Khóa luận Nuôi cấy mô cây dầu mè (jatropha curcas l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học GVHD: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH NGUYỄN VĂN HẠNH Khóa: 2003-2007 iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn:  Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có đƣợc ngày hôm nay.  Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.  Thầy Trần Văn Minh đã tận tình hƣớng dẫn, ân cần chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Cô Bùi Thị Tƣờng Thu, Thạc sĩ Trần Văn Định, Kỹ sƣ Khƣu Hoàng Minh, các anh chị nhân viên cùng các bạn sinh viên thực tập tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã gắn bó, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua. Sinh viên thực hiện Nguyễn Văn Hạnh iv TÓM TẮT NGUYỄN VĂN HẠNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)”. Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới tại TP.HCM. Thời gian thực hiện tháng 2 đến tháng 8 năm 2007. Hạt của cây dầu mè có chứa một lƣợng lớn chất béo (37%) là nguồn nguyên liệu để sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel). Đây là nguồn nguyên liệu mới an toàn cho môi trƣờng, hiệu quả kinh tế và có khả năng tái sinh đƣợc. Nguồn năng lƣợng này hứa hẹn sẽ thay thế cho thủy điện, dầu diesel, dầu hỏa, khí hóa lỏng, than, củi … Dầu của cây còn sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, chất nhuộm và dầu thơm. Lá, vỏ và rễ cây chứa những chất có đặc tính dƣợc liệu. Cây có thể phát triển rất tốt trên những vùng đất khô cằn và không đòi hỏi nhiều sự chăm sóc của con ngƣời. Do đó, cây dầu mè rất thích hợp trở thành cây công nghiệp mang lại hiệu quả kính tế cao cho ngƣời dân. Và để đáp ứng cho nhu cầu giống, chúng tôi thực hiện đề tài “Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)”. Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả sau:  Mẫu hạt cây dầu mè đƣợc vô trùng tốt nhất với Natri hypochlorit 15% trong thời gian 60 phút, mẫu chồi cây dầu mè đƣợc vô trùng tốt nhất trong Natri hypochlorit 10% thời gian 45 phút.  Môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là môi trƣờng MS.  Môi trƣờng thích hợp để nhân chồi cây dầu mè là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).  Môi trƣờng thích hợp cho sự ra rễ là môi trƣờng MS bổ sung IBA nồng độ 0,3 mg/l. v SUMMARY NGUYEN VAN HANH, Nong Lam University, HCMC. August, 2007. “TISSUE CULTURE OF PHYSIC NUT (Jatropha curcas L.)” Guided teacher: A.Professor Dr. TRAN VAN MINH This thesis was completed at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology, Institute of Tropical Biology from Frebruary to August 2007. Seeds of Jatropha contain a large amount of fat (37%), are a source to produce biodiesel. This is an environmentally safe, cost effective and renewable source of non-conventional energy as a promising substitute to hydel power, diesel, kerosene, LPG, coal, firewood etc. Jatropha oil can be used to produce washing agent, dye and perfume. Leave, bark and root contain medicinal substance. Jatropha can grow in arid and semi-arid condition and does not require so much human care. So jatropha is suitable to become an economic industrial plant. To produce breed of jatropha we’ve done this thesis “Tissue culture of physic nut (Jatropha curcas L.)” Some results of this thesis:  Seeds are steriled with Natri hypochlorit 15% for 60 min. axillary nodes with Natri hypochlorit 10% for 45 min.  Salt basal culture medium is MS.  Suitable medium for bud proliferation is MS supplemented with BA (0,1 mg/l) and IBA (0,01 mg/l).  Medium for rooting is MS complemented IBA (0,3 mg/l). vi MỤC LỤC Phần Trang LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv SUMMARY ............................................................................................................. v MỤC LỤC ............................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................... xi Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đăt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu.................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................ 2 1.2.2. Yêu cầu .............................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Nhân giống cây trồng in vitro ..................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 3 2.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................... 3 2.1.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................ 5 2.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro ...................................................... 5 2.1.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy ....................................... 5 2.1.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy .......................................... 6 2.1.4.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh .......................................................... 6 2.1.4.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh .............................................. 6 2.1.4.5. Giai đoạn 5: Đƣa cây ra đất ...................................................... 7 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô ............................. 7 2.1.5.1. Mô nuôi cấy .............................................................................. 7 2.1.5.2. Vô trùng trong nuôi cấy ............................................................ 7 2.1.5.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................... 9 vii 2.1.5.4. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................... 12 2.1.5.5. Vai trò của chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy .......... 12 2.1.5.6. Ảnh hƣởng của pH và Agar .................................................... 14 2.2. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ........................................ 16 2.2.1. Vị trí phân loại ................................................................................. 16 2.2.2. Đặc điểm sinh học ............................................................................ 17 2.2.2.1. Mô tả ....................................................................................... 17 2.2.2.2. Sinh thái .................................................................................. 18 2.2.3. Công dụng ........................................................................................ 19 2.2.3.1. Nhựa mủ ................................................................................. 19 2.2.3.2. Lá, vỏ và rễ cây ....................................................................... 19 2.2.3.3. Hạt và dầu ............................................................................... 19 2.2.3.4. Dầu mè và nguyên liệu sinh học ............................................. 20 2.2.4. Nhân giống ....................................................................................... 22 2.2.4.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền ........................................ 22 2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại .......................................... 23 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................. 25 3.2. Vật liệu ...................................................................................................... 25 3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm ....................................................................... 25 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................. 25 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy......................................................................... 25 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro............................................................... 27 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 27 3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu ............................................................ 27 3.3.2. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 28 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè ...... 28 viii 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro ........................ 29 3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè. ............................................................... 30 3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro .................... 31 3.3.2.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro ................ 32 3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................... 33 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 34 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh ........................ 34 4.1.1. Vô trùng mẫu hạt ............................................................................. 35 4.1.2. Vô trùng mẫu chồi ........................................................................... 36 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè in vitro ...................................................................................................... 39 4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè ................................................................................................ 