Khảo sát dịch trích từ hoa dừa cạn (catharanthus roseus) ức chế virus dengue trong kỳ nguyên phân tế bào gan

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 86 KHẢO SÁT DỊCH TRÍCH TỪ HOA DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS) ỨC CHẾ VIRUS DENGUE TRONG KỲ NGUYÊN PHÂN TẾ BÀO GAN Nguyễn Văn Linh*, Phạm Thị Bảo Trân*, Lê Thị Chi**, Bùi Chí Bảo***, Châu Gia Các**** TÓM TẮT Giới thiệu: Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây nên bởi virus Dengue, lưu hành chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở bệnh nhân SXHD chức năng gan bị rối loạn, tế bào gan người là tế bào đích của virus khi xâm nhiễm và quá trình nhân bản của virus gây ra tiến trình hoại sinh trong tế bào này. Do chưa có vaccine phòng ngừa cũng như thuốc điều trị đặc hiệu nên tỉ lệ người mắc bệnh và tử vong không ngừng gia tăng. Điều này trở thành mối quan ngại lớn đối với sức khỏe cộng đồng trên bình diện quốc tế. Vì thế, việc tìm ra những dược liệu có khả năng ức chế quá trình nhân bản của virus đang được quan tâm trong thời gian gần đây. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) chứa những hợp chất có hoạt tính sinh học như alkaloid có khả năng ức chế quá trình phân bào. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả của dịch trích từ hoa dừa cạn trong việc ức chế sự nhân bản virus Dengue trong kỳ nguyên phân tế bào gan. Mục tiêu: Khảo sát hiệu quả ức chế sự nhân bản của virus Dengue trong tế bào gan bằng thuốc trích từ hoa dừa cạn. Phương pháp: Thu dịch trích từ hoa dừa cạn trắng và kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp HPLC. Xác định khả năng sống của tế bào khi nhiễm virus Dengue qua phương pháp xác định chỉ số MOI. Khảo sát nồng độ dịch trích từ hoa dừa cạn lần lượt là 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml để xác định nồng độ ức chế nhân bản của virus nhưng tế bào gan vẫn sống. Đánh giá tác động của thuốc lên tế bào đã nhiễm virus Dengue bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và biểu hiện RNA của virus thông qua phương pháp RT-PCR. Kết quả: Dịch trích từ mẫu hoa khô cho chất lượng tốt hơn mẫu tươi. Tại chỉ số MOI 50 số tế bào bị nhiễm virus còn sống chiếm tỉ lệ khoảng 80% cao hơn MOI 10 và MOI 100. Tế bào gan có tỷ lệ sống cao và giảm khả năng nhân bản của virus Dengue khi xử lý thuốc ở nồng độ 100 ng/ml. Kết quả kiểm tra RT-PCR cũng cho thấy thuốc có hiệu quả ức chế quá trình nhân bản của virus Dengue. Kết luận: Dịch trích từ hoa dừa cạn có hiệu quả làm giảm sự nhân bản của virus Dengue trong kỳ nguyên phân tế bào gan. Từ khoá: Hoa dừa cạn, sốt xuất huyết, DEN-2, tế bào Chang Liver. ABSTRACT SURVEY DRUG EXTRACTED FROM FLOWERING PERIWINKLE (CATHARANTHUS ROSEUS) INHIBITING VIRUS DENGUE ON DURING MITOSIS LIVER CELL. Nguyen Van Linh, Pham Thi Bao Tran, Le Thi Chi, Bui Chi Bao, Chau Gia Cac * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 86 - 93 Background: Dengue hemorrhagic fever (DHF) is an acute infectious disease caused by Dengue virus in tropical and subtropical regions. Dengue virus infected human liver cells and replicated, leading to dysfunctions and damages to liver cells. Currently, there are no preventive vaccine or specific drugs. Disease prevalent and mortality are inscreased continuously. Thus, DHF is a major concern in global health care. New drugs that * Đại học Cần Thơ **Đại học Cửu Long ***Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh ****Đại học Y Sungkyunwkan, Hàn Quốc Tác giả liên lạc : TS. Bùi Chí Bảo ĐT: 0909.708.225 Email: bcbao@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 87 inhibit viral RNA replication