Khảo sát tác động kháng khuẩn của nhũ dịch chứa tinh dầu tràm trà úc và hương nhu trắng trên vi khuẩn enterococcus faecalis gây viêm ống tuỷ răng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 61 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG KHUẨN CỦA NHŨ DỊCH CHỨA TINH DẦU TRÀM TRÀ ÚC VÀ HƯƠNG NHU TRẮNG TRÊN VI KHUẨN ENTEROCOCCUS FAECALIS GÂY VIÊM ỐNG TUỶ RĂNG Hà Đan Phương*, Lê Tuấn Anh* TÓM TẮT Mở đầu: Enterococcus faecalis là nguyên nhân hàng đầu gây thất bại trong điều trị nội nha. Dung dịch bơm rửa ống tuỷ được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là dung dịch NaClO 3% cho hiệu quả tốt nhưng lại có nhiều nhược điểm như có mùi khó chịu, gây kích ứng nơi tiếp xúc, gây mòn men răng cũng như khả năng diệt vi khuẩn không hoàn toàn. Các nghiên cứu trước đó tại Bộ môn Vi ký sinh, khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã bào chế nhũ tương bơm rửa chứa phối hợp tinh dầu tràm trà Úc (TTO) và hương nhu trắng (OG) để ứng dụng làm dung dịch bơm rửa ống tủy điều trị viêm ống tủy răng cho hiệu quả sát khuẩn trên nhiều vi khuẩn gây bệnh răng miệng tương đương với dung dịch NaClO 3% trên mô hình in vitro. Để tiếp tục mở rộng đề tài, tác dụng sát khuẩn in vitro trên các chủng E. faecalis lâm sàng cũng như tác dụng sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch tinh dầu được so sánh với dung dịch NaClO 3%. Mục tiêu: So sánh hiệu quả sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu với dung dịch NaClO 3% trên các vi khuẩn E. faecalis phân lập từ lâm sàng. So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch bơm rửa với dung dịch NaClO 3% trên mô hình viêm ống tuỷ răng do E. faecalis. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Vi khuẩn thử nghiệm: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Mẫu bệnh phẩm là các mẫu răng nhổ bỏ thu thập từ Răng Hàm Mặt Trung ương TP. Hồ Chí Minh. Chất thử nghiệm: tinh dầu TTO và OG, dung dịch NaOCl 3%. Phương pháp nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn từ các mẫu răng bệnh phẩm bằng phương pháp nuôi cấy. Các chủng E. faecalis được định danh bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Khảo sát tác động sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp TTO và OG trên các chủng E. faecalis phân lập được. So sánh hiệu quả của nhũ tương với dung dịch natri hypoclorid 3%. Khảo sát tác động sát khuẩn ex vivo của nhũ tương trên mô hình nhiễm khuẩn ống tủy răng do E. faecalis. So sánh hiệu quả của nhũ tương với dung dịch natri hydroclorid 3%. Kết quả: Đã phân lập và định danh được 15 chủng E. faecalis từ 80 mẫu răng bệnh phẩm. Thử nghiệm khả năng sát khuẩn in vitro trên các chủng E. faecalis phân lập từ lâm sàng cho thấy hiệu quả tương đương giữa nhũ dịch bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu và dung dịch đối chiếu natri hypochlorite 3%. Thử nghiệm ex vivo trên mô hình viêm ống tủy răng do E. faecalis cho thấy nhũ dịch nghiên cứu cho hiệu quả sát khuẩn chậm hơn nhưng cho tác dụng kéo dài hơn, giảm thiểu được nguy cơ tái nhiễm trùng so với dung dịch NaClO 3%. Kết luận: Kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy tiềm năng của nhũ tương bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu TTO và OG, có khả năng thay thế các dung dịch bơm rửa ống tủy cổ điển. Từ khóa: Tinh dầu tràm trà Úc, tinh dầu hương nhu trắng, NaOCl, nhiễm trùng ống tủy, sâu răng, Enterococcus faecalis. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Tuấn Anh ĐT: 0779784030 Email: letuananh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 62 ABSTRACT STUDY ON THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE EMULSION CONTAINING TEA TREE OIL AND OCIMUM GRATISSIMUM ESSENTIAL OIL ON ENTEROCOCCUS FAECALIS CAUSING ENDODONTIC INFECTION Ha Dan Phuong, Le Tuan Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 61 – 69 Background: Enterococcus faecalis is one of the major causes of failure in endodontic infection treatment. Sodium hypochlorite 3% solution (NaOCl) has been the most commonly irrigant for preparing infected root canals. However, this solution could exert some undesirable effects including tissue toxicity at the exposed sites and eroding enamel for long exposure as well as incompletely killing of bacteria. From former experiments, we had successfully formulated a emulsion containing mixture of tee trea oil (TTO) and Ocimum gratissimum essential oil (OG) that showed the same antibacterial effect with NaClO 3% solution on various pathogen that cause endodontic infection, in vitro. In order to expand the application of this emulsion, we further compare the bactericidal effect of the studied emulsion with NaOCl 3% solution on E. faecalis isolated from clinical specimen, as well as on ex vivo model of endodontic infection by E. faecalis. Objectives: Compare the bactericidal effect of the emulsion contain mixture of TTO and OG with NaClO 3% solution on E. faecalis isolated from clinical samples. Compare the antibacterial effect of the study emulsion on ex vivo model of endodontic infection by E. faecalis. Materials and methods: Tested microbes: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Streptococcus mutans ATCC 35668. Clinical samples: Decayed teeth after tooth extraction procedure, taken from Dental Hospital of Central Ho Chi Minh city. Subtances: tea tree oil, Ocimum gratissimum essential oil, sodium hypoclorite 3% solution. Methods: Isolate Enterococcus faecalis from decayed teeths obtained from patients. Compare the in vitro bactericidal effect of studied emulsion to NaOCl 3% solution on isolated E. faecalis. Compare the antibacterial effect of the studied emulsion to NaOCl 3% on ex vivo model of endodontic infection by E. faecalis. Results: Among 80 samples taken from Dental Hospital of Central Ho Chi Minh city, E. faecalis was dectected in 15 samples. In in vitro test, the studied emulsion exhibited the same bactericidal effect to the NaClO 3% solution. In ex vivo model, the studied emulsion could not eliminate E. faecalis as fast as the NaClO solution did. In contrast, the studied emulsion showed long-lasting effect and reduced the amount of re-infection teeth compare to the NaClO 3% solution. Conclusion: The result of this study showed that the emulsion containing TTO and OG could be a promising irrigant to replace NaClO and others in fighting root canal infection. Keywords: Endodontic infections, Enterococcus faecalis, Irrigants, Tea tree oil, Ocimum gratissimum essential oil ĐẶT VẤN ĐỀ Sức khỏe răng miệng là một phần quan trọng của sức khỏe con người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh răng miệng xếp hàng thứ tư trong số các bệnh lý có chi phí điều trị cao nhất, trong đó, sâu răng và bệnh nha chu từng được xem là gánh nặng sức khỏe răng miệng hàng đầu(12). Hệ vi khuẩn răng miệng là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh nhiễm trùng nội nha, trong đó, nhiễm trùng nội nha tiên phát chủ yếu gây ra do vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí không bắt Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 63 buộc. Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc rất dễ dàng bị loại bỏ hoặc giảm thiểu số lượng bằng các thiết bị và dung dịch bơm rửa nội nha. Ngược lại, vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc có thể sống sót được trong môi trường khắc nghiệt và kháng nhiều phương pháp điều trị. Nhiễm trùng nội nha thứ phát do thất bại trong điều trị nội nha thường do các vi khuẩn còn tồn tại trong ống tủy chân răng sau khi trám bít ổng tủy gây nên. Trong số các tác nhân gây nhiễm trùng nội nha, Enterococcus faecalis được tìm thấy trong 4-40% trường hợp nhiễm trùng nội nha tiên phát(14) và tăng lên đến 30-90% trong nhiễm trùng nội nha thứ phát(17). Vi khuẩn này được xem là nguyên nhân hàng đầu gây thất bại trong điều trị nội nha do khả năng kháng dung dịch bơm rửa cũng như khả năng sống sót cao, đơn lẻ không cần sự hỗ trợ của các loài vi khuẩn khác(7). Hiện nay, có rất nhiều dung dịch bơm