41 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè .......................................................................................... 43 4.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro ................................... 45 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 47 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 47 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 47 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................ 48 PHẦN PHỤ LỤC ...................................................................................................... a ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : Benzyl adenine Ki : Kinetin 2,4-D : Dichlorophenory acetic acid HgCl2 : Thủy ngân chlorite IAA : -indole acetic acid IBA : -indole butyric acid NAA : -naphtalen acetic acid Cw : Nƣớc dừa (Coconut water) Suc : Đƣờng sucrose CRD : Completely randomized design Ctv : Cộng tác viên CV : Hệ số biến động LSD : Sai số nhỏ nhất MS : Murashige – Skoog, 1962 WPM : Lloy – Mc Cown, 1980 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ......................................................... 16 Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè ............................................................................ 18 Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè .................................................................. 18 Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật ............................................................... 22 Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nảy từ các hạt vô trùng .............................................. 38 Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây dầu mè đƣợc vô trùng phát sinh chồi ..................... 38 Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản ....... 40 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............................ 42 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè................ 44 Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro ...................................................... 44 Hình 4.7: Cây dầu mè in vitro ............................................................................... 46 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè .............................................................. 20 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu ........ 29 Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trƣờng khoáng cơ bản .................................. 30 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè ............................................................................................. 31 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............... 32 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè .......................................... 33 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng ............................................................................. 35 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng ........................................................................... 36 Bảng 4.3: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè ........................... 39 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............................ 41 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè ............... 43 Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro ......................... 45 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đăt vấn đề Xã hội con ngƣời ngày càng phát triển hiện đại, cùng với nó là nhu cầu năng lƣợng và nhiên liệu cho phát triển kinh tế - xã hội ngày càng tăng. Nguồn nguyên liệu chính đƣợc con ngƣời sử dụng là xăng dầu có nguồn gốc hóa thạch. Xăng dầu đƣợc sử dụng để chạy các động cơ diessel trong các nhà máy, để vận hành động cơ. Xăng dầu có tác động cực kì lớn đối với sự phát triển nền kinh tế của mỗi quốc gia. Sản lƣợng xăng dầu tiêu thụ trên thế giới tăng tỉ lệ thuận với tốc độ tăng trƣởng kinh tế, các nƣớc tiêu thụ xăng dầu lớn nhất hiện nay là Mỹ và Trung Quốc. Theo ƣớc tính trữ lƣợng dầu mỏ trên thế giới là có giới hạn. Với xu hƣớng khai thác và sử dụng nhƣ hiện nay, chắc chắn trong một thời gian không lâu nguồn nguyên liệu hóa thạch này sẽ cạn kiệt. Do vai trò cực kì quan trọng của dầu mỏ nên trƣớc khi nguồn nguyên liệu này cạn kiệt, con ngƣời phải nhanh chóng tìm ra nguồn nguyên liệu thay thế. Có nhiều nguyên liệu đã đƣợc đề xuất nhƣ khai thác năng lƣợng mặt trời, năng lƣợng gió, thủy triều, sử dụng nguyên liệu hydrô … Và khoảng 30 năm trở lại đây, có một hƣớng rất mới là sử dụng dầu diessel sinh học (biodiesel) để thay thế cho dầu diesel bình thƣờng. Diessel sinh học là dầu đƣợc chiết xuất hoàn toàn từ thực vật nhƣ hạt cải dầu (Mỹ), hạt hƣớng dƣơng (Ý và Miền nam nƣớc Pháp), đậu nành (Mỹ và Braxil), hạt cây bông (Hy Lạp), dầu cọ (Malaysia) và từ hạt cây dầu mè (Nicaragoa và Nam Mỹ). So với các cây khác, cây dầu mè có ƣu điểm chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trƣờng tốt hơn. Ngoài lấy hạt để ép dầu, trồng cây còn giúp cải tạo đất và môi trƣờng nhất là ở những vùng đất hoang, khô cằn. Cây dầu mè là cây có tiềm năng kinh tế rất lớn lại thích hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới của Việt Nam. Nếu nhận đƣợc sự quan tâm đúng mức của bộ Nông nghiệp, cây hoàn toàn có thể trở thành một cây giúp nông dân làm giàu ngay trên những vùng đất bỏ hoang mà nhiều cây trồng khác không phát triển đƣợc. 2 Phƣơng pháp nhân giống cây dầu mè truyền thống là giâm cành, tuy nhiên phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là nhân chậm và rễ tạo ra không sâu nên cây trồng dễ bị ngã đổ. Do đó, tôi thực hiện đề tài “Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)” để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung ứng cho những yêu cầu lớn về số lƣợng cây con. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây dầu mè (Jatropha curcas L.) in vitro nhằm tạo nguồn giống cây ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho nhu cầu sản xuất. 1.2.2. Yêu cầu o Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo nguồn nguyên liệu ban đầu. o Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy in vitro cây dầu mè. o Khảo sát ảnh hƣởng của BA đến quá trình nuôi cấy tạo chồi cây dầu mè in vitro. o Khảo sát sự ảnh hƣởng của BA và IBA trong sự tạo chồi cây dầu mè in vitro. o Khảo sát quá trình tái sinh cụm chồi cây dầu mè in vitro. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nhân giống cây trồng in vitro 2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con ngƣời đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đƣa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay đƣợc chứng minh là phƣơng pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hƣởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hƣởng trực tiếp: môi trƣờng nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu đƣợc sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tƣơng hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã đƣợc nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ. 2.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật. Ở nƣớc ta ngành này mới đƣợc chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã 4 đƣợc phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học nhƣ Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy mô nƣớc ngoài đã nhận định: - Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện đƣợc những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. - Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này đƣợc các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt). - Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lƣơng thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...). - Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dƣới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. - Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn đƣợc chu trình lai tạo. - Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. - Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật nhƣ nuôi cấy vi sinh vật và qua đó ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. - Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. - Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tƣợng bất thụ khi lai xa. - Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào. Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trƣởng thực vật. Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh 5 tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nƣớc ta từ nay tới năm 2010 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phƣơng pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ƣu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1996). 2.1.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Nuôi cấy mô giống nhƣ nhân giống vô tính vì phƣơng pháp này tạo ra cây con đồng nhất và giống nhƣ cây mẹ về mặt di truyền. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo nhƣ phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống nhƣ cây mẹ, trong trƣờng hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống từ hạt. So với kiểu nhân giống vô tính thông thƣờng (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ƣu điểm là có thể nhân một số lƣợng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hƣởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể đƣợc nhân ra nhanh chóng để đƣa vào sản xuất. 2.