Giải trình tự, xác định tính tương đồng của gen zmdreb2a trong cây ngô đã được chuyển gen với gen thiết kế

32 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Những nghiên cứu về quá trình đáp ứng với điều kiện stress phi sinh học ở thực vật ở cấp độ phân tử cho thấy nhân tố phiên mã (Transcription factors) đóng một vai trò rất quan trọng (Chinnusamy et al., 2007; Nakashima et al., 2009). Bằng việc tương tác với các yếu tố điều hòa đặc trưng (cis-/trans-acting element) nằm trên promoter của các gen chống chịu, nhân tố phiên mã có thể hoạt hóa biểu hiện của hàng loạt gen chống chịu đáp ứng với từng loại stress môi trường khác nhau (Farooq et al., 2009; Gao et al., 2008). ZmDREA2A là nhân tố phiên mã hoạt hóa các gen chống chịu hạn và sock nhiệt thuộc họ nhân tố phiến mã AP2/ERF được phân lập từ cây ngô (Qin et al., 2007). ZmDREB2A tồn tại hai dạng cấu trúc phiên mã là ZmDREB2A-L có chiều dài 1.336 bp và ZmDREB2A-S có chiều dài 1.283 bp. So với dạng S, dạng L dài hơn 53bp, điều này dẫn đến khung đọc mở bị thay đổi, làm xuất hiện tín hiệu kết thúc dịch mã sớm và chỉ mã hóa 89 axit amin. Đó là nguyên nhân protein được dịch mã từ dạng L không có khả năng hoạt hóa biểu hiện các gen chống chịu. Trong điều kiện khi cây gặp stress hạn, quá trình biến đổi sau phiên mã sẽ loại bỏ 53bp ở mRNA ZmDREB-L để hình thành dạng ZmDREB2A-S. Mã hóa cho 318 axit amin, có khả năng hoạt hóa biểu hiện các gen chống chịu stress hạn ở Ngô. ZmDREAB2A-S có vai trò trong việc chống chịu hạn cho cây ngô và chỉ được tạo ra khi cây gặp điều kiện môi trường hạn hán (Qin et al., 2007). Trên thế giới, gen ZmDREAB2A đã được chuyển vào cây mô hình Arabidopsis mang lại kết quả giúp nâng cao tính chịu hạn, chịu mặn trên cây chuyển gen (Qin et al., 2007). Ở Việt Nam, năm 2015, Viện Nghiên cứu Ngô và Viện Nghiên cứu Hệ gen đã thiết kế cấu trúc biểu hiện Ubi :: ZmDREB2A-S :: 35S.Gen ZmDREB2A-S điều khiển biểu hiện bởi promoter Ubiquitin và trình tự 35S terminator không dịch mã đầu 3’. Cấu trúc này được chuyển vào 3 nguồn vật liệu ngô K3 và K7 bằng phương pháp biến nạp vào phôi non nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm tăng cường khả năng chống chịu stress hạn ở Ngô (Đoàn Thị Bích Thảo và ctv., 2016). Sự có mặt của gen ZmDREB2A trong genome cây ngô chuyển gen được đánh giá bằng PCR kết hợp với giải trình tự gốc. Trong nghiên cứu này tiến hành đánh giá cấu trúc biểu hiện Ubi :: ZmDREB2A-S :: 35S trong cây ngô chuyển gen thông qua phương pháp PCR, giải trình tự và so sánh với trình tự gốc. Qua đó đảm bảo cấu trúc biểu hiện đươc chuyển vào đầy đủ và không bị biến đổi, đảm bảo cho sự biểu hiện của ổn định của gen ZmDREB2A ở các dòng ngô chuyển gen. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Cây ngô chuyển gen ZmDREB2A từ nguồn K3, K7 tại thế hệ thứ 3 tại Viện Nghiên cứu Ngô. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - ADN tổng số từ lá của mẫu ngô chuyển gen được tách chiết theo phương pháp sử dụng CTAB (Doyle and Doyle, 1990), đồng thời có một số cải biến nhỏ phù hợp với việc tách chiết ADN ở cây ngô và điều kiện phòng thí nghiệm. 