are required. Catharanthus roseus contains biological compounds such as alkaloid which can inhibit mitosis. In this study, we investigate the inhibition effect of drug extracted from Catharanthus roseus in viral RNA replication on mitosis of liver cells. Objectives: Investigate the inhibition effect of drug extracted from Catharanthus roseus in viral RNA replication on mitosis of liver cells. Methods: Drug extracted from Catharanthus roseus was collected and checking purity by HPLC technique. Cell survival ability that infected by Dengue virus was measured by MOI index. Drug extracted with concentration of 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml was used to test inhibition effects. Drug effects was evaluated by immunocytochemistry and RT-PCR for RNA expression. Results: Drug extracted from dried materials are better than fresh materials. At MOI 50, cell survival was 80% which is higher than at MOI 10 and MOI 100. Survival rate is high and viral replication is decreased when treated with drug at 100 ng/ml. RT-PCR results showed that drug can inhibit viral RNA replication. Conclusions: Drug extracted from Catharanthus roseus can inhibit viral RNA replication in liver cell mitosis. Keywords: Catharanthus roseus, Dengue Hemorrhagic Fever, DEN-2, Chang Liver cells. ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính, nguyên nhân gây bệnh do virus Dengue có 4 tuýp huyết thanh khác nhau là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN- 4(1,11). Bệnh truyền từ người sang người qua trung gian truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti. Do bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong cao nên SXHD được xem là vấn đề y tế quan trọng của các quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Hàng năm, theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới có khoảng 20 triệu trường hợp nhiễm virus Dengue và khoảng 24.000 ca tử vong(11). Tại Việt Nam, SXHD được phát hiện từ năm 1959, bệnh lưu hành quanh năm nhưng thường tăng cao từ tháng 6 đến tháng 11. Hơn 85% các ca SXHD và 90% các ca tử vong xảy ra ở các tỉnh phía Nam của Việt Nam. Khoảng 90% các ca tử vong do SXHD là dưới 15 tuổi(11). Tỷ lệ mắc bệnh giữa các năm và giữa các miền dao động rất khác nhau. Hiện chưa có vaccine dự phòng hiệu quả đối với bệnh SXHD cũng như chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Qua nghiên cứu, giải phẫu bệnh học của gan và các tương quan sinh học trong các trường hợp bệnh SXHD đã phát hiện kháng nguyên của virus Dengue được tìm thấy ở đại thực bào, phổi, lách, tuyến ức, tế bào Kuffer ở gan, tế bào monocyte ở máu ngoại biên(11). Do đó, tế bào gan và tế bào Kupffer có thể là các tế bào đích giúp virus Dengue nhân lên, dựa trên cơ sở virus Dengue nhân bản đặc biệt trong quá trình nguyên phân của tế bào gan(9). Suy gan tối cấp là một biến chứng nghiêm trọng và có khả năng gây tử vong cao(4,5,7,9). Ngoài ra, bằng phương pháp hóa dịch mô, kháng nguyên virus Dengue đã được phát hiện trong tế bào gan từ những vùng ngoại tử cho thấy tế bào gan là vị trí chính sao chép virus sốt xuất huyết trong gan và virus gây ra chết theo chương trình của tế bào gan(10). DEN-2 có thể nhiễm đồng đều đến năm dòng tế bào gan, nhưng tỷ lệ nhân bản của virus cao trong các dòng tế bào Hul7, PLC, M3B và Chang cao hơn trong dòng tế bào HA22T(6). Có thể đây yếu tố phân chia tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên của virus trong tế bào gan. Vì thế, việc tìm ra những hoạt chất có khả năng ức chế quá trình nhân bản của virus cần được quan tâm. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) cũng có các tên gọi khác như bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân. Cây dừa cạn có nguồn gốc từ châu Phi. Hiện nay, người ta đã xác định được các hoạt chất của cây dừa cạn là những alkaloid có nhân indol trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 88 nhất trong rễ và lá. Những alkaloid trong dừa cạn được chia làm 2 nhóm: nhóm alkaloid monomer có nhân indol hay indolinic như: ajmalicin, serpentin, alstonin, akuammin, lochnerin, catharanthin, reserpin và vindolin. Nhóm alkaloid dimer, không đối xứng gần như đặc thù của loài dừa cạn như: vinblastine, vincristine, leurosin, leurosidin, rovidin(8). Dừa cạn ở nước ta có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1- 0,2%. Các chất chủ yếu là: vinblastine, vincristine, prinin, vindolin, ajmalicin, catharanthin, tetrahydroalstonin, vincosid(3). Các dẫn xuất của vinblastine có khả năng ức chế phân bào. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm tìm hiểu về dược tính và ứng dụng hiện nay nhằm cung cấp các thông tin cần thiết cho việc tìm ra các loại thuốc ức chế ngăn chặn bệnh SXHD. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Hoa dừa cạn trắng được thu hái ở tỉnh Đồng Tháp. Hình 1: Hoa dừa cạn tươi (A), phơi khô (B) và nghiền thành bột (C). Phương pháp Thu nhận mẫu thuốc Thu hái khoảng 200 g bông dừa cạn tươi, rửa sạch, phơi khô. Sau đó cân lại được 22 g hoa khô. Nghiền thành bột mịn bằng máy xay xát được khoảng 16,6 g bột. Hoà tan với DMSO, gia nhiệt ở nhiệt độ khoảng 60 - 700C, khoảng 30 phút, lọc qua cột lọc 0,2 mm. Chạy sắc kí HPLC để kiểm tra độ tinh sạch. Thu nhận được dịch trích. Nuôi cấy tế bào Chang Liver Giữ ống tế bào trong bể ổn nhiệt 37oC và lắc thật nhanh, tế bào sẽ tan ra trong vòng 1 phút. Sau đó đặt cốc thủy tinh chứa cồn 70% và chuyển ngay vào tủ cấy để thao tác. Mở ống đựng nhưng không cho cồn rơi vào trong ống. Chuyển toàn bộ những gì trong ống vào đĩa nuôi cấy và thêm môi trường Mccoy’s 5A có bổ sung trypsin 10% FBS, 1% PS. Ủ trong tủ trữ ấm ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2. Nuôi trong vòng 2-3 ngày. Sau khi mật độ tế bào chiếm 70% - 80% diện tích đĩa thì tiến hành cấy chuyền. Kết quả được đánh giá bằng cách quan sát khả năng bám dính, sự phát triển của tế bào sau 24 giờ nuôi và kiểm tra sự tạp nhiễm dưới kính hiển vi soi ngược (Olympus). Nhiễm DEN-2 vào tế bào Chang Liver Pha loãng dung dịch gốc chứa virus trong SFM trong ống tuýp 1,5 ml. Bắt đầu bằng cách thêm 500 μl SFM vào mỗi ống. Trộn các ống tại mỗi bước pha loãng. Rửa sạch các tế bào trong các đĩa lây nhiễm, hai lần với 2 ml PBS. Ủ các đĩa ở 370C cho đến khi sẵn sàng cho thu kết quả. Xác định chỉ số MOI (Multiplicity of Infection) Nhiễm virus sang tế bào Chang Liver A B C Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 89 trong môi trường Mccoy’s 5A bổ sung 10% FBS, 1% PS với nồng độ virus (mg/ml) giảm dần: 1/100; 1/500; 1/1000. Ủ trong 24 giờ ở 37oC. Sau đó quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. So sánh tỷ lệ tế bào sống/tế bào chết và tỷ lệ tế bào bị nhiễm virus/ tế bào chưa bị nhiễm ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được đánh giá thông qua chỉ số MOI. Đồng nhất chu kỳ tế bào Chang Liver Đồng nhất tế bào về pha G1: chuyển tế bào vào bình Roux chứa môi trường 10% huyết thanh. Khi đạt độ phủ khoảng 70%, thay môi trường serum starvation (0.1% FBS). Ủ tế bào ở 370C, 5% CO2 trong 24 giờ. Sau đó thêm vào Thymidine. Đồng nhất tế bào về pha S: Xử lý tương tự như pha G1 nhưng thêm vào 5-fluorodeoxyuridine. Đồng nhất tế bào về pha G2/M: chuyển tế bào vào bình Roux chứa môi trường 10% huyết thanh. Cho thêm 200 ng/ml Colchicines, ủ tế bào ở 370C, 5% CO2 trong khoảng thời gian: 6 giờ để đưa tế bào về pha G2, 12-24 giờ để đưa tế bào về pha M. Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Rửa tế bào với nước muối sinh lý và ổn định bằng PFA (4%) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó phá màng tế bào bằng chất tẩy nhẹ triton-X100 (0,03%) để giúp kháng thể đi vào và bắt được với protein, tiếp theo ủ với kháng thể trong vòng 1-2 giờ, sau đó rửa lại với PBS 3 lần, tiếp tục ủ với kháng thể thứ 2 (ủ trong tối), kháng thể thứ 2 này có thể bắt được huỳnh quang với màu tùy theo bước sóng, tiếp tục rửa lại với PBS 3 lần, mẫu thu được cố định trên slide và dùng lamen đậy lại. Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (ZEISS). Ly trích RNA virus và RT-PCR RNA virus được ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào theo phương pháp TRIzol. Tổng hợp cDNA rồi sau đó tiến hành RT-PCR theo bộ Kit TaKaRa. Đánh giá kết quả dựa vào band hình điện di trên gel agrose 2%. Bảng 1: Trình tự các cặp mồi cho phản ứng RT–PCR. Marker Trình tự mồi Kích thước DEN-2 F: GGCCGCAACCATGGCAAACG R: GGCCGCAACCATGGCAAACG 211bp GAPDH F: GCCTTCCGTGTCCCCACTGC R: CAATGCCAGCCCCAGCGTCA 411bp KẾT QUẢ Kết quả phân tích HPLC mẫu hoa dừa cạn Hình 2: Kết quả phân tích HPLC mẫu hoa dừa cạn. A: mẫu chuẩn DMSO; B: DMSO có chứa mẫu hoa tươi; C: DMSO có chứa mẫu hoa khô Nhận xét: Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng hoà tan với dung dịch chuẩn DMSO nhiệt độ 60oC sắc ký chạy từ phải sang trái cho thấy (Hình A) trong vùng chạy từ khoảng 3,6 đến 5 ppm đã xác định có 10 đỉnh (peak). (Hình B) hoà tan DMSO với mẫu tươi Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 90 trong vùng chạy từ 1,2-1,6 ppm có sự xuất hiện 1 đỉnh còn chập nhau 1 phần chưa tách hoàn hoàn. (Hình C) hoà tan DMSO với mẫu khô trong vùng chạy từ 1,2-1,6 ppm có sự xuất hiện của 1 đỉnh tách rời nhau hoàn toàn. Như vậy ở mẫu khô khi phân tích thì cho kết quả tách các chất hoàn toàn tốt hơn so với mẫu tươi. Kết quả nuôi cấy tế bào Hình 3: Tế bào Chang Liver sau khi nuôi cấy. Nhận xét: Sau 24h nuôi cấy, tế bào Chang Liver đã bám vào bề mặt môi trường nuôi cấy và cũng có một số tế bào không bám được vào bề mặt môi trường. Với những tế bào Chang Liver có khả năng bám dính vào bề mặt môi trường là Chang Liver có khả năng thích nghi với môi trường nuôi cấy. Còn đối với các tế bào Chang Liver không bám được vào môi trường là do tế bào chết do bị sốc khi xử lí với trypsin hoặc các tế bào này bị trypsin ức chế làm mất khả năng bám dính của tế bào. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát thấy các tế bào Chang Liver đã phát triển và tăng sinh phủ khắp đĩa nuôi cấy. Chứng tỏ các tế bào đã thích nghi với điều kiện nuôi cấy. Tiến hành thay môi trường sau hai ngày nuôi để bổ sung chất dinh dưỡng cho môi trường nuôi và loại bỏ các tế bào chết và các yếu tố gây cản trở cho sự tăng sinh của tế bào. Kết quả nhiễm DEN-2 vào tế bào Chang Liver Kết quả cho thấy ở MOI 10, khả năng tồn tại của DEN-2 sau khi nhiễm vào tế bào Chang Liver tỉ lệ tế bào bị nhiễm virus Dengue còn sống rất thấp. MOI 100 thì tỉ lệ này lại quá cao, có thể gây ngộ độc tế bào. Các tế bào có chỉ số MOI 10 và MOI 100 đều không thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo. Ở chỉ số MOI 50 (tương ứng với nồng độ 1/500), số tế bào bị nhiễm virus còn sống chiếm tỉ lệ khoảng 80%, khả năng tồn tại của virus Dengue là cao và ổn định tối ưu. Hình 4: Kết quả nhiễm DEN-2 thông qua chỉ số MOI. Biểu hiện hình thái của virus Dengue sau khi tác động thuốc Hình 5: Kết quả điều trị virus Dengue-2 