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt đƣợc khi trải qua các giai đoạn: 2.1.4.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra đƣợc nguyên liệu vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. 6 Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm đƣợc nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. 2.1.4.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hƣớng các mô nuôi cấy. Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thƣờng mô non, chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trƣởng thành. Ngƣời ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trƣởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. 2.1.4.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này đƣợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thƣờng đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trƣởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy, ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. 2.1.4.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định, các chồi đƣợc chuyển từ môi trƣờng ở giai đoạn 3 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. 7 2.1.4.5. Giai đoạn 5: Đƣa cây ra đất Giai đoạn đƣa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dƣỡng sang sống hoàn toàn tự dƣỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vƣờn ƣơm cũng nhƣ ruộng sản xuất. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô 2.1.5.1. Mô nuôi cấy Theo lý thuyết tất cả các mô chƣa hóa gỗ đang sinh trƣởng mạnh nhƣ: Mô phân sinh ngọn, tƣợng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môi trƣờng có chứa một lƣợng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Do đó kết quả thu đƣợc cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đƣa vào nuôi cấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận đƣợc kết quả, hoặc thu đƣợc những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngƣng phát triển ở một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, ngƣời ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh. 2.1.5.2. Vô trùng trong nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi 8 sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trƣờng và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trƣờng bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy. Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Street (1974), đƣa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ sau (Trần Văn Minh, 2004): Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12 5 – 15 Tốt Nƣớc Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà 9 phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vô trùng trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nhằm tránh ảnh hƣởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2004). Sơ đồ xử lý mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nƣớc máy Cho vào bình tam giác Ngâm trong cồn 700C khoảng 30 – 60 giây Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25% trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80 Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm trắng Đặt lên môi trƣờng nuôi cấy 2.1.5.3. Điều kiện nuôi cấy  Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hƣởng sâu sắc đến sinh trƣởng và phát triển cây in vitro qua các tiến trình sinh lý nhƣ hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 270C (Trần Văn Minh, 2004). Còn theo Hughes (1981), nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy mô là 32 – 350C, trong khi những báo cáo khác ghi nhận nhiệt độ thích hợp cho Streptocapus là 120C 10 (Appelyren và Heide, 1972), với nhiều loài cây Begonia nhiệt độ thích hợp là 15 – 24 0C (Heide, 1965; Fonnesbad, 1974). Tuy nhiên nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm. Hầu hết, những thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế nhiệt độ, một vài loài cây nhƣ Lily sự hình thành thể giò đƣợc thực hiện bằng tăng cƣờng sử dụng chu kỳ nhiệt độ ngày và đêm. Những ngƣời trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì khả năng sinh trƣởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp. Nuôi cấy ở ngăn lạnh làm giảm sinh trƣởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền, những cây nuôi cấy này đƣợc di chuyển từ ngăn lạnh đến nơi bắt đầu nhân chồi lại khi yêu cầu nhân giống tăng (Hartmann và ctv, 1997).  Ánh sáng: Ảnh hƣởng của ánh sáng có thể đƣợc chia ra trong sự tác động của cƣờng độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ) và chất lƣợng ánh sáng đến sinh trƣởng, phát triển của thực vật. Cƣờng độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hƣởng đến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cƣờng độ ánh sáng điển hình cho vi nhân giống là từ 40 – 80 µmol/m2/giây trong nuôi cấy vƣơn thân, nhƣng cƣờng độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều. Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200 µmol/m2/giây). Bức xạ ánh sáng cao hơn trong nuôi cấy dị dƣỡng có thể làm mất diệp lục (Chlorophyll) và hoại tử lá (Hartmann và ctv, 1997). Rất nhiều nghiên cứu có hệ thống về tác động của quang chu kỳ trong sự phát triển mô nuôi cấy, nhƣng chiều dài ngày dài hơn từ 12 – 16 giờ thƣờng là thích hợp nhất. Phản ứng quang chu kỳ của hoa có thể đƣợc tạo ra trong in vitro, chồi cây cẩm chƣớng có thể ra hoa bằng cách xử lý 16 giờ chiếu sáng, nhƣng các thực vật còn lại chỉ 12 giờ là đã có thể ra hoa (Hartmann và ctv, 1997). 11 Chất lƣợng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và kiểu bình cấy đƣợc sử dụng. Thông thƣờng trong các phòng nuôi cấy mô sử dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ, chất lƣợng ánh sáng bị ảnh hƣởng bởi chất lƣợng đƣờng truyền của bình và kiểu nút đậy. Bình thủy tinh không truyền đƣợc ánh sáng có bƣớc sóng ngắn hơn 290 nm, trong khi đó bình polycarbonate không truyền đƣợc ánh sáng có bƣớc sóng ngắn hơn 390 nm, mặc dù đây là những số đo khác nhau, nhƣng ánh sáng có bƣớc sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự phát sinh quang hình thái là từ 400 – 800 nm. Chất lƣợng ánh sáng cũng làm thay đổi phản ứng sinh trƣởng của chồi in vitro. Nuôi cấy cây phong lữ (Pelargonium) trong ánh sáng đỏ làm tăng chiều dài chồi hơn so với ánh sáng trắng, trong khi đó ánh sáng xanh làm giảm sự kéo dài chồi, ngƣợc lại khả năng quang hợp cao nhất khi chồi cây Bulo (Betula) đặt trong ánh sáng xanh so với ánh sáng trắng hoặc đỏ, ánh sáng xanh cũng kích thích phát sinh diệp lục và gia tăng kích thƣớc lá. Ngƣời ta cho rằng chất lƣợng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trƣớc khi di chuyển cây từ nuôi cấy. Chất lƣợng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trƣờng phát triển trong nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv, 1997). Nhìn chung ánh sáng kiềm hãm sự phát triển của rễ và có vài chỉ dẫn rằng ngăn không cho ánh sáng từ vùng rễ thì có lợi cho việc hình thành rễ (Hartmann và ctv, 1997).  Không khí: Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao gồm oxy, carbon dioxide và ethylene. Các nhà trồng cây thƣơng mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí đƣợc ở một vài mức độ khác nhau, thƣờng có sự thúc đẩy tăng trƣởng thông qua lỗ thông khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997). 12 2.1.5.4. Môi trƣờng nuôi cấy Trong tất cả các môi trƣờng nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây:  Các muối khoáng đa lƣợng  Các muối khoáng vi lƣợng  Các Vitamin  Đƣờng làm nguồn cacbon  Các chất điều hòa sinh trƣởng Ngoài ra, ngƣời ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định nhƣ acid amin, EDTA, hoặc không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men…vào trong môi trƣờng tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tƣợng nuôi cấy. Trong hàng trăm môi trƣờng do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trƣờng: - Môi trƣờng nghèo chất dinh dƣỡng: White, Knop. - Môi trƣờng có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trung bình: B5, Gamborg. - Môi trƣờng giàu chất dinh dƣỡng: MS (Mura shige – Skoog). 2.1.5.5. Vai trò của chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy Chất điều hoà sinh trƣởng là những chất với liều lƣợng thấp hiệu ứng sinh học cao, đƣợc tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hƣởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh trƣởng là sản phẩm trao đổi chất bình thƣờng của cơ thể thực vật. Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trƣởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng nhƣ trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trƣờng (Bùi Trang Việt, 2000).  Auxin: Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trƣởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trƣởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trƣởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2000). 13 Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trƣởng và phân hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tƣợng hƣớng động, ƣu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trƣởng và chín của quả….(Nguyễn Văn Kế, 2000). Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu. Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ƣu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng. Ngay từ khi chất auxin đƣợc nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tƣơng tự nhƣ các đặc tính của chất auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất đƣợc nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004). Auxin chẳng những kích thích sự tăng trƣởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới. Ở nồng độ thấp và thƣờng dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vƣợt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000).  Cytokinin: Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thƣớc tế bào và sinh tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhƣng lại ức chế sự tạo rễ (Dƣơng Công Kiên, 2002). Sự sinh trƣởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ. Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thƣơng thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện 14 trong sự phối hợp với auxin (Trần Văn Minh, 2004). Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hoá (Trần Văn Minh, 2004).  Gibberellin: Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin. Xử lý gibberellin làm tăng năng suất mía cây và đƣờng (do kích thích sự kéo dài lóng). Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trƣởng lá. Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Ảnh hƣởng của than hoạt tính Nồng độ sử dụng thƣờng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác dụng sau: Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác. Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…). Thúc đẩy sự tạo phôi soma. Ổn định độ pH. 2.1.5.6. Ảnh hƣởng của pH và Agar pH của môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô. Nếu pH môi trƣờng thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Agar xuất phát từ rong biển, đƣợc sử dụng nhƣ là chất keo trong hầu hết môi trƣờng dinh dƣỡng. Agar là polysaccharide, trọng lƣợng phân tử cao có khả năng làm đông môi trƣờng. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nƣớc và hấp thụ hoá chất. Nồng độ agar thƣờng sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %. 15 Trong những năm gần đây sử dụng môi trƣờng hai pha (pha rắn và pha lỏng) trở nên khá phổ biến vì tốc độ nhân giống cao và giảm hiện tƣợng thuỷ tinh thể. Đầu tiên mẫu cấy đƣợc đặt trên môi trƣờng rắn, sau đó thêm vào một lớp môi trƣờng lỏng. Một phần mẫu cấy ở trong môi trƣờng lỏng, một phần ở trong môi trƣờng rắn, một phần ở trong không khí. Nếu nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng cần phải cung cấp oxy tạo sự thoáng khí bằng cách sử dụng máy lắc. Tế bào, mô nuôi cấy có thể bị tổn thƣơng nhƣng thƣờng sinh trƣởng và phát triển tốt vì mẫu cấy hấp thu dinh dƣỡng dễ dàng trên toàn bộ mẫu cấy. 16 2.2. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 2.2.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Nghành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Euphorbiale Họ: Euphorbiacea Chi: Jatropha Loài: curcas Jatropha là tên bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thục phẩm) ngụ ý dƣợc tính của cây. Theo nhƣ Correll và Correll (1982) curcas là tên của cây dầu mè tại vùng Malabar, Ấn Độ. Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 17 Tên bản xứ của cây dầu mè ở một số nƣớc:( Heller, 1996). Physic nut, purging nut (Anh) Pignon d’Inde (Pháp) Purgeernoot (Hà Lan) Purgiernu, Brechnu (Đức) Purgueira (Bố Đào Nha) Fafiola d’India (Ý) Dand barri, habel meluk arand (Hindi) Kadam (Nepal) Yu-lu-tzu (Trung Quốc) Sabudam (Thái Lan) Túbang-bákod (Philippine) Jarak dudeg (Indonesia) Bagani (Cô te d’Ivoire) Kpoti (Togo) Tabanani (Senegal) Mupuluka (Angola) Butuke (Nigeria) Makaen (Tanzania) Pinoncillo (Mexico) Coquillo, tempate (Costa Rica) Tartago (Puerto Rico) Ở Việt Nam cây đƣợc gọi là cây dầu mè hay cây cọc rào (vì thƣờng đƣợc trồng làm rào dậu). 2.2.2. Đặc điểm sinh học 2.2.2.1. Mô tả Cây dầu mè là cây bụi gỗ mềm, thân thẳng cao trung bình 6m với tán rộng. Cành non mập và mọng nƣớc, nhựa cây có màu trắng sữa hay màu vàng nhạt, lá rụng sớm, mọc dày ở phần ngọn. Lá có hình ovan, hoặc hình trái tim, có lá chẻ thùy 18 3 đến 5 thùy. Lá dài 6 – 40cm, rộng 6 – 35cm, cuống dài 2,5 – 7,5cm. Hoa thƣờng nở vào tháng 4 – 5 tạo thành nhiều chùm có màu vàng nhạt, hình chuông. Hoa đực có 10 nhị trong đó 5 nhị dính vào phần chân đế, 5 nhị kết lại thành bó. Hoa cái rời rạc với bầu nhuỵ hình elip, chia làm 3 ô, với 3 núm nhuỵ phân nhánh. Quả có dạng nang, kích thƣớc 2,5 – 4cm về chiều ngang và đƣờng kính. Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này. Hạt cây thuôn màu đen kích thƣớc 2 x 1cm. Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè 2.2.2.2. Sinh thái Cây dầu mè có thể phát triển trong các điều kiện khí hậu khô cằn. Điều kiện thích hợp nhất cho cây phát triển là mƣa ít (200mm) nhƣng cây vẫn có thể sống đƣợc ở nơi có lƣợng mƣa cao lên đến 1200mm. Khi gặp hạn hán, cây thích ứng bằng cách rụng hầu hết lá để làm giảm sự thoát hơi nƣớc. Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5oC. Điều kiện để hạt nẩy mầm là khí hậu nóng ẩm. Hoa nở trong mùa mƣa và tạo quả trong mùa đông. 19 Có nhiều bằng chứng cho thấy cây dầu mè có nguồn gốc từ Mexicô và Trung Mỹ, nhƣng hiện nay cây đƣợc tìm thấy ở hầu hết các nƣớc có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Brazil, Honduras, Fiji, Ấn Độ, Jamaica, Panama, Puerto Rico và Salvador. Cây dầu mè đã có mặt ở Việt Nam từ trƣớc thế kỷ XIV.Cho đến nay cây đã đƣợc trồng rải rác ở nhiều địa phƣơng: Đức Trọng, Bắc Bình, Lạng Sơn, Hàm Thuận Bắc, Hàm Thuận Nam, Ninh Sơn, Thanh Hoá, Lào Cai, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh … 2.2.3. Công dụng 2.2.3.1. Nhựa mủ Nhựa cây dầu mè có chứa các alkaloid nhƣ jatrophine, jatropham, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thƣ. Lá có chứa apigenin, vitexin và isovitexin. Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastenes là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và ôxi hóa. Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, oleic acid và linoleic acid. Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của nó. Nhựa cây đƣợc dùng để trị các bệnh ngoài da nhƣ u nhọt, hắc lào, xuất huyết da. Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). 2.2.3.2. Lá, vỏ và rễ cây Lá cây đƣợc chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung huyết da và kháng kí sinh trùng. Lá đƣợc sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u xơ. Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn. Vỏ cây dùng để thuốc cá, và dùng điều trị các vết thƣơng ngoài da. Nƣớc sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp, bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). 2.2.3.3. Hạt và dầu Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về da. Dầu cây dầu mè có tính tẩy rửa. 20 2.2.3.4. Dầu mè và nguyên liệu sinh học Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây dầu mè đƣợc sự chú ý đặc biệt bởi nó là nguồn nguyên liệu sinh học (biofuel). Hạt của cây có độ ẩm (6.62%), protein (18.2%), chất béo (38%), carbohydrate (17.3%), sợi (15.5%) và tro (4.5%). Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt. Trong dầu chứa 21% các acid béo không bão hòa. Hạt đƣợc xay và ép lấy dầu hoặc dầu đƣợc tách bằng các dung môi. Tên thƣơng mại của loại dầu này là Jatropha. Dầu sau khi lọc đƣợc sử dụng ngay nhƣ là nguồn nguyên liệu sinh học ở dạng bổ sung, dầu Jatropha có thể trộn với dầu thƣờng với tỉ lệ lên đến 20%. Đây là nguồn năng lƣợng mới an toàn, chi phí thấp và là nguồn năng lƣợng tái sinh đƣợc, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lƣợng thay thế cho thủy điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi …. Nguồn năng lƣợng này sẽ giúp các nƣớc cắt giảm một khoản tiền cho năng lƣợng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lƣợng giữa các vùng. Dầu Jatropha có thể hoàn toàn thay thế cho dầu lửa để sƣởi ấm và nấu ăn. Ƣu điểm là khói từ dầu Jatropha không có mùi và không cay nhƣ khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). Việt Nam phải chi khoảng 2 tỉ 410 triệu đô la một năm để nhập khẩu các sản phẩm dầu (năm 2003) và ngày càng tăng theo các năm. Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hƣởng đến toàn bộ nền kinh tế. Trong tƣơng lai dầu Jatropha sẽ thay thế dầu diesel bởi nó có những đặc tính lý hóa tƣơng tự nhƣ dầu diesel, các động cơ chạy bằng dầu diesel thƣờng khi chuyển sang sử dụng dầu Jatropha cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ. 21 2.2.3.4.1. Hiệu quả kinh tế của dầu Jatropha Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè Tuổi cây (năm) Năng suất dầu (kg/ha) 1 250 2 1000 3 2500 4 5000 5 8000 6 trở lên 10000 Nguồn: NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006 Nhƣ vậy với 1 ha cây dầu mè 6 năm tuổi hằng năm có thể thu đƣợc 10 tấn dầu. Hiện nay giá dầu Jatropha đƣợc bán trên thị trƣờng thế giới với giá khoảng 320 USD/ tấn (Trích từ trang web www.bulkoil.com ngày 7/8/2007). 