Foxg1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh ở nơron – một cơ chế tiềm năng trong sinh lý bệnh của hội chứng west

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 24 FOXG1 THÚC ĐẨY SỰ HÌNH THÀNH CÁC GAI THẦN KINH Ở NƠRON – MỘT CƠ CHẾ TIỀM NĂNG TRONG SINH LÝ BỆNH CỦA HỘI CHỨNG WEST Mai Phương Thảo*, Đỗ Đức Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào. Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, nuôi cấy các tế bào thần kinh não chuột. Kết quả: Biểu hiện vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các sợi đuôi gai của tế bào thần kinh. Kết luận: Nghiên cứu này góp phần củng cố mối liên quan giữa hội chứng West và protein FoxG1 đồng thời cũng phần nào làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của hội chứng West vốn chưa được hiểu biết tường tận. Từ Khóa: Protein FoxG1, biểu hiện vượt mức, tế bào thần kinh (neuron), sợi thần kinh (neurite), sợi trục (axon), đuôi gai (dendrite), gai thần kinh (dendritic spine), hội chứng West. ABSTRACT FOXG1 PROMOTES THE FORMATION OF DENDRITIC SPINES – A POTENTIAL MECHANISM FOR WEST SYNDROME PATHOPHYSYOLOGY Mai Phuong Thao, Do Duc Minh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 24 - 28 Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the formation of dendritic spines in vitro. Materials – Methods: Case series report using mouse neuronal culture. Results: Overexpression of FoxG1 promotesthe formation of dendritic spine. Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathophysiology which remains unclear. Key words: FoxG1 (forkhead box protein G1), overexpression, neuron, neurite, axon, dendrite, dendritic spine, West syndrome. ĐẶT VẤN ĐỀ Các gai thần kinh (dendritic spine) là phần màng tế bào lồi ra trên sợi đuôi gai thần kinh, là nơi tiếp hợp của các xi náp thần kinh, mà chủ yếu là các xi náp kích thích (excitatory synapses) của vùng vỏ đại não(15). Các gai thần kinh này được hình thành và biến mất nhanh chóng, thông thường, chúng sẽ được tăng cường hình thành tại khu vực có hoạt động điện thế mạnh với vai trò hỗ trợ các tín hiệu điện thế trong quá trình dẫn truyền thần kinh(16). Gần đây, chúng tôi phát hiện được mối liên quan giữa cơ chế bệnh sinh của hội chứng West và protein FoxG1, cụ thể là khi được tăng cường biểu hiện protein FoxG1, các nơron thần kinh có khuynh hướng hình thành nhiều sợi thần kinh (neurite) hơn, đặc biệt là các sợi đuôi gai (dendrite). Forkhead box protein G1 (FoxG1) là protein được mã hóa từ gen FOXG1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 14 (14q12). Đây là protein kiểm soát phiên mã có vai trò quan trọng trong việc hình thành não bộ trong giai đoạn phôi thai (hình thành não bộ, phân vùng não bộ, kiểm soát sự phân bào của các tế bào đầu dòng thần kinh)(10,11) và trong * Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM ** Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh, ĐT: 0932999989, Email: mdt14284@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Thần kinh 25 giai đoạn trưởng thành (duy trì sự tân tạo các neuron nhằm phục vụ cho các chức năng thần kinh cao cấp)(6,14). Hội chứng West (West syndrome), được đặt theo tên của bác sĩ người anh William James West, là mội hội chứng động kinh hiếm gặp ở trẻ em và trẻ nhũ nhi. Tần suất mắc bệnh ở trẻ mới sinh vào khoảng 1/2000 đến 1/4000(8). Biểu hiện lâm sàng của hội chứng West gồm có tam chứng: động kinh, bất thường trên EEG đột ngột, lan tỏa với hình ảnh sóng cao không đồng dạng (hypsarrhythmia) đặc trưng và chậm phát triển trí tuệ. Các biểu hiện lâm sàng này có thể giải thích bằng tình trạng tăng hoạt động điện quá mức ở não bộ(3, 5). Như đã mô tả ở trên, các gai thần kinh sẽ được tăng cường hình thành tại khu vực hoạt động điện thế mạnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm khảo sát sự thay đổi của mật độ gai thần kinh trên các sợi đuôi gai của các tế bào thần kinh khi chúng được tăng cường biểu hiện protein FoxG1. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Động vật thực nghiệm Dòng chuột CD1 wild-type (wt) được dùng trong nghiên cứu này được nuôi dưỡng và phát triển tại cơ sở động vật của viện SISSA, Trieste- Italy. Nuôi cấy tế bào thần kinh Mô não chuột 16.5 ngày tuổi sẽ được cắt nhỏ trong vòng 5-8 phút trong dung dịch lạnh chứa 1X PBS-0,6% glucose-0,1% DNaseI. Các mẫu này sau đó được ủ với dung dịch trypsin nồng độ 1mg/ml trong 5 phút. Dung dịch trypsin được trung hòa bằng FBS 10%, các mẫu mô lớn sẽ lắng xuống đáy ống nghiệm sau 5 phút và được tách bỏ, phần tế bào trong dung dịch phía trên sẽ được thu và đếm số lượng. Cuối cùng các tế bào này sẽ được nuôi cấy trong môi trường dành riêng cho nơron: 1:1 Neurobasal A, 1X Glutamax (Gibco), 1X yếu tố B27 (Invitrogen), 0,5mM glutamine, 25μM β-Mercaptoethanol, 1X Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml fungizone (Gibco) với mật độ ban đầu là 3*105 tế bào/giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng. Môi trường nuôi cấy được thay mới mỗi 3,5 ngày. Lenti virus vector Lenti virus thế hệ thứ 3 được chuẩn bị theo protocol của Follenzi và Naldini bằng cách biến nạp các plasmid khung của virus và các plasmid mang bộ gen cần biểu hiện vào tế bào HEK293T(7). Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu các virion và hòa tan virion trong PBS. Nồng độ virion được định lượng bằng RT-PCR(13). Miễn dịch huỳnh quang Tế bào nuôi cấy được cố định bằng dung dịch paraformaldehyt 4% trong 20 phút. Sau đó, các tế bào được ủ với dung dịch blocking (1X PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA và 0.1% Triton X100) trong 1 giờ, kháng thể 1 được ủ qua đêm ở nhiệt độ 4oC, và kháng thể 2 được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, các tế bào được nhuộm với dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Phân tích và xử lý hình ảnh Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi Confocal Leica vật kính 63X và sau đó được xử lý bằng phần mềm GIMP 2.6 và Image J để phân tích. Các gai thần kinh sẽ được đếm số lượng và chia cho diện tích bề mặt của sợi đuôi gai để thu được thông số mật độ gai thần kinh trên một điện tích sợi đuôi gai. Phân tích thống kê Các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả được kiểm định bằng t- test và được cho là có ý nghĩa thống kê khi trị số p < 0,05. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FoxG1 thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh trên các nơron Để đánh giá tác động của FoxG1 trên sự hình thành các gai thần kinh, chúng tôi phân lập các tế bào thần kinh từ phôi chuột 16,5 ngày tuổi và sau đó gây nhiễm các tế bào này với Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 26 phức hợp các vector lenti virus như hình 1. Mỗi vector virus sẽ được dùng để gây nhiễm với hệ số là 8 (MOI=8, trong đó MOI: Multiplicity of infection), nghĩa là dùng 8 virion để gây nhiễm 1 tế bào. Để có thể kích hoạt và bất hoạt gen FoxG1 vào bất kì thời điểm nào trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sử dụng kĩ thuật TetON(2). Trong kĩ thuật này, FoxG1 sẽ không được biểu hiện trực tiếp dưới sự tác động của promoter ptα1 mà sẽ được kích hoạt gián tiếp qua promoter TRE (tetracycline respone element), promoter