Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato spotted wilt virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l.) và cây đậu phộng (arachis hypogaea l.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật elisa và chẩn đoán tobacco mosaic vi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006 Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui buồn trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập cho em trong suốt bốn năm đại học. Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp. Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận. TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Văn Ngọc Dung iv TÓM TẮT VĂN NGỌC DUNG. Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/ 2006. “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”. Hội đồng hướng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN. Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006. Nội dung tiến hành: Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh. Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV. Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA. Kết quả thu được: Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh. Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%). Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x Danh sách các hình ............................................................................................... xi Danh sách các bảng .............................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu ......................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá ................................................................................ 3 2.1.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 3 2.1.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 3 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 4 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 4 2.1.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 4 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 4 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 4 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng ............................................................................ 7 2.2.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 7 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 7 vi 2.2.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 7 2.2.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 8 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 8 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 8 2.2.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 8 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 8 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 9 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra ..................................................... 11 2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật ............................................ 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung .................................................................... 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật ......................................... 11 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá ................... 12 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng ............... 13 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus ...................................................... 14 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV ............................................. 15 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV ................................................................... 15 2.4.3 Phân loại TSWV ................................................................................. 15 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV ....................................................................... 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV ........................................... 17 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV ................................................................. 20 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus ............................................................. 20 2.5.1 Nguồn gốc của TMV .......................................................................... 20 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV ..................................................................... 21 2.5.3 Phân loại TMV ................................................................................... 21 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV ......................................................................... 21 2.5.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV ............................................. 22 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV ................................................................... 24 vii 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus .......................................................... 24 2.6.1 Nguồn gốc của CMV .......................................................................... 24 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV ..................................................................... 24 2.6.3 Phân loại CMV ................................................................................... 24 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV ......................................................................... 25 2.6.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV ............................................. 27 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV ................................................................... 27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra ............................................... 29 2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................ 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ........................................... 29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng..................................... 29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .......................................... 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA ............................................................................... 30 2.8.2 Phân loại ELISA ................................................................................. 30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp .................................................................... 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp .................................................................... 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA .................................................................. 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA ................................... 31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ......................... 31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................ 31 2.9.1 Nguyên tắc .......................................................................................... 31 2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR .................................................... 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) ............. 34 2.10.1 Nguyên tắc ........................................................................................ 34 2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................. 34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác ........................................................................... 35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo ............................................................................. 35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR ................................................................ 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) ................... 35 viii 2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra ........................................................................................................... 36 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 36 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam ....................................................... 36 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 37 3.2 Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 37 3.3 Dụng cụ .......................................................................................................... 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA ....... 38 3.4.1 Hóa chất .............................................................................................. 38 3.4.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 38 3.4.2.1 Ly trích mẫu ......................................................................... 38 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA .................................................. 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR ............................................ 40 3.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 40 3.5.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 41 3.5.2.1 Ly trích RNA ........................................................................ 41 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR ................................................. 42 3.5.2.3 Đổ gel điện di ....................................................................... 43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 45 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA ................................................................... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu ........................................................................................ 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ...... 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ....... 48 4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được ........................................ 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá ............. 51 4.2 Kết quả RT – PCR ......................................................................................... 55 ix 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60 7. PHỤ LỤC .......................................................................................................... 