2.2.3.4.2. Dầu Jatropha so với các loại dầu thực vật khác Trên thế giới hàng năm sản xuất khoảng 110 tỉ tấn dầu thực vật, 70% trong số đó đƣợc sản xuất từ 4 loại cây sau: đỗ tƣơng (26%), dầu cọ (18%), hƣớng dƣơng (13%), cải dầu (12%). [Internet 1] Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật Cây đỗ tƣơng Cây dầu cọ Cây hƣớng dƣơng Cây cải dầu 22 Cây dầu mè so với những cây trên là một cây còn khá mới mẻ, chƣa đƣợc biết nhiều đến. Nhƣng nếu tính về phƣơng diện sản xuất dầu sinh học thì cây dầu mè cho hiệu quả kinh tế lớn hơn rất nhiều bởi cây dầu mè là cây lâu năm có thể tạo quả trong nhiều thâp niên, cây có thể phát triển mà không cần phải chăm sóc nhiều trên những vùng đất khô cằn. 2.2.4. Nhân giống Những nghiên cứu về nhân giống cây dầu mè trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế. Cho đến nay phƣơng pháp nhân giống cây dầu mè chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là giâm cành và gieo hạt. Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên cây dầu mè mới chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây. 2.2.4.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền Ở Nam Phi, ngƣời dân trồng cây dầu mè làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thƣờng sử dụng phƣơng pháp giâm cành vì ƣu điểm của phƣơng pháp này là nhanh chóng tạo đƣợc cây trƣởng thành. Cành đƣợc cắt từ các cây dầu mè đã trƣởng thành cắm xuống đất, nếu đƣợc chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có đƣợc cây đủ lớn để đem trồng. Cây tạo ra từ phƣơng pháp giâm cành sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phƣơng pháp nhân giống bằng gieo hạt đƣợc sử dụng nhiều hơn. Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996). Hạt trƣớc khi đem gieo đƣợc lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt đƣợc ngâm nƣớc qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Hôm sau, hạt đƣợc gieo vào trong các bầu đất. Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thƣờng có 1 rễ cái và 4 rễ bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhân giống bằng hạt là chất lƣợng cây con không đồng nhất bởi cây dâu mè là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về 23 mặt di truyền. Nhƣ xét tính trạng hàm lƣợng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lƣợng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007). Trong khi kiểm tra chất lƣợng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phƣơng pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lƣợng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp. 2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại có ƣu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lƣợng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lƣợng cao và đồng nhất. Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc ít đƣợc công bố. Năm 1995, M. Sujatha và N. Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhƣ phần trụ dƣới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất định đƣợc chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trƣờng MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA. Sau đó mô sẹo đƣợc tái sinh gián tiếp trên môi trƣờng MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành đƣợc nuôi và tạo rễ trong môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Năm 2005, M. Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in vitro cây dầu mè bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi. Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung IBA và BA. Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy. Việc tạo chồi bất định từ lá thu đƣợc bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trƣờng bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ đƣợc tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trƣờng bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA. Phƣơng pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã đƣợc áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự 24 (Timir baran Jha và ctv, 2007). Sụ phát sinh phôi soma đƣợc tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trƣờng MS có các chất kích thích sinh trƣởng thực vật Kinetin và IBA, phôi đƣợc khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trƣờng. Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trƣờng ½ MS. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần. Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau. 25 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2007 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.) đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, bình thuỷ tinh 500ml, đĩa, đèn cồn. 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy Các môi trƣờng đƣợc sử dụng gồm: Môi trƣờng MS, ½ MS, WPM, ½ WPM. Trong đó môi trƣờng ½ MS và ½ WPM là môi trƣờng MS và WPM mà thành phần đa lƣợng đƣợc giảm đi một nửa. - Môi trƣờng MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 26 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Sắt EDTA Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2 - Môi trƣờng WPM ( Llooyd và McCown, 1981) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 400 CaNO3 556 K2SO4 990 CaCl2 96 KH2PO4 170 MgSO4 370 Sắt EDTA FeNa2EDTA 65,1 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 27 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin myo-Inositol 100 B1 1 B6 0,5 Nicotinic acid 0,5 Glycine 2 Các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng là BA, IBA (mg/l). Các thành phần khác: Đƣờng sucrose 30 g/l Agar 7,5 /l Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (1210C) trong 20 phút. 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Nhiệt độ 25 2oC Độ ẩm 50 – 60 % Cƣờng độ ánh sáng 2000-3000 lux 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu - Ngoài tủ cấy: Chồi đƣợc cắt dài khoảng 3 cm từ đỉnh chồi. Hạt đƣợc lấy từ những quả chín. Hạt phải có màu đen, chắc, mẩy. 28 Chồi đƣợc cắt bỏ lá non, rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng 0,1 % trong 15 phút và đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy bình thƣờng. Hạt đƣợc rủa sạch bằng nƣớc, dùng dao cạo bỏ lớp vở lụa mềm màu đen bên ngoài hạt, sau đó đƣợc rửa bằng xà phòng 0,1% trong 30 phút và đƣợc rủa lại bằng nƣớc máy nhiều lần. - Trong tủ cấy vô trùng: Rửa chồi và hạt bằng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 700 trong 30 giây Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng Ngâm trong Natri hypochlorit (NaOCl) - nồng độ và thời gian theo thí nghiệm. Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. 3.3.2. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần và ở mỗi lần lập lại cấy 3 bình, trong mỗi bình cấy 3 mẫu. Mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng. 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, loại bỏ những phần bị ngấm chất khử trùng rồi cấy vào các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Hạt đƣợc tách bỏ lớp vỏ cứng bằng kềm, pince và dao sau đó đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Thời gian thực hiện: 7 – 10 ngày Môi trƣờng thí nghiệm: MS Hóa chất đƣợc sử dụng là Natri hypochlorit (10 – 30 %) Vật liệu thí nghiêm: thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 đối tƣợng là chồi và hạt cây dầu mè. 29 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) 1 10 15 2 10 30 3 10 45 4 10 60 5 15 15 6 15 30 7 15 45 8 15 60 9 20 15 10 20 30 11 20 45 12 20 60 Chỉ tiêu theo dõi : 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro Do cây dầu mè là một cây còn khá mới mẻ ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây dầu mè chƣa nhiều. Việc tìm kiếm các tài liệu về nuôi cấy mô cây này là khá khó khăn và có rất ít. Do đó, chúng tôi muốn thực hiện một thí nghiệm cơ bản: khảo sát môi trƣờng khoáng thích hợp để có thể duy trì sự phát triển của mẫu cấy trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 4 loại môi trƣờng: MS, ½ MS, WPM và ½ WPM. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) = Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm X 100 Tổng số mẫu cấy 30 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ hạt đã đƣợc khử trùng và nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau sau khoảng thời gian 7 – 10 ngày. Sau khi hạt nẩy chồi, cắt mẫu dài khoảng 1 cm từ ngọn và cấy vào các môi trƣờng thí nghiệm. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức mỗi nghiệm thức cấy 10 mẫu. Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trƣờng khoáng cơ bản Nghiệm thức Môi trƣờng 1 MS 2 ½ MS 3 WPM 4 ½ WPM Chỉ tiêu theo dõi: o Tỉ lệ sống (%) o Tỉ lệ nảy chồi (%) o Phù gốc (+/-) 3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè. Sau khi xác định môi trƣờng khoáng cơ bản trong thí nghiệm 2, chúng tôi bổ sung BA nồng độ thay đổi từ 0 – 0,5 mg/l. Thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác có chứa 50 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu. Thời gian lấy số liệu 1 tháng. Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định nồng độ BA nào thích hợp cho nuôi cấy tạo chồi cây dầu mè in vitro. Dựa vào tài liệu tham khảo và quá trình thí nghiệm thăm dò nồng độ BA đƣợc chia theo các mức sau: 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) 1 Khoáng cơ bản TN2 0 2 Khoáng cơ bản TN2 0,1 3 Khoáng cơ bản TN2 0,3 4 Khoáng cơ bản TN2 0,5 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ mẫu cấy chồi hoặc hạt đã đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau 7 – 10 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: o Số chồi phát sinh/1 mẫu cấy o Chiều cao chồi (mm) o Số lá/1 mẫu cấy 3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự tác động đồng thời của BA và IBA đến khả năng phát sinh chồi của cây dầu mè. Trong thí nghiệm IBA đƣợc bổ sung ở 1 mức thấp 0,01 mg/l, BA đƣợc bổ sung ở các mức khác nhau 0 mg/l; 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l. Thí nghiệm này có 6 nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần và mỗi nghiệm thức cấy vào ba bình tam giác. Trong mỗi bình tam giác cấy ba mẫu. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. 32 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 0 2 0,1 0,01 3 0,3 0,01 4 0,5 0,01 Chỉ tiêu theo dõi: 1. Số chồi/1 mẫu 2. Chiều cao chồi (mm) 3. Số lá/1 mẫu 4. Sự tạo mô sẹo (+/-) 3.3.2.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây dầu mè in vitro nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Đối tƣợng nghiên cứu: Các chồi phát sinh sau khi thực hiện các thí nghiệm 3 và 4 có kích thƣớc 2 – 3 cm. Thí nghiệm này có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cấy trong các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng khoáng cơ bản bổ sung IBA ở những nồng độ khác nhau. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 2 0,1 3 0.3 4 0,5 Các chỉ tiêu theo dõi: o Số rễ/1 mẫu o Chiều dài rễ (mm) 33 3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphic 7.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phƣơng pháp LSD). 34 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy mô cây dầu mè. Mục tiêu đạt đƣợc của thí nghiệm này là xác định nồng độ của hóa chất diệt khuẩn (Natri hypochlorit) và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. 35 4.1.1. Vô trùng mẫu hạt Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 5,00 a 2 10 30 18,33 b 3 10 45 16,67 b 4 10 60 20,83 bc 5 15 15 10,00 a 6 15 30 10,83 a 7 15 45 20,83 bc 8 15 60 26,79 d 9 20 15 10,00 a 10 20 30 19,55 bc 11 20 45 20,37 bc 12 20 60 25,00 cd CV (%) 18,6 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Theo kết quả trong bảng 4.2 cho thấy ở cả 3 nồng độ Natri hypochlorit 10 %, 15 % và 20 % tỉ lệ mẫu hạt vô trùng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Càng kéo dài thời gian khử mẫu tỉ lệ mẫu vô trùng càng cao do hạt cây có lớp vỏ cứng nên khi ngâm khử trùng chất khử không ngấm vào trong hạt gây chết mẫu. 3 nghiệm thức có tỉ lệ mẫu hạt vô sống cao nhất là nghiệm thứ 4, 8 và 12 trong đó nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ cao nhất 26,79 %. Do đó kết luận điều kiện khử mẫu hạt tốt nhất là sử dụng Natri hypochlorit nồng độ 15 % và thời gian khử mẫu là 60 phút. 36 4.1.2. Vô trùng mẫu chồi Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 0,00 a 2 10 30 1,28 ab 3 10 45 6,30 c 4 10 60 4,90 bc 5 15 15 1,33 ab 6 15 30 2,08 abc 7 15 45 4,91 bc 8 15 60 4,52 abc 9 20 15 1,52 abc 10 20 30 4,23 abc 11 20 45 3,13 abc 12 20 60 3,77 abc CV (%) 15,12 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Xét ở nồng độ 10 % tỉ lệ mẫu sống tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Khi tăng thời gian khử mẫu từ 15 phút lên 60 phút tỉ lệ sống tăng từ 0 % (nghiệm thức 1) tăng lên 4,9 % (nghiệm thức 4) và nghiệm thức đạt cao nhất là nghiệm thức 3 với thời gian khử mẫu 45 phút và tỉ lệ mẫu sống 6,3 %. Nồng độ Natri hypochlorit 15%, tỉ lệ mẫu sống cũng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Tỉ lệ mẫu sống tăng từ 1,33 % (nghiệm thứ 5) tăng lên 4,52 % (nghiệm thứ 8). Tuy nhiên tỉ lệ mẫu sống cao nhất là nghiệm thức 7 chỉ đạt 4,91 % 37 thấp hơn so với nghiệm thứ 3. So với nống độ Natri hypochlorit 10% tỉ lệ nhiễm nấm, khuẩn có giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc chất khử trùng tăng. Ở nồng độ Natri hypochlorit 20% việc kéo dài thời gian khử trùng mẫu cũng làm tăng tỉ lệ mẫu sống. Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu sống ở nồng độ 20 % thấp hơn so với các nghiệm thức ở các nồng độ 10 % và 15 %. Nồng độ Natri hypochlorit cao tác dụng khử trùng nấm và khuẩn rõ ràng cao hơn, nhƣng tác dụng gây độc với mẫu khử cũng cao. Do đó tuy tỉ lệ nhiễm giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc cao đặc biệt ở các nghiệm thức 11 và 12. Từ đó chúng tôi kết luận, cách thức khử mẫu thích hợp cho chồi cây dầu mè là ngâm mẫu trong Natri hypochlorit 10% với thời gian 45 phút. So với các cây khác, thời gian khử của cây dầu mè lâu hơn do chồi non của cây dầu mè có kích thƣớc lớn, mọng nƣớc nên chịu đƣợc tác động của chất khử trùng tốt hơn. 38 Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nẩy từ các hạt vô trùng Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây dầu mè đƣợc vô trùng phát sinh chồi 39 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè in vitro Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phát sinh chồi của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản. Tuy nhiên, tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây dầu mè không nhiều, ít công bố. Do đó thí nghiệm đƣợc thực hiện mang tính chất thăm dò. Do dầu mè là cây thân gỗ nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 4 loại môi trƣờng là MS, WPM, ½ MS và ½ WPM. Các môi trƣờng không bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thực vật Bảng 4.3: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng Tỉ lệ sống (%) Tỉ lệ nảy chồi (%) Phù gốc 1 MS 100 100 - 2 ½ MS 75 50 - 3 WPM 100 100 + 4 ½ WPM 50 67 + Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Mẫu khi cấy vào môi trƣờng MS và WPM sau khoảng 1 tuần đều nẩy chồi (100 %), trên các môi trƣờng ½ MS và ½ WPM thì chậm hơn 5 – 6 ngày và tỉ lệ nảy chồi cũng thấp hơn: ½ MS là 50% ; ½ WPM là 67%. Trong khoảng thời gian từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 4, trên môi trƣờng ½ MS và ½ WPM các chồi có biểu hiện bị úng ngọn. Ngọn dần chuyển sang màu vàng, lan đỉnh xuống gốc và mẫu chết. Hiện tƣợng này chỉ xuất hiện trên các môi trƣờng có khoáng đa lƣợng giảm một nửa chứng tỏ đòi hỏi về khoáng của cây cao và các môi trƣờng này không đáp ứng đƣợc. Khi xem xét gốc của mẫu cấy nhận thấy môi trƣờng WPM và ½ WPM gốc của mẫu cấy phù to. Trong khi đó trên môi trƣờng MS và ½ MS gốc mẫu hoàn toàn bình thƣờng không bị phù. 40 Từ những kết quả đạt đƣợc kết luận môi trƣờng khoáng thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè là môi trƣờng MS. 1 2 3 4 Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản 1: Môi trƣờng MS 2: Môi trƣờng WPM 3: Môi trƣờng ½ MS 4: Môi trƣờng ½ WPM 41 4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè Sử dụng kết quả của thí nghiệm 2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung BA nồng độ 0 – 0,5 mg/l. Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) 1 MS 0,1 1,00 a 1,86 b 2 MS 0,3 2,17 b 3,46 c 3 MS 0,5 2,38 c 3,54 c 4 MS 0 0,87 a 1,33 a CV (%) 12,5 4,8 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Kết quả thí nghiệm cho thấy số chồi sinh ra trên một mẫu cấy tăng tỉ lệ thuận với nồng độ BA trong môi trƣờng nuôi cấy. Ở nghiệm thức 1 (BA 0,1 mg/l) số chồi phát sinh là 1.0 chồi/ mẫu, sang nghiệm thức 2 số chồi tăng lên 2,17 chồi/mẫu và đạt cao nhất ở nghiệm thức thứ 3 2,38 chồi/mẫu. Chiều cao chồi sinh ra cũng tăng tỉ lệ thuận với việc tăng nồng độ BA trong môi trƣờng. Khi bổ sung BA ở mức 0,1 mg/l (NT1) thì chiều cao chồi là 1,86 mm so với nghiệm thức đối chứng (NT4) là 1,33 mm cho thấy mức BA 0,1 mg/l có tác động chƣa lớn đến chiều cao chồi.. Khi tăng nồng độ lên ở NT2 và NT3 chiều cao chồi có sự cải thiện rõ rệt - đạt cao nhất 3,54 mm ở NT3. Điều đó chứng tỏ từ nồng độ 0,3 – 0,5 mg/l, BA có sự tác động đáng kể đến chiều cao chồi tạo thành. Theo các thí nghiệm thăm dò trƣớc và theo một số tài liệu thì không nên tăng nồng độ BA cao hơn 0,5 mg/l vì cây rất nhạy, nồng độ BA cao mẫu cấy tạo khá nhiều mô sẹo. Hiện tƣợng này không tốt đối với, dễ làm cho mẫu chết và gây xáo trộn di truyền cây. 42 Nhƣ vậy, chúng tôi kết luận rằng nồng độ BA thích hợp để khích thích sự tạo chồi của cây dầu mè là 0,5 mg/l. Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 1: BA 0,1 mg/l 2: BA 0,3 mg/l 3: BA 0,5 mg/l 1 2 3 43 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè Trong môi trƣờng khoáng cơ bản là MS chúng tôi bổ sung BA và IBA để xác định sự tác động của 2 chất khích thích sinh trƣởng này đến sự tạo thành chồi của cây dầu mè. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) IBA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) Số lá Mô sẹo 1 MS 0,1 0,01 2,13 c 4.67 c 4,41 d + 2 MS 0,3 0,01 2,28 d 3.32 b 3.81 c ++ 3 MS 0,5 0,01 1,89 b 3.42 b 3.00 b +++ 4 MS 0 0 0,87 a 1.30 a 1.00 a - CV (%) 8,85 6,21 13,00 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Kết quả thí nghiệm cho thấy khi bổ sung đồng thời 2 loại kích thích sinh trƣởng thực vật (BA và IBA) số chồi trên 1 mẫu cấy gần nhƣ không tăng so với thí nghiệm chỉ bổ sung 1 chất khích thích sinh trƣởng BA (thí nghiệm 3). Nhƣng chiều cao chồi đƣợc cải thiện đáng kể. Điều này là phù hợp vì khi có sự hiện diện của auxin, cytokinin kích thích mạnh hơn sự phân chia tế bào (Dƣơng Công Kiên, 2002). Khi có sự hiện diện của IBA ở mức thấp 0,01 mg/l, việc tăng nồng độ BA từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l không làm tăng số chồi, chiều cao chồi cũng nhƣ số lá trên 1 mẫu cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nghiệm thức thứ nhất - chỉ bổ sung BA ở nồng độ 0,1 mg/l và IBA 0,01 mg/l thì kết quả tạo chồi cầy dầu mè tỏ ra vƣợt trội hơn các nghiệm thúc khác về cả 3 chỉ tiêu: số chồi 2,13 chồi/mẫu cầy; chiều cao chồi cao nhất 4,67 mm, số lá 4,41 lá/mẫu cấy. Thí nghiệm cũng cho thấy khi tăng nồng độ BA mô sẹo tạo ra trên các mẫu càng nhiều. 