1 Viện Nghiên cứu Ngô, 2 Viện Nghiên cứu Hệ gen GIẢI TRÌNH TỰ, XÁC ĐỊNH TÍNH TƯƠNG ĐỒNG CỦA GEN ZmDREB2A TRONG CÂY NGÔ ĐÃ ĐƯỢC CHUYỂN GEN VỚI GEN THIẾT KẾ Đoàn Thị Bích Thảo1, Nguyễn Xuân Thắng1, Lê Công Lực1, Nguyễn Thị Thu Hoài1, Tạ Thị Thuỳ Dung1, Lê Công Tùng1, Bùi Mạnh Cường1, Nông Văn Hải TÓM TẮT ZmDREB2A là nhân tố phiên mã thuộc họ nhân tố phiên mã AP2/ERF được phân lập từ ngô. Nhiều nghiên cứu trên thực vật đã chỉ ra rằng ZmDREB2A có khả năng hoạt hóa biểu hiện hàng loạt gen chống chịu có liên quan đến con đường đáp ứng chịu hạn và sock nhiệt ở Ngô. Nghiên cứu này đánh giá sự có mặt và độ chính xác về mặt phân tử cấu trúc biểu hiện Ubi :: ZmDREB2A-S :: 35S trên cây ngô chuyển gen ZmDREB2A có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ngô K3 và K7. Nghiên cứu sử dụng PCR kết hợp với giải trình tự và so sánh các trình tự nucleotide promoter Ubiquitin, gen đích ZmDREB2A và 35S terminator với trình tự gốc. Kết quả so sánh cho thấy độ tương đồng cao trên 98% ở cả ba đoạn trình tự trong cây chuyển gen và trình tự gốc. Mức độ tương đồng như trên đảm bảo cho sự biểu hiện ổn định của gen chuyển trong cây ngô chuyển gen. Từ khóa: Ngô, gen ZmDREB2A, Agrobacterium tumefaciens 33 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 - Phản ứng PCR dùng khuếch đại đoạn trình tự promoter Ubiquitin, gen ZmDREB2A và 35S terminator từ ADN tổng số được thực hiện theo hướng dẫn sách cẩm nang phòng thí nghiệm (Sambrook and Russell, 2001). + Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong thí nghiệm được trình bày theo bảng sau: + Thành phần phản ứng PCR được tiến hành ở thể tích 25 µl bao gồm: ddH20: 16,7 µl; đệm 10X: 2,5 µl; mồi xuôi (10 pmol): 1 µl; mồi ngược (10 pmol): 1 µl; dNTPs 10 mM: 2,5 µl; Taq ADN polymerase: 0,3 µl; ADN khuôn (20 ng): 1 µl. + Sản phẩm sau khi tinh sạch được giải trình tự bằng máy CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter, so sánh trình tự bằng phần mềm bioEdit và BLAST trên NCBI. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện vụ Thu năm 2016 và vụ Xuân 2017 tại Viện Nghiên cứu Ngô - Đan Phượng, Hà Nội. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nhân bản cấu trúc biểu hiện gen ZmDREB2A trong cây ngô chuyển gen Nhằm phục vụ cho việc giải trình tự và so sánh trình tụ nucleotide. Tiến hành PCR nhân bản và giải trình tự đoạn trình tự trong cấu trúc biểu hiện gen ZmDREB2A bao gồm: vùng promoter Ubiquitin, gen đích ZmDREB2A và vùng 35S terminator. Lá các cây ngô chuyển gen từ nguồn K3 và K7 được sử dụng để tách chiết ADN tổng số, sau đó được sử dụng là khuôn trong phản ứng PCR với mồi đặc hiệu của từng vùng trình tự. Kết quả PCR được điện di trên gel Agarose 1,5 %. Kết quả PCR được thể hiện trên hình 1-A. Phản ứng PCR đã nhân thành công trình tự promoter Ubiquitin cây ngô chuyển gen từ nguồn K3, K7 có kích thước đúng với kích thước mong muốn (1,4 kb). Tương tự với gen đích ZmDREB2A (954 bp) và vùng 35S terminator (256 bp) cũng được khuếch đại thành công và đúng kích thước, hình 1-B, 1-C. Các băng ADN được thôi gel và tinh sạch sử dụng cho việc giải trình tự và so sánh. Tên mồi Trình tự Gen đích ZmDREB2A-F 5’CGT GTA GTC CCT GAG GTG CAG G 3’ ZmDREB2A ZmDREB2A-F 5’AGACCGGCAACAGGATTCAA3’ Ubiquitin-F 5’ ACGAGTCTAA CGGACACCAA CC 3’ promoter Ubiquitin Ubiquitin-R 5’ AGC GTC ATG GAT CCT CTG CAG 3’ 35s-F 5’TTCCAAAGACGAACTCTAGC3’ 35S terminator 35s-R 5’ATCCAGTGACCTGCAGGCAT3’ A B C 1 300bp 200bp 2 3 4 5 6 Hình 1. Kết quả PCR các vùng trong cấu trúc biểu hiện gen ZmDREB2A ở cây ngô chuyển gen A: Kết quả PCR vùng promoter Ubiquitin; B: Kết quả PCR gen đích ZmDREB2A: C: Kết quả PCR vùng 35S terminator 1: AND ladder; 2: đối chứng dương plasmid; 3: đối chứng âm nước ; 4: đối chứng âm cây không chuyển gen; 5-6: mẫu ngô chuyển gen nguồn K3,K7. 