TRE lại chịu sự kiểm soát của phức hợp ptα1-rtTA. Trong môi trường nuôi cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất của nhóm tetracycline) thì rtTA sẽ kích hoạt TRE và từ đó phiên mã gen FoxG1 và ngược lại trong môi trường không có Doxycycline, quá trình này sẽ bị bất hoạt. Các tế bào được chia làm 2 nhóm, nhóm được gây nhiễm với vector giúp tăng biểu hiện protein FoxG1 (phức hợp a-b1) và nhóm chứng được gây nhiễm với vector biểu hiện protein PLAP (phức hợp a-b2); một protein không có hoạt tính sinh học trên tế bào thần kinh. Hình 1: Các vector lenti virus dùng trong nghiên cứu Sau khi được gây nhiễm, các tế bào này sẽ được nuôi cấy và biệt hóa trong vòng 5 ngày mà không có doxycyclin (các gen tăng biểu hiện protein FoxG1 và PLAP chưa được kích hoạt). Sau 5 ngày, 2μg/ml Doxycyclin được thêm vào môi trường nuôi cấy nhằm kích hoạt sản xuất protein FoxG1 và PLAP ở các tế bào. Đến ngày thứ 10 (5 ngày sau khi thêm Doxycyclin), các tế bào ở 2 nhóm FoxG1 và PLAP lại được chia làm 2 nhóm với 1 nhóm chứng và một nhóm được kích thích gây khử cực bằng cách thêm vào môi trường nuôi cấy 50mM KCl trong vòng 12 giờ (hình 2). Mục đích của việc khử cực này nhằm đánh giá khả năng hình thành các gai thần kinh ở các nơron khi các tế bào này tăng cường hoạt động điện(9). Hình 2: Tóm tắt quy trình thực hiện nghiên cứu Cuối cùng các tế bào này sẽ được nhuộm miễn dịch huỳnh quang với Map2 (nhằm đánh giá cấu trúc của các sợi đuôi gai) và PSD95 (đánh giá các gai thần kinh) (hình 3). Hình 3: Kết quả miễn dịch huỳnh quang các sợi đuôi gai (MAP2) và các gai thần kinh (PSD95) Vì hình ảnh thu được từ kính hiển vi confocal là các hình ảnh 2 chiều, đồng thời do cấu trúc của các sợi đuôi gai khác nhau, nên chúng tôi lựa chọn phân tích mật độ của các gai thần kinh trên một đơn vị diện tích đuôi gai. Từ các hình ảnh thu được sau khi chụp với kính hiển vi confocal, chúng tôi đếm số lượng các gai thần kinh trên từng sợi đuôi gai, diện tích của các sợi đuôi gai sẽ được tính bằng phần mềm ImageJ. Như đã được mô tả trước đó, khi ta khử cực các nơron bằng dung dịch kali clorua, mật độ các gai thần kinh tăng lên 1,66 lần. Điều đặc biệt là đối với các tế bào được tăng cường biểu hiện FoxG1 đơn thuần, mật độ gai thần kinh tăng lên 2,63 lần so với các tế bào chứng, và khi kết hợp kali clorua và tăng biểu hiện protein FoxG1, mật độ gai thần kinh tăng lên đến 3,34 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Thần kinh 27 lần (mật độ gai thần kinh của nhóm chứng trung bình là 0,17±0,03/μm2) (hình 4). Hình 4: Biểu đồ so sánh mật độ gai thần kinh trên một diện tích đuôi gai ở các thí nghiệm (so với nhóm chứng không khử cực bằng kali clorua và không tăng cường biểu hiện FoxG1) BÀN LUẬN Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi có thể kết luận rằng việc tăng cường biểu hiện FoxG1 trên tế bào thần kinh sẽ thúc đẩy sự hình thành các gai thần kinh nhiều hơn so với các tế bào thần kinh thông thường. Kết quả này như là một bằng chứng gián tiếp cho thấy sự tăng cường hoạt động điện của các nơ ron thần kinh được tăng biểu hiện protein FoxG1 và từ đó cho thấy mối liên quan giữa tình trạng lặp đoạn trên nhiễm sắc thể số 14 mang gene FOXG1 và hội chứng West. Cơ chế phân tử của việc thúc đẩy hình thành các gai thần kinh bởi FoxG1 được kiến nghị như hình 5, trong đó FoxG1 ức chế các protein pSmad (pSmad2,3), các protein pSmad này cần thiết cho sự hình thành protein Mdm2 để 1 lần nữa ức chế PSD95 là một protein rất quan trọng trong việc hình thành và duy trì sự ổn định của các gai thần kinh(1,4, 12). Bước tiếp theo chúng tôi sẽ đào sâu con đường tín hiệu này nhằm hiểu biết rõ hơn về vai trò phân tử của FoxG1 trong hôi chứng West. Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích hiện tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành các gai thần kinh KẾT LUẬN Các nơron thần kinh biểu hiện vượt mức protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh hơn như là một bằng chứng gián tiếp cho thấy sự tăng cường hoạt động điện thế ở các nơron này. Từ đó cho thấy protein FoxG1 là một nguyên nhân tiềm năng trong sinh lý bệnh của hội chứng West. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Araki S, Eitel JA, Batuello CN, Bijangi-Vishehsaraei K, Xie XJ, Danielpour D, Pollok KE, Boothman DA, Mayo LD (2010). TGF-beta1-induced expression of human Mdm2 correlates with late-stage metastatic breast cancer. J Clin Invest, 120(1):290–302 2. Brancaccio M, Pivetta C, Granzotto M, Filippis C, Mallamaci A (2010). Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells Dayt Ohio, 28(7):1206–1218 3. Chugani HT, Shields WD, Shewmon DA, Olson DM, Phelps ME, Peacock WJ (1990). Infantile spasms: I. PET identifies focal cortical dysgenesis in cryptogenic cases for surgical treatment. Ann Neurol, 27(4):406–413 4. Colledge M, Snyder EM, Crozier RA, Soderling JA, Jin Y, Langeberg LK, Lu H, Bear MF, Scott JD (2003). Ubiquitination regulates PSD-95 degradation and AMPA receptor surface expression. Neuron, 40(3):595–607 5. Desguerre I, Pinton F, Nabbout R, Moutard ML, N’Guyen S, Marsac C, Ponsot G, Dulac O (2003). Infantile spasms with basal ganglia MRI hypersignal may reveal mitochondrial disorder due to T8993G MT DNA mutation. Neuropediatrics, 34(5):265–269 6. Fasano CA, Phoenix TN, Kokovay E, Lowry N, Elkabetz Y, Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009). Bmi-1 cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell self- renewal in the forebrain. Genes Dev, 23(5):561–574 7. Follenzi A, Naldini L (2002). HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med, 69:259–274 8. Hrachovy RA, Frost JD (1989). Infantile spasms. Pediatr Clin North Am, 36(2):311–329 9. Kim TK, Hemberg M, Gray JM, et al (2010). Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature, 465(7295):182–187 10. Martynoga B, Morrison H, Price DJ, Mason JO (2005). Foxg1 is required for specification of ventral telencephalon and region- specific regulation of dorsal telencephalic precursor proliferation and apoptosis. Dev Biol, 283(1):113–127 11. Muzio L, Mallamaci A (2005). Foxg1 confines Cajal-Retzius neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the dorsomedial pallium. J Neurosci Off J Soc Neurosci, 25(17):4435–4441 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Chuyên Đề Nội Khoa II 28 12. Rodriguez C, Huang LJ, Son JK, McKee A, Xiao Z, Lodish HF (2001). Functional cloning of the proto-oncogene brain factor-1 (BF-1) as a Smad-binding antagonist of transforming growth factor-beta signaling. J Biol Chem, 276(32):30224–30230 13. Sastry L, Johnson T, Hobson MJ, Smucker B, Cornetta K (2002). Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther, 9(17):1155–1162 14. Shen L, Nam HS, Song P, Moore H, Anderson SA (2006). FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in the postnatal hippocampus and contextual memory deficits. Hippocampus, 16(10):875–890 15. Spruston N (2008). Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci, 9(3):206–221 16. Yuste R (2013). Electrical compartmentalization in dendritic spines. Annu Rev Neurosci, 36:429–449 Ngày nhận bài báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016