rửa nội nha được sử dụng trong lâm sàng như natri clorid, hydroperoxid 3%, clorohexidin tuy nhiên phổ biến nhất vẫn là natri hypoclorid (NaClO). Ở nồng độ sử dụng 2,5% - 5,25%, NaOCl cho hiệu quả sát khuẩn cao cũng như khả năng làm sạch mô bị hoại tử tốt. Tuy nhiên, NaClO có mùi khó chịu, tác dụng sát khuẩn có thể bị giảm khi tiếp xúc với dịch viêm có tính acid. Khi sử dụng ở nồng độ cao và trong thời gian dài, NaClO có thể ảnh hưởng đến độ bền và độ đàn hồi của lớp ngà răng là nguyên nhân gây vỡ thân răng do dung dịch này có khả năng hoà tan ion calci của ngà răng(1). Ngoài ra, trong khi rửa ống tủy, dung dịch dễ bị đẩy ra ngoài và kích thích vùng nha chu quanh chóp hay làm bỏng niêm mạc miệng. Do đó, việc nghiên cứu các dung dịch bơm rửa nội nha có tác dụng tương đương hoặc tốt hơn NaOCl mà không gây tác dụng phụ đang là vấn đề được quan tâm. Tinh dầu Hương nhu trắng và Tràm trà Úc từ lâu đã được biết đến với tác dụng sát khuẩn mạnh. Các nghiên cứu của Bộ môn Vi – Ký sinh đã cho thấy phối hợp hai loại tinh dầu cho tác dụng cộng lực trên nhiều loại vi khuẩn(4,6). Lê Văn An (2017) đã xây dựng và tối ưu hóa thành công công thức nhũ tương phối hợp hai loại tinh dầu trên cho hiệu quả sát khuẩn in vitro tốt trên nhiều vi khuẩn gây bệnh răng miệng, tương đương với dung dịch NaClO 3%(5). Tuy vậy, nhũ tương trên mới chỉ được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn chuẩn in vitro và cần được đánh giá hoạt tính trên các vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cũng như thử nghiệm trên các mô hình dược lý có độ tin cậy cao hơn. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Vi sinh vật Enterococcus faecalis ATCC 29212, Streptococcus mutans ATCC 35668 Chất thử nghiệm Nhũ tương chứa 0,45% (kl/kl) tinh dầu Tràm trà Úc (TTO); 0,13% (kl/kl) tinh dầu Hương nhu trắng (OG)(5). Dung dịch NaClO 3% Phương pháp nghiên cứu Mẫu răng bệnh phẩm Mẫu răng bệnh phẩm được thu thập tại khu điều trị kỹ thuật cao, bệnh viện Răng Hàm Mặt Trung Ương TP Hồ Chí Minh. Các răng được lựa chọn là các răng cối, trưởng thành, ống tuỷ còn nguyên vẹn. Sát trùng xung quanh vùng răng nhổ bằng dung dịch H2O2 3% và NaClO 2,5%, trung hòa bằng dung dịch Na2S2O3 5%. Răng sau khi nhổ, được chuyển vào ống falcon có nút vặn chứa môi trường Streptococcus faecalis Broth (SF broth) vô trùng, lưu giữ ở nhiệt độ lạnh 10oC. Chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý trong vòng 2 giờ. Phân lập vi khuẩn Mẫu răng đươc làm vỡ bằng cách cho tiếp xúc nhanh với nitơ lỏng và đập mạnh bằng chày trong cối sao cho mảnh răng vỡ thành mảnh kích thước khoảng 5 mm. Chuyển toàn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 64 bộ mảnh vỡ vào môi trường SF broth, vortex mạnh và ủ ở 37oC trong vòng 2 giờ để hồi phục vi khuẩn trong mẫu(Error! Reference source not found.). Pha loãng cấp 10 liên tiếp 2 cấp độ trong môi trường SF broth. Hút 100 μl từ mỗi cấp pha loãng ở trên trải lên đĩa thạch chứa môi trường thạch máu, ủ các đĩa ở 37oC, ở điều kiện vi hiếu khí. Sau 48 giờ, quan sát sự mọc của các khóm vi khuẩn trên đĩa và bắt lấy các khóm vi khuẩn có các đặc tính của chi Enterococcus: cầu khuẩn gram dương, dạng chuỗi ngắn, huyết giải  hoặc , có phản ứng catalase âm, Pyrrolidonyl Arylamidase (PYR) test dương và bile esculin dương. Định danh vi khuẩn Chiết tách ADN nhiễm sắc thể Phân lập vi khuẩn đã bắt giữ ở bước trên lên trên thạch máu, sau đó, chuyển một khóm vi khuẩn thu vào môi trường Tryptic Soy Broth (TSB), ủ ở 37oC trong 18 giờ. Tiến hành chiết tách ADN nhiễm sắc thể của vi khuẩn trên theo phương pháp SDS-KOAc. Khuếch đại đoạn gen 16S rADN Sử dụng cặp mồi phổ quát (mồi xuôi, 5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' và ngược, 5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3')(18). Chương trình nhiệt được thiết lập cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC trong 5 phút; biến tính ở 95oC trong 45 giây; bắt cặp ở 55oC trong 45 giây; tổng hợp ở 72oC trong 2 phút; bước tổng hợp cuối cùng ở 72oC trong 10 phút. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, sản phẩm mong muốn có kích thước 1505 bp được tinh chế bằng bộ kit của hãng ABM (Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của E. faecalis Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu có kích thước 310 bp từ gen 16S rADN, trong đó, mồi xuôi EF-F có trình tự 5’-GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG AG-3’ nằm ở vị trí base thứ 165 đến 187 trên gen 16S rARN của E. faecalis (mã số truy cập Y18293 trên GenBank) và mồi ngược EF-R có trình tự 5’-CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’ nằm ở vị trí base thứ 457 đến 474 trên gen 16S rARN của E. faecalis (mã số truy cập Y18293 trên GenBank)(9). Chương trình nhiệt được thiết lập cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC trong 2 phút; biến tính ở 95oC trong 30 giây; bắt cặp ở 60oC trong 1 phút; tổng hợp ở 72oC trong 1 phút; bước tổng hợp cuối cùng ở 72oC trong 2 phút. Mẫu chứng dương là sản phẩm PCR đoạn 16S rARN của E. faecalis ATCC 29212, chứng âm là sản phẩm PCR đoạn 16S rARN của Streptococcus mutans ATCC 35668. Vi khuẩn được xác định là E. faecalis khi kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% thu được băng ADN kích thước 310 bp. Chuẩn bị vi sinh vật cho thử nghiệm tính kháng khuẩn của nhũ tương nghiên cứu Phân lập vi khuẩn E. faecalis lên môi trường Tryptic soy agar (TSA). Chuyển 3-5 khóm vi khuẩn được phân lập sang ống nghiệm chứa môi trường TSB, ủ ở 37oC trong 2-6 giờ. Hiệu chỉnh mật độ vi sinh vật về khoảng 1-3.108 CFU/mL bằng cách đo OD ở bước sóng 625 nm, với cóng đo 1 cm đạt trong khoảng 0,08-0,1. Sau đó, pha loãng về mật độ 107 CFU/mL bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) vô trùng. Vi khuẩn sau khi chuẩn bị xong phải đưa vào thử nghiệm trong vòng 15 phút. Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro của nhũ tương nghiên cứu trên các chủng E. faecalis phân lập từ bệnh phẩm Hút 500 L huyền trọc E. faecalis mật độ 107 CFU/mL phân lập từ lâm sàng cho lần lượt vào 3 ống nghiệm chứa 10 ml lần lượt nhũ tương nghiên cứu, dung dịch NaClO 3% và dung dịch PBS. Vortex mạnh để trộn đều. Sau 60 giây tiếp xúc, đếm số lượng vi khuẩn sống còn lại trong mỗi ống bằng phương pháp đếm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 65 sống trên môi trường Streptococcus faecalis agar (SF agar). Thử nghiệm được lặp lại 3 lần. Tạo mô hình viêm ống tủy răng do E. faecalis Dựa trên mô hình được mô tả bởi Nakamura C.V, và cs(8), nhưng có sự điều chỉnh về lượng vi sinh vật nạp vào mẫu răng. Các mẫu răng sau khi được thu nhận sẽ được làm sạch với 100 mL nước cất. Sau đó làm đồng nhất chiều dài và dung tích làm việc của các ống tủy răng bằng máy trâm quay Protaper Universal (Dentsply Maillefer) với các trâm SX, S1, F1, F2, F3, F4. Rửa sạch các ống tủy bằng nước cất. Dùng composite resin trám chặt vùng lỗ chóp chân răng, để khô. Chôn cố định các răng vào eppendorf 2 mL, đậy chặt nắp và tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. Bơm 10 μL huyền trọc vi khuẩn E. faecalis mật độ 108 CFU/mL vào mỗi ống tủy. Dùng trâm K-file #15 vô khuẩn đưa tới lui trong ống tủy để huyền trọc vi khuẩn đi được đến chóp răng. Ủ mẫu răng ở 37oC. Sau mỗi 24 giờ, thêm vào mỗi ống tủy 50 μL môi trường Brain Heart Infusion broth (BHI). Nuôi mẫu răng liên tục trong 7 ngày. Xác định lượng vi khuẩn trong mỗi ống tủy Dùng côn giấy vô khuẩn #20 có chiều dài tương ứng với chiều dài làm việc đặt vào ống tủy, để yên trong 1 phút. Chuyển côn giấy vào eppendorf chứa sẵn 2 mL dung dịch NaCl 0,9% vô khuẩn, vortex mạnh trong 1 phút. Đếm số lượng vi khuẩn sống có trong eppendorf bằng phương pháp đếm sống trên môi trường SF agar. So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo trên E. faecalis của nhũ dịch nghiên cứu và dung dịch NaClO 3% Sau thời gian nuôi cấy, phân chia ngẫu nhiên các răng thành ba nhóm, mỗi nhóm 13 răng. Tiến hành xác định số lượng vi khuẩn trong các răng ở mỗi nhóm trước khi rửa (T0) Sau đó, các răng trong mỗi nhóm được bơm rửa bằng nhũ dịch nghiên cứu hoặc dung dịch NaClO 3% hoặc NaCl 0,9% theo cùng một quy trình như sau: Dùng bơm tiêm hút 2 mL dung dịch bơm rửa. Đặt kim bơm vào vừa chặt ống tủy, lùi lại khoảng 1,0 mm. Bơm nhẹ với vận tốc 2 mL/phút. Thao tác bơm rửa chỉ thực hiện một lần Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống tủy của mỗi nhóm ngay sau khi bơm rửa (T1). Tiếp tục bơm 50 μL môi trường BHI vào các ống tủy, ủ các mẫu răng ở 37o Sau mỗi 24 giờ, thêm vào mỗi ống tủy 50 μL môi trường BHI. Nuôi các mẫu răng liên tục trong 7 ngày. Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống tủy ở mỗi nhóm sau 7 ngày (T2) Từ các giá trị T0, T1, T2, xác định phần trăm lượng vi khuẩn giảm ở các ống tủy trong mỗi nhóm ngay sau khi rửa và sau 7 ngày. So sánh phần trăm lượng vi khuẩn bị tiêu diệt trung bình ở mỗi nhóm bằng phép kiểm T-test qua phần mềm Microsoft Excel 2016. KẾT QUẢ Phân lập vi khuẩn E. faecalis từ mẫu răng bệnh phẩm Từ 80 mẫu răng thu thập được, chúng tôi đã phân lập được 40 mẫu cầu khuẩn có các đặc điểm thỏa mãn các đặc tính của nhóm Enterococci là khóm huyết giải  hoặc ; cầu khuẩn gram dương, xếp thành chuỗi ngắn; phản ứng catalase âm tính, PYR dương tính và phản ứng Bile esculin dương tính. Tiến hành chiết tách và khuếch đại đoạn gen 16S rARN từ 40 mẫu sử dụng cặp mồi phổ quát. Sau khi tinh chế sản phẩm 16S rADN ở trên, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự đặc hiệu của E. faecalis sử dụng cặp mồi EF-F: 5’-GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG AG-3’ và EF-R: 5’- CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’. Kết quả, chứng dương E. faecalis ATCC 29212 cho băng ADN kích thước 310 bp, chứng âm Streptococcus mutans ATCC 35668 và mẫu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 66 trắng (không có ADN khuôn mẫu) không cho băng ADN nào. Từ đó, 15 chủng liên cầu cho kết quả khuếch đại được băng ADN kích thước 310 bp được xác định là E. faecalis. Như vậy tỷ lệ E. faecalis phân lập và định danh được từ lâm sàng là 15/80 mẫu chiếm 18,75%. Hình 1: Kết quả PCR khuếch đại đoạn 310 bp của E. faecalis từ một số mẫu bệnh phẩmGiếng 1: 100bp Opti-DNA Marker; Giếng 2: mẫu E. faecalis ATCC 29212 (chứng dương); Giếng 3: mẫu S. mutans ATCC 35668 (chứng âm); Giếng 4 – 20: một số mẫu bệnh phẩm; Giếng 21: mẫu trắng Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro của nhũ tương nghiên cứu trên các chủng E. faecalis phân lập từ bệnh phẩm Kết quả đếm sống cho thấy, nhũ tương bơm rửa ống tủy cho hiệu quả sát khuẩn hoàn toàn sau 60 giây tiếp xúc trên cả 15 chủng vi khuẩn E. faecalis phân lập và định danh từ mẫu bệnh phẩm tương đương với dung dịch đối chứng NaClO 3%. Bảng 1: Số lượng vi khuẩn ở mỗi nhóm sau khi cho tiếp xúc với các dịch thử nghiệm 60 giây STT Lượng vi khuẩn (CFU/ml) Mẫu trắng (x105 CFU) Nhũ dịch bơm rửa Dung dịch hyposol 3% Lượng còn % diệt Lượng còn % diệt 1 2,12 99,99 99,99 2 3,50 99,99 99,99 3 2,52 99,99 99,99 4 4,86 99,99 99,99 5 1,34 99,99 99,99 6 4,00 99,99 99,99 7 4,15 99,99 99,99 8 3,20 99,99 99,99 9 1,04 99,99 99,99 10 2,32 99,99 99,99 11 1,05 99,99 99,99 12 2,70 99,99 99,99 13 2,31 99,99 99,99 14 1,15 99,99 99,99 15 4,08 99,99 99,99 Ghi chú: Các mẫu không có vi khuẩn mọc trở lại được biểu diễn là có ít hơn 10 CFU/răng (giới hạn phát hiện của phương pháp đếm sống trong nghiên cứu này) Tạo mô hình viêm ống tuỷ răng do E. faecalis Sau khi tạo mô hình, lượng vi khuẩn E.faecalis trung bình từ 3 nhóm (nhóm trắng, nhóm thử và nhóm chứng) tại thời điểm ban đầu được thể hiện qua bảng 1. Số lượng vi khuẩn ban đầu trong các răng ở mỗi nhóm khác nhau không có ý nghĩa thống kê p > 0,05. So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo trên E. faecalis của nhũ dịch nghiên cứu và dung dịch NaClO 3% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 500 bp 300 bp 200 bp E1 E2 E6 E13 E21 E23 E25 E34 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 67 Sau khi bơm rửa ống tuỷ bằng 3 dung dịch, số lượng vi khuẩn đếm được trong mỗi nhóm