63 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pairs cDNA : complementary DNA CMV : Cucumber Mosaic Virus Da : Dalton DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay DEPC : Diethyl pyrodicarbonate DNA : Deoxyribonucleic acic DNase : Deoxyribonuclease dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ig : Immunoglobulin mRNA : Messenger ribonucleic acid OD : Optical density p – NPP : p – nitrolphenol phosphate PBS – T : Phosphate buffer saline with Tween – 20 PCR : Polymerase Chain Reaction PVP : Polyvinylpyrolydol RT – PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction ssRNA : Single strand RNA Ta : Annealing temperature TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting temperature TMV : Tobacco Mosaic Virus TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus UV : Ultra violet xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. ......................................................................... 3 Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. ..................... 6 Hình 2.3 Arachis hypogaea L. ......................................................................... 7 Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. ................ 10 Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV ....................................................................... 15 Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm ........................................................... 17 Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật .............................. 19 Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV ......................................................................... 21 Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật ............................................ 23 Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV ......................................................................... 25 Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật ................................ 28 Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu ................ 53 Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên ............... 54 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên ........................................................................................... 56 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu ............................................................................................ 57 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng ...................................... 45 Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá .... 46 Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá ............................................ 47 Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá ............................................ 48 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ................................................... 50 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá ......... 51 xiii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV .. 46 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ....................... 47 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ...................... 48 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ........................................................... 50 Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá ............................. 51 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích. Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia. Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên. Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật. Tỉnh Tây Ninh có diện tích trồng thuốc lá và đậu phộng khá lớn, sản lượng thu hoạch hàng năm khá cao và mang lại nhiều lợi nhuận. Nhưng trong những năm gần đây, việc trồng trọt hai loại cây này đã gặp nhiều tổn thất vì bệnh do virus gây ra. Trong đó, Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) là ba loại virus mà tác hại của nó vô cùng nghiêm trọng, dẫn tới giảm năng suất và chất lượng nguyên liệu cây trồng. Một khi bệnh đã phát triển thành dịch thì rất khó khống chế và có khi phải tiêu hủy tất cả diện tích đã trồng trọt. Việc làm này sẽ gây nhiều khó khăn và đem lại tổn thất lớn cho người trực tiếp canh tác cũng như cho kinh tế đất nước. Chính vì lý do đó mà chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”, nhằm đưa ra phương pháp phát hiện bệnh sớm nhất, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời, với mong muốn giảm bớt được thiệt hại do các virus này gây 2 ra, góp phần ổn định được nguồn thu nhập từ thuốc lá và đậu phộng cho tỉnh Tây Ninh nói riêng và cả nước nói chung. 1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chẩn đoán bệnh Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Phát hiện Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2 Yêu cầu Lấy mẫu thuốc lá có triệu chứng nhiễm CMV, TMV, TSWV và đậu phộng có triệu chứng nhiễm TSWV ngoài đồng ruộng, tại các huyện trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật DAS – ELISA và RT – PCR, sau đó mới tiến hành chẩn đoán. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 2.1.1 Vị trí phân loại Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotyledones Họ : Solanaceae Tên khoa học : Nicotiana tabacum L. Tên tiếng Anh : Tobacco Tên tiếng Việt : Thuốc lá 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Hàng ngàn năm trước Công nguyên, người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác. Họ dùng thuốc lá với mục đích nghi lễ và chữa bệnh. Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là Tabaccos. Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới. Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào Việt Nam. 2.1.3 Đặc điểm di truyền Bộ nhiễm sắc thể 2n = 48. Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 3,9 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể. Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 3,73 × 109 bp. 2.1.4 Đặc điểm hình thái. Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm: Rễ cái, rễ nhánh, rễ hấp thụ và rễ bất định. Rễ thường ăn sâu xuống đất từ 1,5 – 2 m. Thuốc lá là cây cỏ nhất niên, cây trưởng thành thường cao 1 – 2 m, chỉ phân nhánh ở ngọn. Trên thân cây có nhiều lóng, được phân cách bởi những đốt. Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. 4 Lá cây thuốc lá rất to, đơn nguyên, hình bầu dục, đầu hơi nhọn, mọc cách, mềm, có lông dính ở hai mặt. Số lá trên thân chính trung bình từ 20 – 35 lá. Hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, màu trắng hồng, hồng tươi, dài 1 – 2 cm. Quả nang, hai ngăn. Mỗi cây có 100 – 150 quả trên một chùm hoa, có những cây (tùy giống) có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa. Hạt thuốc lá rất nhỏ, rất cứng, bề mặt vỏ hạt sù sì, nhiều nếp nhăn. 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu Thuốc lá là cây ưa sáng trực tiếp. Cây có thể thích nghi với một phổ khí hậu rộng. Nhiệt độ lý tưởng cho cây thuốc lá: 25oC – 28oC. Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%. Độ ẩm đất thích hợp: Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%. Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%. Giai đoạn già chín của lá: 60%. 2.1.5.2 Yếu tố đất đai Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt, thoát nước dễ. Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9. Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 – 110kg/ ha. 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá. Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều. Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá. Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu. 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng 5 Lợi nhuận đối với người trồng thuốc lá rất cao. Sản phẩm chính của cây thuốc lá là sản xuất ra các loại thuốc hút, nhai, ngửi. Các bộ phận trên cây thuốc lá có tỷ lệ: Lá: 30%, thân: 40%, hạt: 20% và rễ: 10%. Như thế, đối với các nước có nền công nghiệp chưa phát triển, thì việc sử dụng năng suất sinh học còn rất thấp vì ngoài lá ra không tận dụng được các bộ phận còn lại để sản xuất các sản phẩm khác. Thành phần độc hại trong thuốc lá có nhiều, quá trình nhiệt phân, ngưng tụ trong khi đốt, cháy (hút) đã tạo ra một số chất, ảnh hưởng sâu sắc đến hóa tính của lá thuốc. Vì thế, để hạn chế độc hại của thuốc lá đòi hỏi nhà sản xuất thuốc lá phải nỗ lực tìm ra các biện pháp để giảm bớt các thành phần này. Người ta tận dụng các loại phế thải thân, lá thuốc lá để sản xuất ra sunfat nicotin, có tác dụng tốt trong phòng trừ sâu bệnh trên đồng ruộng. Từ thân và lá thuốc lá, giáo sư R. L. Wain (Anh) đã chiết xuất được sclareol và 13 epi sclareol có tác dụng phòng trừ được bệnh rỉ sắt trong cây họ đậu. Sản xuất nước hoa từ hoa thuốc lá, acid nicotinic, acid citric lấy từ cây thuốc lá nhiều hơn từ 2 – 3 lần trong cam chanh để sử dụng vào công nghiệp thực phẩm. Chiết xuất được trong hạt thuốc lá 35% 40% dầu sử dụng trong công nghiệp. Thân cây thuốc lá còn được chế biến thành thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng cao, thu được 3 – 3,5 tấn/ ha hoặc thu được 12% 15% protein cao cấp trong cây thuốc lá để làm thực phẩm. Ngoài ra, các phế thải của thuốc lá trong quá trình chế biến như vụn, bụi được tận dụng chế biến làm phân hữu cơ khá tốt. Về mặt nghiên cứu, cây thuốc lá được coi là đối tượng thử nghiệm các nghiên cứu sinh học. Nicotiana spp. được dùng làm mô hình nghiên cứu in vitro về sự tái sinh ở thực vật từ năm 1957. Trong những nghiên cứu cổ điển của Skoog và Miller thì Nicotiana tabacum là đối tượng được chú ý sớm nhất. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô, về sinh học phân tử đã đạt được nhiều thành công ở cây thuốc lá. Hy vọng trong tương lai, cây thuốc lá sẽ còn có nhiều công dụng khác để phục vụ cho nhu cầu xã hội. 6 (C) (A) (B) (A): Vườn cây thuốc lá Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. (D) (E) (F) (B): Đặc điểm hình thái (C), (D), (E), (F): Sự đa dạng về chủng loại và màu sắc ( 7 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng 2.2.1 Vị trí phân loại Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Phân họ : Faboideae Giống : Aeshynoenaeae Tên khoa học : Arachis hypogaea L. Tên tiếng Anh : Peanut, groundnut Tên tiếng Việt : Đậu phộng, lạc 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố Cây đậu phộng đã có từ khoảng 1500 – 1200 năm trước Công nguyên. Người Inca trồng đậu phộng như một loại rau tên là “ynchis” dọc theo vùng duyên hải Peru. Đến 1609, người Tây Ban Nha phát hiện thấy các vùng trồng đậu phộng ở Nam Mỹ, đặc biệt trên những vùng đảo Tây Ấn, Mexico, vùng biển Đông – Đông Bắc Braxin, trên những dãi đất ấm áp của vịnh Ria Plata (Argentina, Paragoay, cực Tây Nam Braxin, Peru), và gọi tên là “mani”. Có nhiều quan điểm của nhiều tác giả tranh luận về trung tâm khởi thủy chính xác của loài Arachis hypogaea. Nhìn chung các quan điểm cho rằng Braxin là trung tâm khởi nguyên của loài Arachis hypogaea, một số tác giả lại cho rằng nơi xuất xứ là ở Bolivia (Krapovickas, 1968, Cardenas, 1969), vùng thượng lưu sông Plata. Hiện nay, cây đậu phộng được trồng rộng rãi trên 100 nước từ 40o Bắc đến 40o Nam thuộc vùng nhiệt đới và các vùng ấm áp trên thế giới. Châu Á đứng hàng đầu thế giới về diện tích trồng đậu cũng như là sản lượng, tiếp theo là châu Phi, Bắc Mỹ rồi đến Nam Mỹ. Trong số 25 nước trồng đậu phộng ở Châu Á, Việt Nam đứng hàng thứ 5, và đậu phộng đã được trồng khá phổ biến từ xưa đến nay ở nhiều nơi. 2.2.3 Đặc điểm di truyền Bộ nhiễm sắc thể: 2n = 40. Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 4,31 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể. Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 4,2 × 109 bp. Hình 2.3 Arachis hypogaea L. 8 2.2.4 Đặc điểm hình thái Đậu phộng có rễ cọc phát triển tốt. Rễ dạng bò khoẻ hơn dạng mọc đứng. Đây là cây cỏ nhỏ, nhất niên, nhánh sà, có lông, chiều cao từ 20 – 40 cm. Thân chính mọc từ đốt cuối của trụ trên lá mầm, hai lá mầm đối xứng nhau. Có 4 hoặc 3 lá chét ( chỉ có ở Erectoides), hình dạng lá thay đổi từ thuôn, lưỡi mác đến elip, elip thuôn dài, có lông bao phủ. Hoa đậu phộng dạng cánh bướm, màu vàng, cánh rời, cây phát hoa ở nách lá, các hoa ở gần mặt đất. Quả hình thành dưới đất, thắt từ 1 – 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt với 2 lá mầm và 1 phôi thẳng. Bế quả có quả bì chạm trổ. Hạt có vỏ lụa mỏng, đỏ, chiều dài 7 – 21 mm, đường kính 5 – 13 mm. 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu Cây sinh trưởng cần nhiều ánh sáng mặt trời và thời tiết ấm nóng. Không mẫn cảm với chiều dài ngày. Ở những vùng có lượng mưa từ 500 – 1250 mm phân phối đều, cây sẽ cho sản lượng cao. Đậu phộng không chịu đông giá và úng nước. 2.2.5.2 Yếu tố đất đai Đất đai lý tưởng cho đậu phộng là thoát nước nhanh, màu sáng, lỏng, dễ vỡ, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và một lượng chất hữu cơ vừa phải (York và Codwell, 1951). Có thể đạt sản lượng cao trên đất hơi chua pH = 6 – 6,4 (Woodrof, 1966). Cây khá mẫn cảm với đất mặn. Đậu phộng có nhu cầu về chất dinh dưỡng các loại cao. 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật Có trên 90 loài sâu, 9 giống tuyến trùng gây hại cho đậu phộng trên đồng ruộng. Ngoài ra cây còn chịu ảnh hưởng của các loại bệnh nấm. Bên cạnh đó thì cỏ dại tranh với cây về độ ẩm của đất, chất dinh dưỡng, ánh sáng và còn là ký chủ chuyển giao một số bệnh cây. Ngoài ra, đậu phộng còn chịu thiệt hại bởi các loài sâu hại lá trong kho như mọt. 9 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng Đậu phộng là cây thực phẩm, cây có dầu quan trọng dùng chế biến thành dầu thực vật. Trong số các loại cây hạt có dầu trồng hàng năm trên thế giới, đậu phộng đứng thứ hai sau đậu tương về diện tích trồng cũng như về sản lượng. Giá trị dinh dưỡng trong 100g đậu phộng gồm có: 22g cacbonhydrat, 50g chất béo và hàm lượng protein là 24g. 100g đậu phộng cung cấp 590 KCalo. Các nhà khoa học thuộc Đại học Y Harvard (Mỹ) đã rút ra kết luận: Người thường xuyên ăn đậu phộng hay bơ lạc sẽ ít có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường type 2 so với những người khác. Ăn 140g đậu phộng hay bơ lạc mỗi tuần sẽ giảm được 27% nguy cơ mắc bệnh. Điều đó được giải thích là do trong đậu phộng có chứa chất béo chưa bão hòa giúp cải thiện độ ổn định của insulin đường máu. Ngoài các chất chống oxy hóa ra thì đậu phộng có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng khác nên nó còn giúp ngăn ngừa bệnh tim nhờ làm giảm lượng cholesterol trong máu. Đậu phộng là một trong những cây xuất khẩu thu ngoại tệ của nước ta. Hiện nay, ngoài những vùng chuyên canh, thì nó đã và đang được trồng khá phổ biến ở nhiều vùng trong nước. Mặc dù có vai trò quan trọng như vậy, nhưng nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu các ứng dụng về đậu phộng ở nước ta nhìn chung vẫn còn nhiều hạn chế. 10 ( Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. (A) (B) (C) (D) (A): Đặc điểm hình thái (B): Hoa đậu phộng (C): Cây đậu phộng trưởng thành (D): Hạt đậu phộng 11 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra 2.3.1 Sơ lƣợc chung về virus gây hại thực vật 2.3.1.1 Đặc điểm chung Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ. Chúng thiếu hệ thống men, hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số lượng. Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều virus. Chúng không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành nhiều virus mới. Cơ thể thực vật kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết. Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thước rất nhỏ bé, cấu tạo rất đơn giản: Là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy nhiên, cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA. Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan. Các acid nucleic (RNA hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng. Trọng lượng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da. Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: Hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh trùng. Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trường có thể tạo thành các tinh thể. 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dưới rồi lại từ dưới lên trên khi các dòng chất dinh dưỡng được vận chuyển về các cơ quan sinh thực. Virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn. Các con đường truyền bệnh: Truyền qua nhân giống vô tính: Ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép, cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay thân cây. Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: Có khoảng 100 loài virus có khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí. 12 Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Trồng cây với mật độ dày, giao tán, lá cọ sát nhau giữa cây bệnh với cây khỏe. Hay truyền qua vết thương do gió, chăm sóc, thu hái, gia súc. Truyền bệnh bằng côn trùng môi giới (nhện, tuyến trùng): Côn trùng là nhóm môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên đồng ruộng. Một loại côn trùng thường chỉ là môi giới truyền bệnh cho một loại virus mà thôi. Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng: Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây tới 30 phút sau khi chích hút ở cây bệnh và có thể lây ngay. Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền bệnh cho cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời. Đây là kiểu truyền bệnh theo phương pháp sinh học. Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian giữa hai nhóm trên. Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi: Tăng về số lượng, tăng cường tính ký sinh gây bệnh và được đưa vào đúng tầng mô mẫn cảm bệnh. Nhưng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức sống giảm. Truyền bệnh nhờ nấm: Đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng truyền bệnh virus cho cây. Truyền bệnh bằng dây tơ hồng (Cuscuta sp.): Đây là thực vật thượng đẳng ký sinh tạo rễ ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa. Do vậy, có nhiều loại virus thực vật di chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh. 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá  Bệnh virus Y khoai tây Triệu chứng: Rất đa dạng, điển hình nhất là khảm và gân xanh đậm, lá nhăn nheo, biến dạng, cây bị lùn. Virus gây bệnh: Potato Virus Y (PVY), thuộc nhóm Potyvirus. 13  Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá Triệu chứng: Bao gồm triệu chứng của TMV, CMV, lá bị khảm và có những vệt xanh đậm dọc theo gân lá. Virus gây bệnh: Tobacco Etch Virus (TEV), thuộc nhóm Potyvirus.  Bệnh virus đốm gân thuốc lá Triệu chứng: Đa dạng tùy theo những dòng thuốc lá khác nhau, lá bị khảm nhẹ, biến dạng, triệu chứng điển hình là hóa vàng dọc theo gân chính. Virus gây bệnh: Tobacco Vein Mottling Virus (TVMV), nhóm Potyvirus.  Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng Triệu chứng: Trên tàn lá xuất hiện dạng khảm có màu vàng trắng hay trắng, đôi khi mất màu vùng mô giữa các gân lá, thường được xem như là bệnh khảm calico, các dạng sọc vàng và chết hoại cũng có thể xảy ra. Thông thường, lá không bị biến dạng, cây có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng. Virus gây bệnh: Alfalfa Mosaic Virus (AMV).  Bệnh virus cong lá thuốc lá Triệu chứng: Lá cong và biến dạng, lốm đốm vàng và chết hoại, cây bị lùn. Virus gây bệnh: Tobacco Leaf Curl Virus (TLCV). 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng  Bệnh hoại tử chồi (thối ngọn) Triệu chứng: Lá có các vòng đồng tâm úa vàng hoặc các mảng vàng xanh xen lẫn nhau, cây thối ngọn, rồi lan sang các phần khác, cây bị ức chế sinh trưởng, nách lá nảy chồi nhanh, các lá ở chồi nách giảm kích thước, bị vặn, đốm khảm và úa vàng. Cây bị nhiễm sớm lá xoăn lại và thành dạng bụi. Virus gây bệnh: Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV).  Bệnh chùn đậu phộng do virus Triệu chứng: Đầu tiên xuất hiện các vết và đốm tròn úa vàng, sau đó mờ dần, phiến lá màu xanh đậm với đốm nhạt, cây cằn lại, xanh tối, tạo thành một búi, lá có đốm khảm, vòng vàng, quả nhỏ, rễ kém phát triển, đen tối, vỏ dễ bong, dễ nhiễm các vật hại khác. Virus gây bệnh: Peanut Clump Virus (PCV). 14  Bệnh hoa lá đậu phộng do virus Triệu chứng: Cụm xanh tối rải rác xen kẽ với các vòng úa vàng xuất hiện ở các lá non nhất, cây bị nhiễm không có dấu hiệu cằn cỗi. Virus gây bệnh: Peanut Mottle Virus (PMV), thuộc virus khoai tây nhóm Y.  Bệnh virus đốm nhạt ở cây đậu bò Triệu chứng: Gân lá trong, lá bị uốn cong, các vết hoại tử hình thành ở lá và cuống làm rụng lá, cây lùn, quả ít, lá non có từng dải sọc. Virus gây bệnh: Cowpea Mild Mottle Virus (CMMV).  Bệnh khảm xanh đậu phộng Triệu chứng: Đốm úa vàng, ở lá chết non gân lá trong, cây bị hại nặng bị lùn. Virus gây bệnh: Peanut Green Mosaic Virus (PGMV).  Bệnh đốm vàng đậu phộng do virus Triệu chứng: Lá có khảm xanh rõ rệt. Virus gây bệnh: Groundnut Chlorotic Spotting Virus (GCSV).  Bệnh khảm vàng Triệu chứng: Lá non bị nhiễm có các đốm vàng sáng, nhăn nheo, mép lá cuốn lên phía trên. Virus gây bệnh: Được truyền bởi bọ phấn trắng Bemisia tabaci. 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV Năm 1915, TSWV được phát hiện lần đầu tiên khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia. Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và nhiều vùng trên thế giới. Năm 1926, TSWV xuất hiện trên cây thơm (dứa) ở Hawaii và phát triển thành dịch ở California vào năm 1935. Năm 1938, phát hiện thấy TSWV trên cà chua trồng trong nhà kính tại Ohio. Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng tại Hawaii. Năm 1970, lần đầu tiên, TSWV được xác định là gây bệnh tại Georgia. Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng nề các cánh đồng trồng đậu phộng vào năm 1985 – 1986. 15 Năm 1972, TSWV được phát hiện thấy lần đầu tiên tại Louisiana. Năm 1989, TSWV gây thiệt hại nặng cho thuốc lá, đậu phộng và cà chua ở miền Nam Georgia. Trong hai năm 1997 và 1998, tại Florida, ước tính thiệt hại khoảng 40 triệu USD mỗi năm do TSWV gây bệnh trên đậu phộng trồng tại đây (University of Florida, 2000). 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV TSWV là virus thuộc họ Bunyaviridae, giống Tospovirus. Bunyaviridae là một họ lớn gồm những virus được mang bởi động vật chân đốt, gồm năm giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó, Tospovirus được đánh giá là một trong mười nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất. Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA. Genome của TSWV gồm ba phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba sợi RNA này khác nhau về kích thước và được gọi là Large (L), Middle (M), Short (S). Mỗi RNA được bao bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwyk và cộng sự, 1993). Giữa các đoạn L, M, S có trình tự kết thúc như nhau. TSWV hình cầu, đường kính 80 – 110 nm (Lindsey Irons and Emily Sims). 2.4.3 Phân loại TSWV TSWV được phân loại như là đại diện duy nhất của nhóm cây đơn thân (Mathew, 1979). Năm 1989, được phân chia thành 2 dòng: TSWV dòng L và TSWV dòng I. Những năm 1989 - 1992, 2 dòng này được xác định là có đặc tính huyết thanh học khác nhau và được đổi tên thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I). Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV 16 Hiện nay, TSWV được phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Người ta dựa trên tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I). Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II). Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III). Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV). Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V). Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV. 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp các lục địa. Nó bao gồm những cây cảnh như Aster, Vinca, Impatiens, Ranunculus, Zinna và các cây trồng như Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa và Solanum tuberosum, và Arachis hypogaea. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính (Y.Antignus và cộng sự, 1997). 2.4.5 Con đƣờng truyền bệnh TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau. Có ít nhất 4 loài bọ trĩ: Thrips tabaci Lind, Western Flower Thrips (bọ trĩ hoa) (Frankliniella occidentalis), Frankliniella schultzei (Trybom), Frankliniella fusca (Hind). Trong đó, do có sự phân bố rộng rãi nên Western Flower Thrips (Frankliniella occidentalis) và Onion Thrips (bọ trĩ hành) (Thrips tabaci) là các vectơ chính truyền bệnh. Bọ trĩ (Thrips) là những côn trùng có kích thước rất nhỏ (0,5 1mm), khó thấy bằng mắt thường, thân thon, di chuyển nhanh nhẹn bằng cách nhảy, con trưởng thành có thể bay. Chúng thường di chuyển với số lượng lớn và bay theo gió tới hàng dặm. Con trưởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh sản không cần con đực, đẻ trứng vào mô mềm của thân cây, lá hay hoa. Một ổ trứng có từ 50 – 60 trứng, ấp trứng trong 7 ngày. Sau khi trứng nở, ấu trùng sẽ ăn ngay, trong khoảng 6 – 7 ngày trước khi bắt đầu chuyển vào giai đoạn “ngủ”. Ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng đưa virus vào bên trong cơ thể. Thời gian ăn càng kéo dài thì khả năng mang virus càng tăng lên. Chỉ ấu trùng mới có khả năng mang virus. 17 Sau đó, chúng không ăn nữa, chui vào đất, sâu khoảng 8 cm, trở thành nhộng, và bắt đầu “ngủ”. Kết thúc giai đoạn “ngủ”, chúng trở thành bọ trĩ trưởng thành, có cánh và lên mặt đất. Thời gian để từ trứng trở thành bọ trĩ trưởng thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện phát triển. ( Ấu trùng bọ trĩ chưa lan truyền bệnh cho cây ngay được mà phải chờ đến khi chúng trưởng thành. TSWV sản sinh trong bọ trĩ sẽ tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Có hai lý do để cần thời gian cho bọ trĩ trưởng thành: Thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, từ miệng vào tuyến nước bọt, để truyền cho cây khác. Con non không có cánh nên khả năng di chuyển sang cây khác khó thực hiện được, vì vậy phải đợi trưởng thành di chuyển dễ dàng hơn. Mỗi năm có nhiều thế hệ bọ trĩ sinh ra và trưởng thành, nên số lượng của chúng khá nhiều. Vòng đời trung bình của bọ trĩ vào khoảng 30 ngày. 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh TSWV thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ dao động từ 20oC đến 37 o C. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp gây bất lợi cho bọ trĩ. Nhiệt độ lạnh trong mùa đông cũng làm giảm đáng kể số lượng bọ trĩ. TSWV phát triển trong suốt giai đoạn sinh trưởng, sinh dưỡng của cây, giai đoạn mà virus được bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân tới, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây Hình 2.6 Bọ trĩ trƣởng thành dài 1mm 18 nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây (Ray Cerkauskas, 2004). 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy thuộc vào tuổi cây, điều kiện môi trường, mức độ lây nhiễm, số lượng và thành phần các virus gây hại cho cây ký chủ. Sự nhiễm bệnh cho cây ký chủ được biểu hiện thấy trên những tế bào biểu bì, được truyền bệnh thông qua những vết thương do bọ trĩ cắn. Triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện trong vòng từ 2 đến 4 ngày, hoặc từ 10 ngày đến 6 tuần, có khi lại lâu hơn. Những cây con có thể bị héo và chết trong vòng 1 tuần kể từ khi nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhưng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trưởng thành đều có thể bị TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, như bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thường. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thương phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trường gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác. 19 Cây thuốc lá Lá thuốc lá Lá đậu phộng Cây đậu phộng Lá cà chua Trái cà chua Trái ớt Thân Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật ( 20 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Cây con rất dễ bị nhiễm TSWV, do đó nên trồng cây con trong nhà kính hoặc sử dụng màng che cẩn thận, phun thuốc diệt côn trùng để ngăn ngừa bọ trĩ tấn công. Có mật độ trồng phù hợp để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những vùng nhiễm bệnh đến. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trên cùng một vùng đất. Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị ảnh hưởng của TSWV. Loại bỏ các loài cỏ dại và cây mọc tự nhiên quanh khu vực trồng trọt. Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3 – 4 tuần. Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm để kháng bệnh. Khống chế bọ trĩ bằng các biện pháp sinh học để có hiệu quả và có lợi nhất, mà không gây ô nhiễm môi trường. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lượng và thời gian hợp lý để tiêu diệt được nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt được kết quả tốt nhất. Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để tránh sự kháng thuốc. 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.5.1 Nguồn gốc của TMV Năm 1892, nhà bác học Nga D. I. Ivanopski khi nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc lá đã phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh”, không phải là vi khuẩn, không nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học mà có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn. Năm 1898, M. Baijerinck, Đan Mạch, cũng đã phát hiện và xác nhận nguồn gây bệnh đó mang tên tượng trưng là “virus” có nghĩa là “chất độc”. Năm 1939, Kaushe Pfankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus khảm thuốc lá TMV. Điều này đã giúp cho việc nghiên cứu và phát hiện nhóm virus gây hại thực vật phát triển nhanh chóng và thu được nhiều thành tựu to lớn. TMV là virus thực vật đầu tiên được phát hiện (Võ Thị Thu Oanh, 2002). 21 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV TMV hình que, dạng ống thẳng cứng, không di động, chiều dài 300 nm, đường kính 18 nm, trọng lượng phân tử 39,4 triệu Da (Caspa, 1963). Lớp vỏ gồm 2134 phân tử protein, chiếm 95% trọng lượng phân tử, mỗi phân tử protein gắn kết với 3 nucleotide kề cận trên sợi RNA và với các protein khác xung quanh, tạo thành cấu trúc xoắn từ phải qua quanh phân tử RNA (16,3 phân tử protein cho 1 vòng xoắn). Mỗi phân tử protein chứa 158 amino acid. Genome của virus là RNA dương tính. RNA gồm 6401 ribonucleotide, cũng có cấu trúc xoắn tương tự, nằm chính giữa cách 1 bán kính khoảng 4 nm, nhờ đó mà RNA không bị phân hủy bởi enzyme cellulase của lớp vỏ protein. ( 2.5.3 Phân loại TMV TMV thuộc giống Tobamovirus và là một thành viên trong loài virus có cấu trúc giống xoắn alpha. 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV TMV có dãy ký chủ rộng lớn, 199 loài và 30 họ, nhưng ký chủ tự nhiên lại có giới hạn, hầu hết thuộc họ Solanaceae: Thuốc lá, cà chua, tiêu, là những cây trồng dễ bị ảnh hưởng nhất. Chưa có vectơ sinh học nào được tìm thấy. 2.5.5 Con đƣờng truyền bệnh Hầu hết những côn trùng ăn lá đều có thể truyền TMV, nhưng không có hiệu quả. TMV có khả năng xâm nhiễm và lây lan rất cao. Bệnh dễ lây lan đến mức chỉ cần có 1 cây bệnh thì có thể lây sang 8 – 10 cây khác. Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV 22 Virus dễ dàng truyền qua các vết thương cơ giới, tiếp xúc cơ học trong quá trình trồng trọt hay do sự cọ xát vào nhau giữa lá khỏe và lá bị bệnh. Vì vậy, côn trùng không phải là tác nhân chủ yếu trong việc truyền virus. TMV còn có thể lây sang từ các sản phẩm như thuốc điếu, thuốc nhai. Virus chủ yếu tồn tại trong xác cặn bã (thân, rễ cây) vụ trước còn lại trên mặt luống, đây cũng là nguồn lây bệnh đáng kể, hay có thể từ các cây dại gần khu vực vườn ươm như: Cà dại và cây thù lù cạnh (Physalis angulata L.), là những cây rất mẫn cảm với virus này. Nếu trên ruộng đã có một số cây nhiễm virus thì sự lây lan chủ yếu là do người trồng. Nếu cây con trong vườn ươm đã nhiễm virus thì bệnh sẽ biểu hiện khoảng 1 tuần sau khi trồng. 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh Bệnh dễ xảy ra khi cây dư ẩm, mọng nước. Quá trình lây bệnh trên cây trồng diễn ra chủ yếu vào thời kỳ cây sinh trưởng mạnh. Bệnh lan nhanh vào giai đoạn nhổ cây, xới xáo, vun luống, bẻ ngọn, bấm chồi. Ngoài đồng ruộng, TMV có thể tồn tại với số lượng rất lớn trong rễ hoặc thân cây vụ trước, cho đến khi cây thuốc lá vụ sau được trồng tiếp tục. TMV có trong thân cây hoặc mảnh vụn thuốc lá sau khi thu hoạch xong, sẽ trở nên mất hoạt tính nếu bị nắng mưa phân hủy trong vòng từ 5 đến 6 tháng. Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại suốt hơn 2 năm liền trong đất trồng hay các mảnh vụn của thân, rễ nếu các phần này không bị phân hủy. Ngoài ra, loại đất trồng cũng có ảnh hưởng đến thời gian tồn tại của virus. 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV TMV có biểu hiện triệu chứng dạng khảm trên thuốc lá. Lá non bị biến dạng, cong xuống, có khảm, loang lỗ xanh đậm, xanh nhạt, có chổ biến vàng dọc gân lá. Triệu chứng này rõ rệt hơn trên lá non và mô non. Khảm không làm chết cây nhưng nếu bệnh xảy ra cây sẽ bị còi cọc, héo rũ dần. Trong suốt thời gian nhiệt độ không khí cao (khô, nóng), cường độ chiếu sáng mạnh, những lá bị bệnh có thể chết, hiện tượng này gọi là “cháy do khảm”. Trường hợp này vùng chết lan rộng trên lá. Những lá bệnh vặn vẹo, cong queo, kéo dài ra. Trong khi đó, rễ cây bệnh vẫn biểu hiện bình thường. Triệu chứng bệnh thường biểu hiện sau khi trồng từ 7 đến 10 ngày trở lên. Càng nhổ cây con bị bệnh càng muộn thì bệnh ngày càng nặng. 23 (E) (F) (A): Trái cà chua Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật (B), (C), (D): Cây thuốc lá (E), (F): Lá thuốc lá ( (A) (D) (B) (C) 24 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV Luân canh với cây trồng khác, không phải ký chủ của virus gây bệnh. Tiêu hủy phần còn lại của cây sau thu hoạch. Vệ sinh trong và ngoài khu vực gieo trồng. Chọn vườn ươm trên đất mới hoặc đã luân canh từ 3 vụ trở lên. Sử dụng giống kháng, cây sạch bệnh. Tỉa bỏ cây bệnh ngay sau khi trồng càng sớm càng tốt. Tuyệt đối không hút thuốc trong vườn ươm, ruộng trồng. Khi vào vườn ươm và mỗi 15 – 20 phút làm việc trong luống ươm phải rửa tay chân và công cụ bằng bột giặt hay bằng dung dịch sửa tươi. Không được sử dụng vật dụng có liên quan đến thuốc lá nguyên liệu như: Bao tải đóng kiện, tấm bạt che phủ, sọt đựng lá để che phủ luống ươm và vận chuyển cây con cũng như lá thuốc tươi. Áp dụng hiện tượng kháng chéo: Lây nhiễm chủng virus có độc tính thấp lên cây khỏe nhằm tăng sức chống chịu của cây đối với virus khác có độc tính cao. Cơ sở khoa học của hiện tượng được giải thích bằng giả thiết: Vỏ protein của chủng virus lây nhiễm đầu tiên sẽ cản trở tách RNA ra khỏi vỏ protein của virus sau, do đó ức chế sự nhân lên của virus này. 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus (CMV) 2.6.1 Nguồn gốc Bệnh do CMV được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 (Doolittle, 1916), là một trong số những bệnh cây sớm nhất được biết là do virus gây ra. Sau đó, chúng xuất hiện ở nhiều nơi khác nhau tại Mỹ, cuối cùng lan tới châu Âu và châu Phi (Price, 1934) và những nơi khác trên thế giới. 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV CMV hình tròn, đường kính 28 nm, trọng lượng phân tử vào khoảng 5,8 triệu đến 6,7 triệu Da, trong đó chứa 18% RNA và 82% protein. Genome của nó là ssRNA, có kích thước 8621 kb. Genome chia ra làm 3 phần: Phần lớn nhất dài 3389 kb, phần thứ hai dài 3035 kb và phần thứ ba dài 2197 kb (Gould và Symons, 1977). Tỷ lệ cơ bản của các nucleotide: G: 24%, A: 23%, C: 23%, U: 30%. Cuối đầu 5’ của RNA có 1 mũ methylnucleotide và không có poly (A) ở đầu 3’. Genome có cấu trúc giống như tRNA 25 hoạt động, có khả năng nhận tyrosine. Không tìm thấy 1 nucleic acid nào trong virion mà không thuộc genome virus. Virion được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây ký chủ và trong tế bào chất. Trong tế bào chất nó có dạng kết tinh (thường là hình thoi, hình lục giác, hình cầu răng cưa, hay dạng lõm). ( 2.6.3 Phân loại CMV Cucumber Mosaic Virus thuộc họ Bromovidae. Họ này gồm 5 giống: Cucumovirus, Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus và Oleavirus. Trong đó, CMV thuộc giống Cucumovirus. CMV gồm có nhiều dòng, bao gồm: A – CMV, E – CMV, L – CMV, N – CMV, P – CMV, Z – CMV và WAI// WAII, nó được chia ra làm 2 nhóm kháng nguyên, ToRS và DTL (Devergne, 1975). 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV CMV có dãy ký chủ rộng lớn, 191 loài trong 40 họ. Trong số đó, chịu ảnh hưởng của virus này nhiều nhất là ớt (Capsicum annum L.), cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) và chuối (Musa L. spp.). Một số cây trồng ký chủ như: Các loại dưa, cà chua, rau spinach, cần tây, tiêu, cải xoong, củ cải đường, củ cải, su su, thanh yên, bầu bí, đậu lima, hành tây, cây anh đào, khoai tây, đại hoàng, cà rốt, thì là, ngò tây (Chupp và Sherf, 1960), mướp (Huang và cộng sự, 1987), atiso (Chabbouh và Cherif, 1990). Một số cây cảnh làm ký chủ: Cúc, cây phi yến, phong lữ, lay ơn, cây vòi voi, dạ lan hương, vạn thọ, bìm bìm, dừa cạn, dã yên thảo, trúc đào, hoa mõm chó và các loại cây có hoa rực rỡ (Chupp và Sherf, 1960; Agrios, 1978). Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV 26 2.6.5 Con đƣờng truyền bệnh CMV có thể truyền bằng con đường cơ học nhưng vì không là virus bền vững như TMV nên không được truyền bởi những người tiếp xúc với cây bệnh. Virus lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá, có hơn 60 loài, bao gồm: Myzus persicae, Acrythosiphon pisum và Aphis craccivora. Có 2 loại rệp: Có cánh và không cánh, nhưng thường là không cánh. Rệp không cánh hình quả trứng màu xanh và đỏ. Khi thiếu thức ăn, rệp mọc cánh để có thể di chuyển sang nơi khác. Rệp non chịu đói kém hơn rệp trưởng thành và nhạy cảm với điều kiện bất lợi của môi trường, thuốc hóa học. Trong quá trình sinh trưởng phát dục rệp non lột xác 3 lần. Trong đó, thành trùng là vectơ quan trọng nhất. Tuy nhiên, tất cả các giai đoạn ấu trùng của rệp đều có thể truyền bệnh. Khi chích hút trên lá bệnh, nó thu nhận virus vào vòi hút chỉ trong 5 giây và truyền sang cây khỏe trong 10 giây. Do truyền theo kiểu virus không bền vững nên khi chúng vừa chích hút xong trên cây bệnh lập tức bay sang cây khỏe gần đó truyền bệnh ngay. Vòng đời trung bình của rệp từ 7 đến 8 ngày, có thể có từ 15 đến 17 vòng đời trong năm. CMV còn được truyền thông qua hạt nhưng ở mức độ không ổn định trong 19 loài ký chủ, bao gồm một số cỏ dại, thực vật ký sinh. 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh CMV sống tốt trong cơ thể rệp không ăn là 8 giờ và trong rệp đang ăn thì ít hơn 4 giờ. Tuy nhiên, rệp mất khả năng mang virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm: Nhiệt độ, loài, hành vi tìm thức ăn của chúng, và thời gian di chuyển từ cây bệnh sang cây khỏe. Khả năng rệp truyền CMV sẽ giảm đi sau 2 phút và sẽ mất khả năng lây bệnh sau 2 giờ. CMV xuất hiện trên thuốc lá trong suốt mùa vụ, đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên nhiều cây trồng khác quanh năm. Điều này phần nào giải thích tại sao CMV tồn tại trên thuốc lá từ năm này sang năm khác. CMV được giữ trong rễ của các cỏ dại lâu năm, hoa và cây trồng trong suốt mùa đông và phát triển trở lại vào mùa xuân lúc rệp truyền virus cho những loại cây trồng nhạy cảm với bệnh. 27 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV Triệu chứng CMV rất đa dạng tùy theo dòng thuốc lá, lại dễ nhầm lẫn với các triệu chứng do virus khác gây ra như Tobacco Etch Virus (TEV), Tobacco Mosaic Virus (TMV). Triệu chứng xuất hiện trên cây bệnh trong khoảng từ 6 đến 8 tuần sau khi trồng. Trên lá bệnh xuất hiện đốm vòng vàng nhạt, khảm nhẹ, chết hoại, hình thành lá mới kéo dài, thùy lá co lại hình sợi, lá bị vặn xoắn, phiến lá bất thường, dày, hơi phồng rộp (u lồi) dọc theo gân phía mặt dưới lá. Các lá còn non có mép bị uốn cong về phía dưới, gân chính và các gân phụ nổi rõ, hơi cong queo, thun cuốn lại, thỉnh thoảng có màu nâu nhạt. Nếu nhiễm nhẹ, các triệu chứng trên chỉ xuất hiện ở các tầng lá phía trên của cây. Cây bị bệnh ngả vàng, lùn, khoảng cách giữa các đốt ngắn lại, hoa biến dạng, thường không cho quả, nếu có thì quả nhỏ, màu nhợt nhạt, lớn chậm. 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV Sử dụng giống kháng bệnh, làm sạch cỏ dại xung quanh ruộng. Luân canh với cây trồng không là ký chủ của bệnh. Loại bỏ ngay cây bệnh. Bấm ngọn, bẻ chồi triệt để sẽ làm mất nguồn thức ăn ưa thích của rệp và loại bỏ một phần rệp tập trung ở búp chồi, giảm thu hút rệp có cánh bay đến. Phòng trừ rệp bằng các loại thuốc như: Confider, Oncol, Lanate 0,1% và bằng con đường sinh học. Do khả năng sinh sản của rệp rất lớn nên rất dễ xuất hiện rệp kháng thuốc. Vì thế, sau 3 ngày phun thuốc phải kiểm tra lại, nếu thấy số lượng rệp không giảm thì phải thay thuốc khác. 28 (A) (B) (C) (D) (E) Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật (F) (A): Trái ớt (B): Trái dưa leo (C): Trái cà chua (D): Cây cà chua (E): Cây thuốc lá (F): Rau diếp ( 29 2.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra 2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử. Trong tế bào ký chủ, virus thường ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô thực vật bị nhiễm bệnh, người ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra, người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh được cắt. 2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bệnh là biểu hiện bên ngoài, phản ánh những đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Do đó, đối với các loại bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phương pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài thể hiện những đặc trưng điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. 30 Tuy nhiên, trong một số trường hợp cũng dễ dẫn đến những nghi hoặc và nhầm lẫn, nhất là trong trường hợp chẩn đoán các bệnh có cùng một triệu chứng bên ngoài tương tự nhau nhưng thực chất lại do các ký sinh vật khác nhau gây ra. Triệu chứng bệnh tuy có tính chất ổn định nhưng vẫn có thể biến đổi ít nhiều tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây và điều kiện ngoại cảnh. Do đó, trong những trường hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp bổ sung khác. 2.8 ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 2.8.1 Nguyên lý ELISA Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng: Kháng nguyên, kháng thể và cơ chất tạo màu, gồm hai bước: Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng oxi nguyên tử và chính oxi nguyên tử này oxy hóa cơ chất tạo màu. Cơ chất tạo màu thay đổi màu chứng tỏ sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. 