................................................................. 49 4.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và bức xạ đến sự sinh trƣởng và biến đổi hình thái của cây hoa Gloxinia in vitro ........................................................... 53 4.4. Trồng thử nghiệm cây Gloxinia in vitro ngoài vƣờn ƣơm ..................................... 61 Nội dung 2 ..................................................................................................................... 69 4.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 lên sự tạo củ cây Gloxinia in vitro ............... 69 4.6. Ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu sáng đến sự tạo củ cây hoa Gloxinia in vitro ...... 71 Phần 5. Kết luận và đề nghị ........................................................................................ 73 5.1. Kết luận................................................................................................................... 73 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 73 Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 74 Tài liệu Tiếng Việt ......................................................................................................... 74 Tài liệu Internet ............................................................................................................. 74 Phụ lục .......................................................................................................................... 78 Phụ lục 1 ........................................................................................................................ 78 Phụ lục 2 ........................................................................................................................ 79 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA: N 6 -benzyladenine PBA: tetrahydro piranyl benzyl aldenin IBA: Indole-3-butyric acid Krad: đơn vị đo năng lƣợng hấp thụ ATP: Adenozintriphotphat TDZ: Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 1.1. Giới thiệu một số giống hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) ......................... 31 Hình 4.1. Ảnh hƣởng của liều xạ γ đến biến dị lá của cây Gloxinia in vitro ................ 48 Hình 4.2. Ảnh hƣởng của BA đến biến dị lá của cây Gloxinia in vitro ........................ 52 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của liều xạ γ và BA đến biến dị màu sắc lá của cây Gloxinia in vitro ............................................................................................................................ 59 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của liều xạ γ và BA đến biến dị hình dạng lá của cây Gloxinia in vitro ............................................................................................................................ 60 Hình 4.5. Các kiểu hình cây Gloxinia đƣợc xử lý tia gamma ở 30 ngày ngoài vƣờn ƣơm....................................................................................................................... 62 Hình 4.6. Kiểu hình của các cây Gloxinia đƣợc xử lý BA ở 30 ngày ngoài vƣờn ƣơm ................................................................................................................................ 64 Hình 4.7. Các kiểu hình cây Gloxinia đƣợc xử lý BA và tia gamma ở 30 ngày ngoài vƣờn ƣơm ............................................................................................................. 68 Hình 4.8. Các củ Gloxinia hình thành ở các nồng độ KH2PO4 khác nhau .................... 70 Hình 4.9. Các củ Gloxinia hình thành ở các cƣờng độ chiếu sáng khác nhau .............. 72 x DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến chiều cao của cây Gloxinia in vitro ... 43 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến số lá của cây Gloxinia in vitro ............. 44 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến tỷ lệ cây ra rễ của cây Gloxinia in vitro ................................................................................................................................ 45 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến tần số biến dị lá của cây Gloxinia in vitro ở 60 ngày sau chiếu xạ ...................................................................................... 47 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến chiều cao của cụm chồi Gloxinia in vitro ..................................................................................................... 49 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến hệ số nhân chồi của chồi Gloxinia in vitro ..................................................................................................... 50 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến tần số biến dị lá của chồi Gloxinia in vitro sau 60 ngày nuôi cấy .................................................................. 51 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của các yếu tố chất điều hòa sinh trƣởng BA, liều lƣợng tia γ đến chiều cao của cụm chồi Gloxinia in vitro ............................................................ 53 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của các yếu tố chất điều hòa sinh trƣởng BA, liều lƣợng tia γ đến hệ số nhân chồi của chồi Gloxinia in vitro .......................................................... 55 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của các yếu tố chất điều hòa sinh trƣởng BA, liều lƣợng tia γ đến tần số biến dị lá của chồi Gloxinia in vitro .......................................................... 57 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến sự sinh trƣởng của cây Gloxinia ngoài ƣờm ƣơm.............................................................................................................. 61 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến khả năng sống sót của cây Gloxinia khi đem trồng ngoài vƣờn ƣơm .................................................................................... .62 Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến sự sinh trƣởng của cây Gloxinia ngoài ƣờm ƣơm ........................................................................................ 63 Bảng 4.14. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến khả năng sống sót của cây Gloxinia ngoài vƣờn ƣơm ................................................................................ 64 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và liều xạ gamma đến sự sinh trƣởng của cây Gloxinia ngoài ƣờm ƣơm ......................................................... 65 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và liều xạ gamma đến xi khả năng sống sót của cây Gloxinia ngoài vƣờn ƣơm................................................... 67 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến sự tạo củ của cây Gloxinia in vitro sau 60 ngày nuôi cấy ......................................................................................... 69 Bảng 4.18. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo củ của cây Gloxinia in vitro sau 60 ngày nuôi cấy ..................................................................................... 71 xii 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Trong quá trình sống và làm việc, con ngƣời luôn tìm cách tạo cho mình niềm vui để giảm áp lực công việc và cuộc sống. Xã hội loài ngƣời ngày càng phát triển tiến bộ thì lại càng có nhiều căng thẳng và mâu thuẫn đƣợc sinh ra. Chính vì vậy, họ phải luôn sáng tạo để tìm ra những thú vui mới cho bản thân, gia đình và bạn bè. Một trong những thú vui lành mạnh đó là chơi hoa, thƣởng thức cái đẹp của hoa. Hoa, ngoài biểu tƣợng cho cái đẹp, nó còn là thông điệp tình yêu, niềm hạnh phúc và sức sống. Mỗi một loài hoa có một ý nghĩa riêng, một tiếng nói rất đặc trƣng. Hoa còn là cầu nối cho con ngƣời giúp họ bày tỏ cảm xúc dễ dàng hơn. Hƣơng thơm và màu sắc của chúng làm cho môi trƣờng sống trở nên đẹp hơn, không khí trong lành và khí hậu dịu mát hơn. Chúng còn tạo cảm giác hƣng phấn cho con ngƣời, giúp họ hăng say hơn trong công việc. Yêu hoa là một niềm đam mê chung của mọi ngƣời. Việc thƣởng thức chúng không giới hạn về tuổi, giới tính và biên giới. Ngoài những giá trị tinh thần, hoa còn có giá trị kinh tế rất cao. Hiện nay trên thị trƣờng nội địa, nhiều loại hoa mới xuất hiện bên cạnh các loài hoa truyền thống, một trong số đó có cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa). Loài hoa này có vẻ đẹp rất riêng và xuất xứ từ châu Phi. Nó đƣợc trồng trong chậu, hoa có nhiều màu sắc khác nhau, cánh nhung, viền trắng, phát triển tốt với điều kiện ánh sáng nhẹ và nơi thoáng mát. Do đó, cây hoa Gloxinia rất thích hợp để trang trí trong nhà, công ty, các khách sạn du lịch. Tuy cây hoa Gloxinia là giống mới du nhập vào thị trƣờng Việt Nam nhƣng cũng đƣợc các nhà nghiên cứu giống cây trồng ở Việt Nam tìm hiểu về kỹ thuật nhân giống và điều kiện sinh thái nhằm cung cấp nhiều loại hoa mới cho ngành hoa kiểng. Để tiến xa hơn nữa trong công tác giống, cung cấp số lƣợng lớn cây giống Gloxinia có màu sắc đặc biệt, mới lạ cho thị trƣờng hoa Việt Nam và nhu cầu sản xuất - xuất khẩu loại hoa này bằng cách áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật và bức xạ, đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của TS Trần Thị Dung, chúng tôi tiến hành đề tài: 2 "NỘI DUNG 1: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TIA GAMMA VÀ CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG BA ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI KIỂU HÌNH CỦA CÂY GLOXINIA (Sinningia speciosa) IN VITRO. NỘI DUNG 2: KHẢO SÁT SỰ TẠO CỦ IN VITRO CỦA CÂY GLOXINIA ". 1.2. Mục tiêu nghiên cứu  Mục đích  Nội dung 1 Nhằm xác định nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng BA và liều lƣợng chiếu xạ tia gamma để tạo cây giống Gloxinia có kiểu hình mới và đẹp. Tìm hiểu sự tăng trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi bị tác động bằng hoá chất và bức xạ trong phòng thí nghiệm và trong giai đoạn vƣờn ƣơm.  Nội dung 2 Nhằm xác định môi trƣờng thích hợp cho sự tạo củ của cây Gloxinia in vitro để cây tạo đƣợc nhiều củ, phục vụ cho công tác giống. Tạo đƣợc nguồn giống gọn nhẹ, dễ vận chuyển, có khả năng sống sót cao hơn cây con in vitro khi ra môi trƣờng tự nhiên.  