34 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 3.2. Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự Promoter Ubiquitin Sản phẩm PCR vùng trình tự promoter Ubiquitin được giải trình tự hai chiều: Chiều xuôi với mồi Ubiquitin-F và chiều ngược với mồi Ubiquitin-R. Một phần kết quả giải trình tự chiều xuôi promoter Ubiquitin thuộc nguồn K7 được thể hiện trên hình 2. Kết quả giải trình tự promoter Ubiquitin từ cây ngô chuyển gen được sử dụng so sánh với trình tự gốc promoter Ubiquitin(1408 bp). Kết quả so sánh được thể hiện trên bảng 1. Hình 2. Một phần kết quả giải trình tự đoạn Promoter Ubiquitin bằng mồi Ubiquitin-R thuộc nguồn K7 Hình 3. Một phần kết quả trình tự promoter Ubiquitin với mồi Ubiquitin-R với trình tự gốc Hình 4. Một phần kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A bằng mồi ZmDREB2A-F cây ngô chuyển gen nguồn K7 Bảng 1. Kết quả so sánh đoạn trình tự Promoter Ubiquitin và trình tự gốc Kết quả so sánh đoạn promoter Ubiquitin được giải trình tự bằng mồi Ubiquitin-F cho kết quả so sánh đạt độ tương đồng khá thấp, đặc biệt ở mẫu K7 khi chỉ có thể so sánh một đoạn dài 405 bp. Nguyên nhân có thể do việc mẫu ADN giải trinh tự không đạt được độ sạch cần thiết sau khi thôi gel, dẫn đến khó khăn trong việc đọc giải trình tự. Ngược lại, với đoạn promoter Ubiquitin được giải trình tự bằng mồi Ubiquitin-R cho độ tương đồng và mức độ so sánh cao. Tuy nhiên, tại vị trí nucleotide 793 ở hai mẫu K3 và K7 đều có sự xuất hiện của 1 trình tự gồm 4 nucleotide TTAA (hình 3) mà trình tự gốc không xuất hiện. Nguyên nhân xuất hiện sự sai khác này có thể do những biến đổi trong quá trình biến nạp gen vào hệ genome của ngô. Cũng không loại trừ đây là kết quả hiện tượng đột biến chuyển đoạn. Tuy nhiên, kết quả so sánh cũng không nhận sự khác biệt giữa đoạn promoter Ubiquitin ở cây chuyển gen và trình tự gốc ở một số vùng quan trọng trong cấu trúc của mộtpromoter như hộp TATA box. Đảm bảo Ubiquitin promoter không bị ảnh hưởng. Đảm bảo cấu trúc biểu hiện gen đích vẫn hoạt động bình thường. Mẫu Mồi giải trình tự Kích thước (bp) Mức độ so sánh Giá trị e Số vị trí trống Độ tương đồng (%) K3 Ubiquitin-F 1027 bp 686/804 0.0 27 85,3 Ubiquitin-R 863 bp 852/865 0.0 10 98.5 K7 Ubiquitin-F 780 bp 405/420 0.0 5 96,4 Ubiquitin-R 1132 bp 973/990 0.0 10 98,3 3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự gen ZmDREB2A Một phần kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A từ cây ngô chuyển gen nguồn K7 được thể hiện trên hình 4. Chúng ta có thể thấy các đỉnh peak rõ ràng, không chồng lấn lên nhau cho thấy kết quả thu được là chính xác. 35 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Bảng 2. Kết quả so sánh đoạn trình tự Gen ZmDREB2A và trình tự gốc Hình 5. Kết quả so sánh trình tự gen ZmDREB2A từ nguồn K7 và trình tự gốc Hình 6. Một phần kết quả giải trình tự đoạn 35S terminator bằng mồi 35S-F cây ngô chuyển gen nguồn K7 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen ZmDREB2A hai dòng ngô K3, K7 và đoạn trình tự gen ZmDREB2A gốc được trình bày trên bảng 2. Kết quả bảng 2 cho thấy, mức độ nucleotide tương đồng giữa gen ZmDREB2A được tách từ cây ngô chuyển gen từ hai nguồn dòng K3 và K7 cho kết quả gần như tương đồng 100%. Sự sai khác chỉ xảy ra tại vùng từ 20-30 nucleotide đầu tiên vùng 5’ ở các mẫu giải trình tự do việc giải trình tự trực tiếp từ mồi đặc hiệu (hình 5) cho kết quả không chính xác. Có thể