2.8.2 Phân loại ELISA 2.8.2.1 ELISA trực tiếp (Direct ELISA) ELISA trực tiếp được xem là dạng cơ bản nhất của ELISA. Là phương pháp đánh dấu kháng thể với huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên. Trong phương pháp này, kháng thể sơ cấp được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên. Phương pháp ELISA trực tiếp thường được dùng để dò lượng kháng nguyên có trong mẫu bằng cách dùng kháng thể đơn dòng. 2.8.2.2 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Hệ thống ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp ở chổ kháng nguyên được cố định trong pha rắn và sau đó, được gắn kết với kháng thể đặc hiệu được thêm vào. Tuy nhiên, các kháng thể này không gắn với các enzyme tạo màu như ở ELISA trực tiếp mà lại được gắn kết bằng kháng thể thứ cấp (có gắn enzyme tạo màu) được thêm vào sau đó. Các kháng thể thứ cấp này được sản xuất trong cơ thể động vật khác loài so với động vật sản xuất ra kháng thể sơ cấp. Do đó, nếu kháng thể sơ cấp được tạo ra từ cơ thể thỏ thì kháng thể thứ cấp sẽ là những Ig kháng thỏ sản xuất trong cơ 31 thể các động vật khác (thường là ngựa). Điều này tạo ra tính linh hoạt trong quá trình sử dụng. Phương pháp này sử dụng kháng thể thứ cấp được đánh dấu để phát hiện. Đầu tiên, kháng thể sơ cấp được gắn với kháng nguyên. Tiếp theo, cho kháng thể thứ cấp được đánh dấu vào để nhận biết kháng thể sơ cấp. Điều quan trọng là enzyme tạo màu phải có tính đặc hiệu. 2.8.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA là một xét nghiệm khá nhạy dùng để định lượng hormone, kháng nguyên gây bệnh truyền nhiễm và cytokine. Dạng ELISA này có thể cần thiết hơn ELISA trực tiếp và gián tiếp trong một vài trường hợp, đặc biệt là khi lượng mẫu cần phân tích quá loãng để gắn kết lên đĩa polystyrene (ví dụ như một protein trong nuôi cấy bề mặt) hoặc không gắn lên đĩa plastic (ví dụ như phân tử hữu cơ nhỏ). Đây là phương pháp xét nghiệm dựa trên việc đo lượng chất cần phân tích khi chất đó được gắn giữa hai kháng thể bắt (capture antibody) và kháng thể phát hiện (detecting antibody). 2.8.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong phản ứng ELISA Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng. Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên. Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên. Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai. 2.8.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng ELISA Đối chứng âm cho kết quả dương tính do bị nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm. Đối chứng dương không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu là do đối chứng quá hạn sử dụng hay điều kiện bảo quản không tốt. Đối chứng dương và mẫu kiểm tra có màu quá thấp thì cần phải kiểm tra lại kháng thể được gắn vào enzyme và nồng độ chất tạo màu. 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.9.1 Nguyên tắc DNA polymerase là enzyme có chức năng tổng hợp các sợi đơn DNA. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần 32 sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (primer). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Thông qua phương pháp PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro. Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (Denaturation) Phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của phân tử, thường là 94oC – 95oC, trong vòng 30 giây – 1 phút. Bước 2: Giai đoạn lai (Hybridization) Primer gắn vào 2 sợi đơn DNA ở vị trí chuyên biệt. Giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer), cho phép primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc vào Tm của primer, và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (Extension) Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase, vốn là polymerase chịu nhiệt, hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng DNA khuôn mẫu lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng mẫu ban đầu. Theo nguyên tắc, PCR được áp dụng để khuếch đại các DNA có chiều dài từ 200 – 2000 bp. Tổng số DNA khuếch đại = m × 2n n : số chu kỳ. m : số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta cần phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó để tạo các primer bổ sung chuyên biệt. Các primer này gồm 1 primer xuôi 33 (forward primer), ký hiệu là F và 1 primer ngược (reverse primer), ký hiệu là R. Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen. 2.9.2 Ƣu nhƣợc điểm của phản ứng PCR  Ưu điểm Độ nhạy rất cao. Thao tác đơn giản. Thời gian thực hiện nhanh. Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Định lượng so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, dễ bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu ngày, hóa thạch, tóc, móng tay người đã chết. Có thể giúp nhận biết được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay đột biến điểm.  Hạn chế Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Việc mở nắp các eppendorf sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín, như phòng thí nghiệm, sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi eppendorf bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau: Các công đoạn thao tác khác nhau phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. 34 Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không được sử dụng vào các thao tác khác để tránh sự nhiễm. Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phần tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ với các lần thao tác. Các hãng sản xuất đưa ra thị trường nhiều hệ thống có thể loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm. Tuy nhiên bất lợi là giá thành cao. Các sai sót gây ra do Taq polymerase. Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (1000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không quan trọng nếu chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt. Ví dụ: Đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính xác. 2.10 RT – PCR ( Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) 2.10.1 Nguyên tắc Phương pháp RT – PCR dùng để nhân hay khuếch đại DNA bổ sung nhờ enzyme “Reverse transcriptase”. RNA được chuyển mã ngược thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngược. cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Sử dụng hai primer có tính chuyên tính đối với gen, một cDNA có chuỗi trình tự đã được biết rõ, người ta cho khuếch đại trong PCR. Tuy nhiên, cái khó là làm sao phân lập những bản sao của cDNA toàn bộ chiều dài, vì cơ sở thông tin về chuỗi mã của phân tử mRNA cũng rất hạn chế. Chuỗi mã chưa được biết này nằm kề một đoạn nhỏ của chuỗi mã đã biết rõ, chuỗi mã chưa được biết không thể được khuếch đại bằng phương pháp PCR thông thường. 2.10.2 Phƣơng pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA Trường hợp 1: Đối với các loại virus có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA có thể được thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6 35 nucleotide. Đoạn oligo(dT) dùng mRNA làm dây nền để tổng hợp cDNA dây đơn. Kết quả là cuối dây cDNA tạo thành móc hình cong. Khi mRNA được xử lý với NaOH, móc cong này trở thành primer cho DNA polymerase I, hoàn thành việc cặp dây đôi DNA. Móc cong này được cắt bởi S1 nuclease. Trường hợp 2: Đối với các loại virus không có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA chỉ dựa vào các primer chuyên biệt. 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) Kỹ thuật này dùng phân lập các phần nằm trước hoặc sau một đoạn DNA đã biết, từ đó phân tích được chuỗi nucleotide nằm trước hoặc sau của một gen. Kỹ thuật này gồm các giai đoạn sau: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn. Các đoạn DNA được nối lại thành dạng vòng và sử dụng như DNA khuôn cho phản ứng PCR với hai mồi đặc hiệu xuất phát từ phần DNA đã biết. Như vậy kỹ thuật này được sử dụng để xác định promoter hoặc các đoạn nucleotide làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen. 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR Nguyên tắc của kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật PCR bình thường. Sản phẩm DNA của phản ứng PCR thứ nhất (với cặp primer thứ nhất) được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ hai (dùng cặp primer thứ hai) với khoảng cách giữa hai primer lần sau ngắn hơn lần trước. Làm như vậy nhằm tăng tính đặc hiệu, tính chính xác cho sản phẩm cần khuếch đại và sản lượng thu được cũng nhiều hơn. 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’ (5’RACE) và 3’ (3’RACE) của trình tự cDNA.  Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua phiên mã ngược từ phân tử mRNA bằng mồi RT (có gắn Phospho ở đầu 5’) đặc hiệu. Phân hủy RNA ở thể lai DNA – RNA bằng RNase H. Tạo vòng (circularization) sợi đơn cDNA hoặc tạo chuỗi (concatemers) bằng RNA ligase. Khuếch đại DNA bằng NESTED – PCR. 36  Kỹ thuật thực hiện đối với đầu 3’: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua sự phiên mã ngược với adaptor dT ở đầu 3’ của mRNA. Thực hiện PCR gen bằng mồi đặc hiệu và primer adaptor dT có ba vị trí cắt giới hạn (dT – 3 sites adaptor primer) (Kpn I, Xba I, BamH I). Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn thích hợp (Kpn I hoặc Xba I hoặc BamH I). Tạo dòng đoạn DNA nhận được (sau khi cắt) ở vectơ thích hợp và xác định trình tự. 2.13 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới Năm 1996, Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker đã chuyển gen N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen. Năm 1998, Ki Huyn Ryu, Chung Ho Kim và Peter Palukaitis đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy ký chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì. Năm 2001, R. T. Folkertsma, R. W. Goldbach và J. Hille đã mô tả gen SW – 5 của Lycopersicon pervuvianum tạo ra tính kháng TSWV. Năm 2002, Luciana Tavella và cộng sự đã tiến hành việc xác định TSWV trong vector dẫn truyền là Frankliniella occidentalis. 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam Một vài nghiên cứu tại trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh trong những năm gần đây: Năm 2003, Nguyễn Ngọc Bích đã nghiên cứu một số bệnh do virus trên thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh bằng phương pháp ELISA. Kết quả cho thấy: Tại thời điểm điều tra, CMV, TMV, TSWV đang phát triển khá mạnh ở vùng này. Năm 2005, Nguyễn Đình Trường chẩn đoán thấy trên cây ớt (Capsicum annum L.) ở ngoại thành TP. Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận có nhiễm TSWV, nhưng chưa phát triển mạnh. Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh sau khi đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus trên cà chua (Solanum lycopersicum) đã có kết luận: Tại Lâm Đồng, cà chua nhiễm CMV là chủ yếu, TSWV chưa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm điều tra. 37 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 03 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu: Xã Trà Vong – Huyện Tân Biên – Tỉnh Tây Ninh. Xã Tân Thuận – Huyện Bến Cầu – Tỉnh Tây Ninh. Xã Lộc Ninh – Huyện Dương Minh Châu – Tỉnh Tây Ninh. Tiến hành chẩn đoán CMV, TMV và TSWV tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu Công tác điều tra được tiến hành như sau: Liên hệ với các hộ dân trồng thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh, thực hiện điều tra theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu: Đặc điểm vườn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh. Khâu lấy mẫu được thực hiện như sau: Lấy mẫu theo phương pháp năm điểm trên hai đường chéo góc. Lấy phần ngọn cây bị xoăn đọt, lá bị khảm, có triệu chứng của bệnh do TMV, CMV và TSWV gây ra. Tùy theo diện tích vườn có thể lấy từ 5 tới 10 mẫu, cho vào bọc nylon, có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vườn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu được cho vào thùng xốp và được giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu. Mẫu được đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện được giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. 