Yêu cầu  Nội dung 1 Xác định đƣợc nồng độ BA, liều lƣợng tia gamma, sự kết hợp giữa BA và tia gamma để có những biến đổi kiểu hình đặc trƣng. Xác định đƣợc khả năng sống sót và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi đƣợc xử lý bức xạ hoặc hóa chất trong phòng thí nghiệm và trong giai đoạn vƣờn ƣơm.  Nội dung 2 Xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để cây Gloxinia in vitro tạo củ tốt nhất. 1.3. Giới hạn của đề tài Nội dung 1: - Chƣa thực hiện kiểm tra sinh học phân tử để xác định loại biến dị. 3 - Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chỉ chiếu xạ kết hợp với chất điều hòa sinh trƣởng BA, chƣa kết hợp với các hóa chất khác để tăng hiệu quả gây biến dị.  Nội dung 2: - Do thời gian hạn hẹp nên chƣa kết hợp đƣợc nhiều yếu tố ảnh hƣởng để tìm ra môi trƣờng thích hợp và tối ƣu cho sự tạo củ của cây Gloxinia in vitro. - Do không đủ chi phí nên đề tài chƣa kết hợp dùng hóa chất với bức xạ để kích thích cây ra củ tốt đồng thời thu đƣợc những biến dị mong muốn. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của tia gamma và chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia 2.1. Tình hình sản xuất hoa kiểng trên thế giới và ở Việt Nam 2.1.1. Tình hình sản xuất hoa kiểng trên thế giới Sản xuất hoa kiểng trên thế giới ngày càng phát triển và trở thành một trong các ngành thƣơng mại có lợi nhuận cao. Ƣớc tính số lƣợng hoa kiểng đƣợc tiêu thụ mỗi năm trên thế giới có giá trị khoảng 100 tỷ USD, mức tăng bình quân là 10%. Giá trị nhập khẩu của hoa kiểng ngày càng tăng. Các nƣớc nhập khẩu hoa kiểng nhiều là Đức, Anh, Pháp, Mỹ, …  Hà Lan: hàng năm, tổng kim ngạch xuất khẩu hoa tƣơi, chậu hoa cảnh, sinh vật cảnh và các loại cây cảnh của Hà Lan đạt hơn 6 tỷ USD. Chỉ riêng hoa Tulip đã có đến hơn 200 loại và đƣợc cung cấp rộng rãi cho các chợ hoa ở nhiều nƣớc trên thế giới. Hà Lan xuất khẩu chiếm 64,8% sản lƣợng hoa xuất khẩu trên thị trƣờng thế giới với các loại hoa: hoa hồng, hoa cúc, cẩm chƣớng, đồng tiền, huệ, phong lan, lay ơn [12].  Colombia: chiếm 12% thị trƣờng xuất khẩu thế giới với các loại hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, cúc.  Israel: chiếm 5,7% thị trƣờng xuất khẩu hoa với các loại hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, cúc, lay ơn.  Bungari: trồng nhiều hoa hồng.  Các nƣớc Nam Mỹ cũng có vị trí không nhỏ trong việc trồng và xuất khẩu hoa.  Trung Quốc: đã trở thành nƣớc sản xuất và tiêu thụ hoa cắt cành lớn nhất thế giới, với sản lƣợng hàng năm đạt 2,7 triệu tấn, trị giá 54 tỷ NDT (nhân dân tệ), chiếm 1/3 sản lƣợng toàn cầu. Diện tích trồng hoa ở Trung Quốc tính tới năm 2004 là 636.400 hecta. Xuất khẩu hoa của Trung Quốc đang tăng với tốc độ rất nhanh, đạt 260 triệu NDT mỗi năm. Hiện nay, theo thống kê, Trung Quốc có đến 53.000 doanh nghiệp chuyên về hoa, trong đó có 6.700 doanh nghiệp có doanh thu trên 5 triệu nhân dân tệ mỗi năm. Hoa đƣợc xuất khẩu sang các nƣớc châu Á, chủ yếu là Nhật Bản, Hàn 5 Quốc, Singapore, Nga và Thái Lan. Hiện Trung Quốc đã có trên 20.000 website của các vƣờn hoa cũng nhƣ nhà kinh doanh hoa chuyên nghiệp [13; 14].  Ấn Độ: có diện tích trồng hoa là 65.000 ha, giá trị đạt 2050 R.S/năm, trồng chủ yếu là hoa hồng, cúc, lay ơn, đồng tiền, huệ, nhài, Anthurium, Gypsophila, lan.  Tây Ban Nha là nƣớc xếp thứ năm ở châu Âu về sản xuất hoa (sau Hà Lan, Ý, Đức, Anh) [19]. Hiện nay, các nƣớc châu Á, đặc biệt là Đài Loan và Thái Lan đã sản xuất và cung cấp nhiều giống hoa mới cho thị trƣờng hoa kiểng trên thế giới nhƣng chủ yếu mới chỉ phục vụ thị trƣờng nội địa. Các nƣớc châu Á có diện tích hoa cây cảnh lớn là: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Srilanka, Thái Lan, Việt Nam, Inđônêsia, Philippin. 2.1.2. Tình hình trồng hoa cây cảnh ở Việt Nam Những năm gần đây, nghề trồng hoa phát triển khá mạnh ở nhiều địa phƣơng. Theo số liệu điều tra của Viện Di truyền Nông nghiệp, tại một số địa phƣơng, hoa là cây trồng cho thu nhập khá. Theo chƣơng trình phát triển sản xuất hoa của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tin từ Bộ Thƣơng mại cho biết, chính phủ thông qua chỉ tiêu xuất khẩu 1 tỷ bông hoa từ nay đến 2010. Theo đó, với tổng vốn đầu tƣ khoảng 5 triệu USD, diện tích trồng hoa của cả nƣớc sẽ tăng lên 8.000 ha, cho sản lƣợng 4,5 tỷ cành. Đạt đến quy mô diện tích này, nƣớc ta sẽ là cƣờng quốc sản xuất hoa. Hoa Việt Nam hoàn toàn đủ tiêu chuẩn xuất khẩu. Nếu xuất khẩu hoa lên tới con số 1 tỷ bông, doanh thu từ xuất khẩu hoa dự kiến sẽ đạt 60 triệu USD. Theo kế hoạch này, các vùng trồng hoa tập trung sẽ là Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Thanh Hóa, Tiền Giang, Sapa (Lào Cai), Đà Lạt, Đức Trọng (Lâm Đồng), Hải Phòng, Vĩnh Phúc, Thái Bình, Quảng Ninh… Hoa hồng sẽ chiếm 50% trong tổng số các loài hoa đƣợc trồng, hoa cúc chiếm 25% và hoa phong lan chiếm 10%. Hiện nay, cả nƣớc có trên 5.700 ha hoa, tập trung ở Hà Nội (khoảng 1.500 ha), Lâm Đồng (1.400 ha), Hải Phòng (730 ha), TP.HCM (700 ha)... Diện tích hoa lớn nhƣ vậy đã đáp ứng đƣợc nhu cầu ngày càng tăng của thị trƣờng, nhất là ở các thành phố lớn. Đồng thời, do sản xuất hoa cho thu nhập cao, bình quân đạt khoảng 130 triệu đồng/ha, nên nhiều địa phƣơng đã mở rộng diện tích hoa trên những vùng đất có tiềm năng. Hoa hồng vẫn chiếm 35 – 40 %, hoa cúc chiếm 25 – 30 %, còn lại là lay ơn, cẩm 6 chƣớng, thƣợc dƣợc, hoa huệ, đồng tiền, lan... Ƣớc tính, lƣợng hoa tiêu thụ ở mức hơn 1 triệu cành các loại trong một ngày. Hiện một số nƣớc trên thế giới nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản và các nƣớc Tây Âu có nhu cầu nhập khẩu hoa với số lƣợng lớn. Với 35 – 40 % tổng diện tích trồng hoa hồng, 25 – 30 % trồng hoa cúc, Việt Nam đang có cơ cấu hoa phù hợp với thị hiếu nhập khẩu của các nƣớc này. Tuy nhiên, đây là những thị trƣờng khó tính, đòi hỏi hoa phải có hình thức đẹp, chất lƣợng cao, cạnh tranh về giá (theo nguồn: Thông Tấn Xã Việt Nam, Nông nghiệp Việt Nam, [15; 16; 17; 19]). Nhật Bản có nhu cầu nhập khẩu hoa tƣơi rất lớn, mỗi năm khoảng 462 triệu USD. Trong khi đó, kim ngạch xuất khẩu hoa tƣơi của Việt Nam sang Nhật mới chỉ đạt khoảng 6,2 triệu USD/năm, chiếm 1,4 % thị phần. Ngƣời Nhật đặc biệt yêu thích sản phẩm hoa sen mà Việt Nam rất có thế mạnh. Bộ Thƣơng mại dự báo, nếu thâm nhập tốt, xuất khẩu hoa tƣơi của Việt Nam sang Nhật trong thời gian tới có thể tăng tới hơn 8 triệu USD/năm, đặc biệt là hoa phong lan và các loại hoa ghép cành [18]. Một số thông tin về các vùng trồng hoa nổi tiếng trong nƣớc:  Hà Nội - Các tỉnh phía Bắc Hà Nội là một trong các địa phƣơng có nghề trồng hoa từ lâu với các làng hoa nổi tiếng Ngọc Hà, Quảng An, Nhật Tân, Vĩnh Tuy và các vùng hoa mới nhƣ Tây Tựu, Thanh Trì, Lĩnh Nam… Hoa trồng ở Hà Nội khá đa dạng và phong phú, bao gồm cả các loại hoa có nguồn gốc nhiệt đới và ôn đới nhƣ: lan, hồng, cúc, cẩm chƣớng, lay ơn, huệ, loa kèn, thƣợc dƣợc, đồng tiền, trà mi và các loại hoa cây cảnh đặc trƣng của Hà Nội nhƣ đào và quất. Diện tích trồng hoa của Hà Nội và các vùng xung quanh có khoảng 1.500 ha, tập trung chủ yếu ở quận Tây Hồ, các huyện Từ Liêm, Đông Anh…và một số tỉnh khác. Hiện nay thành phố Hà Nội đặt mục tiêu phấn đấu đến năm 2010 phát triển trên 2.500 ha diện tích trồng hoa – cây cảnh. Thành phố Hải Phòng có trên 300 ha trồng hoa cung cấp một lƣợng đáng kể (chủ yếu là hoa lay ơn) cho thị trƣờng Hà Nội và một số loài hoa ƣa lạnh [19].  TP.HCM Thành phố sẽ qui hoạch ổn định vùng sản xuất hoa kiểng lên trên 1.200 ha vào năm 2010 để trở thành 1 trong 4 địa phƣơng có ngành sản xuất hoa kiểng hàng hóa lớn 7 nhất nƣớc với kim ngạch xuất khẩu dự kiến lên đến 20 triệu USD năm 2010, và hình thành các vùng chuyên canh cụ thể nhƣ vùng sản xuất mai vàng 120 ha ở các quận 2, 9, 12, Thủ Đức; vùng hoa lan, hoa cao cấp, cây cảnh rộng 280 ha ở các quận 12, 9, Gò Vấp, Thủ Đức và huyện Củ Chi; và vùng hoa nền 100 ha ở quận 12, Gò Vấp, huyện Hóc Môn và Bình Chánh. Tp.HCM sẽ đầu tƣ 14 tỷ 200 triệu đồng cho chƣơng trình phát triển hoa, cây kiểng và cá cảnh. Tp.HCM hiện có 700 ha trồng hoa, cây cảnh, với khoảng 1.400 hộ chuyên nghề trồng hoa các loại nhƣ mai vàng, lan cắt cành, bonsai... và xuất khẩu chủ yếu sang các quốc gia, vùng lãnh thổ ở châu Á nhƣ Đài Loan, Thái Lan, Singapore, ngoài ra còn xuất sang Mỹ [20; 21]. Đáng chú ý là huyện Củ Chi: là huyện có diện tích trồng hoa kiểng lớn nhất Tp.HCM với trên 130 ha. Ngoài ra huyện còn có 1 đơn vị đầu tƣ nƣớc ngoài với 110 ha hoa kiểng xuất khẩu, chủ yếu là cây các giống với giá trị xuất khẩu trên 1 triệu USD/năm. UBND.TpHCM đã phê duyệt đề án làng hoa kiểng Thủ Đức sẽ đƣợc thực hiện từ năm 2006 đến năm 2010, do UBND quận Thủ Đức làm chủ đầu tƣ. Địa điểm xây dựng làng hoa kiểng tại phƣờng Linh Đông 40 ha, phƣờng Hiệp Bình Chánh 25 ha và phƣờng Hiệp Bình Phƣớc 65 ha, quận Thủ Đức. Dự kiến đến năm 2010, diện tích trồng hoa kiểng sẽ là 130 ha, tăng 40% so với năm 2005 [22].  Đặc biệt là Đà Lạt, một trong những công ty nổi tiếng ở đây là Dalat Hasfarm, ngày càng khẳng định vị trí xuất khẩu hoa của Việt Nam trên thị trƣờng hoa thế giới. Hoa Việt Nam không còn xa lạ gì với các nƣớc xung quanh, và ngày càng đƣợc yêu mến nhiều hơn. 2.2. Giới thiệu về cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) 2.2.1. Vị trí phân loại Cây Gloxinia đƣợc phân loại nhƣ sau:  Ngành : Angiospermae  Lớp : Dicotyledoneae  Bộ : Polemoniales  Họ : Gesneriaceae  Giống : Sinningia  Loài : sinningia sp. 8 Đây là giống nhập nội vào nƣớc ta trong những năm gần đây và đã xuất hiện khá rộng rãi trên thị trƣờng. Cây Gloxinia có tên tiếng Anh là Temple bell, Canterbury bell. Ngoài ra, nó còn có một số tên thƣờng đƣợc gọi nhƣ: Florist Gloxinia, Gloxinia, Brazilian gloxinia. Ở Việt Nam, cây này đƣợc gọi là hoa Chuông và một vài tên gọi khác. Những tên gọi này không chính xác và rất dễ nhầm lẫn. Do đó, tên Gloxinia vẫn đƣợc dùng phổ biến ở thị trƣờng hoa của Việt Nam. 2.2.2. Đặc tính sinh học của họ Gesneriaceae  Đặc điểm phân loại học của họ Gesneriaceae Họ Gesneriaceae là một họ lớn với khoảng 150 giống và 3200 loài. Trong họ này, thành viên đƣợc biết đến nhiều nhất là African Violet. Họ này đƣợc đặt tên để tỏ lòng kính trọng nhà thực vật học Thụy Điển Konrad Gesner. Hầu hết gesneriads thƣờng đƣợc phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng thƣờng đƣợc tìm thấy ở những nơi đất mùn, khe đá và rừng phủ mùn. Những cây thƣờng gặp trong họ này là: African Violet, Florist Gloxinia (Sinningia speciosa), Lipstick Plant (Aeschynanthus), Goldfish Plant (Nematanthus), Cape Primrose (Streptocarpus), Flame Violet (Episcia) và Cupid's Bower (Achimenes) [23; 24; 26; 30]. Họ Gesneriaceae rất giống với họ Scrophulariaceae, Bignoniaceae và cả Orobanchaceae. Gesneriaceae đƣợc phân biệt dựa vào một số đặc điểm sau:  Họ Gesneriaceae: đính phôi trắc mô, không khí sinh.  