44 Từ đó chúng tôi kết luận: môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy cây dầu mè invitro là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l). Hình 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sụ tạo chồi của cây dầu mè 1: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,1) 2: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,3) 3: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,5) 1 2 3 45 4.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro Mục tiêu là xác định môi trƣờng thích hợp cho sự tạo rễ của cây dầu mè. Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt (Banerjee và Delanghe, 1985). Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro Nghiệm thức Môi trƣờng IBA (mg/l) Số rễ Chiều dài rễ (mm) 1 MS 0,1 2,88 b 14,46 c 2 MS 0,3 5,50 c 15,07 c 3 MS 0,5 6,38 d 11,63 b 4 MS 0 0,00 a 0,00 a CV (%) 10,68 21,00 Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Tác động của IBA đến việc tạo rễ của cây dầu mè in vitro là khá nhanh và mạnh. Các nghiệm thức 2 và 3 sau khi cấy mẫu khoảng 1 tuần cây bắt đầu mọc rễ , trong nghiệm thức 1 rễ mọc chậm hơn khoảng 2 – 3 ngày. Rễ cây mọc trên các môi trƣờng có màu trắng sau khoảng 2 tuần có màu nâu sậm. Từ kết quả thí nghiệm trên bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức 3 là nghiệm thức cho kết quả tốt nhất. Số rễ tạo ra trên mỗi mẫu cấy là nhiều nhất và chiều dài rễ so với 2 nghiệm thức còn lại có sự khác biệt không nhiều. Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp để tạo rễ cây dầu mè là MS + IBA (0,5 mg/l). 46 Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro 1: Môi trƣờng MS + IBA 0,1 (mg/l) 2: Môi trƣờng MS + IBA 0,3 (mg/l) 3: Môi trƣờng MS + IBA 0,5 (mg/l) Hình 4.7: cây dầu mè in vitro 3 2 1 47 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:  Mẫu cây dầu mè thực sinh đƣợc vô trùng tốt nhất trong điều kiện Natri hypochlorit 10% trong khoảng thời gian 45 phút.  Môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là môi trƣờng MS.  Môi trƣờng thích hợp để nhân chồi cây dầu mè là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).  Môi trƣờng thích hợp cho sự ra rễ là môi trƣờng MS bổ sung IBA nồng độ 0,3 mg/l. 5.2. Đề nghị  Cần nghiên cứu thêm môi trƣờng để nuôi cấy cây dầu mè từ sau khi ra rễ cho đến khi cây đủ lớn để đƣa ra vƣờn ƣơm, theo dõi sinh trƣởng cây trong giai đoạn vƣờn ƣơm đến khi đạt tiêu chuẩn đem trồng.  Xây dụng hoàn chỉnh qui trình nhân giống in vitro và trên vƣờn ƣơm cây dầu mè. 48 Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ môi trƣờng An Giang. 2. Trần Thị Dung, 2003, Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh 5. Trần Văn Minh, 2004. Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 933 trang. 6. Khƣu Hoàng Minh, 2006. Nuôi cấy mô cây Trai Nam Bộ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.). Luận văn kĩ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 7. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, tập 1, 2. 8. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương. Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 333 trang 9. NIIR Board of Consultants and Engineers. 2006. The Complete Book on Jatropha (Bio-Diesel) with Ashwagandha, Stevia, Brahmi & Jatamansi Herbs (Cultivation, Processing & Uses) – Asia Pacific Business Press Inc. 10. Heller, J. (1996). Physic nut. Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops. 1. Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, International Plant Genetic Resources Institute, Rome. 11. M. Sujatha & N. Mukta, 1995. Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curca. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 135 – 141, 1996 12. M. Sujatha, H.P.S. Makkar and K. Becker, 2005. Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non-toxic Jatropha curcas L. Plant Growth Regulation (2005) 47: 83 – 90. 49 13. Nannapat Thepsamran, Chockpisit Thepsithar and Aree Thongpukdee. In vitro multiple shoot induction of physic nut (Jatropha curcas). Nakhon Pathom 73000, Thailand. 14. Timir baran Jha, Priyanka Mukherjee and Mukul Manjari Datta, 2007. Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant. Springer Japan 1:135 -140, 2007. INTERNET 1. 2. s.2006-10-25.0403019214/view?searchterm=curcas 3. 4. PHỤ LỤC Thí nghiệm 1 - 1: Vô trùng mẫu hạt cây dầu mè One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN12._GT Level codes: TN12.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .1145915 11 .0104174 9.771 .0000 Within groups .0202576 19 .0010662 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .1348491 30 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN12._GT by TN12.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 2 .0500000 .0118000 .0230889 .0158204 .0841796 2 3 .1833333 .0057877 .0188520 .1554258 .2112409 3 3 .1666667 .0075922 .0188520 .1387591 .1945742 4 3 .2083333 .0389930 .0188520 .1804258 .2362409 5 2 .1000000 .0234500 .0230889 .0658204 .1341796 6 3 .1083333 .0136290 .0188520 .0804258 .1362409 7 3 .2083333 .0101583 .0188520 .1804258 .2362409 8 3 .2678571 .0255744 .0188520 .2399496 .2957647 9 2 .1000000 .0235640 .0230889 .0658204 .1341796 10 2 .1954545 .0098225 .0230889 .1612749 .2296342 11 3 .2037037 .0189627 .0188520 .1757962 .2316113 12 2 .2500000 .0067400 .0230889 .2158204 .2841796 -------------------------------------------------------------------------------- Total 31 .1751804 .0058646 .0058646 .1664987 .1838620  Multiple range analysis for TN12._GT by TN12.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 2 .0500000 X 5 2 .1000000 X 9 2 .1000000 X 6 3 .1083333 X 3 3 .1666667 X 2 3 .1833333 X 10 2 .1954545 XX 11 3 .2037037 XX 4 3 .2083333 XX 7 3 .2083333 XX 12 2 .2500000 XX 8 3 .2678571 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.13333 0.06240 * 1 - 3 -0.11667 0.06240 * 1 - 4 -0.15833 0.06240 * 1 - 5 -0.05000 0.06836 1 - 6 -0.05833 0.06240 1 - 7 -0.15833 0.06240 * 1 - 8 -0.21786 0.06240 * 1 - 9 -0.05000 0.06836 1 - 10 -0.14545 0.06836 * 1 - 11 -0.15370 0.06240 * 1 - 12 -0.20000 0.06836 * 2 - 3 0.01667 0.05582 2 - 4 -0.02500 0.05582 2 - 5 0.08333 0.06240 * 2 - 6 0.07500 0.05582 * 2 - 7 -0.02500 0.05582 2 - 8 -0.08452 0.05582 * 2 - 9 0.08333 0.06240 * 2 - 10 -0.01212 0.06240 2 - 11 -0.02037 0.05582 2 - 12 -0.06667 0.06240 * 3 - 4 -0.04167 0.05582 3 - 5 0.06667 0.06240 * 3 - 6 0.05833 0.05582 * 3 - 7 -0.04167 0.05582 3 - 8 -0.10119 0.05582 * 3 - 9 0.06667 0.06240 * 3 - 10 -0.02879 0.06240 3 - 11 -0.03704 0.05582 3 - 12 -0.08333 0.06240 * 4 - 5 0.10833 0.06240 * 4 - 6 0.10000 0.05582 * 4 - 7 0.00000 0.05582 4 - 8 -0.05952 0.05582 * 4 - 9 0.10833 0.06240 * 4 - 10 0.01288 0.06240 4 - 11 0.00463 0.05582 4 - 12 -0.04167 0.06240 * denotes a statistically significant difference. Thí nghiệm 1 – 2: Vô trùng mẫu chồi cây dầu mè One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN11._GT Level codes: TN11.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups .0119997 11 .0010909 4.751 .0007 Within groups .0055110 24 .0000229 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) .0175108 35 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN11._GT by TN11.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .0000000 .0000000 .0087488 -.0127711 .0127711 2 3 .0128205 .0015005 .0087488 .0000495 .0255916 3 3 .0629630 .0088441 .0087488 .0501919 .0757340 4 3 .0489766 .0193466 .0087488 .0362055 .0617477 5 3 .0133333 .0064959 .0087488 .0005623 .0261044 6 3 .0208333 .0074545 .0087488 .0080623 .0336044 7 3 .0490741 .0068402 .0087488 .0363030 .0618451 8 3 .0452279 .0064439 .0087488 .0324569 .0579990 9 3 .0151515 .0027933 .0087488 .0023805 .0279226 10 3 .0423077 .0066542 .0087488 .0295366 .0550788 11 3 .0313390 .0039580 .0087488 .0185680 .0441101 12 3 .0376984 .0144886 .0087488 .0249274 .0504695 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 .0316438 .0025256 .0025256 .0279571 .0353305  Multiple range analysis for TN11._GT by TN11.