thuốc với các nồng độ thuốc (A): (–) Dengue-2; (B): (+) Dengue-2/ (-) thuốc; (C): + 100 ng/ml thuốc; (D): +200 ng/ml thuốc; (E): +300 ng/ml thuốc. Nhận xét: Tế bào nhiễm Dengue-2 khi cho thuốc tác động vào ở nồng độ khác nhau, thì với nồng độ 100 ng/ml ức chế được DEN-2 tế bào không bị chết biểu hiện (GFP) phát sáng, các tế bào chết biểu hiện các chấm đen, ở nồng độ 200 ng/ml nồng độ thuốc cao không có ức chế được DEN-2 vì tế bào chết nhiều biểu hiện dấu chấm đen, nồng độ 300 ng/ml nồng độ thuốc rất cao gây ra tế bào chết cao gây ngộ độc tế bào. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 91 Hình 6: Biểu hiện của virus Dengue. Nhận xét: Khi quan sát dưới ánh sáng huỳnh quang ta thấy các chấm có màu xanh lục là các hạt (particle) của virus Dengue (GFP phát sáng). Kết quả cho thấy tế bào Chang Liver có các chấm màu xanh lục (GFP phát sáng) rất nhiều, đặc biệt các đốm màu xanh do chưa có thuốc chứng tỏ giai đoạn này sự nhân bản của virus Dengue trong tế bào, tế bào Chang Liver khi cho thuốc tác động lên có các chấm màu xanh lục (GFP phát sáng) ít nhất, tương ứng với số lượng virus Denguegiảm di rất nhiều. Điều này đã chứng minh rằng khi có thuốc tác động lên tế bào nhiễm virus Dengue đã ức chế được sự nhân bản của Dengue. Hình 7: Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm cDNA bằng marker GAPDH (chứng nội). Kết quả RT-PCR Hình 8: Kết quả diện di bằng marker DEN-2 và biểu đồ phân tích sản phẩm điện di. Nhận xét: Trong kết quả điện di, ở giếng (Nước) không biểu hiện band hình; giếng (– Thuốc), band điện di sáng và rõ; giếng (+ Thuốc) band rất mờ. Trong biểu đồ (sử dụng phần mềm ImageJ) so sánh giữa giếng không điều trị và điều trị thuốc cho thấy, band ở giếng không điều trị thuốc (62,04%) sáng và rõ hơn band ở giếng điều trị thuốc (37,95%), chứng tỏ hiệu quả của thuốc đã ức chế quá trình nhân bản của virus Dengue trong tế bào. BÀN LUẬN Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu có thành phần phức tạp, để đáp ứng được tính đặc hiệu, thông thường phương pháp HPLC hay được sử dụng. HPLC cũng là phương pháp định lượng phổ biến nhất trong các dược điển hiện hành. Tuy nhiên, để áp dụng các phương pháp này, một trong những yêu cầu đầu tiên là phải có các chất chuẩn. Hơn thế nữa, các chất chuẩn rất cần thiết cho công tác nghiên cứu phát triển dược liệu và các chế phẩm từ dược. Vì vậy, phương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 92 pháp HPLC được lựa chọn trong nghiên cứu này để định lượng và xác định tạp chất liên quan. Sau khi thu được dịch chiết toàn phần, thực hiện quá trình phân lập để tách riêng đối tượng nghiên cứu. Việc phân lập các hợp chất nghiên cứu trong đề tài dựa trên các quá trình hóa lí như dựa vào tính tan của hợp chất trong dung môi, khả năng thẩm thấu, khả năng phân bố của chất vào môi trường. Tùy thuộc vào mức độ tinh khiết của hợp chất sau phân lập, quá trình tinh chế có thể được thực hiện bằng một trong các phương pháp sau: nếu hợp chất sau phân lập đã có độ tinh khiết khá cao thì chỉ cần tinh chế đơn giản bằng cách kết tinh lại trong dung môi nhiều lần, nếu hợp chất sau phân lập có độ tinh khiết chưa cao thì quá trình tinh chế có thể thực hiện bằng cách lặp lại quá trình sắc kí cột như giai đoạn phân lập để lựa chọn phân đoạn tinh khiết hơn, hoặc thay đối dung môi rửa giải hoặc kiểu sắc kí. Trên thế giới, một số nghiên cứu gần đây cho thấy khi xử lý các tế bào Vero với cytochalasin D, một chất ức chế macropinocytosis, ngoài tác dụng ức chế tế bào như mong muốn còn dẫn đến ức chế sự xâm nhiễm của virus(2) hay việc sử dụng đột biến trội Esp15 trong việc ức chế clathrin qua