Họ Orobanchaceae: đính phôi trắc mô, khí sinh rễ.  Họ Bignoniaceae: đính phôi trung trục, tâm bì với nhiều noãn, hột thƣờng có cánh và không có cán phôi cứng, to, thƣờng là cây thân mộc.  Họ Scrophulariaceae: đính phôi trung trục, tâm bì với nhiều noãn, hột không có cán phôi cứng, to, hột ít khí có cánh và ít khi dẹp. Về hình thái học và sinh lý học thì họ này bị phân thành hai phân họ chính: Cyrtandroideae và Gesnerioideae. Cyrtandra là giống lớn nhất và phổ biến, có khoảng 600 loài đƣợc phân bố ở Đông Nam châu Á, Malaysia, Indonesia, Philippine và các đảo của Thái Bình Dƣơng nhƣ là Hawaii. Nhiều giống trong họ Gesneriaceae đƣợc ƣa chuộng nhƣ là những cây hoa trong nhà. Gesneriads đƣợc tách thành 3 nhóm dựa vào có hay không có và cách nào mà thân của chúng đƣợc thay đổi thành bộ phận dự trữ: căn hành, thân củ, rễ sợi, nghĩa là chúng không có nhiều cấu trúc dự trữ (mặc dù tất cả gesneriads đều có rễ sợi). 9 Các nhà thực vật học có sự đóng góp to lớn trong việc phân loại họ Gesneriaceae, đó là George Bentham, Robert Brown, B.L. Burtt, C.B. Clarke, Olive M. Hilliard, Joseph Dalton Hooker, William Jackson Hooker, Elmer Drew Merrill, Harold E. Moore, Jr., Conrad Vernon Morton, Henry Nicholas Ridley, Laurence Skog, W.T. Wang, Anton Weber và Hans Wiehler. Nhiều nhà nghiên cứu đang tiếp tục thực hiện công việc này. Do đó, sự phân loại đặc điểm chung của giống loài trong họ này hay bị thay đổi. Tên của họ đƣợc đặt cho giống Gesneria. Các giống nằm trong họ Gesneriaceae: Achimenes, Aeschynanthus, Alsobia, Anodiscus, Besleria, Capanea, Chirita, Columnea, Episcia, Gasteranthus, Gesneria, Gloxinia, Koellikeria, Kohleria, Mitraria, Nematanthus, Pearcea, Saintpaulia, Seemannia, Sinningia, Streptocarpus [23; 24; 26; 30].  Đặc điểm hình thái của cây thuộc họ Gesneriaceae Hầu hết các loài là thân thảo lƣu niên hoặc thân bụi thấp. Một vài loài là những cây thân gỗ nhỏ, một số ít là cây leo, hiếm khi là cây thân gỗ lớn. Họ này có sự đa dạng rất lớn về kích thƣớc, hoa, bộ lá, màu sắc và hình dạng. Đây là một họ thực vật có tính đa dạng rộng và các cây phát triển dƣới điều kiện tƣơng tự nhau. Một vài gesneriads đƣợc lai giống khắp nơi, kết quả của hàng trăm cây trồng mà có thể từ các loài hoàn toàn khác nhau. Các cây nằm trong họ Gesneriaceae thì thân và lá có nhiều lông tơ. Cây có lá mọc đối xứng. Hoa đơn, lƣỡng tính, có hai cặp nhị so le với nhau trong đó có một nhị lép đính trên tràng hoa. Các bao phấn dính nhau thành từng cặp (chỉ có nhị dính) hoặc hợp sinh ở một số giống. Cây có một nhụy hoa, vòi nhụy mảnh mai, núm nhụy chia thành hai thùy. Trái thƣờng có vỏ chẻ ô hoặc phì quả. Hạt nhiều và nhỏ, thƣờng có nội nhũ (Trần Hoàng Ngọc Bích, 2004) [3]. 2.2.3. Đặc điểm của cây Sinningia speciosa  Đặc tính sinh học của giống Sinningia Sinningia là một giống thuộc họ Gesneriaceae. Sinningia có khoảng 65 loài thân thảo có củ sống lƣu niên, tất cả đều xuất hiện ở Trung Mỹ và Nam Mỹ, các loài nằm trong giống này tập trung nhiều nhất ở Nam Brazil. Loài đƣợc biết đến nhiều nhất là Sinningia speciosa. 10 Sinningia thƣờng mọc trên những hòn đá cuội hoặc vách đá và hầu hết đƣợc thụ phấn nhờ chim ruồi hoặc ong. Phần lớn các loài có hoa lớn, màu sắc sặc sỡ. Những loài có thân củ lớn nằm trong giống Sinningia là Sinningia leucotricha, S. iarae, S. lineata và S. macropoda [25].  Đặc tính sinh học của Sinningia speciosa  Giới thiệu về cây Gloxinia (Sinningia speciosa) Sinningia speciosa là tên khoa học của Gloxinia. Cây Gloxinia có xuất xứ từ Brazil. Cây Gloxinia đƣợc phát hiện đầu tiên ở Brazil vào năm 1785. Nó đƣợc đặt tên đầu tiên là Gloxinia vào năm 1817 bởi nhà chăm sóc vƣờn ƣơm ngƣời Anh tên là Conrad Loddiges. Lúc đó, nó đƣợc gọi là Gloxinia speciosa. Sau đó vài năm, nó xuất hiện với tên gọi là Ligeria speciosa. Đến năm 1825 loài hoa Gloxinia đƣợc đặt lại đúng theo tên giống, Sinningia, họ Gesneriaceae, tên chính xác là Sinningia speciosa. Một số cây Gloxinia hiện nay là kết quả của sự lai tạo từ hai loài hoa của Brazil: Sinningia speciosa và Sinningia maxima do những ngƣời làm vƣờn scottland thực hiện vào thế kỉ XIX. Mặc dù không chính xác nhƣng tên Gloxinia đã đƣợc mọi ngƣời sử dụng và nhớ đến cho đến ngày nay. Ngày nay, cây Gloxinia đã có mặt và đƣợc trồng rộng rãi nhiều nơi trên thế giới nhƣ Brazil, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Việt Nam… Cây Gloxinia tƣợng trƣng cho tính thanh lịch, sự tao nhã. Vì vậy, cây Gloxinia đƣợc trồng nhân dịp lễ Tạ Ơn, Noel, và Lễ Tình Nhân. Gần đây với sự ƣa chuộng rộng rãi, giống cây Gloxinia đƣợc trồng quanh năm. Ngƣời ta thƣờng dùng màu trắng của cây Gloxinia và màu đỏ của lá trạng nguyên để trang trí cho Giáng Sinh. Màu đỏ tía của Gloxinia kết hợp với hoa Thủy Tiên vàng hoặc Tulip trắng sẽ làm nổi bật ngày xuân [26; 27; 28; 29; 30].  Đặc tính sinh học cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) Cây Gloxinia là loại cây thân thảo lƣu niên, có hoa đẹp, chủ yếu đƣợc trồng làm cây kiểng. Chiều cao cây khoảng 15 – 30 cm, tán lá tỏa ra có đƣờng kính khoảng 22 – 33 cm [31; 36]. Cây có củ nằm dƣới mặt đất, lá rộng mọc sát đất, thân thấp, mọng nƣớc. Lá có hình vỏ sò, màu xanh lá cây đậm, dài 20 – 30 cm, có lông nhung mềm mƣợt, mặt duới của lá thƣờng hơi đỏ. Mép lá có dạng khía, răng cƣa. Cuống lá thuôn, 11 gân lá hình xƣơng cá, có nhiều lông tơ mịn. Lá mọc đối xứng từng cặp xen kẽ nhau. Ở mỗi nách lá thƣờng có chồi nách phát triển rất mạnh [29; 34; 37; 38]. Cây Gloxinia thƣờng nở hoa vào khoảng cuối mùa xuân đến đầu mùa thu. Đôi khi chúng ra hoa suốt năm. Thời gian hoa nở khoảng 10 ngày. Hoa Gloxinia có hình chuông, đƣờng kính khoảng 6 – 9 cm mọc đơn lẻ hay mọc thành từng cụm nhiều bông. Chúng có thể có hai màu với màu trắng ở giữa hoặc màu trắng ở ngoài mép cánh hoa. Hoa có nhiều màu: trắng, hồng, hồng da cam, cam, đỏ, xanh, tím, cho đến tím sẫm. Hoa có thể cánh đơn hoặc cánh kép, cánh hoa mềm mại, rìa cánh hoa trơn mịn hoặc gợn sóng, có phủ lớp lông mịn nhƣ nhung. Các cánh hoa xếp xen kẽ nhau. Cây Gloxinia còn đƣợc ngƣời yêu hoa gọi là "Nữ hoàng của hoa mùa hè" [31; 32; 33]. 2.2.4. Điều kiện ngoại cảnh của cây Sinningia speciosa  Về nhiệt độ Nhiệt độ ấm bình thƣờng trong phòng (18 – 24oC) là thích hợp cho sự tăng trƣởng của cây. Trong giai đoạn ra hoa, nhiệt độ lạnh hơn 16 – 18°C sẽ kéo dài sự ra hoa. Dự trữ củ ngủ đông ở nhiệt độ 7 – 15°C. Nhiệt độ dƣới 10oC gây tổn thƣơng ở lá và hoa. Nhiệt độ trên 27oC làm cho cây phát triển nhanh chóng. Đặt cây gần cửa sổ hƣớng đông và hƣớng nam. Cây thích nhiệt độ buổi tối vì mát mẻ, tốt nhất là thấp hơn nhiệt độ ban ngày [32; 39].  Ánh sáng Cây Gloxinia cần nhiều ánh sáng nhƣng nó không thích ánh sáng mặt trời trực tiếp. Ánh sáng trực tiếp sẽ làm cháy lá, trong thời kì nghỉ thì cây không cần ánh sáng. Quang kì tốt nhất cho cây Gloxinia khoảng 12 – 14 giờ sáng mỗi ngày. Ánh sáng thấp: 270 lux đƣợc chấp nhận với nhiệt độ mát 18oC nhƣng mức ánh sáng từ 0,5 – 1,1 klux hoặc cao hơn đƣợc đề nghị để phát triển số lƣợng núm hoa lớn nhất [31]. 2.2.5. Kỹ thuật trồng cây Sinningia speciosa  Nước tưới Cây Gloxinia không chịu đƣợc hạn và úng nƣớc. Nó ƣa độ ẩm trung bình và cần đƣợc tƣới thƣờng xuyên bằng nƣớc ở nhiệt độ trung bình, không quá lạnh. Giữ cho đất trồng ẩm nhƣng không quá ƣớt trong suốt thời gian cây tăng trƣởng. Không để cây bị ngập nƣớc. Không cho nƣớc lên đỉnh sinh trƣởng hoặc lên 12 trên lá. Nƣớc lạnh sẽ gây đốm lá. Khi cây ở giai đoạn nghỉ thì màu sắc lá sẽ bị héo đi, lúc đó giảm bớt lƣợng nƣớc tƣới. Dự trữ các củ ngủ đông thật khô ráo [39]. Nếu để cây bị ƣớt quá trong giai đoạn ra hoa sẽ làm cho các núm hoa bị rụng và có thể làm cây bị chết [31; 32]. Tuới nƣớc khi thấy bề mặt đất bị khô. Chậu dùng để trồng cây Gloxinia phải thoát nƣớc, thoáng. Tƣới mỗi ngày hay 2 lần/tuần phụ thuộc vào cƣờng độ ánh sáng và nhiệt độ trong nhà. Chỉ chắc chắn một điều là nƣớc phụ thuộc vào nhiệt độ trong phòng hoặc nhiệt độ biểu bì [34; 35].  Phân bón Bón phân cho cây khi chúng phát triển tốt, lớn và trong giai đoạn ra hoa. Phân bón có thể dùng khi tƣới, nhƣng tốt nhất là pha loãng 1/10 hoặc 1/4 của nồng độ yêu cầu [32]. Bón cho cây 2 tuần/lần nếu nồng độ loãng đi 1/2. Không bón phân trong giai đoạn cây ngủ đông [39].  Những vấn đề thường gặp Cây Gloxinia yêu cầu một khoảng thời gian nghỉ ngơi sau khi ra hoa. Ra hoa có thể ít nhất 2 tháng, nhƣng sau đó cây khô hạn ở bất cứ nơi nào. Khi cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông thì giảm lƣợng nƣớc tƣới, đặt cây nơi thoáng mát và khô ráo. Sau thời gian nghỉ (6 – 12 tuần) củ nên đƣợc trồng lại trong chậu sạch, tƣới nƣớc trở lại, đặt nơi ấm áp có ánh nắng mặt trời (nhƣng tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp) và chẳng bao lâu cây phát triển trở lại, sẵn sàng cho hoa tiếp. Hầu nhƣ phần phức tạp nhất là chăm sóc Gloxinia trong khoảng thời gian nghỉ [32; 34; 35]. Cắt bỏ những bông hoa bị héo để kích thích những nụ hoa phát triển tốt hơn [34]. Những bông hoa bị rụng, yếu là do độ ẩm và cƣờng độ ánh sáng trong nhà thấp hơn môi trƣờng bên ngoài. Cắt bỏ những cuống hoa đã hƣ và để cây nghỉ ngơi cho lần ra hoa tiếp. Khi những bông hoa héo thì ngừng bón phân và giảm nƣớc tƣới. Khi lá cây bị héo thì ngừng tƣới hoàn toàn. Lá sẽ bị quăn và rụng. Khi cây bắt đầu suy tàn, cắt bỏ những lá khô, để thân củ khô và trồng lại sau thời gian nghỉ của cây. Để giữ hoa tồn tại lâu, làm ẩm gián tiếp bằng máy làm ẩm không khí, nhƣng không phun sƣơng trên lá [35; 39]. Những bệnh thƣờng gặp: thối rữa củ, virus, giun tròn, rệp cây, nhện, sâu đục lá, bọ trĩ, sự thối rữa từ việc quá lạnh và ẩm ƣớt; mép lá rập cuộn lên trên cho biết không 13 khí khô; lá cháy sém, khô héo là do ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu lên lá; lá bị đốm là do tƣới phun sƣơng trên lá. Những cây thân củ thì trồng trên bề mặt đất trồng, chôn sâu quá sẽ làm cây thối rữa [34]. 