nói gen ZmDREB2A tồn tại trong hệ genome cây ngô chuyển gen khá ổn định và không có sự sai khác nào về trình tự so với trình tự gốc. Qua đó đảm bảo cho việc mã hóa protein không bị sai sót và thay đổi so với trình tự gốc, giúp tăng cường tính chịu hạn cho cây ngô chuyển gen. Mẫu Mồi giải trình tự Kích thước (bp) Mức độ so sánh Giá trị e Số vị trí trống Độ tương đồng (%) K3 ZmDREB2A-F 942 bp 909/913 0.0 3 99,562 ZmDREB2A-R 944 bp 914/918 0.0 3 99,564 K7 ZmDREB2A-F 949 bp 912/917 0.0 2 99,455 ZmDREB2A-R 950 bp 904/907 0.0 2 99,669 3.4. Kết quả giải trình tự và so sánh trình tự 35S terminator Một phần kết quả giải trình tự đoạn 35S terminator được thể hiện hình 6. Kết quả giải trình tự và so sánh đoạn trình tự 35S terminator được tách từ cây ngô chuyển gen nguồn K3 và K7 và đoạn đoạn trình tự 35 Sterminator gốc (256 bp) được thể hiện qua bảng 3. 36 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Kết quả so sánh thể hiện bảng 3 cho thấy sự tương đồng cao giữa trình tự 35S terminator trên cây ngô chuyển gen dòng K3 và K7 ở cả hai chiều ngược và xuôi. Điều này chứng tỏ trình tự 35S terminator đã được chuyển nguyên vẹn vào hệ genome của cây ngô chuyển gen hai nguồn K3 và K7. Bảng 3. Kết quả so sánh đoạn trình tự 35S terminator của dòng ngô K3, K7 và trình tự gốc Hình 7. Kết quả so sánh đoạn 35S terminator nguồn K7 và trình tự gốc Mẫu Mồi giải trình tự Kích thước (bp) Mức độ so sánh Giá trị e Số vị trí trống Độ tương đồng (%) K3 35S-F 227 bp 213/217 0.0 3 98 35S-R 233 bp 221/224 0.0 3 99 K7 35S-F 227 bp 214/215 0.0 1 99 35S-R 231 bp 211/213 0.0 2 99 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã khuếch đại và giải trình tự thành công các đoạn trình tự promoter Ubiquitin, gen đích ZmDREB2A, đoạn trình tự 35S terminator. - Kết quả so sánh các đoạn trình tự đoạn trình tự promoter Ubiquitin, gen đích ZmDREB2A, đoạn trình tự 35S terminator với gen đích cho kết quả độ tương đồng cao. Đặc biệt là mẫu cây ngô chuyển gen thuộc nguồn K7. 4.2. Kiến nghị - Tiến hành đánh giá trên nhiều mẫu hơn để tăng độ tin cậy cho việc so sánh trình tự. - Tiến hành đánh giá biểu hiện gen ZmDREB2A ở các cây ngô chuyển gen nguồn K7. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đoàn Thị Bích Thảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nguyên Thị Thu Hoài, Tạ Thị Thùy Dung, Lê Công Tùng, Bùi Mạnh Cường, Nông Văn Hải, 2016. Biến nạp gen chịu hạn ZmDREB2A vào một số nguồn vật liệu ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 3(64): 7-12. Chinnusamy V., Zhu J., Zhu JK., 2007. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends Plant Sci, 12: 444-451. Doyle JJ., Doyle JL., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13-15. Farooq M., A. Wahid, N. Kobayashi, D. Fujita and S. M. A. Basra, 2009. Plant drought stress: effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development, 29(1): 185-212. Gao J. P., D. Y. Chao and H. X. Lin, 2008.Toward Understanding Molecular Mechanisms of Abiotic Stress Responses in Rice. Rice, 1(1): 36-51. Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K, 2009. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses. Plant Physiol., 149:88-95. Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Tran L.S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, 2007. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant J., 50:54-69. Sambrook, J.F. and Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.