được thể hiện qua bảng 1. Như vậy, nhũ tương nghiên cứu có khả năng tiêu diệt được 99,90% lượng vi khuẩn ngay sau khi bơm rửa, thấp hơn có ý nghĩa (p < 0,05) so với Nhóm đối chiếu (NaClO 3%) khi dung dịch này tiêu diệt được hơn 99,99% lượng vi khuẩn với 10/10 mẫu răng đều không phát hiện được vi sinh vật mọc trở lại trong phương pháp đếm sống. Trong khi đó, mẫu trắng bơm rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% làm giảm (do rửa trôi cơ học) được 83,36% lượng E. faecalis, thấp nhất trong 3 nhóm thử nghiệm (p < 0,05) Bảng 2: Thống kê số lượng vi khuẩn trong các răng ở mỗi nhóm thử nghiệm Nhóm trắng NaCl 0,9% Nhóm thử Nhũ tương bơm rửa Nhóm đối chiếu NaClO 3% To T1 T2 To T1 T2 To T1 T2 Số răng (n) (*) 11 11 11 11 11 11 10 10 10 Số vi khuẩn trung bình (x103 CFU/ml) 134,36 33,70 25,68 7,21 51,98 16,29 154,55 36,21 0,14 0,10 1,72 1,25 158,77 38,46 < 0,001 (**) 3,88 3,63 % giảm - 83,36 2,11 61,31 8,59 - 99,90 0,18 99,00 1,26 - > 99,99 97,55 1,43 Số răng có vi khuẩn mọc lại 11/11 11/11 11/11 11/11 7/11 4/11 10/10 0/10 9/10 Ghi chú: (*) Số lượng răng thực tế ở mỗi nhóm sau khi loại bỏ sai số thô, (**) Các răng không phát hiện được vi khuẩn được biểu diễn là có ít hơn 10 CFU/răng (giới hạn phát hiện của phương pháp đếm sống trong nghiên cứu này) Sau 7 ngày, mẫu trắng làm giảm 61,31% lượng vi khuẩn so với ban đầu, trong đó cả 11/11 răng có vi khuẩn mọc trở lại. Mẫu thử bơm rửa bằng nhũ dịch tinh dầu làm giảm 99,00% lượng vi khuẩn so với ban đầu, với 4/11 răng có vi khuẩn mọc trở laị. Mẫu đối chiếu làm giảm 97,55% lượng vi khuẩn so với ban đầu và có 9/10 răng có vi khuẩn mọc trở lại. Như vậy, nhũ dịch tinh dầu nghiên cứu cho khả năng ức chế vi khuẩn kéo dài và ngăn ngừa sự tái nhiễm tốt hơn so với dung dịch NaClO 3% (p < 0,05) BÀN LUẬN Phân lập vi khuẩn E. faecalis từ mẫu răng bệnh phẩm Định danh vi sinh vật gây nhiễm trùng nội nha bằng kỹ thuật PCR khuyếch đại đoạn 16S hoặc 23S rADN đã được chứng minh là có độ nhạy và hiệu quả hơn các phương pháp nuôi cấy. Enterococcus faecalis có thể được xác định bằng phương pháp PCR bằng nhiều đoạn mồi khác nhau như khuếch đại đoạn gen tuf dài 112 bp (phiên mã cho yếu tố nối dài EF-Tu), hoặc các đoạn gen trên 16S rARN đặc hiệu cho E. faecalis như đoạn 310 bp (base thứ 165 - 474 của gen 16S rADN E. faecalis, GenBank accession no. Y18293) hoặc 138 bp (base thứ 51 - 188 gen của 16S rADN E. faecalis, GenBank accession no. Y18293)(9). Cặp mồi khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 310 bp sử dụng để xác định E. faecalis trong đề tài này tuy có độ nhạy không cao như cặp mồi khuếch đại gen tuf tuy nhiên lại cho độ đặc hiệu cao hơn(9). Ngoài ra, tính đặc hiệu của đoạn mồi này cũng đã được chứng minh qua nghiên cứu của Siqueira và cs. khi thử nghiệm với ADN của các loài khác(15). Do đó, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi này để xác định vi khuẩn E. faecalis. Sau khi định danh bằng cặp mồi đặc hiệu, kết quả cho thấy trong 80 răng sâu thu nhận có 15 răng có sự hiện diện của E. faecalis, chiếm 18,75%. Tỉ lệ này tương tự với các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thế Hạnh và cs, E. faecalis xuất hiện ở 7/27 răng giai đoạn trước khi tạo hình ống tủy(10). Theo nghiên cứu của Sjogren U. và cs, E. faecalis xuất hiện ở 3/18 răng giai đoạn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 68 trước khi tạo hình ống tủy(16). Tỉ lệ này sẽ cao hơn nếu mẫu bệnh phẩm lấy từ răng đã điều trị nội nha và thất bại. Theo nghiên cứu của Ozbek S. M. và cs, có 32/43 điều trị tủy thất bại có sự hiện diện của E. faecalis(11). So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ tương nghiên cứu và dung dịch NaClO 3% Trong mô hình nhiễm trùng ống tuỷ răng ex vivo, việc khảo sát lượng vi khuẩn còn lại ngay sau khi bơm rửa cho phép đánh giá tốc độ sát khuẩn của các dung dịch bơm rửa, trong khi việc tái đánh giá lượng vi khuẩn sau 7 ngày cho phép nhận định hiệu quả sát khuẩn hoàn toàn của các dung dịch bơm rửa. Kết quả cho thấy, ngay sau khi bơm