2.2.6. Kỹ thuật nhân giống cây Sinningia speciosa  Nhân giống truyền thống Gloxinia đƣợc nhân giống truyền thống qua 2 cách: nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính.  Nhân giống hữu tính: Gloxinia thƣờng đƣợc nhân giống hữu tính bằng cách gieo hạt. Đây là phƣơng pháp nhân giống khá đơn giản và không cần nhiều trang thiết bị. Hạt đƣợc gieo vào giá thể thích hợp với độ ẩm trung bình. Sau 2 – 3 tuần, hạt nảy mầm thì chuyển sang chậu mới cùng loại đất thích hợp cho cây tăng trƣởng.  Nhân giống vô tính: Gloxinia đƣợc nhân giống vô tính bằng củ, cắt đốt, lá hay thân, xử lý với chất kích thích ra rễ rồi cấm vào đất. Tuy nhiên, phƣơng pháp cắt đốt và lá ít đƣợc sử dụng do tỉ lệ thành công thấp vì cây ít có rễ hoặc ra rễ yếu ớt.  Vi nhân giống Đây là phƣơng pháp nhân giống vô tính sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm. Sản phẩm cho ra những cây con từ mô và cơ quan của cây với chất lƣợng tƣơng đƣơng nhau, ít nhiễm bệnh. 2.3. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1. Khái niệm Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, đƣợc đặt trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 2.3.2. Ứng dụng Kỹ thuật này thể hiện một số ƣu điểm đã đƣợc ứng dụng:  Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh.  Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.  Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.  Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn.  Lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn.  Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. 14  Cải biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai.  Cố định nitrogen.  Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp.  Bảo quản nguồn gen quý. Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Các vấn đề cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamine, chất điều hòa sinh trƣởng, nguồn carbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng đƣợc hiểu sâu sắc hơn. 2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy đốt đơn thân Phƣơng pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ đƣợc kích thích cho tăng trƣởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Đây là phƣơng pháp tự nhiên nhất trong những phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro bởi vì có thể áp dụng đƣợc in vivo. Chồi đƣợc thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trƣởng. Chồi mới tăng trƣởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục đƣợc cấy chuyền đến khi đạt đủ số lƣợng chồi cần thiết thì chúng đƣợc cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh và đƣợc chuyển ra trồng trong đất. Nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy nốt đơn thân và cảm ứng rễ cho chồi đƣợc tiến hành trên cây măng tây (Galston, 1947, 1948; Gorter, 1965; Andreassen và Elison, 1967). Phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân đã đƣợc thực hiện thành công trên nhiều cây: khoai tây (Morel và Martin, 1955), lê (Quoirin, 1974), hoa hồng (Heliott, 1970)…Phƣơng pháp này cũng đƣợc áp dụng để nhân giống cà chua, dƣa chuột, cà tím (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. 2.3.4. Phƣơng pháp nhân chồi bên Về nguyên tắc phƣơng pháp này giống nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Điều khác nhau lớn nhất là trong phƣơng pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài của chồi, thân và thƣờng không cần đến cytokinin để phát triển. Trong phƣơng pháp nhân chồi bên, chồi ngọn đƣợc cô lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dƣới ảnh hƣởng của cytokinin với 15 nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ƣu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này đƣợc tiếp tục chuyển sang môi trƣờng mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục đƣợc tạo ra. Sau đó các chồi này đƣợc chuyển vào môi trƣờng ra rễ và đƣợc đƣa ra ngoài vƣờn ƣơm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Thực tế cả hai phƣơng pháp này thƣờng đƣợc áp dụng chung: đầu tiên, chồi tăng trƣởng bình thƣờng, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy để cảm ứng sự hình thành các chồi bên. Phƣơng pháp nhân giống bằng chồi bên đầu tiên đƣợc tiến hành ở cây hoa cẩm chƣớng bởi Hackett và Anderson (1967), sau đó là Adams (1972) và Boxus (1973, 1974) tiến hành trên cây dâu tây, Pierik và công sự (1973, 1974, 1975), Murashige và cộng sự (1974) tiến hành trên cây cúc đồng tiền (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên sự hình thành chồi bên  Nhu cầu về cytokinin rất khác nhau (loại và nồng độ cytokinin).  Nhu cầu cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn nuôi cấy.  Phối hợp auxin ở nồng độ thấp với cytokinin ở nồng độ cao.  Sự cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến.  Khi cấy chuyền nhiều lần, tốc độ tăng sinh chồi bị thay đổi. Ngoài ra còn có các phƣơng pháp nuôi cấy khác nhƣ: nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nuôi cấy mô sẹo, phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy protoplast - chuyển gen, nuôi cấy tế bào đơn bội. Tùy theo loại cây và mục đích mà ngƣời ta chọn lựa phƣơng pháp nuôi cấy thích hợp, đem lại hiệu quả cao. 2.4. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Chất điều hoà sinh trƣởng Chất sinh trƣởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dƣỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật. Về đại cƣơng các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trƣởng với nhau là điều cần thiết. 16 2.4.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng Hiện nay 5 nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc dùng: auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscisic, ethylen, các hợp chất phenol và các chất làm chậm sinh trƣởng.  Auxin  Auxin là một nhóm các chất đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực.  Chức năng của auxin - Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thƣớc của các cơ quan, ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào nhƣ cellolose, pectin… - Điều chỉnh tính hƣớng động của cây: quang hƣớng động và địa hƣớng động. - Gây ra hiện tƣợng ƣu thế ngọn đƣợc giải thích bằng việc ức chế sinh trƣởng của chồi bên khi auxin đƣợc vận chuyển từ ngọn xuống dƣới. - Kích thích sự hình thành rễ. - Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả. - Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù. Các phản ứng auxin và sự tăng trƣởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trƣng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993). 17 Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981) (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].  Cytokinin  Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh… Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. Cytokinin đƣợc sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô.  Đặc điểm của cytokinin Cytokinin đƣợc vận chuyển trong cây không phân cực nhƣ auxin, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng nhƣ các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là ure.  Các cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA.  Chức năng của cytokinin - Vai trò sinh lý đặc trƣng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. - Ảnh hƣởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi. - Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic. - Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. - Điều chỉnh hiện tƣợng ƣu thế ngọn. - Ảnh hƣởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hƣởng đến các quá trình trao đổi chất. - Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trƣởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bƣớu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). 18  Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng nhƣ trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhƣng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nƣớc. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì ngƣời ta thƣờng phối hợp cytokinin với auxin. Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10 mg/l) thƣờng cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và cộng sự, 1991) đồng thời cản sự tăng trƣởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin (Humphries, 1960) (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8]. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì tùy vào mẫu cấy và yêu cầu của từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc dùng một cách hợp lý. 2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1 Muối khoáng Muối khoáng đƣợc tế bào cây sử dụng cho sự tổng hợp phân tử hữu cơ hay xúc tác các phản ứng enzyme. Những ion của muối hòa tan đóng vai trò quan trọng trong sự vận chuyển phân tử, điều hòa thẩm thấu và duy trì điện thế của cây trồng. Nitơ, Phốtpho, Lƣu Huỳnh là thành phần của protein và acid nucleic. Magiê và một số vi lƣợng hình thành các phần chủ yếu của enzyme và cấu trúc tế bào, do đó xúc tác nhiều phản ứng khác nhau. Canxi và acid boric đƣợc tìm thấy chủ yếu trong vách tế bào và Canxi có vai trò quan trọng trong sự ổn định màng sinh học. Kali và Clo quan trọng trong sự điều hòa thẩm thấu, duy trì điện thế và hoạt tính enzyme. Các nguyên tố đa lƣợng: N, P, K, S, Ca, Mg. Các nguyên tố vi lƣợng: Fe, Cu, Mn, Co, B, I, Ni, Cl, Al (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8]. 19  Muối khoáng đa lượng Nhu cầu của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các muối khoáng đa lƣợng cần cung cấp là muối Nitơ, Phốtpho, Canxi, Kali… Nitơ thƣờng đƣợc dùng ở dạng Nitrat hoặc muối Amonium, Nitrit và Amoniac ít đƣợc dùng vì ở nồng độ thấp thì nó không đủ mà ở nồng độ cao thì nó gây độc. Phốtpho đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng mono hay dihydrogenphosphate Kali hay Natri. Một số dạng muối đƣợc sử dụng: NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4. Canxi đƣợc cung cấp dƣới dạng muối Canxi Clorua: CaCl2.H2O hoặc CaCl2.2H2O. Cây trồng hấp thụ Ca ở dạng Ca 2+ . Sự dƣ thừa hay thiếu hụt các chất khoáng đa lƣợng đều có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro, đôi khi còn có tác động đến hình thái của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [5; 8].  