trung gian của quá trình dung hợp hai tế bào cho thấy sự giảm xâm nhập của virus West Nile được trên tế bào C6/36. Kết quả này đã làm giảm việc xâm nhập của virus Dengue rất khả quang, giảm đến 80%(2). các nghiên cứu của Chu và cs. (2004)(2) và Krishnan và cs. (2007)(5) đã điều tra sự xâm nhập của virus Dengue vào các tế bào HeLa, kết quả cho thấy sự xâm nhập của virus Dengue nói riêng và chi flavivirus nói chung không chỉ thông qua endocytosis mà còn bằng nhiều con đường khác nhau, giúp ích đáng kể cho sự hiểu biết của chúng ta về sự xâm nhập flavivirus vào tế bào chủ, từ đó sẽ có phương pháp ngăn chặn hiệu quả sự nhân bản hay sự xâm nhiễm của virus Dengue vào tế bào, lảm giảm các hậu quả đáng tiếc từ bệnh do virus Dengue gây raTừ những nghiên cứu đã công bố, có thể nhận ra một điểm chung là các thuốc hoặc chất ức chế quá trình nguyên phân của tế bào có thể làm giảm và tiêu diệt virus. Nghiên cứu này cũng có kết quả tương tự, virus DEN-2 hiện diện nhiều trong chu trình G2-M của tế bào dòng Chang Liver so với các chu trình tế bào khác. Kết quả này giúp mở ra một hướng liệu trị bệnh sốt xuất huyết do DEN-2. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã thu được dịch trích từ hoa dừa cạn tinh chiết từ ethanol và kiểm tra độ tinh khiếtqua phương pháp HPLC cho thấy ly trích từ mẫu khô cho kết quả tốt hơn so với mẫu tươi. Xác định được khả năng tồn tại của tế bào Chang Liver sau khi nhiễm DEN-2 là khá cao khoảng 80%. Xác định được ở nồng độ thuốc 100ng/ml có khả năng giúp tế bào gan sống và giảm được khả năng nhân bản của virus Dengue trong kỳ nguyên phân tế bào Chang Liver. Quan sát được sự biểu hiện kiểu hình khi quan sát dưới huỳnh quang và biểu hiện kiểu gen của virus Dengue thông qua phương pháp RT-PCR. Đánh giá được tác động của thuốc vào tế bào gan đã nhiễm virus trong kỳ nguyên phân đồng thời biểu hiện làm giảm khả năng nhân bản của virus Dengue. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alvarez ME, et al (1985). Dengue and hepatic failure. Am. J. Med, 79: 670-674. 2. Chu JJH, et al. (2004). Infectious Entry of West Nile Virus Occurs through a Clathrin-Mediated Endocytic Pathway. Journal of Virology, 78: 10543-10555. 3. Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tái bản lần thứ 7, trang 307-309. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 4. Krishnan MN, et al (2007). Rab 5 is required for the cellular entry of Dengue and WestNile Viruses. Journal of Virology, 81(9):4881-5. 5. Lawn SD, et al (2003). Dengue haemorrhagic fever with fulminant hepatic failure in an immigrant returning to Bangladesh. Clin. Inf. Dis, 37: 1-4. 6. Lin YL, et al(2000). Infection of five human liver cell lines by dengue-2 virus. J. Med. Virol., 60:425-431. 7. Lum LC, et al (1993). Fulminant hepatitis in Dengue infection. Southeast Asian J. Trop.Med. Public Health, 24(3): 467-471. 8. Moreno-Valenzuela OA, et al(1998). Effect of differentiation on the regulation of indole alkaloid production in Catharanthusroseus hairy roots. Plant Cell Rep, 18(1-2):99-104. 9. Perez EA, et al (2009). Microtubule inhibitors: differentiating tubulin-inhibiting agents based on mechanisms of action, clinical activity, and resistance. Mol Cancer Ther, 8(8):2086– 2095. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 93 10. Subramanian V (2005). Dengue haemorrhagic fever and fulminant hepatic failure. Dig. Dis. Sci, 50: 1146-1147. 11. WHO (2014). Hỏi đáp về sốt xuất huyết Dengue và sốt xuất huyết Dengue nặng. Tổ chức Y tế Thế giới, Văn phòng đại điện WHO Việt Nam. Ngày nhận bài báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016