Đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp thụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận - Đỗ Khắc Đại

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 5 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG HLA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN SUY THẬN MẠN TÍNH DỰ KIẾN GHÉP THẬN Đỗ Khắc Đại1; Nguyễn Ngọc Tuấn1 Hoàng Trung Kiên1; Nguyễn Đặng Dũng1 TÓM TẮT Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. Đối tượng và phương pháp: sử dụng 2 bộ kít sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trên 55 mẫu huyết thanh được thu thập từ 55 bệnh nhân suy thận và phân tích bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trên hệ thống Luminex 200 tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y. Kết quả: 27/55 mẫu huyết thanh (49,09%) có kháng thể kháng HLA dương tính, trong đó dương tính với lớp I + lớp II chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%). Định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II. Kết luận: đã ứng dụng thành công kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong xét nghiệm sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận. * Từ khoá: Suy thận mạn tính (dự kiến ghép thận); Phát hiện kháng thể kháng HLA; Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent Assay in Detection of Anti-HLA Antibodies in Recipient Candidates for Kidney Transplant Summary Objectives: Anti-HLA antibodies in serum of kidney transplant recipients may significantly be involved in antibody-mediated graft rejection. Identification of the antibodies before kidney transplant in these patients, therefore, helps clinicians to better manage the patients both pre-and post-transplant. The aims of the present study are to screen and to identify anti-HLA antibodies in serum of recipient candidates for kidney transplant at 103 Military Hospital. Subjects and methods: A fluorescence covalent microbead immunosorbent assay test kit, along with Luminex 200 analyzer, were adopted in the study which allowed screening and identifying anti-HLA antibodies present in 55 serum samples from 55 recipient candidates for kidney transplant. 1. Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) Ngày nhận bài: 21/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/01/2019 Ngày bài báo được đăng: 28/02/2019. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 6 Results: 27 (out of 55) serum samples (49.09%) were reactive to anti-HLA antibodies; samples simultaneously reactive to anti-HLA class I and class II accounted for 44.4% of total number of reactive samples. HLA class I antibodies identified include 17 anti-HLA-A and 31 anti-HLA-B; for HLA class II antibodies, 22 anti-HLA-DR antibodies were identified. Conclusions: Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay with Luminex 200 analyzer were effective in screening and identification of anti-HLA antibodies in kidney transplant recipients. * Keywords: Kidney transplant; Recipient candidates for kidney transplant; Anti-HLA antibody; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay. ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ khi ca ghép thận đầu tiên trên thế giới thành công năm 1954, ghép thận đã trở thành phương pháp điều trị tối ưu nhất đối với bệnh nhân (BN) suy thận mạn (STM) giai đoạn cuối. Tại Việt Nam, ca ghép thận đầu tiên được thực hiện thành công tại Bệnh viện Quân y 103 vào tháng 6 - 1992. Từ đó đến nay, đã có hàng ngàn BN được ghép thận thành công tại các trung tâm y tế lớn trên toàn quốc. Một trong những vấn đề quan trọng nhất trong ghép thận đó là tình trạng đào thải thận ghép, nguyên nhân do đáp ứng miễn dịch của cơ thể túc chủ chống lại mô ghép khác gen. Trong đó, phản ứng đào thải thận ghép tối cấp, cấp tính và mạn tính qua trung gian kháng thể được nhiều tác giả công bố [1]. Nhiều phương pháp xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng - kháng nguyên HLA trước ghép (xét nghiệm tiền mẫn cảm) được ứng dụng trên lâm sàng nhằm hạn chế phản ứng đào thải thận ghép tối cấp và cấp tính qua trung gian kháng thể như kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC); kỹ thuật ELISA và kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (FCMIA). Trong đó, kỹ thuật FCMIA là kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm nổi bật như có độ nhạy và độ chính xác cao trong việc phát hiện kháng thể kháng lại kháng nguyên HLA so với kỹ thuật CDC và ELISA. Tại Học viện Quân y, việc triển khai thành công kỹ thuật này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, góp phần hạn chế tối đa phản ứng đào thải mô ghép trong ghép thận, cũng như theo dõi xuất hiện của kháng thể kháng HLA sau ghép nhằm nâng cao hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị cho BN nhận thận ghép. Xuất phát từ những phân tích trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: Sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bằng kỹ thuật FCMIA và hiệu quả định danh kháng thể kháng HLA ở BN STM tính dự kiến ghép thận. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. * Đối tượng nghiên cứu: 55 mẫu huyết thanh được thu thập từ 55 BN STM tính dự kiến ghép thận và có chỉ định ghép thận tại Bệnh viện Quân y 103. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 7 * Vật liệu nghiên cứu: - 2 kít xét nghiệm: + Kít xét nghiệm sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA (LMX) (Hãng Immucor, Mỹ). + Kít xét nghiệm định danh kháng thể kháng HLA (ID1 và ID2) (Hãng Immucor, Mỹ). - Hoá chất và sinh phẩm xét nghiệm: + Hỗn hợp với số lượng bằng nhau các loại hạt từ khác nhau, mỗi loại hạt từ huỳnh quang được gắn lên bề mặt một hoặc một số loại kháng nguyên HLA. + Hỗn hợp kháng thể phát hiện đã gắn phức hợp huỳnh quang PE. + Dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng Immucor, Mỹ sản xuất và cung cấp). + Hệ thống Luminex 200 và phần mềm điều khiển đi kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế tạo và cài đặt). - Vật liệu và thiết bị labô phụ trợ khác như máy lắc, máy hút chân không, các loại pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế được chính hãng sản xuất cung cấp. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phương pháp tách huyết thanh từ máu toàn phần: Lấy máu toàn phần số lượng 2 ml cho vào ống không có chất chống đông, đặt trong tủ ấm 30 phút ở nhiệt độ 370C để co cục máu tự nhiên. Ly tâm với tốc độ 2.500 rpm trong 20 phút, hút 0,5 ml dịch nổi màu vàng cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml và tiến hành xét nghiệm ngay. * Phương pháp xét nghiệm sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật FCMIA: - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh + 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (LMX bead) được lấy từ kít LMX vào các giếng xét nghiệm tương ứng. - Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời gian ủ tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng. - Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất huỳnh quang PE. - Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết mô tả tại bước 2. - Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy lắc 30 giây. - Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên hệ thống Luminex 200. * Phương pháp xét nghiệm định danh kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật FCMIA: - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh + 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (ID1 và ID2 bead) được lấy từ kít ID1 và ID2 vào các giếng xét nghiệm tương ứng. - Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời gian ủ, tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 8 - Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất huỳnh quang PE. - Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết mô tả tại bước 2. - Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy lắc 30 giây. - Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên hệ thống Luminex 200. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN * Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA (n = 55): Dương tính: 27 BN (49,09%); âm tính: 28 BN (50,91%). Theo Bùi Văn Mạnh và CS (2009), tỷ lệ này là 69,2% [2], của Yamamoto và CS (2014) là 39,4% [3]. Kết quả thu được khác nhau phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu, cỡ mẫu nghiên cứu. Đặc biệt là phương pháp xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HLA. Bùi Văn Mạnh và CS nghiên cứu trên cỡ mẫu nhỏ hơn (n = 39) so với nghiên cứu của chúng tôi và Yamamoto. Chúng tôi nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn (n = 55); đối tượng nghiên cứu là BN suy thận có chỉ định ghép thận và sử dụng kỹ thuật FCMIA để phát hiện kháng thể kháng HLA. * Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA theo lớp kháng nguyên HLA: Dương tính với lớp I: 8 BN (29,63%); dương tính với lớp II: 7 BN (25,93%); dương tính với lớp I + lớp II: 12 BN (44,44%). Trên các mẫu có kháng thể kháng HLA dương tính, nhóm có kháng thể kháng HLA dương tính với cả 2 lớp (lớp I + lớp II) chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%), cao hơn trường hợp chỉ dương tính với 1 lớp. Kết quả này có thể giúp các nhà lâm sàng theo dõi điều trị BN sau ghép thận tốt hơn. Trường hợp kháng thể kháng HLA dương tính với cả 2 lớp, tiên lượng xấu hơn dương tính với 1 lớp. Bảng 1: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA-A. Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-A Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%) 1 A*01 6 7,32 2 A*02 7 8,54 3 A*03 6 7,32 4 A*11 6 7,32 5 A*23 4 4,88 6 A*24 2 2,44 7 A*25 1 1,23 8 A*26 6 7,32 9 A*29 3 3,66 10 A*30 5 6,10 11 A*31 6 7,32 12 A*32 4 4,88 13 A*33 9 10,98 14 A*34 1 1,23 15 A*66 3 3,66 16 A*68 10 12,20 17 A*74 3 3,66 Tổng 82 100 Đã định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A. Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng thể kháng HLA-A*68 (12,20%) và thấp nhất là kháng thể kháng HLA-A*2534 (1,23%). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 9 Bảng 2: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA-B. Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-B Tần suất xuất hiện Tỷ lệ % 1 B*07 2 2,99 2 B*08 5 7,46 3 B*14 6 8,96 4 B*15 4 5,97 5 B*27 4 5,97 6 B*35 4 5,97 7 B*37 2 2,99 8 B*38 1 1,49 9 B*39 1 1,49 10 B*40 3 4,48 11 B*41 1 1,49 12 B*42 2 2,99 13 B*44 3 4,48 14 B*45 3 4,48 15 B*47 1 1,49 16 B*48 1 1,49 17 B*49 1 1,49 18 B*52 1 1,49 19 B*53 1 1,49 20 B*54 2 2,99 21 B*57 2 2,99 22 B*58 3 4,48 23 B*62 1 1,49 24 B*63 1 1,49 25 B*64 1 1,49 26 B*65 4 5,96 27 B*72 1 1,49 28 B*73 1 1,49 29 B*77 2 2,99 30 B*78 2 2,99 31 B*81 1 1,49 Tổng 67 100 Đã định danh được 31 loại kháng thể kháng HLA-B. Trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng thể kháng HLA-B*14 (8,96%) và B*08 (7,46%). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 10 Nghiên cứu đã phát hiện một số kháng thể kháng lại các kháng nguyên HLA như A*23, A*25, B*08, B*14 Theo nghiên cứu của Nguyễn Đặng Dũng và CS, những kháng nguyên trên mẫu tế bào thu nhận từ máu cuống rốn chưa thấy xuất hiện [3], chứng tỏ trong cộng đồng người Việt vẫn có người mang kháng nguyên này, nhưng để phát hiện được kháng nguyên hiếm gặp đòi hỏi phải có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và thực hiện trên nhiều khu vực khác nhau mới có thể đưa ra kết luận chính xác. Bảng 3: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo phân lớp. Đã định danh được 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II, trong đó chiếm tỷ lệ lớn nhất là HLA-DRB1*10 (14,29%). Số TT Kháng thể kháng HLA lớp II Phân lớp Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%) 1 B1*01 6 10,71 2 B1*03 2 3,57 3 B1*04 1 1,79 4 B1*07 2 3,57 5 B1*08 2 3,57 6 B1*09 3 5,36 7 B1*10 8 14,29 8 B1*11 2 3,57 9 B1*12 2 3,57 10 B1*13 2 3,57 11 B1*14 3 5,36 12 DRB1 B1*16 2 3,57 13 B3*01 1 1,79 14 B3*02 2 3,57 15 DRB3 B3*03 1 1,79 16 DRB4 B4*01 4 7,14 17 DRB5 B5*01 3 5,36 18 B1*02 3 5,36 19 B1*03 3 5,36 20 B1*04 1 1,79 21 B1*05 2 3,57 22 DQB1 B1*06 1 1,79 Tổng 56 100 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 11 Bảng 4: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo các nhóm. Số thứ tự Kháng thể kháng HLA lớp II Số lượng Tỷ lệ % 1 DRB1 14 48.28 2 DRB3 2 6.90 3 DRB4 4 13.79 4 DRB5 3 10,35 5 DQB1 6 20,68 Tổng 29 100 Đã định danh được 5 nhóm kháng thể kháng HLA lớp II (HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5 và HLA-DQB1). Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng thể kháng HLA-DRB1 (48,28%), tiếp theo là DQB1 (20,68%) và thấp nhất là kháng thể kháng DRB3 (6,90%). Bảng 5: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA theo loại kháng thể/mẩu huyết thanh. Loại kháng thể kháng HLA/mẫu huyết thanh Số lượng Tỷ lệ (%) 1 8 29,62 2 - 3 4 14,81 4 - 6 4 14,81 > 6 11 40,76 Tổng 27 100 Số mẫu huyết thanh có > 6 loại kháng thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao nhất (40,76%). Kết quả này có thể do kỹ thuật FCMIA có độ nhạy cao, có thể định danh được nhiều loại kháng thể khác nhau tương ứng với các allen kháng nguyên đã biết gắn trên hạt từ huỳnh quang. Do vậy, xét nghiệm tiền mẫn cảm trước ghép bằng kỹ thuật FCMIA giúp sàng lọc và lựa chọn người cho thận phù hợp nhất, góp phần làm giảm tỷ lệ đào thải thận ghép trên lâm sàng. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật FCMIA trong xét nghiệm sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của BN nhận thận ghép như sau: - 27/55 BN (49,09%) dương tính với kháng thể kháng HLA, trong đó dương tính với HLA lớp I: 29,63%; lớp II: 25,93%; lớp I và lớp II: 44,44%. - Đã định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA-DR và DQ với tần suất xuất hiện cao nhất là kháng thể kháng HLA-A*68; HLA-B*14 và HLA-DRB1*10. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hoàng Mạnh An. Những tiến bộ trong ghép tạng ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam. 2014, số 8, tr.41-43. 2. Bùi Văn Mạnh và CS. Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng và một số chỉ số miễn dịch ở BN sau ghép thận. Luận án Tiến sỹ Y học. Học viện Quân y. 2009. 3. Nguyễn Đặng Dũng và CS. Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu HLA của các mẫu tế bào gốc dây rốn được hiến tặng cho Ngân hàng Tế bào gốc Mekostem. Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2007, số 7, tr.21-28. 4. Yamamoto H, Uchida N, Matsuno N, Ota H, Kageyama K, Wada et al. Anti-HLA antibodies other than against HLA-A, -B, -DRB1 adversely affect engraftment and nonrelapse mortality in HLA-mismatched single cord blood transplantation: Possible implications of unrecognized donor-specific anti-bodies. Biol Blood Marrow Transplant. 2014, 20 (10), pp.1634-1640. doi:10.1016/j bbmt 2014.06.024.