Muối khoáng vi lượng Welander (1977) đã đƣa ra những bằng chứng cho thấy tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng vi lƣợng có thể có ảnh hƣởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (Beasley và cộng sự, 1974). Sắt đƣợc đƣa vào môi trƣờng dƣới dạng muối vô cơ (FeCl3, FeSO4). Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu cho thấy sắt đƣợc dùng dƣới dạng Chelat kết hợp với Na2 – EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng từ từ ra môi trƣờng theo nhu cầu của mô thực vật. Sự hiện diện của nguyên tố Fe đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Legrand, 1975). Muối khoáng vi lƣợng thƣờng dùng là Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Cobalt (Co), Boron (B), Idodine (I), Molypden (Mo)… Một số muối vi lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng là ZnSO4, CuSO4, MnSO4, CoCl2, KI… 2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn carbon Trong môi trƣờng nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dƣỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đƣờng để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đƣờng thƣờng đƣợc sử dụng là sucrose, d – glucose, 20 d – fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon đƣợc sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trƣởng và yêu cầu thí nghiệm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. 2.5.3. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dƣỡng khác nhau. Thông thƣờng thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trƣởng và phát triển của chúng. Khi tế bào và mô đƣợc nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Vì vậy chỉ có một số vitamin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamine là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trƣởng của tất cả các tế bào. Các vitamin khác nhƣ Vitamin H, C, E đôi khi đƣợc thêm vào. Vitamin C đôi khi đƣợc dùng ở nồng độ cao nhƣ là một chất chống oxy hóa. Myo-inositol có ý nghĩa cải thiện các phản ứng in vitro và tăng trƣởng của cây trồng, đặc biệt ở cây đơn tử diệp (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. 2.5.4. Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trƣởng của mô. Các chất bổ sung có nhiều loại nhƣ: nƣớc cam, nƣớc cà chua, khoai tây, chuối… Hiện nay, chất bổ sung đƣợc dùng phổ biến là nƣớc dừa. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Nƣớc dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trƣờng với lƣợng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng nhƣ sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng nƣớc dừa, nhiều mô thực vật đƣợc nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi nhƣ nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nƣớc chiết cà chua… Nhƣng thông thƣờng các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Hoạt tính của nƣớc dừa khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế đƣợc BAP. Van Overbeek và csv (1941) cho thấy nƣớc dừa kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà độc dƣợc (Datura solanaceae) trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong nƣớc dừa giàu các 21 hợp chất nitơ dạng khử nhƣ các acid amin, ngoài ra nó còn chứa các hormone sinh trƣởng nhƣ cytokinin (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. Theo sự phân tích thành phần dinh dƣỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong nƣớc dừa có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin nhƣ thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đƣờng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. 2.5.5. Độ pH và agar pH của môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở khoảng 5,7 – 5,8. pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Các mô thực vật đều đƣợc cấy trên môi trƣờng agar. Agar thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 6 – 10 g/l, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8 g/l (Ribeiro và csv, 2000) (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002) [8]. 2.5.6. Các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cƣờng độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhƣng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cƣờng độ cao từ 3.000 - 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dƣỡng sang tự dƣỡng có khả năng quang hợp. Dƣới cƣờng độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhƣng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trƣờng đất. Chƣa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trƣờng cấy mô, nhƣng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn neon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trƣờng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thƣờng đƣợc giữ ở 25 – 28oC. 2.6. Một số nghiên cứu về nhân giống cây hoa Gloxinia  Đặng Phƣơng Trâm , nhân giống cây hoa sinningia bằng phƣơng pháp cấy mô  Nguyễn Thị Nhẫn, 1997 – 1999, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Gloxinia speciosa bằng phƣơng pháp nuôi cấy trong ống nghiệm  Nguyễn Quang Thạch, Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Xuân Trƣờng, Nguyễn Công Hoan, Nguyễn Thị Lý Anh, nghiên cứu nhân nhanh cây hoa chuông (Sinningia speciosa). 22 2.7. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật 2.7.1. Khái niệm bức xạ Bức xạ là sự phát năng lƣợng vào môi trƣờng dƣới dạng tia (tia bức xạ). Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đƣờng đi đều coi là tia ion hóa. Tia ion hóa đƣợc chia làm 2 loại:  Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ).  Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron …[45] 2.7.2. Bức xạ Gamma Bức xạ gamma là bức xạ điện từ. Nó đi đƣợc khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh. Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tƣơng tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp. Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tƣợng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể. Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lƣợng của bức xạ gamma theo hàm mũ [46; 47] 2.7.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) Coban (Co 60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học. Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị. Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn. Nguồn Co60 hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhƣng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao. Nhiều sinh vật sống (kể cả ngƣời) phải cần đến một lƣợng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại. Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12. Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ. Tên này do những ngƣời thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trƣờng [46]. 2.7.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion hóa trên cơ thể sống Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thƣơng bức xạ ở mức phân tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật. Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật có những biến đổi về hóa học. Khi bị tác động thì gene bị biến đổi. Tùy theo mức độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau. 23 Sau khi nhận năng lƣợng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:  Giai đoạn hóa lý Giai đoạn này rất ngắn (10-13 - 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa. - Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thƣơng các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thƣơng đến chức năng của tế bào. - Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nƣớc trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ nhƣ các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác. Khi số tế bào bị hại, bị chết vƣợt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hƣởng đến cơ thể sinh vật [45]. Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng nhƣ enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thƣơng, ngƣời ta gọi đó là những tổn thƣơng hóa sinh  Giai đoạn sinh học Nếu những tổn thƣơng hóa sinh không phục hồi đƣợc, những tổn thƣơng chuyển hóa dẫn đến những tổn thƣơng hình thái và chức năng. Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa. Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ. 2.7.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau:  Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tƣợng đột biến nhiễm sắc thể.  Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới. Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau:  Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi - Làm biến tính base trên DNA nhƣng không phá hủy DNA. 24 - Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide. - Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tƣơng xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA.  Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi - Tạo các chất tƣơng tự base của DNA. - Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base. - Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các base của DNA, gây rối loạn các phản ứng sinh lý, sinh hóa…  Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA - Làm rối loạn chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các base DNA, enzyme… - Làm biến đổi enzyme DNA polymerase  Ảnh hƣởng phối hợp Tác nhân gây ảnh hƣởng lên hệ thống sửa chữa DNA, làm tăng dần số đột biến tự nhiên. Bức xạ ion hóa gây tác động tổng hợp tạo các mảnh đứt DNA hoặc tạo sự khâu mạch giữa hai chuỗi polynucleotide gần nhau và đối với vài trƣờng hợp có thể gây sắp xếp lại trật tự trên nhiễm sắc thể. 2.7.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ  Ngoài nước Phƣơng pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra đƣợc những sinh vật biến dị nổi bật. Vì vậy năm 1925 đƣợc xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ. Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trƣởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng". Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi nhƣ: rút ngắn thời gian sinh trƣởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lƣợng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lƣợng hoa. Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lƣơng nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) đƣợc thành lập và tổ chức này đã công bố 1019 25 giống đột biến ở những cây có hạt đƣợc đƣa vào sản xuất và 523 giống đột biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau. Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn nhƣ: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau. Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dƣới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hƣởng của tia gamma trên thực vật.  Trong nước Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng đƣợc bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội. Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác nhƣ: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lƣơng thực và thực phẩm, các trƣờng Đại học nông nghiệp… tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tƣợng cây trồng khác nhau. Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60 trên đậu nành, thu đƣợc một số dòng có triển vọng nhƣ: M103, A75, A9 có năng suất cao. Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo đƣợc hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh trƣởng. Gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu đáng chú ý về ảnh hƣởng của tia gamma lên cây trồng nhƣ:  Nguyễn Văn Vinh (Viện Khoa Học Kỹ Thuật Hạt Nhân), 2002, nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến hom mía.  Hoàng Hƣng Tiến (Trung Tâm Kỹ Thuật Hạt Nhân), 2003, nghiên cứu phóng xạ kích thích hạt giống sắn mì.  Nguyễn Tiến Thịnh (Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt), 2004, nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu khoai tây giống.  Ở Viện Khoa Học Miền Nam, 2004, nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma.  Nguyễn Thị Lang và Lê Xuân Thám, 2004, nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa khô. 26  Một số nghiên cứu về chiếu xạ kích thích hạt giống hoa Kiết Tƣờng; ảnh hƣởng tia phóng xạ γ trên hoa Lily. Trần Thanh Hân, 2005, Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây khoai tây và ảnh hƣởng kích thích sinh trƣởng của bức xạ gamma liều thấp.  Lê Văn Hòa (Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ), 2006, nghiên cứu: "Xác điṇh khả năng gây đôṭ biến giống hoa lan cắt cành (dendrobium sp.) bằng colchicine và tia gamma" Hiện nay, các đề tài khoa học nghiên cứu về ảnh hƣởng của tia gamma đến kiểu hình, khả năng kích thích sinh trƣởng trên đậu nành, lúa, bắp và những cây trồng khác đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu. Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm áp dụng phƣơng pháp chiếu xạ tạo đột biến đa dạng trên hệ nuôi cấy in vitro nhiều cây trồng nhƣ khoai lang, khoai tây, dâu tằm, chuối, hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, địa lan, cúc... Tuy nhiên kết quả thu đƣợc còn hạn chế (theo tài liệu của Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 2002 – 2006). Nội dung 2: Khảo sát sự tạo củ in vitro của cây Gloxinia 2.8. Sơ lƣợc về sự tạo củ 2.8.1. Khái niệm về củ Các sản phẩm đồng hóa đƣợc sinh ra trong quá trình quang hợp, một phần giúp thực vật phát triển bằng cách tham gia vào cấu trúc, một phần đƣợc tích lũy trong các cơ quan dự trữ nhƣ trái, hột, thân, rễ. Đối với những thực vật có khả năng tạo củ thì các chất đồng hóa sẽ đƣợc tích lũy dƣới dạng củ. Vai trò của củ  Là cơ quan dự trữ carbon, nitrogen ở dạng có thể cung cấp cho các cơ quan khác khi cần thiết.  Là cơ quan nhân giống. Thực vật có các cơ quan dự trữ thƣờng là những cây lƣu niên. 2.8.2. Sự hình thành củ Sự hình thành củ có liên quan đến các quá trình trong sự sinh trƣởng của thực vật. Những yếu tố giúp kích thích tăng trƣởng cây thì có tác dụng ức chế quá trình tạo củ, còn các yếu tố ức chế sự tăng trƣởng của cây lại có thể có tác dụng kích thích hình thành củ ở những loài cây tạo củ (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. Vì vậy sự tạo củ của cây chịu 27 ảnh hƣởng bởi nhiều nhân tố: chế độ dinh dƣỡng, điều kiện môi trƣờng, sự phân chia các chất đồng hóa, kiểu gene… Quá trình hình thành củ bắt đầu vào cuối giai đoạn tăng trƣởng, khi các cơ quan dinh dƣỡng bắt đầu ngừng sinh trƣởng. Sau đó, sự phình to của củ xảy ra vào giai đoạn phát triển và sinh sản. Khi các cơ quan dinh dƣỡng ngừng sinh trƣởng hẳn, cơ quan sinh sản và dự trữ sẽ hoạt động mạnh. Do đó, nếu ức chế sự sinh trƣởng của các cơ quan sinh dƣỡng (rễ, lá) sẽ thúc đẩy quá trình hình thành củ hay các cơ quan dự trữ khác (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. 2.8.3. Phân loại củ Hiện nay, từ "củ" đƣợc mọi ngƣời dùng để gọi các cơ quan phình ra nằm dƣới mặt đất của thực vật. Củ là cơ quan dự trữ nằm dƣới mặt đất của thực vật có nhiều nguồn gốc phát sinh khác nhau. Mỗi loại củ đƣợc gọi tên theo quá trình phân hóa của thực vật. Chúng là cơ quan sống tiềm sinh và có khả năng sinh sản vô tính. Các cơ quan dự trữ nằm dƣới đất: hành (true bulb), thân hành (corm), thân củ (tuber), căn hành (rhizome), rễ củ (tuberous root), giả hành (pseudobulb hay false bulb) và một dạng phình to của trục hạ diệp nằm dƣới mặt đất (enlarged hypocotyls) [41; 42; 43; 44]. 2.8.4. Các chất dự trữ trong củ Củ thƣờng chứa nhiều tinh bột, 1 – 2 % trọng lƣợng khô protein. Nguồn protein này đóng vai trò to lớn trong quá trình tích trữ nitrogen, sulfur và carbon giúp thực vật có khả năng tái sinh thành cây mới. Ở củ có rất ít lipid, khoáng và vitamin (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. 2.8.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố lên quá trình tạo củ Chỉ có những loài có khả năng tạo củ mới tạo củ đƣợc và có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo củ. Ngoài các yếu tố môi trƣờng thì kiểu gene, tuổi sinh lý và tình trạng của cây cũng gây ra sự khác nhau đáng kể (Stephen, 1999).  Yếu tố môi trường A. Cƣờng độ ánh sáng Thông thƣờng, cƣờng độ ánh sáng cao sẽ giúp cây quang hợp mạnh, tạo nên nhiều sản phẩm biến dƣỡng di chuyển về các cơ quan dự trữ của cây (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật đều có ngƣỡng ánh sáng riêng, nếu vƣợt quá ngƣỡng này, không những cây không phát triển mà có khả năng quá trình quang 28 hợp bị ức chế, vì vậy mà khả năng sinh củ giảm (Bùi Trang Việt, 2000; Nguyễn Du Sanh, 1998) [6], [4]. Khi củ bị phơi trực tiếp ngoài ánh sáng, một số loài cây tạo củ cũng ngừng quá trình tăng trƣởng củ do tinh bột dự trữ trong phần nhu mô giảm, số lƣợng tế bào hóa mộc gia tăng (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. B. Quang kì Những nghiên cứu đầu tiên trong sự tạo củ đã chứng minh rằng sự hình thành củ đƣợc kích thích bởi điều kiện ngày ngắn. Thời gian chiếu sáng dài có thể gây ức chế sự hình thành, phát triển của củ, các tia củ dƣới mặt đất vì không phình to thành củ đƣợc nên sinh trƣởng tiếp tục hình thành chồi đâm lên trên mặt đất (gọi là sự sinh trƣởng lần thứ 2), (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. C. Nhiệt độ Nhiệt độ thấp đƣợc xem là yếu tố điều khiển sự tạo củ trong điều kiện quang kì ngày ngắn. Nhiệt độ lý tƣởng cho sự tạo củ là 15 – 18oC . Nhiệt độ về đêm rất quan trọng đối với việc hình thành củ vì có ảnh hƣởng sự tích lũy carbohydrate (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. D. Độ ẩm Đối với thực vật tạo củ, nƣớc rất cần cho quá trình hình thành củ. Trong điều kiện nƣớc bị hạn chế thì tƣợng tầng hoạt động kém, khả năng phân chia của tƣợng tầng giảm. Khi thiếu nƣớc, quá trình quang hợp của thực vật bị ức chế dẫn đến việc cản trở tổng hợp và tich lũy các chất đồng hóa, hạn chế sự phình to củ. Tuy nhiên, thực vật tạo củ chịu úng kém (trừ các loài sen, súng…). Khi bị úng, chất dự trữ trong củ (chủ yếu là carbohydrate) bị thủy phân nhanh, thu hút các vi sinh vật tấn công gây hại củ (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. E. Giá thể Cây tạo củ cần một loại giá thể tơi xốp, thấm nƣớc nhanh, giàu dinh dƣỡng và giữ ẩm tốt. Đất tƣơi xốp giúp tƣợng tầng dễ hoạt động phân chia tế bào tốt hơn đất kết quá chặt. Các loại đất sét, đất pha sét, đất giữ nƣớc làm giảm oxy trong đất. Do đó ngăn cản sự tạo củ (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. Các loại chất đông môi trƣờng đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm cũng đƣợc xem là giá thể cho sự phát triển của cây. Loại agar đƣợc dùng phổ biến hiện nay trong nuôi cấy in vitro là dạng agar thông thƣờng. Agar là một dạng polysaccharide tự nhiên, đƣợc chiết xuất từ tảo biển. 29 Agar làm đông môi trƣờng bằng các liên kết chéo [45]. Hoạt động của agar là tạo những lỗ hỏng để giữ các phân tử trong môi trƣờng. Tuy nhiên, nếu nhƣ sử dụng agar không tinh sạch thì sẽ làm môi trƣờng bị đục màu do các tạp chất gây nên. Agar có thể gây ra những tác động sinh lý lên mô thực vật (Dƣơng Công Kiên, 2003) [7].  Yếu tố hormone Sự hình thành củ đƣợc điều chỉnh bằng sự cân bằng hormone trong cơ thể. Vai trò của các phytohormone lên quá trình này nhƣ sau:  Auxin kích thích sự hình thành rễ. Chúng đƣợc sản sinh ở chồi ngọn và lá non, vận chuyển hƣớng gốc và kích thích sự hình thành rễ do nó kích thích phân chia tƣợng tầng, giúp sự phân hóa mô dẫn (libe và mạch mộc) nhƣng ức chế sự hình thành củ (Nguyễn Du Sanh, 1998; Vũ Văn Vụ, 2003) [4; 5].  Gibberellin đƣợc tổng hợp trong lá và vận chuyển không phân cực. Nó kích thích sự sinh trƣởng của tia củ và kích thích sự phình to của củ.  Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trƣởng của rễ và chồi, nó đƣợc hình thành trong lá, ức chế sự hình thành của tia củ và kích thích sự phình to của củ. ABA tác động lên quá trình tạo củ là do tác dụng kích thích hấp thu sucrose trong các tế bào, làm tăng áp suất thẩm thấu (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].  Cytokinin là chất cảm ứng sự hình thành chồi. Chúng đƣợc hình thành trong rễ, kích thích sự hình thành tia củ và sự phình to của củ.  Nguồn khoáng Các chất khoáng N, P, K cần thiết cho quá trình tạo củ do chúng tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp trong quá trình đồng hóa và là thành phần của các hợp chất hữu cơ, các enzyme…  Nitrogen (N) là nguyên tố cần thiết cho sự tăng trƣởng các cơ quan sinh dƣỡng nhƣ thân, lá. Khi thiếu N, lá sẽ chuyển sang màu vàng nhạt, thân cây thấp. Trong giai đoạn tạo củ, không cung cấp N thƣờng xuyên, sự tạo củ xảy ra chậm. N trực tiếp tác động lên sự phát triển của cơ quan sinh dƣỡng là nơi xảy ra quá trình đồng hóa tạo các chất dự trữ. Nhƣng hàm lƣợng N cao sẽ kích thích phát triển cơ quan sinh dƣỡng và làm giảm lƣợng tinh bột dự trữ do có sự cạnh tranh giữa cơ quan tích trữ và nguồn cung cấp chất dự trữ (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. 