3.3 Dụng cụ Cối, chày sứ nghiền mẫu, kéo cắt mẫu, cân phân tích, micropipette P10, P100, P1000, eppendorf, đầu tip, tủ định ôn, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ sấy, máy ly tâm, đĩa ELISA (mỗi đĩa 96 giếng), máy rửa ELISA, máy đọc ELISA, máy PCR, bồn điện di, bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp gel. 38 3.4 Phƣơng pháp chẩn đoán CMV, TMV và TSWV bằng dDAS – ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 3.4.1 Hóa chất Bộ kit ELISA cho CMV, TMV và TSWV do công ty BioRad cung cấp gồm: Extraction buffer (dung dịch đệm trích mẫu). Coating buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể). Conjugate buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể có gắn enzyme) Substrate buffer X1 (dung dịch đệm pha cơ chất). Kháng thể đơn dòng. Kháng thể gắn enzyme. Chất chỉ thị màu p – Nitrophenyl phosphate (p – NPP). Dung dịch đệm rửa (PBS – T). Đối chứng dương (Positive control). Đối chứng âm (Negative control). 3.4.2 Phƣơng pháp thực hiện 3.4.2.1 Ly trích mẫu Mẫu lấy về được trữ ở -20oC. Cân 0,5 gam mẫu lá cho vào cối, thêm 2,5 ml dịch trích mẫu, nghiền thật nát vụn thành dạng dung dịch. Sau đó, cho mẫu nghiền vào eppendoff 1,5 ml gần đầy, ghi ký hiệu mẫu. Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 3 phút, ở 4oC. Dùng micropipette P1000 hút phần dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml mới, ghi ký hiệu mẫu (loại bỏ cặn lắng). Giữ ở 4oC để thực hiện ELISA trong vòng 24 giờ. 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA Bước 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dương. Bước 2: Pha loãng kháng thể trong dung dịch đệm (coating buffer), theo tỷ lệ có sẵn trong kit. Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100 µl, chạy trên 5 đĩa. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC, trong 2 giờ. Bước 3: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. 39 Bước 4: Mỗi đối chứng âm và dương được hòa tan với 1 ml nước cất. Hút nước cất, 100 µl mỗi giếng, cho vào cột đầu tiên (số 1) (Substrate). Hút 100 µl đối chứng dương vào mỗi giếng, vào 2 ô PC (Positive control). Hút 100 µl đối chứng âm vào mỗi giếng, vào 2 ô NC (Negative control). Hút 100 µl dung dịch trích mẫu vào mỗi giếng, tổng cộng 135 mẫu, cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại. Ủ qua đêm ở 4oC. Bước 5: Rửa 3 lần với PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. Bước 6: Pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm tương tự như pha kháng thể bước 2. Hút 100 µl nước cất vào mỗi giếng, cho vào cột số 1. Hút 100 μl dung dịch kháng thể có gắn enzyme vào mỗi giếng từ cột số 2 đến cột số 11. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Bước 7: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA. Bước 8: Hòa tan p - NPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ ml của p - NPP. Cách pha: Nghiền nát thành bột mịn 7 viên p- NPP (mỗi viên 5 mg), cho vào 35 ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để p - NPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37 oC trong 30 phút. Bước 9: Đọc kết quả bằng máy đọc OD với bước sóng 450 nm, tại các thời điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ sau khi ủ với chất tạo màu. OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate). OD mẫu so với ngưỡng (ngưỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm). POS: Kết quả dương tính - nhiễm bệnh khi OD của mẫu vượt quá ngưỡng. NEG: Kết quả âm tính - không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dưới ngưỡng. Bên cạnh đó kết quả cũng có thể được đánh giá bằng mắt thường thông qua sự đổi màu của các giếng: Những giếng xuất hiện màu vàng: Giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh. Những giếng không màu: Giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh. 40 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Chú thích: Substract: Nước cất. BF: Dịch trích, PC: Đối chứng dương, NC: Đối chứng âm. Vùng load mẫu (số từ 1 đến 27) 3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán TMV bằng RT PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 3.5.1 Hóa chất Hóa chất ly trích RNA: Lysis solution (dịch trích mẫu). Low stringency wash solution (dịch rửa nhẹ). High stringency wash solution (dịch rửa nặng). Elution solution (dịch hòa tan RNA). DNase I dạng bột. Dịch pha loãng DNase I. Polyvinylpyrolidone – 40 (PVP) 2%. Các hóa chất để thưc hiện phản ứng RT - PCR: Kit tổng hợp cDNA do BioRad cung cấp. Dung dịch đệm PCR (10 X PCR buffer). iTaq DNA polymerase 5U/ µl. Hỗn hợp dNTP 10 mM. MgCl2 50 mM. cDNA được tổng hợp ở trên. 41 Primer (F và R). Agarose. Loading dye 6X (thuốc nhuộm). Thang chuẩn (ladder) 1000 bp (BioRad). TAE 1X. Nước không chứa nuclease (Nuclease free water). 3.5.2 Phƣơng pháp thực hiện 3.5.2.1 Ly trích RNA Bước 1: Cân khoảng 60 mg mẫu đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dương tính, cắt nhỏ mẫu (<5 mm). Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa bằng nước cất, bọc giấy bạc, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô 1 ngày đêm), nghiền mẫu thành bột mịn với nitơ lỏng. Bước 2: Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) bổ sung PVP 2% (gồm 14 μl PVP 2% + 700 μl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Bước 3: Thêm 700 μl dung dịch ly giải đã được trộn ở trên vào tube 2 ml chứa mẫu, trộn mẫu bằng pipet khoảng 10 lần (hút lên xuống để phá vỡ mẫu). Bước 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút, chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới có nắp đậy. Bước 5: Thêm 700 μl ethanol 70%, hòa tan bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp. Bước 6: Ủ ấm dung dịch hòa tan (elution solution) trong bồn ủ (water bath) ở 70 oC (chuẩn bị cho bước 15). Đặt RNA binding column (RNA bc) vào tube 2 ml không nắp. Bước 7: Cho 700 μl dung dịch ở bước 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây (ở 4oC), loại bỏ dịch lọc trong ống rửa và đặt RNAbc trở lại. Cho dịch còn lại vào cột, ly tâm 60 giây. Làm tiếp cho đến khi hết dịch. Bước 8: Dịch rửa low stringency (20 ml) từ 5X pha loãng bằng 80 ml ethanol 95% 100% xuống còn 1X. Bước 9: Cho 700 μl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC, loại bỏ dịch lọc. 42 Bước 10: Pha DNase I (đang ở dạng bột mịn) với 250 μl Tris 10mM 7,5pH . Hòa tan bằng pipet (trộn nhẹ). Bước 11: Trộn 5 μl DNase I với 75 μl dung dịch DNase delution trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ dịch lọc (phần dịch bên dưới). Bước 12: Cho 700 μl dung dịch high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 13: Cho 700 µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc. Bước 14: Ly tâm thêm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Bước 15: Chuyển RNAbc vào tube 1,5 ml có nắp, cho vào 80 μl dung dịch rửa trôi (elution solution) ở bước 6, để 1 phút cho dung dịch thấm, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4oC hay sử dụng ngay cho RT – PCR. 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT PCR RT PCR 2 bước: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl Nuclease free water 13 μl RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Thay đổi lần lượt RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl. Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC 43 Bước 2: Khuếch đại bằng PCR Sử dụng cặp primer có trình tự như sau: Forward primer: Tm = 64 o C 5’-CCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGG-3’ Reverse primer: Tm = 64 o C 5’-CCCTCGCTTTATTACGTGCCTGCG-3’ Thành phần hóa chất: Thể tích Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5 μl 1 X MgCl2 2,5 μl 2,5 mM dNTP 1μl 200 µM iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl primer F 1 µl 0,4 μM primer R 1 µl 0,4 μM Nuclease free water 34 µl cDNA 5µl Tổng thể tích 50 μl Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 3 phút ở 94oC 35 chu kỳ 1 phút ở 94oC 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72oC 1 chu kỳ 7 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 10 phút. 3.5.2.3 Đổ gel điện di Chuẩn bị gel agarose 1% 2%. Agarose đã được nấu chín đến 50oC – 60oC, 650W trong 2 phút, đổ vào khuôn và chèn lược vào để tạo gel. Lấy luợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 1X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR. 44 Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và thuốc nhuộm vào giếng. Chạy điện di: Hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong 60 phút. Lấy gel ra, ngâm trong ethidium bromide (1%) trong 20 phút. Rửa gel. Đọc kết quả dưới tia UV. Chụp hình gel để lưu lại. Đọc kết quả phản ứng PCR: Dương tính khi có đoạn 921 bp, âm tính khi không có đoạn 921 bp. 45 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dƣơng Minh Châu và Bến Cầu Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng Huyện Số mẫu (+) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) Dương Minh Châu 0 35 0 Bến Cầu 0 30 0 Chú thích: (+): Dương tính Kết quả trên cho thấy tất cả các mẫu đậu phộng thu thập được đều không có biểu hiện dương tính với TSWV (0%). Đậu phộng trồng tại 2 huyện này có triệu chứng biểu hiện giống như triệu chứng bệnh do TSWV gây ra nhưng không phát hiện được dương tính khi chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, có thể giải thích là do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường. Qua người dân, chúng tôi biết rằng, nước tưới tiêu tại địa bàn điều tra được lấy từ những giếng đào sâu trong lòng đất, tận dụng mạch nước ngầm là chủ yếu. Thời điểm tiến hành điều tra, thu thập mẫu nhằm vào những tháng tỉnh Tây Ninh đang là mùa khô, thời tiết khá nóng, nắng gay gắt, giếng đào dần cạn nước, đất trồng khô, nứt nẻ, và việc thiếu nước tưới đã xảy ra, nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục. Đậu phộng trồng tại đây bị thiếu nước lâu ngày nên hình thái cây bị biến đổi: Lá vàng, thân cây rủ xuống. Nắng khá gay gắt và nóng làm cháy lá, đốm lá, gây héo lá, giống như bị hoại tử và lá rụng dần. Các triệu chứng này đã dẫn tới việc lầm tưởng cây đã nhiễm TSWV. Kết quả này còn chứng tỏ một điều là không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng bên ngoài mà xác định bệnh. Bên cạnh đó, cũng có khả năng là thật sự TSWV chưa nhiễm trên đậu phộng ở huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu vào thời điểm thu thập mẫu. 46 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Thể hiện qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.1. Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với CMV, TMV, TSWV trên thuốc lá Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Số mẫu (-) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) CMV 26 26 52 50 TMV 29 13 42 69,1 TSWV 0 70 70 0 Chú thích: (+): Dương tính (-): Âm tính 0 10 20 30 40 50 60 70 CMV TMV TSWV Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính Số mẫu điều tra Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dƣơng tính, âm tính với CMV, TMV và TSWV Sau khi tiến hành chẩn đoán TSWV cho 70 mẫu thuốc lá thu được tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh, không phát hiện được mẫu dương tính với TSWV (0%). Điều này có thể được giải thích bởi 3 lý do sau: Tại các huyện thu thập mẫu, TSWV vào thời điểm này còn ít, chưa phát tán rộng, nên chưa lấy được đúng mẫu đã nhiễm TSWV. Do mẫu được lấy chủ yếu dựa theo triệu chứng bên ngoài nên có thể mẫu đã nhiễm các virus khác với TSWV nhưng triệu chứng biểu hiện lại tương tự như nhiễm TSWV. S ố m ẫ u Tác nhân gây bệnh 47 Vì thu thập theo triệu chứng nên có thể những triệu chứng này là do ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, phân bón hay do điều kiện canh tác gây ra. Ngoài ra, các mẫu thuốc lá và đậu phộng cùng được lấy tại huyện Bến Cầu đều không có biểu hiện nhiễm TSWV (0%), kết quả này cũng góp phần cho thấy rằng tại đây TSWV chưa xuất hiện và gây bệnh. Trong khi đó, mẫu thuốc lá có biểu hiện dương tính với CMV (50%) và TMV (69,1%) khá cao. Như vậy, có thể nói rằng vào tháng 4 năm 2006 (thời gian thu thập mẫu), cây thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh đang chịu ảnh hưởng của CMV và TMV. 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Tân Biên 20 33 60,6 Bến Cầu 6 19 31,6 Chú thích: (+): Dương tính 0 10 20 30 4 50 60 70 Tân Biên Bến Cầu Mẫu dương tính Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu Kết quả từ Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.2 cho thấy: Trên tổng số mẫu thuốc lá thu được tại từng địa bàn điều tra, huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV khá cao (60,6%), trong khi đó tại huyện Bến Cầu tỷ lệ nhiễm CMV ít hơn (31,6%). Như vậy, Tân Biên có tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV cao gấp 2 lần so với Bến Cầu. Kết quả này có thể lý giải như sau: T ỷ l ệ % Huyện 48 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tân Biên Bến Cầu Mẫu dương tính CMV được lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá. Khi khảo sát tại huyện Tân Biên ta thấy cỏ dại, lùm bụi khá nhiều, không được phát quang. Đây chính là nơi cư trú tốt cho rệp, và tạo điều kiện cho chúng sinh sôi, phát triển mạnh mẽ. Vì thế, tại đây CMV được lan truyền nhanh hơn, nhiều hơn. Tại Bến Cầu, công tác vệ sinh, dọn dẹp cỏ dại quanh khu vực trồng thuốc lá được thực hiện tốt hơn. Các bụi rậm được phát quang sạch sẽ, rệp không còn chổ để trú ẩn, không có điều kiện thuận lợi để phát triển. Nên số lượng không tăng thêm nhiều, khả năng truyền virus cũng giảm. 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Tân Biên 18 26 69,2 Bến Cầu 11 16 68,8 Chú thích: (+): Dương tính Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu Các số liệu từ Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.3 đã cho thấy: Tại huyện Tân Biên, thuốc lá nhiễm TMV khá cao (69,2%) và tại huyện Bến Cầu, tỷ lệ này cũng khá cao (68,8%). Khi so sánh tỷ lệ thuốc lá bệnh giữa 2 huyện, ta nhận thấy rằng tỷ lệ này là tương đương nhau. T ỷ l ệ % Huyện 49 TMV chủ yếu tồn tại trong tàn dư thực vật của vụ truớc để lại trên đồng ruộng. Nhưng hiện nay, tại các huyện này, sau khi thuốc lá được thu hoạch xong thì phần thân, rễ còn lại sẽ được giữ làm phân bón cho vụ sau mà không được đốt bỏ. Điều này đã tạo điều kiện cho TMV phát triển trở lại và tiếp tục gây bệnh cho vụ trồng kế tiếp. TMV nằm trong xác cặn bã thực vật sẽ bị phân hủy ngoài tự nhiên trong vòng từ 5 đến 6 tháng do thời tiết. Tuy nhiên, vì Tây Ninh là một địa bàn chuyên canh trồng thuốc lá ở nước ta nên các vụ mùa được trồng liên tục, kế tiếp nhau, không có thời gian nghỉ giữa 2 vụ. Do đó, cây thuốc lá nhiễm bệnh từ vụ này sang vụ khác, năm này sang năm khác mà không thể khắc phục được. Tỷ lệ nhiễm TMV khá cao tương đương nhau tại huyện Tân Biên và Bến Cầu cũng còn do sự lưu thông giữa những vùng trồng thuốc lá trong tỉnh. Những đoàn xe vận chuyển thuốc lá nguyên liệu trong quá trình di chuyển từ vùng này sang vùng kia, đồng thời cũng mang TMV trên những lá thuốc còn sót lại hay trên những vật dụng có liên quan theo và góp phần phát tán bệnh. Ngoài ra, thuốc lá thường xuyên nhiễm CMV, TMV trong suốt mùa vụ và từ năm này sang năm khác còn vì lý do khách quan sau: Tây Ninh là vùng trồng thuốc lá phổ biến với diện tích lớn, nhưng chủ yếu việc trồng trọt diễn ra ở những hộ gia đình, tập quán của người nông dân là thường trồng những loại cây như bầu bí, dưa, thơm hay vài loại hoa làm cảnh, đây chính là những cây ký chủ của CMV và TMV. Đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên các cây trồng này quanh năm. Nên khi các cây này đã nhiễm virus thì nó dễ dàng và nhanh chóng phát tán sang thuốc lá. Khi trong vườn thuốc lá xuất hiện cây bị bệnh, nhưng vì lý do kinh tế, mà người nông dân thường vẫn tiếp tục trồng những cây này, mà không tỉa bỏ, vì thế từ một vài cây bệnh ban đầu đã mau chóng lan sang các cây khác. 50 4.1.5 Tỷ lệ thuốc lá chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập đƣợc Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Tổng số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Chỉ nhiễm CMV 0 42 0 Chỉ nhiễm TMV 20 47,6 Nhiễm CMV và TMV 11 26,2 Chú thích: (+): Dương tính 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Chỉ nhiễm CMV Nhiễm CMV và TMV Chỉ nhiễm TMV Mẫu dương tính Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV Theo kết quả từ Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.4, số mẫu thuốc lá chỉ nhiễm TMV chiếm tỷ lệ cao nhất là 47,6%. Số mẫu nhiễm hỗn hợp CMV và TMV là 26,2%, nhưng không có mẫu nào nhiễm CMV mà không nhiễm TMV. Điều này cũng có nghĩa là tất cả các mẫu điều tra lúc này đều bị nhiễm TMV. Như vậy, có thể nói rằng TMV đang là virus gây bệnh chủ yếu cho thuốc lá ở Tân Biên và Bến Cầu vào thời điểm khảo sát. T ỷ l ệ % Tác nhân gây bệnh 51 0 10 20 30 40 50 60 70 80 TC1 TC2 TC3 Mẫu dương tính 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên cây thuốc lá Sau khi so sánh kết quả chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và triệu chứng trên lá cây thuốc lá quan sát được trên đồng ruộng, tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh được thể hiện qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.5. Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên lá Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Lá dày, phồng rộp (TC1) 2 8 25 Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6 Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40 Chú thích: (+) : Dương tính TC1: Triệu chứng 1 [Hình 4.12 (D) và 4.13 (B)] TC2: Triệu chứng 2 [Hình 4.12 (C)] TC3: Triệu chứng 3 [Hình 4.13 (C) và 4.13 (D)] Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng Từ tỷ lệ này có thể cho phép nhận định: Các lá thuốc lá có triệu chứng khảm xanh – vàng (TC2) có khả năng nhiễm CMV và TMV (78,6%) khá cao. Một số cây thuốc lá có biểu hiện triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc hơn so với các cây khác (tất cả được trồng cùng lúc và trong điều kiện canh tác như nhau) như trong Hình 4.13 (E). Nhưng trên lá của tất cả các cây có sự thay đổi hình thái vừa nêu trên đều mang một hay tất cả các triệu chứng đã xét trong Bảng 4.6. Vì vậy, có thể nói T ỷ l ệ % Triệu chứng 52 việc thu thập mẫu thuốc lá nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu hiện trên lá cây sẽ dễ dàng hơn là thu thập theo các triệu chứng khác. Bên cạnh đó, cũng có một số cây thuốc lá có mang các triệu chứng như trên, nhưng lại không cho kết quả dương tính khi tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, một lần nữa cũng khẳng định rằng việc xác định cây nhiễm virus mà chỉ dựa vào triệu chứng biểu hiện là không hoàn toàn chính xác. Trong quá trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tôi thấy có triệu chứng cong ngọn trên cây thuốc lá, là triệu chứng đặc trưng do TSWV gây ra. Tuy nhiên, những mẫu này, sau khi dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán đã không cho kết quả dương tính. Có lẽ, đó là do số lượng của TSWV quá ít, không đủ để biểu hiện thành phản ứng dương tính. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh của từng giống thuốc lá. Vì bà con nông dân ở đây đa số chỉ biết là mua giống tại công ty nào thôi, hầu như không quan tâm đến giống của cây thuốc lá đang trồng là gì. Một lý do nữa, là do chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV và TSWV trên các cây thuốc lá được trồng trong nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc lá mang virus tới lây nhiễm cho cây) và các cây thuốc lá được trồng trong vườn của Tổng Công ty Thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu này chỉ được thực hiện trên những cánh đồng trồng thuốc lá của các hộ gia đình. Vì thế, chúng tôi chưa khảo sát được tỷ lệ nhiễm virus của thuốc lá khi trồng ngoài tự nhiên và khi trồng trong điều kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh. 53 (A) (B) (C) (D) Hình 4.12: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe (B), (C), (D): Triệu chứng cây thuốc lá nhiễm virus TMV 54 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng cây nhiễm virus CMV và TMV Hình 4.13: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe 55 4.2 Kết quả RT – PCR Sau khi có kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA, chọn những mẫu dương tính mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR.  Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ lá thuốc lá bằng kit ly trích Aurum TM Total RNA Mini Kit do Bio – Rad cung cấp.  Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với bộ kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio – Rad cung cấp. Kết quả RT – PCR thu được có thành phần hóa chất và chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl Nuclease free water 13 μl RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC Bước 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR Thể tích Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5 μl 1 X MgCl2 2,5 μl 2,5 mM dNTP 1μl 200 µM iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl primer F 1 µl 0,4