rửa, nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu tiêu diệt được 99,91% lượng vi khuẩn E. faecalis trong các răng, là thấp hơn có ý nghĩa (p < 0,05) so với dung dịch đối chiếu NaClO 3%, khi dung dịch này tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn. Điều này có thể được giải thích là do gốc OCl có kích thước nhỏ và tính oxy hóa rất mạnh, dễ dàng thấm qua các lớp tế bào và phá hủy các thành phần của vi khuẩn một cách nhanh chóng. Trong khi đó, tinh dầu ở dạng nhũ tương với các hoạt chất có kích thước lớn hơn, nên việc tiếp xúc và thấm qua tế bào vi khuẩn sẽ gặp hạn chế hơn rất nhiều. Kết quả này là tương tự với nghiên cứu trước đó của cùng nhóm nghiên cứu(5), khi so sánh hiệu quả kháng khuẩn ex vivo của hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc (0,22% kl/kl) – hương nhu trắng (0,13% kl/kl) – cồn 15% (kl/kl) và dung dịch NaClO 2,5% cũng nhận thấy hiệu quả kháng khuẩn của hỗn hợp này thấp hơn so với dung dịch đối chiếu ngay sau khi bơm rửa (95,77% so với 99,99%). Kết quả tái đánh giá vi khuẩn sau 7 ngày thể hiện được ưu điểm nhũ tương nghiên cứu. Nhũ tương nghiên cứu có khả năng tiêu diệt được 99,00% lượng E. faecalis so với ban đầu, trong đó có 7/11 số ống tủy khảo sát không thể phát hiện được vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống. Trong khi đó, dung dịch NaClO 3% không tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn (97,55%) trong ống tủy, 9/10 răng khảo sát đều có vi khuẩn mọc trở lại sau 7 ngày. Nhóm trắng bơm rửa bằng NaCl 0,9% chỉ làm giảm vi khuẩn bằng cơ chế cơ học nên không có khả năng diệt hoàn toàn vi khuẩn với 11/11 răng có vi khuẩn mọc lại sau 7 ngày. Như vậy, tuy có tốc độ sát khuẩn không nhanh bằng dung dịch NaClO, nhưng nhũ tương nghiên cứu có khả năng ức chế vi khuẩn E. faecalis kéo dài. Ngay cả sau khi thêm môi trường mới vào ống tủy, nồng độ của cồn và tinh dầu giảm xuống nhưng vẫn còn đủ khả năng ức chế vi khuẩn làm chúng không sinh trưởng được và bị tiêu diệt. Ở nhóm đối chiếu, khi thêm môi trường mới vào, nồng độ các gốc OCl- giảm xuống làm mất đi khả năng sát khuẩn. Vi khuẩn E. faecalis sẽ phát triển trở lại và gây nhiễm ống tủy tiếp tục và đây là nguyên nhân mà E. faecalis có thể sống sót trong điều kiện thực tế và gây thất bại trong điều trị nội nha. Kết quả thu được từ nghiên cứu cũng có sự đồng thuận với nghiên cứu của trước đó của cùng nhóm nghiên cứu(5), khi sử dụng hỗn hợp tinh dầu – cồn 15% cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn kéo dài khi tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn E. faecalis trong 5/6 răng thử nghiệm so với dung dịch NaClO 2,5%, khi dung dịch này không thể diệt hoàn vi khuẩn trong ống tủy với 6/6 răng tái nhiễm. Nghiên cứu của Estrela C. và cs. cũng phát hiện thấy E. faecalis trong 11/16 răng sau khi điều trị ống tủy với dung dịch NaClO 0,5-2,5%(2). Nghiên cứu của cũng Priyank H. và cs. cho thấy khi tăng nồng độ của NaClO lên 4% hay phối hợp thêm các biện pháp khác như sử dụng siêu âm, phối hợp với dung dịch H2O2 3% cũng không tiêu diệt được hoàn toàn E. faecalis(13). Như vậy, sử dụng dung dịch NaClO được chứng minh qua nhiều nghiên cứu là không hiệu quả trên E. faecalis. Điều này nói lên sự cần thiết trong việc nghiên cứu phát triển một dung dịch bơm rửa nội nha mới có thể tiêu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 69 diệt được E. faecalis và chống tái nhiễm sau khi điều trị. Nhũ tương nghiên cứu trong đề tài có thể mở ra hướng đi mới cho vấn đề này. Tuy nhiên để nâng cao hơn nữa hiệu quả sát khuẩn của nhũ tương nghiên cứu, cần thiết phải giảm cỡ hạt nhũ bằng phương pháp bào chế để tăng khả năng thấm vào tế bào cũng như đi đến được các vị trí sâu trong chân răng để tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn. KẾT LUẬN Kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy tiềm năng của nhũ tương bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu TTO và OG, có khả năng thay thế các dung dịch bơm rửa ống tủy cổ điển. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Agrawal Vineet S, Rajesh M, Sonali K, et al. (2014). A contemporary overview of endodontic irrigants–a review. J Dent App, 1 (6): pp.105-115. 2. Estrela C, Silva JA, et al. (2008). Efficacy of sodium hypochlorite and chlorhexidine against Enterococcus faecalis: a systematic review. Journal of Applied Oral Science, 16 (6): pp.364-368. 3. Fukushima H., Yamamoto K. et al. (1998). Localization and identification of Root Canal Bacteria in Clinically Asymptomatic Periapical Pathosis. Journal of Endodontic, 16 (11): 534-538 4. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Hồ Ánh Nguyệt, Lâm Thị Ngọc Phương (2014). Tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm trà Úc và hương nhu trắng trên các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh phân lập từ bệnh phẩm. Chuyên Đề Dược, Y học TP. Hồ Chí Minh, Phụ bản 18(2): tr.209-215. 5. Lê Tuấn Anh, Lê Văn An, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2018). Khảo sát tác động kháng khuẩn của hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc và hương nhu trắng trên các vi khuẩn gây nhiễm trùng ống tủy. Chuyên đề Dược, Y học TP. Hồ Chí Minh, phụ bản 22 (1): tr.445-452. 6. Lê Tuấn Anh, Nguyễn Thị Kim Loan, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2017), Khảo sát tác động kháng khuẩn của hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc và hương nhu trắng trên vi khuẩn Enterococcus faecalis gây viêm ống tủy răng. Chuyên đề Dược, Y học TP. Hồ Chí Minh, phụ bản 21 (1): tr.562-567. 7. Love RM (2001). Enterococcus faecalis – a mechanism for its role in endodontic failure. International Endodontic Journal, pp.34: 399-405. 8. Nakamura VC, Cai S, Candeiro GTM, et al. (2012). Ex vivo evaluation of the effects of several root canal preparation techniques and irrigation regimens on a mixed microbial infection. International Endodontic Journal, 46 (3): pp.217 - 224 9. Nandakumar R, Mirchandani R, Fouad A (2007). Primer sensitivity: can it influence the results in Enterococcus faecalis prevalence studies?. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 103 (3): pp.429-432. 10. Nguyễn Thế Hạnh (2015). Nghiên cứu lâm sàng, vi khuẩn học và đánh giá hiệu quả sát khuẩn trong điều trị bệnh lý tủy rang thể loại BAUME IV bằng calcium hydroxide và camphorated parachlorophenol. Viện nghiên cứu khoa học y dược lâm sàng, tr.108. 11. Ozbek SM, Ozbek A, Erdorgan AS (2009). Analysis of Enterococcus faecalis in samples from Turkish patients with primary endodontic infections and failed endodontic treatment by real-time PCR SYBR green method. Journal of Applied Oral Science, 17: pp.370-374. 12. Petersen PE (2003). The World Oral Health report 2003: continuous improvement of oral health in the 21st century - the approach of the WHO Global Oral Health Programme. Community Dent Oral Epidemiol, 31 (1): pp.3 –23. 13. Riyank H, Pandey V, Bagul A, et al. (2017). Evaluation of 4% Sodium Hypochlorite in eliminating Enterococcus faecalis from the Root Canal when Used with Three Irrigation Methods: An in vitro Study. The journal of contemporary dental practice, 18 (3): pp.214-217. 14. Rôças IN, Siqueira JrJF, Santos KR (2004). Association of Enterococcus faecalis with different forms of periradicular diseases. Journal of Endodontics. 30 (5): pp.315-320. 15. Siqueira JrJF, Rôças IN (2004). Polymerase chain reaction– based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 97 (1): pp.85-94. 16. Sjögren U, Figdor D, Spångberg L, et al. (1991). The antimicrobial effect of calcium hydroxide as a short‐term intracanal dressing. International Endodontic Journal, 24 (3): pp.119-125. 17. Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, et al. (2006). Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. Journal of Endodontics, 32 (2): pp.93-98. 18. Wilson KH, Blitchington RB. and Greene RC (1990). Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 28: pp.1942-1946 Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019