30 N tồn tại trong tế bào thực vật chủ yếu là ở dạng amin và các dạng khử NH2 + . Vì vậy cần phải có quá trình amin hóa để chuyển N ở dạng NO3 - sang dạng N khử dễ sử dụng. Quá trình amin hóa đƣợc tóm tắt nhƣ sau: NO3 - → NO2 - → NH4 + Các enzyme tham gia quá trình này là: nitrate reductase, nitrit reductase, hiponitrit reductase và hidroxylamin reductase. Các enzyme này thuộc dạng các flavoprotein và có sự tham gia hoạt hóa của các chất vi lƣợng nhƣ Mo, Cu, Mn, Mg (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. N tồn tại ở dạng NH4 + có thể chuyển hóa tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất và là thành phần cấu tạo nên những hợp chất hữu cơ. Các N hữu cơ có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất và giúp thực vật hấp thu các loại muối khoáng.  Postassium (K): K giúp cho cây hấp thu N dễ dàng hơn. K còn giúp vận chuyển nƣớc trong quá trình tạo các bó mạch trong thân và vận chuyển các chất dinh dƣỡng trong cây và đồng thời nó còn giúp cho sự tích trữ chất dinh dƣỡng.  Phosphore (P): P đƣợc cho là nguyên tố điều khiển sự phát triển của rễ, rễ nhánh, tạo hoa, kết hạt và phát triển cơ quan dự trữ. Các loài cây tạo củ có nhu cầu P tƣơng đối cao. P thƣờng tham gia vào quá trình điều hòa năng lƣợng và hoạt hóa sự tổng hợp tinh bột.  Nguồn sucrose Trong nuôi cấy mô in vitro, thực vật không có khả năng tự dƣỡng do chức năng của lục lạp bị khiếm khuyết. Vì vậy cần bổ sung nguồn C bên ngoài để đáp ứng nhu cầu phát triển của tế bào. Thông thƣờng sucrose đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô, vì nó đƣợc sử dụng nhanh hơn và tập trung ở rễ nhiều hơn, cho nên môi trƣờng có chứa sucrose thích hợp sẽ giúp tạo củ tốt hơn. 31 Hình 1.1: Giới thiệu một số giống hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) 32 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của tia gamma và chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cây hoa Gloxinia (Sinningia speciosa) in vitro. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ 02/2006 – 08/2006 Địa điểm: tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn neon, vĩ xốp … Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, đĩa petri, đĩa cấy, đèn cồn … 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy Mẫu cấy: chồi đơn của cây hoa Gloxinia in vitro, chiều cao của mỗi chồi khoảng 1 cm do Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cung cấp. Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,2 atm trong thời gian 25 phút. Điều kiện nuôi cấy:  Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux  Nhiệt độ 26 2oC  Ẩm độ 60 – 80 %  Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày Ngoài vƣờn ƣơm: các cây Gloxinia in vitro đƣợc trồng trong vĩ xốp và đặt trên kệ. Phía trên đƣợc che phủ lƣới đen để giảm cƣờng độ ánh sáng và ngăn mƣa. Tƣới phun sƣơng 4 lần/ngày trong giai đoạn chuyển từ ống nghiệm ra môi trƣờng ngoài vƣờn ƣơm. Khi cây phát triển tốt thì chuyển sang những chậu lớn, trồng và chăm sóc cho đến khi cây ra hoa, tƣới gốc 1lần/ngày. 33 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS của Murashige và Skoog (1962) Các chất khác:  Đƣờng sucrose: 30 g/l  Agar: 7 g/l  Nƣớc dừa: 15% pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 Các chất điều hòa sinh trƣởng: BA (N6-benzyladenine), IBA (Indole-3-butyric acid) 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ Đồng vị phóng xạ nhân tạo Co60 đƣợc sử dụng là nguồn phát xạ gamma tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt. Tia γ có bản chất sóng điện từ, có bƣớc sóng ngắn nên không bị lệch hƣớng khi đi qua điện từ trƣờng và có khả năng đâm xuyên rất lớn. Trong xử lý phóng xạ ngƣời ta dùng hai đơn vị để đo lƣờng phóng xạ:  Rad: để đo năng lƣợng hấp thụ. Rad là liều lƣợng bức xạ bất kỳ loại nào tạo ra trong môi trƣờng vật chất mà tia phóng xạ đó truyền qua.  Roentgen (Г): đơn vị dùng để đo năng lƣợng phát xạ của tia ion có bản chất là sóng điện từ (tia X và tia γ) Tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt vào thời điểm tiến hành thí nghiệm cuối tháng 02/2006 máy phát xạ tia γ hoạt động với các thông số sau: Suất liều phát xạ tại chỗ:  Liều đỉnh : 17 rad/giây.  Liều trung tâm : 22,86 rad/giây.  Liều đáy : 21,4 rad/giây. Liều dịch chuyển  Liều đỉnh : 321 rad  Liều trung tâm : 471 rad  Liều đáy : 421 rad Dung tích buồng chiếu là 4 lít. Chiều cao 24 cm, đƣờng kính 15 cm. Các ứng dụng và tính toán đƣợc dựa trên cơ sở suất liều phát xạ trung tâm và liều dịch chuyển trung tâm, công thức tính thời gian xử lý mẫu nhƣ sau: 34 liều cần chiếu (rad) – liều dịch chuyển (rad) T = Suất liều phát xạ (rad/giây) T: thời gian mẫu cần đƣợc xử lý (giây) 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Pha môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA khác nhau tùy theo từng nghiệm thức. Môi trƣờng đƣợc cho vào bình nƣớc biển có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút. 3.4.2. Nội dung thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Thiết kế thí nghiệm: Cây hoa Gloxinia in vitro (đã đƣợc cấy chuyền 3 tháng), mẫu cấy là các chồi đơn cao 1 cm. Gồm 4 thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của tia đến sự sinh trƣởng và biến đổi kiểu hình cây hoa Gloxinia in vitro. Mẫu cấy tạo cây hoàn chỉnh trong môi trƣờng chiếu xạ MS có chất điều hòa sinh trƣởng IBA Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA đến biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro. Mẫu cấy nhân chồi trong môi trƣờng MS có chất tạo cây điều hòa sinh trƣởng BA hoàn chỉnh. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và bức xạ đến sự sinh trƣởng và biến đổi hình thái của cây hoa Gloxinia in vitro. Mẫu cấy nhân chồi trong môi chiếu xạ tạo cây hoàn trƣờng MS có chất điều chỉnh hòa sinh trƣởng BA Thí nghiệm 4: Trồng thử nghiệm cây Gloxinia in vitro ngoài vƣờn ƣơm Cây con ở thí trồng thử nghiệm ngoài trên giá thể trên giá thể nghiệm 1, 2, 3 vƣờn ƣơm trấu đất sạch 35 Ghi chú: Giai đoạn xử lý phóng xạ : các cây Gloxinia in vitro (sau 15 ngày cấy chuyền từ bình giống ban đầu) đƣợc đem đi xử lý phóng xạ với các liều lƣợng khác nhau. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: cây sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng MS có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng IBA (Indole-3-butyric acid) 2 mg/l.  Thí nghiệm 1: "Ảnh hưởng của tia đến sự sinh trưởng và biến đổi kiểu hình cây hoa Gloxinia in vitro" Các chồi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có IBA 2 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh. Sau đó các cây con đƣợc đem chiếu xạ từ 1 – 4 krad. Vì vậy thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức liều xạ và 1 nghiệm thức đối chứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Nghiệm thức Liều lƣợng tia Gamma (krad) Thời gian xử lý (giây) 1.1 (đối chứng) 0 0 1.2 1 23,14 1.3 2 66,89 1.4 3 110,63 1.5 4 154,37 Ghi chú: Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng IBA (2 mg/l). Số nghiệm thức: 5 Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 4 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 180 Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia in vitro sau khi chiếu tia , gồm các chỉ tiêu sau:  Tỷ lệ cây sống sót Tỷ lệ sống sót = (số cây sống sót / số mẫu đã cấy)*100 Theo dõi sau ngày xử lý, đếm số cây sống sót.  Tỷ lệ cây ra rễ Tỷ lệ ra rễ = (số cây ra rễ / tổng số cây đã cấy)*100 36 Thời gian ra rễ (ngày) tính từ ngày cấy chuyền đến khi 50% cây ra rễ. Đếm số lƣợng cây ra rễ ở từng nghiệm thức từ ngày cấy chuyền đến khi ra vƣờn ƣơm.  Sự tăng trƣởng chiều cao Chiều cao cây (cm) Số lá trên cây (Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm)  Ảnh hƣởng của liều lƣợng chiếu xạ đến đặc điểm hình thái - Lá: Quan sát và đếm số lƣợng cây bị biến dị lá. Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về: + Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân: Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân. Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân / số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm tất cả các thay đổi trên thân nhƣ: thân to hay nhỏ, thân cao hay thấp, màu sắc của thân … (Khảo sát trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm).  Thí nghiệm 2: "Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA đến biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro" Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung BA gồm 2, 4, 6, 8 mg/l. Do đó, thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức: 4 nghiệm thức BA và 1 nghiệm thức đối chứng. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Nghiệm thức BA (mg/l) 2.1 (đối chứng) 0 2.2 2 2.3 4 2.4 6 2.5 8 37 Ghi chú: môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng MS có bổ chất điều hòa sinh trƣởng BA với các nồng độ khác nhau. Số nghiệm thức: 5 Số bình của 1 nghiệm thức: 3 Số mẫu trong 1 bình: 4 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu cấy: 180 Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi cấy chuyền, gồm các chỉ tiêu sau:  Hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi = tổng số chồi hình thành / tổng số mẫu đã cấy.  Tần số biến dị Tần số biến dị = (số chồi bị biến dị / số mẫu đã cấy)*100  Ảnh hƣởng của nồng độ chất kích thích sinh trƣởng BA đến đặc điểm hình thái - Sự tăng trƣởng chiều cao - Chiều cao cụm chồi (cm) (Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm) - Lá: Quan sát và đếm số lƣợng chồi bị biến dị lá. Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về: + Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân: Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân. Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân /số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm những thay đổi: + Thân to hay nhỏ + Thân cao hoặc thấp + Màu sắc của thân 38  Thí nghiệm 3: "Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và bức xạ đến sự sinh trưởng và biến đổi hình thái của cây hoa Gloxinia in vitro" Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung BA gồm 2, 4, 6, 8 mg/l. Sau thời gian 15 ngày nuôi cấy, tiến hành chiếu xạ từ 1 – 4 krad. Vì vậy thí nghiệm bao gồm 21 nghiệm thức, trong đó 20 nghiệm thức kết hợp liều xạ với nồng độ BA và 1 nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức BA (mg/l) Liều lƣợng tia Gamma (krad) Thời gian xử lý (giây) 3.1 (ĐC) 0 0 0 3.2 0 1 23,14 3.3 2 1 23,14 3.4 4 1 23,14 3.5 6 1 23,14 3.6 8 1 23,14 3.7 0 2 66,89 3.8 2 2 66,89 3.9 4 2 66,89 3.10 6 2 66,89 3.11 8 2 66,89 3.12 0 3 110,63 3.13 2 3 110,63 3.14 4 3 110,63 3.15 6 3 110,63 3.16 8 3 110,63 3.17 0 4 154,37 3.18 2 4 154,37 3.19 4 4 154,37 3.20 6 4 154,37 3.21 8 4 154,37 Số nghiệm thức: 21 39 Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu trong mỗi bình: 4 Tổng số bình: 189 Tổng số mẫu: 756 Chỉ tiêu theo dõi: 15 ngày theo dõi 1 lần, theo dõi sự sinh trƣởng và sự biến đổi kiểu hình của cây hoa Gloxinia in vitro sau khi cấy chuyền và sau khi chiếu tia , gồm các chỉ tiêu sau:  Hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi = tổng số chồi hình thành / tổng số mẫu đã cấy  Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ sống sót = (số cụm chồi còn sống / tổng số mẫu đã cấy)*100  Tần số biến dị Tần số biến dị = (số chồi bị biến dị / số mẫu đã cấy)*100  Ảnh hƣởng của nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng BA đến đặc điểm hình thái - Sự tăng trƣởng chiều cao - Chiều cao cụm chồi (cm) (Đếm trƣớc khi đem cây từ bình nuôi cấy ra vƣờn ƣơm) - Lá: Quan sát và đếm số lƣợng cây bị biến dị lá Tần số biến dị lá = (số cây bị biến dị lá / số cây quan sát)*100 Biến dị lá gồm những thay đổi về: + Màu sắc + Hình dạng + Kích thƣớc - Thân: Quan sát thân cây và đếm số cây bị biến dị thân Tần số biến dị thân = (số cây bị biến dị thân /số cây quan sát)*100 Biến dị thân gồm những thay đổi: + Thân to hay nhỏ + Thân cao hoặc thấp + Màu sắc của thân 40  Thí nghiệm 4: "Trồng thử nghiệm cây Gloxinia in vitro ngoài vườn ươm" Các cây con ở mỗi thí nghiệm 1, 2, 3 đƣợc đem trồng với giá thể đất sạch. Thiết kế các thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, theo nghiệm thức của các thí nghiệm trƣớc. a) Thí nghiệm 4a: các cây con đƣợc xử lý với tia γ từ 0 – 4 krad đƣợc bố trí nhƣ sau: Số nghiệm thức: 5 Số cây ở mỗi nghiệm thức: 4 Tổng số cây đem trồng: 60 b) Thí nghiệm 4b: các cây con đƣợc xử lý BA với 0, 2, 4, 6, 8 mg/l đƣợc bố trí nhƣ sau: Số nghiệm thức: 5 Số cây ở mỗi nghiệm: 4 Tổng số cây đem trồng: 60 c) Thí nghiệm 4c: các cây con đƣợc xử lý với BA ( 0, 2, 4, 6, 8 mg/l) và tia γ ( 0 – 4 krad) đƣợc bố trí nhƣ sau: Số nghiệm thức: 21 Số cây ở mỗi nghiệm thức: 4 Tổng số cây đem trồng: 252 Các chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu đƣợc theo dõi 10 ngày/lần, gồm:  Tỷ lệ sống sót. Tỷ lệ sống sót = (số cây sống sót / tổng số cây đem trồng)*100  Các chỉ tiêu về hình thái: lá, thân,…  Chiều cao cây (cm): đƣợc tính từ gốc đến đỉnh sinh trƣởng.  Tốc độ ra lá = (số lá lần sau - số lá lần trƣớc) / thời gian giữa 2 lần quan sát.  Kích thƣớc lá (cm): chiều dài và chiều rộng lá.  Tần số biến dị lá.  Tần số biến dị thân. 41 Nội dung 2: Khảo sát sự tạo củ in vitro của cây Gloxinia Đối tƣợng nghiên cứu, thời gian và địa điểm nghiên cứu, thiết bị dụng cụ dùng trong nghiên cứu, mẫu cấy đều giống nội dung 1. 3.5. Môi trƣờng nuôi cấy tạo củ in vitro Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS của Murashige và Skoog (1962). Các chất khác:  Đƣờng sucrose: 30 g/l hoặc 50 g/l  Agar: 7 g/l pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 3.6. Bố trí thí nghiệm tạo củ in vitro Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Thiết kế thí nghiệm: Cây hoa Gloxinia in vitro (đã đƣợc cấy chuyền 3 tháng), mẫu cấy là các chồi đơn cao khoảng 1 cm. Gồm 2 thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 lên sự tạo củ cây Gloxinia in vitro Mẫu cấy nuôi trong môi trƣờng MS có nồng độ khảo sát sucrose 5 % có nồng độ KH2PO4 thay đổi Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu sáng đến sự tạo củ cây hoa Gloxinia in vitro. Mẫu cấy nuôi trong môi trƣờng MS chiếu sáng với cƣờng độ có sucrose 3% khác nhau  Thí nghiệm 1: "Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 lên sự tạo củ cây Gloxinia in vitro". Các chồi Gloxinia in vitro đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS 5% sucrose, nồng độ KH2PO4 thay đổi. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ sau: Nghiệm thức Hàm lƣợng KH2PO4 (mg/l) 1.1 85 1.2 170 1.3 340 1.4 680 42 Ghi chú : môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có sucrose 5% Số nghiệm thức: 4 Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 5 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: 180  Thí nghiệm 2: "Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự tạo củ cây hoa Gloxinia in vitro". Các chồi Gloxinia đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS 3% sucrose và đƣợc chiếu sáng ở 1000 – 5000 lux. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ sau: Nghiệm thức Cƣờng độ chiếu sáng (lux) 2.1 1000 2.2 2000 2.3 3000 2.4 4000 2.5 5000 Ghi chú : môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có sucrose 3% Số nghiệm thức: 5 Số bình của mỗi nghiệm thức: 3 Số mẫu cấy trong mỗi bình: 5 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 225 Chỉ tiêu theo dõi ở cả 2 thí nghiệm:  Chiều cao cây (cm): đo trƣớc khi cắt củ.  Tỷ lệ tạo củ (%) = (số cây tạo củ/ số mẫu đã cấy)* 100  Trọng lƣợng củ (g): đo trọng lƣợng tƣơi  Đƣờng kính củ (cm): đo khi củ còn tƣơi. 3.7. Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHICS 7.0. 43 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của tia gamma và chất điều hòa sinh trưởng BA đến sự biến đổi kiểu hình của cây Gloxinia 4.1. Ảnh hƣởng của tia γ đến sự sinh trƣởng và biến đổi kiểu hình cây hoa Gloxinia in vitro  Chiều cao cây Các cây con in vitro đƣợc chiếu xạ từ 1 – 4 krad. Tia gamma có thể kích thích hoặc không kích thích cây tăng trƣởng chiều cao tùy theo sự tƣơng tác của nó trên mô. Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến chiều cao của cây Gloxinia in vitro Nghiệm Thức Liều lƣợng tia γ (krad) Chiều cao trung bình (cm) Trƣớc chiếu xạ 1 ngày Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 1,21a 1,53a 2,09ab 1.2 1 1,28 a 1,81 b 2,75 d 1.3 2 1,23 a 1,83 b 2,45 c 1.4 3 1,29 a 1,85 b 2,27 bc 1.5 4 1,26 a 1,52 a 1,95 a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về chiều cao của cây Gloxinia in vitro trƣớc khi đem chiếu xạ là do sai số ngẫu nhiên. Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê là do ảnh hƣởng của liều chiếu xạ. Ở thời gian 30 ngày sau khi chiếu xạ:  Liều xạ γ 1 krad cho thấy phù hợp với sự tăng trƣởng chiều cao của cây.  Nghiệm thức liều chiếu xạ 4 krad có chiều cao cây thấp nhất. Cây đối chứng và cây đƣợc chiếu xạ 4 krad không có sự khác biệt về chiều cao trên phƣơng diện thống kê học. Giai đoạn này phát hiện đƣợc liều xạ thích hợp với cây Gloxinia. Kết quả khảo sát cho thấy liều lƣợng tia γ càng tăng thì chiều cao cây không tăng theo và chúng thực sự có tác động lên sự phát triển của cây. 44  Số lá của cây Các cây con in vitro đƣợc chiếu xạ ở 1 – 4 krad. Số lá trung bình trên một cây không tỷ lệ thuận với sự tăng liều lƣợng tia γ. Tia γ có tác dụng kích thích hoặc ức chế việc ra lá của cây còn phải tùy thuộc vào mức độ gây ổn thƣơng trên mô, gene của nó. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến số lá của cây Gloxinia in vitro Nghiệm Thức Liều lƣợng tia γ (krad) Số lá trung bình/cây Trƣớc chiếu xạ 1 ngày Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 11,61a 16,44b 27,00b 1.2 1 11,67 a 34,17 e 38,00 c 1.3 2 12,83 a 27,17 c 39,78 c 1.4 3 11,78 a 30,5 d 38,72 c 1.5 4 11,33 a 14,28 a 20,06 a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy số lá trung bình của cây Gloxinia in vitro trƣớc khi đem chiếu xạ 1 ngày ở các nghiệm thức có sự sai số ngẫu nhiên; ở thời gian 15 và 30 ngày sau khi chiếu xạ giá trị trung bình của các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. 30 ngày sau chiếu xạ  Số lá trung bình trên cây ở nghiệm thức liều xạ 1, 2, 3 krad cao hơn nghiệm thức đối chứng và giữa chúng không có sự khác biệt về mặt thống kê.  Nghiệm thức liều xạ 4 krad có số lá trên cây thấp nhất. Liều xạ thấp nhất giúp cây ra lá nhiều hơn. Vì với liều lƣợng đó không gây chết mô cây, không làm ức chế quá trình trao đổi chất của cây và có tác động kích thích cây phát triển. Liều xạ cao hơn có thể gây ra ức chế khi vừa tiếp xúc với mô cây. Do cây có những phản ứng phòng vệ khi có tác nhân tác động vào nó. Những phản ứng đó có thể có lợi cho cây hoặc ngƣợc lại tùy theo loại tác nhân. Bức xạ liều cao sẽ gây ra những biến đổi mạnh trên gene, tế bào cây trồng làm thay đổi đột ngột các phản ứng trong cây dẫn đến ức chế. 45  Tỷ lệ cây ra rễ Khi không có sự tác động của tia γ thì cây ra rễ chậm. Cây đƣợc chiếu xạ 1 krad ra rễ sớm nhất. Kết quả khảo sát liều chiếu xạ γ ảnh hƣởng đến tỷ lệ cây ra rễ nhƣ sau: Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ γ đến tỷ lệ cây ra rễ của cây Gloxinia in vitro Nghiệm Thức Liều lƣợng tia γ (krad) Tỷ lệ cây ra rễ (%) Sau chiếu xạ 15 ngày 30 ngày 1.1 (ĐC) 0 41,67a 83,33a 1.2 1 100,00 b 100,00 b 1.3 2 47,22 a 100,00 b 1.4 3 52,78 a 100,00 b 1.5 4 38,89 a 100,00 b Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy tỷ lệ cây ra rễ của cây Gloxinia in vitro có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê là do ảnh hƣởng của liều lƣợng bức xạ γ. 15 ngày sau chiếu xạ  Nghiệm thức liều xạ 1 krad là thích hợp cho sự ra rễ của loài hoa này (100% cây ra rễ).  Các nghiệm thức liều xạ 2, 3, 4 krad khi mới tác động vào cây trồng, chúng không kích thích cây mau chóng ra rễ. Có thể do liều xạ cao, đột ngột tác động làm cho các tế bào bị tổn thƣơng nên cần thời gian phục hồi. 30 ngày sau khi chiếu xạ  Tất cả những cây đƣợc chiếu xạ đều ra rễ. Nghiệm thức liều xạ 1, 2, 3, 4 krad cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Sự chiếu xạ làm giảm nồng độ auxin tự do (Skoog, 1935) và kìm hãm quá trình biến đổi tryptophan thành heteroauxin (Gordon, 1956). Khi chiếu xạ với liều lƣợng cao hơn thông thƣờng thì sự giảm hàm lƣợng auxin mang tính chất thuận nghịch. Do đó hàm lƣợng auxin trong thí nghiệm không đƣợc quan tâm. Tỷ lệ ra rễ của cây Gloxinia in vitro chỉ do yếu tố liều xạ ảnh hƣởng. 46  Tỷ lệ cây sống sót Ở thời điểm khảo sát là 30 ngày sau khi chiếu xạ, tất cả các cây trồng đều sống sót. Tất cả các nghi