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 .0000000 X 2 3 .0128205 XX 5 3 .0133333 XX 9 3 .0151515 XX 6 3 .0208333 XXX 11 3 .0313390 XXX 12 3 .0376984 XXXX 10 3 .0423077 XXX 8 3 .0452279 XXX 4 3 .0489766 XX 7 3 .0490741 XX 3 3 .0629630 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.01282 0.02554 1 - 3 -0.06296 0.02554 * 1 - 4 -0.04898 0.02554 * 1 - 5 -0.01333 0.02554 1 - 6 -0.02083 0.02554 1 - 7 -0.04907 0.02554 * 1 - 8 -0.04523 0.02554 * 1 - 9 -0.01515 0.02554 1 - 10 -0.04231 0.02554 * 1 - 11 -0.03134 0.02554 * 1 - 12 -0.03770 0.02554 * 2 - 3 -0.05014 0.02554 * 2 - 4 -0.03616 0.02554 * 2 - 5 -0.00051 0.02554 2 - 6 -0.00801 0.02554 2 - 7 -0.03625 0.02554 * 2 - 8 -0.03241 0.02554 * 2 - 9 -0.00233 0.02554 2 - 10 -0.02949 0.02554 * 2 - 11 -0.01852 0.02554 2 - 12 -0.02488 0.02554 3 - 4 0.01399 0.02554 3 - 5 0.04963 0.02554 * 3 - 6 0.04213 0.02554 * 3 - 7 0.01389 0.02554 3 - 8 0.01774 0.02554 3 - 9 0.04781 0.02554 * 3 - 10 0.02066 0.02554 3 - 11 0.03162 0.02554 * 3 - 12 0.02526 0.02554 4 - 5 0.03564 0.02554 * 4 - 6 0.02814 0.02554 * 4 - 7 -0.00010 0.02554 4 - 8 0.00375 0.02554 4 - 9 0.03383 0.02554 * 4 - 10 0.00667 0.02554 4 - 11 0.01764 0.02554 4 - 12 0.01128 0.02554 5 - 6 -0.00750 0.02554 5 - 7 -0.03574 0.02554 * 5 - 8 -0.03189 0.02554 * 5 - 9 -0.00182 0.02554 5 - 10 -0.02897 0.02554 * 5 - 11 -0.01801 0.02554 5 - 12 -0.02437 0.02554 6 - 7 -0.02824 0.02554 * 6 - 8 -0.02439 0.02554 6 - 9 0.00568 0.02554 6 - 10 -0.02147 0.02554 6 - 11 -0.01051 0.02554 6 - 12 -0.01687 0.02554 7 - 8 0.00385 0.02554 7 - 9 0.03392 0.02554 * 7 - 10 0.00677 0.02554 7 - 11 0.01774 0.02554 7 - 12 0.01138 0.02554 8 - 9 0.03008 0.02554 * 8 - 10 0.00292 0.02554 8 - 11 0.01389 0.02554 8 - 12 0.00753 0.02554 9 - 10 -0.02716 0.02554 * 9 - 11 -0.01619 0.02554 9 - 12 -0.02255 0.02554 10 - 11 0.01097 0.02554 10 - 12 0.00461 0.02554 11 - 12 -0.00636 0.02554 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến tạo chồi cây dầu mè 1 – Số chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN3CHOI._GT Level codes: TN3CHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 16.028922 3 5.3429739 158.549 .0000 Within groups 1.010975 30 .0336992 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 17.039897 33 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN3CHOI._GT by TN3CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 5 1.0000000 .0671296 .0820965 .8814163 1.1185837 2 6 2.1666667 .1666667 .0749435 2.0584150 2.2749183 3 8 2.3750000 .0301137 .0649030 2.2812513 2.4687487 4 15 .8666667 .0132254 .0473984 .7982023 .9351310 -------------------------------------------------------------------------------- Total 34 1.4705882 .0314826 .0314826 1.4251135 1.5160630  Multiple range analysis for TN3CHOI._GT by TN3CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 .8666667 X 1 5 1.0000000 X 2 6 2.1666667 X 3 8 2.3750000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.16667 0.22707 * 1 - 3 -1.37500 0.21378 * 1 - 4 0.13333 0.19365 2 - 3 -0.20833 0.20252 * 2 - 4 1.30000 0.18114 * 3 - 4 1.50833 0.16417 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2 – Chiều cao chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN3CAO1._GT Level codes: TN3CAO1.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 47.418907 3 15.806302 1008.869 .0000 Within groups .673696 43 .015667 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 48.092603 46 1 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN3CAO1._GT by TN3CAO1.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 7 1.8571429 .0474769 .0473095 1.7896631 1.9246226 2 13 3.4615385 .0362717 .0347157 3.4120219 3.5110550 3 13 3.5384615 .0322259 .0347157 3.4889450 3.5879781 4 14 1.3333333 .0341119 .0334529 1.2856180 1.3810487 -------------------------------------------------------------------------------- Total 47 2.6099291 .0182578 .0182578 2.5838871 2.6359710 Multiple range analysis for TN3CAO1._GT by TN3CAO1.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 14 1.3333333 X 1 7 1.8571429 X 2 13 3.4615385 X 3 13 3.5384615 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -1.60440 0.11837 * 1 - 3 -1.68132 0.11837 * 1 - 4 0.52381 0.11688 * 2 - 3 -0.07692 0.09903 2 - 4 2.12821 0.09725 * 3 - 4 2.20513 0.09725 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA và IBA đến tạo chồi cây dầu mè 1 – Số chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4CHOI._GT Level codes: TN4CHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 20.301868 3 6.7672894 246.960 .0000 Within groups 2.000376 73 .0274024 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.302245 76 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4CHOI._GT by TN4CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 22 2.1363636 .0310786 .0352926 2.0866160 2.1861113 2 21 2.2857143 .0488223 .0361231 2.2347959 2.3366327 3 19 1.8947368 .0332663 .0379767 1.8412056 1.9482681 4 15 .8666667 .0288300 .0427414 .8064192 .9269141 -------------------------------------------------------------------------------- Total 77 1.8701299 .0188647 .0188647 1.8435386 1.8967211  Multiple range analysis for TN4CHOI._GT by TN4CHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 .8666667 X 3 19 1.8947368 X 1 22 2.1363636 X 2 21 2.2857143 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.14935 0.10067 * 1 - 3 0.24163 0.10335 * 1 - 4 1.26970 0.11050 * 2 - 3 0.39098 0.10448 * 2 - 4 1.41905 0.11156 * 3 - 4 1.02807 0.11398 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  2 – Chiều cao chồi One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4CCHOI._GT Level codes: TN4CCHOI.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 134.35998 3 44.786659 927.509 .0000 Within groups 6.47047 134 .048287 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 140.83044 137 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4CCHOI._GT by TN4CCHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 41 4.7125000 .0198652 .0343181 4.6644942 4.7605058 2 45 3.3222222 .0334361 .0327574 3.2763997 3.3680447 3 37 3.4130022 .0473763 .0361256 3.3624681 3.4635363 4 15 1.3000000 .0543358 .0567374 1.2206331 1.3793669 -------------------------------------------------------------------------------- Total 138 3.5398086 .0187058 .0187058 3.5136421 3.5659751  Multiple range analysis for TN4CCHOI._GT by TN4CCHOI.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 1.3000000 X 2 45 3.3222222 X 3 37 3.4130022 X 1 41 4.7125000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 1.39028 0.09385 * 1 - 3 1.29950 0.09857 * 1 - 4 3.41250 0.13118 * 2 - 3 -0.09078 0.09647 2 - 4 2.02222 0.12961 * 3 - 4 2.11300 0.13306 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  3 – Số lá One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN4LA._GT Level codes: TN4LA.T Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 113.23593 3 37.745310 213.449 .0000 Within groups 12.90900 73 .176836 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 126.14493 76 0 missing value(s) have been excluded.  Table of means for TN4LA._GT by TN4LA.T -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 22 4.4090909 .0403457 .0896548 4.2827153 4.5354665 2 21 3.8095238 .0722893 .0917646 3.6801742 3.9388734 3 19 3.0000000 .1637446 .0964735 2.8640129 3.1359871 4 15 1.0000000 .0614260 .1085774 .8469515 1.1530485 -------------------------------------------------------------------------------- Total 77 3.2337662 .0479225 .0479225 3.1662156 3.3013168  Multiple range analysis for TN4LA._GT by TN4LA.T -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 1.0000000 X 3 19 3.0000000 X 2 21 3.8095238 X 1 22 4.4090909 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 0.59957 0.25574 * 1 - 3 1.40909 0.26254 * 1 - 4 3.40909 0.28069 * 2 - 3 0.80952 0.26542 * 2 - 4 2.80952 0.28339 * 3 - 4 2.00000 0.28954 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.  Thí nghiệm 5: Tạo rễ in vitro cây dầu mè 1 – Số rễ One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN5RE._GT Level codes: TN5RE.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 223.72059 3 74.573529 541.958 .0000 Within groups 4.12801 30 .137600 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 227.84860 33 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TN5RE._GT by TN5RE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 8 2.8750000 .1023560 .1311489 2.6855628 3.0644372 2 8 5.5000000 .2126994 .1311489 5.3105628 5.6894372 3 8 6.3750000 .1341517 .1311489 6.1855628 6.5644372 4 10 .0000000 .0000000 .1173032 -.1694378 .1694378 -------------------------------------------------------------------------------- Total 34 3.4705882 .0636166 .0636166 3.3786977 3.5624788 Multiple range analysis for TN5RE._GT by TN5RE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 10 .0000000 X 1 8 2.8750000 X 2 8 5.5000000 X 3 8 6.3750000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -2.62500 0.37887 * 1 - 3 -3.50000 0.37887 * 1 - 4 2.87500 0.35943 * 2 - 3 -0.87500 0.37887 * 2 - 4 5.50000 0.35943 * 3 - 4 6.37500 0.35943 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2 – Chiều dài rễ One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: TN5DRE._GT Level codes: TN5DRE.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1976.2044 3 658.73480 96.248 .0000 Within groups 848.6706 124 6.84412 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2824.8750 127 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TN5DRE._GT by TN5DRE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 24 14.458333 .4339704 .5340146 13.710780 15.205887 2 43 15.069767 .3711575 .3989555 14.511280 15.628255 3 51 11.627451 .4409978 .3663310 11.114633 12.140269 4 10 .000000 .0000000 .8272918 -1.158105 1.158105 -------------------------------------------------------------------------------- Total 128 12.406250 .2312351 .2312351 12.082550 12.729950 Multiple range analysis for TN5DRE._GT by TN5DRE.NT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 10 .000000 X 3 51 11.627451 X 1 24 14.458333 X 2 43 15.069767 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 -0.61143 1.31966 1 - 3 2.83088 1.28204 * 1 - 4 14.4583 1.94938 * 2 - 3 3.44232 1.07228 * 2 - 4 15.0698 1.81830 * 3 - 4 11.6275 1.79119 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.