Đề tài Nhân giống lan hồ điệp phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (tis – temporary immersion system) - Ưng Thị Mỹ Tiên

Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) nói chung với các loại Lan khác nói riêng được xem là cây trồng đem lại nhiều hiệu quả kinh tế cao; do đó đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồng Lan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 - 3 lần so với cây trồng khác. Lan Hồ Điệp là một trong những loài Lan quý đang rất được ưa chuộng và đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như cây cảnh trên thế giới. Chúng không chỉ đẹp về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một vẻ đẹp sang trọng và trang nhã. Tuy nhiên, số lượng sản xuất cây Lan hiện nay vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Nguyên nhân do Lan Hồ Điệp là loài sinh trưởng chậm và là một loài Lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn. Hiện tại có một số trường Đại Học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kỹ thuật mới như: Bioreactor, Nuôi cấy quang tự dưỡng… nhưng vẫn chưa được áp dụng rộng rãi. Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đối với cây Lan Hồ Điệp nhằm tạo cây giống sạch bệnh rất được quan tâm. Tuy nhiên phương pháp này thực hiện khó thành công vì đỉnh sinh trưởng quá nhỏ nên không thể tái sinh hoặc chết đi qua các lần khử trùng. Lan Hồ Điệp là loại Lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí quá trình nuôi cấy. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 2 cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa Lan Hồ Điệp có chứa các mắt ngủ có thể tạo thành chồi. Do đó, phương pháp nuôi cấy phát hoa in vitro để tạo chồi được xem là đặc trưng ở Lan Hồ Điệp nhưng hệ số nhân giống từ phương pháp này cũng rất thấp. Gần đây, các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được nhiều nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây trồng. Hệ thống này có tác dụng làm tăng cường sức sống của chồi và tăng khả năng tạo phôi soma, phôi được tạo ra không bị biến dị; loại bỏ được hiện tượng thủy tinh thể khi nuôi cấy lỏng. Thực vật được nhân giống trong hệ thống ngập chìm có khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa ngoài vườn ươm so với các thực vật được nuôi cấy trong hệ thống bán rắn hay lỏng. Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa kiểng đặc biệt là Lan Hồ Điệp ở Việt Nam chỉ mới được ứng dụng trong thời gian gần đây. Với mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Lan Hồ Điệp khi so sánh với các hệ thống nuôi cấy thông thường Th.S. Cung Hoàng Phi Phượng và các cộng sự đã ứng dụng thành công hệ thống góp phần mở ra khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường tại Việt Nam. Để từng bước áp dụng công nghệ mới trong sản xuất cây Lan giống ở nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo qui mô công nghiệp, góp phần khắc phục sự thiếu hụt cây giống trên thị trường. Qua đề tài "NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP PHALAENOPSIS SP. BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS – Temporary Immersion System)" với mong muốn có thể tìm hiểu rõ về kỹ thuật nuôi cấy này cũng như những ưu Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 3 điểm nhân giống Lan Hồ Điệp bằng nuôi cấy ngập chìm so với những phương pháp nuôi cấy khác.  2. Mục đích nghiên cứu Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá, đồng thời tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ của các chồi Lan Hồ Điệp nhằm thiết lập nhân nhanh giống cây Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System). 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu nồng độ các khoáng đa lượng trong môi trường MS và ảnh hưởng của nồng độ và loại đường lên sự nhân nhanh PLB của Lan Hồ Điệp. Qua đó khảo sát việc nhân nhanh PLB bằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Plantima của Đài Loan trên đối tượng Phalaenopsis Dtps. Taida Salu. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS thuộc dạng bioreator đơn giản. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định việc áp dụng công nghệ TIS trong vi nhân giống cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, chất lượng cây giống tốt, nâng cao hệ số nhân chồi gấp 3 - 20 lần so với phương pháp nhân truyền thống, rút ngắn được thời gian nuôi cấy trong phòng, góp phần làm giảm giá thành sản phẩm cây giống. Ý nghĩa thực tiễn: Áp dụng hệ thống TIS trong vi nhân giống hoa Lan ở nước ta là một công nghệ mới, nó sẽ mở ra triển vọng cho việc sản xuất cây giống theo qui mô công nghiệp, đáp ứng đủ lượng cây trồng với chất lượng cao cho sản xuất trong nước và cho xuất khẩu. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 4 Cây Lan giống sản xuất bằng hệ thống TIS trong nước giúp người nông dân chủ động sản xuất, hạn chế nhập cây giống từ nước ngoài, góp phần ngăn chặn được dịch bệnh lây lan từ nước ngoài qua con đường cây giống. 5. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy PLB trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, nghiên cứu trên 5 giống Lan Hồ Điệp chủ yếu là giống 1 (Dtps. Taida Salu) và giống 2 (Dtps. Taida Firebird). Thí nghiệm bố trí kiểu đầy đủ và ngẫu nhiên hoàn toàn. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức, Schleiden và Schwanm đưa ra thuyết tế bào và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật có phức tạp tới đâu thì đều có cấu tạo đơn vị rất nhỏ là tế bào. Năm 1902, Haberlandt thực hiện nuôi cấy tế bào thực vật đầu tiên từ lá của một số cây một lá mầm như: Errythronium, Orrnithogalum… Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhưng trên đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo, trên môi trường lỏng có muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn. Năm 1934, White và Gautheret đã nuôi cấy thành công rễ cà chua trên môi trường muối khoáng và dịch chiết nấm men. Cùng thời điểm Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trưởng của mô sẹo cà rốt. Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Năm 1955, các chất kích thích sự phân bào được Skoog đặt tên là kinetin và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin. Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô vào cây Lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm. Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính Lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, Lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 6 Đến nay, hầu hết các giống Lan đã được nhân giống nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Dendrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Ngọc Điểm... và ngay cả Lan Hài nổi tiếng của Việt Nam. 1.1.2. Các bước nhân giống in vitro Nhân giống vô tính các cây trồng in vitro gồm các giai đoạn sau: - Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy. - Tạo thể nhân giống in vitro. - Nhân giống in vitro. - Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh. - Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm. 1.1.3. Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá được hình thành. Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng chồi cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. 1.1.3.2. Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Nhưng khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển. Còn phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới tác dụng của cytokinin nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. 1.1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi ngọn được rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypochlorite Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 7 calcium. Sau đó dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh. Với phương pháp này, chúng ta tạo được cây sạch bệnh, sạch virus. 1.1.3.4. Nuôi cấy mô sẹo Tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hoá chất, tia phóng xạ,...). Các tế bào của mô sẹo phải chịu sự phản phân hoá trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Mô sẹo tăng trưởng nhanh trên môi trường có chất auxin và trong môi trường không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn. 1.1.3.5. Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào được tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc liên tục. Trong môi trường lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ các chất dinh dưỡng. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường đặc để tái sinh thành cây. 1.1.3.6. Nuôi cấy thể đơn bội Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những phần sau cho việc nuôi cấy in vitro: - Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa. Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn. - Hạt phấn: Được nuôi cấy trên môi trường để tạo mô sẹo. - Cụm hoa: Thường nuôi cấy trong môi trường lỏng. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 8 1.1.3.7. Nuôi cấy protoplast (tế bào trần) Tế bào thực vật được xử lý bằng hoá lý để tách lớp vỏ cenlulose, nhưng vẫn còn giữ chức năng của tế bào. Trong môi trường thích hợp, protoplast có thể phân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau. 1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro 1.1.4.1. Ưu điểm Thuận lợi của phương pháp vi nhân giống trên môi trường bán rắn so với phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép...) là: - Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền. - Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. - Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. - Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… - Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. - Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn. - Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 9 Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. 1.1.4.2. Nhược điểm Dễ xuất hiện các biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt tái sinh qua mô sẹo. Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Nhân giống trên môi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao (do sử dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài. Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp, chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn rất lớn. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế cụ thể như đối với các loài ngũ cốc và sự tái hình thành cây in vitro thường khó xảy ra, đặc biệt với các cây thân gỗ. 1.2. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa Lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Tỷ lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỉ USD. Trong năm 2000, kim ngạch xuất nhập khẩu của Lan cắt cành và cây Lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó Lan cắt cành đạt 128 triệu USD. Thị trường tiêu thụ hoa Lan ở Châu Âu rất hấp dẫn. Năm 2006, khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa Lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa Lan là 73 EUR. Trong đó, Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu âu có công nghiệp trồng Lan xuất khẩu, do trồng nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa Lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 10 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa Lan chiếm 95% (52.049 ngàn sản phẩm) trên tổng sản lượng hoa Lan trong khối EU (Nguồn: AIPH/Union Fluer: International Statistics Flowers an Plants 2007). Mặc dù, khối châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa Lan cao hơn so với các khối khác nhưng do nhu cầu tiêu thụ hoa Lan trong khối EU cao nên trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa Lan từ các nước lên tới 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (Nguồn: AIPH/Union Fluer: International Statistics Flowers an Plants 2007). Hoa Lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang lại nguồn lợi kinh tế cho nhiều quốc gia Châu Á. Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu là hoa Lan nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium sonia và Jumbo White. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Vanda và Oncidium. Hơn 80% Dendrodium trên thị trường thế giới là từ Thái Lan. Chỉ với loại hoa Lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. Trong khi đó, Đài Loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa Lan Hồ Điệp bằng qui trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa Lan Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với Lan Hồ Điệp cắt cành. Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu cành Phalaenopsis. Trong đó, 12 triệu cành hoa Lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu cành đến Nhật Bản; 3 triệu cành đến Trung Quốc; 2,5 triệu cành tới Hoa Kỳ và 3,5 triệu cành cho các quốc gia khác. Vào tháng 6/2004, Hoa Kỳ đã cấp giấy phép xuất khẩu Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kỳ (Nguồn: The world’s fascination with potted orchid- Floraculture Itn.htm). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 11 1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và Lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển với nhiều chủng loại. Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2.500 ha nhưng hoa Lan chỉ chiếm 5- 6%. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa Lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Chỉ riêng TP. HCM diện tích vườn Lan tới nay đã gần 80 ha, hoa Lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều nông hộ. Tuy nhiên hiện nay do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, nên các nhà vườn nhập cây giống từ nước ngoài như: Thái Lan, Đài Loan và Trung Quốc (Nguồn: Báo cáo điều tra thống kê của Sở NN& PTNT TP.HCM, năm 2008). Theo thống kê của Sở NN& PTNT TP.HCM trong năm 2003, doanh số kinh doanh hoa Lan, cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600 - 700 tỉ đồng ngay từ những tháng đầu năm. Theo TS. Dương Hoa Xô - Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM, đến nay đã hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa Lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa Lan cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium, Phalaenopsis, Catteya. Năm 2007, Trung tâm đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000 cây hoa Lan cấy mô các loại. Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa Lan cấy mô, tập trung cho nhóm hoa Lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống lan rừng quý. Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa Lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú được tìm trong rừng sâu. Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi Lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3% về chi và 76,5% về loài Lan rừng của Việt Nam. Không ít loài Lan được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới mang tên Đà Lạt, 10/12 loài Lan quý của Việt Nam Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 12 phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những năm 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa Lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kỹ thuật công nghệ cao vào sản xuất. Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.000 đồng/gốc Lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô in vitro và đặc biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng. TS. Dương Tấn Nhựt cùng các cộng sự ở Phân Viện Sinh Học Đà Lạt đã nhân giống thành công Hồng Hài - loài Lan hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chúng chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống và khó sinh sản. Theo TS. Dương Tấn Nhựt, Thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa Lan trong thiên nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng Lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan... Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa Lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước ASEAN khác. 1.3. Giới thiệu về Lan Hồ Điệp 1.3.1. Nguồn gốc và phân bố Lan Hồ Điệp là giống Lan có tên gọi Phalaenopsis. Tên gọi này bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con bướm” và Opsis Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 13 có nghĩa là “giống như”. Lan Hồ Điệp là loài lan có hoa giống bươm bướm phất phơ rất đẹp. Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album. Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum amabile; và năm 1825 Blume một nhà thực vật Hà Lan định danh một lần nữa là Phalaenopsis amabilis và tên đó được dùng cho đến ngày nay. Lan Hồ Điệp có chừng 44 loại nguyên giống, mọc trên dãy Himalaya đến suốt châu Á và sang cả Úc châu. Lan Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malaysia, Indonesia, Philipin, phía Đông Ấn Độ và miền Bắc Australia. Lan Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa chịu được khí hậu nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát. Ở Việt Nam có khoảng 4 - 5 loài Lan Hồ Điệp rừng như: - Lan Hồ Điệp dẹt (Phalaenopsis coenu): cây sống phụ, rễ lớn, không có thân, lá hình bầu dục thuôn dài. Phát hoa dài 30 cm, hoa màu vàng xanh, có từ 6 - 12 hoa, hoa nở rất lâu tàn và có hương thơm. Cây mọc ở miền Trung, có dáng đẹp, có thể trồng ở Đà Lạt; hoa nở vào mùa thu. - Lan Hồ Điệp trung (Phalaenopsis parishii): cây nhỏ, lá hình trái xoan, màu xanh bong, rụng vào mùa khô. Phát hoa mọc thẳng đứng, mang 3- 9 hoa ở đỉnh màu vàng nhạt môi hồng tươi, giữa có 2 vạch nâu. Cây mọc đẹp, hoa đứng, màu sắc sặc sỡ nên được trồng làm cảnh, trang trí cho phòng họp; hoa nở vào mùa xuân. - Lan Hồ Điệp ấn (Phalaenopsis mannii): cây mảnh, có lá dạng bầu thuôn, hơi cong, màu xanh bóng. Phát hoa dài thường buông thòng xuống, hoa tập trung ở đỉnh cánh màu vàng nghệ với vân màu đỏ. Cây mọc ở Trung Bộ, Đà Lạt - Lâm Đồng; hoa nở vào mùa hè. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 14 Hình 1.1. Lan Hồ Điệp ấn - Lan tiểu Hồ Điệp hay Hồ Điệp nhài (Phalaenopsis pulcherrima). Cây nhỏ sống trên đất cát trong các rừng, chồi và rễ mập khỏe, lá hình trái xoan. Phát hoa nở dài mang hoa ở đỉnh. Hoa màu trắng, hồng tím…Hoa nhỏ, cánh bầu dục , lưỡi có màu đậm hơn, họng màu tím. Cây mọc ở miền Trung, Đồng Nai, Bình Châu… Cây ra hoa vào mùa mưa. Hình 1.2. Lan tiểu Hồ Điệp Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 15 Ngoài ra còn một số cây như: Phalaenopsis gibbosa, Phalaenopsis lobbii, Phalaenopsis fuscata, Phalaenopsis cornu x cervi, Phalaenopsis petelotii… Những cây này thường có hương thơm. Hình 1.3. Phalaenopsis cornu x cervi 1.3.2. Phân loại khoa học Giới Plantae (Thực vật) Ngành Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp Liliopsida (Hành) Phân lớp Liliidae (Hành) Bộ Orchidales (Lan) Họ Orchidaceae (Lan) Chi Phalaenopsis (Lan Hồ Điệp) Loài Phalaenopsis sp. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 16 1.3.3. Đặc điểm hình thái Lan Hồ Điệp là loại Lan đơn thân, ngắn, mập, lá to, dày mọc sát nhau. Đây là giống gồm các loài có hoa lớn và đẹp. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, cánh hoa phẳng, môi hoa cong, dẹp, có 2 râu dài; trụ hoa hình bán nguyệt với 2 phân khối u lên chứa đầy phấn hoa. Lan Hồ Điệp là Lan có màu sắc hoa phong phú từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím và có loài có sự phối màu tự nhiên như có đốm hay sọc... Thời kỳ nở hoa thay đổi theo từng loài, hoa lâu tàn khoảng 2 - 4 tuần. Lan Hồ Điệp là một loại Lan đại chúng được xếp vào bậc nhất với hoa to, hình dáng đẹp đẽ, nhiều màu, có hoa quanh năm. Nếu trồng đúng cách Lan Hồ Điệp có thể sống rất lâu; có cây sống được trên 18 năm, sau đó ra hoa ở ngọn rồi mới chết. Lan Hồ Điệp rất đa dạng về di truyền nhưng chúng cũng có những đặc tính chung về cấu tạo của cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 17 Hình 1.4. Sự đa dạng và phong phú về màu sắc, hình dáng Lan Hồ Điệp Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 18 1.3.3.1. Cơ quan sinh dưỡng + Thân: Cây đơn thân không có giả hành, được tạo ra bởi một đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục. Các đốt thân rất ngắn và thường được bao bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân. + Lá: Lá đơn nguyên, dày, không cuốn và có bẹ, mọng nước, có bẹ ôm lấy thân. Hình dạng lá đơn giản với màu xanh đơn thuần hoặc tạp sắc. Thông thường một cây có từ 4 - 5 lá, mỗi lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho ra một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn. + Rễ: Rễ bất định, khí sinh phát triển mạnh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá. Xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc. Lớp mô xốp này dễ dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp tạo thành một vành đai tăng diện tích tiếp xúc với ánh sáng. 1.3.3.2. Cơ quan sinh sản + Hoa: Hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị và nhụy dính liền thành cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới. Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn, đính bên (Hoàng Thị Sản, 2003). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 19 Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa), có dạng thẳng đôi khi phân nhánh. Trung bình một phát hoa cho 7 - 15 hoa, mỗi hoa bền khoảng hai tháng. + Quả:  Quả của Lan Hồ Điệp thuộc dạng quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên đường của giá noãn. Quả Lan chứa vô số các hạt nhỏ li ti, tùy vào giống và loài mà quả có thể chứa vào trăm đến vài ngàn hạt. Hạt cần trải qua 130 - 150 ngày để trưởng thành, hạt mở sau 90 ngày. Hạt nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa. Theo Bernard (1999), hạt Lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào. Trong thực nghiệm, người ta có thể đánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose (Bùi Trang Việt, 2002). + Keiki: Keiki chỉ một cây con mọc từ một mấu trên cuống hoa. Một số loài có hoa nhỏ như Phalaenopsis lueddemaniana thường tạo keiki trên cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả lần đầu tiên vào năm 1894 (Williams và Williams, 1894). Keiki còn có thể được hình thành ở nhiều loài Phalaenopsis và một số loại thuộc các chi lai. Chẳng hạn trong The Genus Phalaenopsis (Sweet,1980) có trình bày rõ khả năng phát triển cây con từ đốt phát hoa Phalaenopsis kunstleri ở Kew Gardens. Keiki còn có thể hình thành từ rễ ở các loài Philippin Phalaenopsis stuartiana (Williams và Williams, 1894) và Phalaenopsis schilleriana (Davis và Steiner, 1952). Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 20 Hình 1.5. Keiki của Lan Hồ Điệp 1.3.4. Điều kiện sinh thái của Lan Hồ Điệp 1.3.4.1. Nhiệt độ Lan Hồ Điệp là loại Lan có thể phát triển ở nhiệt độ tối thiểu 22oC - 25oC ban ngày và 18oC vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để cây phát triển tốt là 25oC - 27oC. Lan Hồ Điệp không chịu được điều kiện quá nóng hay quá lạnh, lại không cần nhiều ánh sánh cho nên thích hợp trồng trong nhà hay trong nhà kính. Khi cây đang ra nụ, nhiệt độ hay độ ẩm thay đổi bất thường sẽ làm cho nụ hoa hép rụng. 1.3.4.2. Độ ẩm       Lan Hồ Điệp chịu ẩm cao, cần ẩm độ 50 - 80 % nhưng không chịu nhiều nước. Giàn che lan cần phải thích hợp che được 70% nắng. Lan Hồ Điệp cần nhiều ẩm hơn nước tưới. 1.3.4.3. Ánh sáng Lan Hồ Điệp cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát, biên độ khá rộng 5000 - 15000m/m2, ánh sáng chỉ cần 20% - 30% là đủ. Tuy nhiên Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 21 không trồng Lan Hồ Điệp ở nơi quá râm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuếch tán vừa phải rất tốt; nếu chiếu sáng được 12h - 16h mỗi ngày, 12h cho cây lớn và 16h cho cây nhỏ thì cây sẽ phát triển tốt hơn. Trồng Hồ Điệp trong nhà kính cần có hệ thống làm mát, ánh sáng nhân tạo thích hợp để Lan phát triển tốt; còn trồng trong nhà thì cần để Lan ở gần cửa sổ có ánh nắng hoặc không cũng được. 1.3.4.4. Độ thông thoáng So với các loài Lan khác, sự thông thoáng rất cần thiết cho Lan Hồ Điệp. Lan Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phỏng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Lan Hồ Điệp tăng trưởng mạnh, nhưng những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt cây; do đó để ngăn ngừa tình trạng trên Lan cần phải được che chắn cẩn thận. Cần cung cấp đủ nước cho cây tránh sự héo rũ, nhăn lá vào mùa gió nhiều và mùa nắng. 1.3.4.5. Nhu cầu nước tưới Lan Hồ điệp là cây đơn thân nên không có giả hành để dự trữ dinh dưỡng và nước, hơn nữa nước thường tập trung ở lá vì Lan Hồ Điệp có lá lớn, diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho cây một lượng nước đầy đủ. Tránh để Lan quá khô vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: sáng, trưa, chiều. Chú ý khi tưới nước vào buổi trưa phải tưới thật đẫm để tránh nắng sẽ làm sốc cây Lan. Mùa mưa thì tuỳ theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp, có thể khoảng 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá cây sẽ khô, tránh nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 22 1.3.4.6. Dinh dưỡng Lan Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ. Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao và đừng tưới lên ngọn cây, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Tùy từng độ tuổi của cây mà ta có lượng phân cần bón với tỷ lệ NPK thích hợp. Ngoài việc dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ loãng có pha thêm thuốc trừ nấm. Lan Hồ Điệp cần bón phân với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu, vitamin B1 kích thích ra rễ... Các chất dinh dưỡng cần thiết nhất là Đạm (N), Lân (P), Kali (K) và Canxi (Ca). Sự thiếu các chất dinh dưỡng này có thể làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển và làm giảm năng suất hoa. 1.3.4.7. Một số sâu bệnh và cách phòng trị + Bệnh nhiệt thán: (bệnh đốm nâu) Là một trong những bệnh hại do nhiễm nấm đĩa gai gây ra, chủ yếu gây hại trên lá. Thời kì đầu phát bệnh thường có những chấm nhỏ màu xám nhạt hoặc nâu sẫm, dần dần lan rộng thành đốm bầu dục hoặc tròn có vùng màu vàng bao quanh đốm đen. Có thể dùng zineb 0,2% lưu huỳnh - vôi 0,3%, hay benlat 0,1% để trị bệnh. + Bệnh mảng trắng: Do hạt khuẩn nhỏ gây ra chủ yếu là gây hại trên mầm mới của cây Lan, sau khi bị nhiễm bệnh chồi của mầm non sẽ bị phân hủy thấm ra chất dịch màu vàng và mục rữa khiến cây lan bị rụng chết. Nên thay chậu kịp thời, cắt bỏ rễ cây hư và dùng dung dịch CuSO4 hoặc RD20 rửa sạch cây lẫn chậu lan, sau khi hong khô thì đem đi trồng lại Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 23 với vật liệu mới. Có thể dùng dung dịch benlat hoặc các loại thuốc chứa benomyl xịt vào cây Lan, góc lá và rễ. + Bệnh khô lá: Lá xuất hiện những chấm nhỏ màu nâu đỏ, sau đó nhanh chóng lan ra thành đốm bệnh hình tròn, đốm bệnh phát sinh ở mép lá có hình bán nguyệt, làm cho lá Lan bị khô với diện tích lớn có thể nhanh chóng gây chết cây. Cắt bỏ lá bệnh và dọn sạch các lá rụng, có thể phun thuốc zineb 0,2% truban, banor hoặc benlat 0,1% để phun xịt. + Bệnh đốm tròn: Đốm bệnh hình tròn màu đen, ở cả hai mặt lá lõm xuống, khi bệnh nặng toàn bộ lá trải đều những đốm đen khô và chết, bệnh sinh sản nhanh. Có thể dùng Truban, Banort, Zineb 0,2 % hoặc Benlat 1,2 % phun xịt. + Bệnh mốc: Do khuẩn mốc xâm nhập vào lá gây ra. Bệnh thường phát sinh ở mặt lưng của lá, với những đốm màu vàng cam hay dạng mốc sết trên lá. Bệnh thường phát sinh vào mùa hè nóng bức và khi trồng Lan không thông gió. Cắt bỏ những lá bị bệnh nặng, tưới nước kịp thời và hong khô lá. Trị bằng Benlat 0,1% hoặc bất cứ loại thuốc nào có chứa Benomyl. + Nhện đỏ: Sống tập trung ở dưới lá bánh tẻ và lá già, hút nhựa làm lá vàng, cháy khô xơ xác. Dùng Cascade 5EC, Comite 73EC, phun kỹ mặt dưới lá khi nhện mới xuất hiện và kết hợp các biện pháp phòng trị bọ trĩ và rệp. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 24 Hình 1.6. Nhện đỏ hại Lan 1.3.4.8. Chậu, giá thể và cách trồng Cách trồng tốt nhất cho các loại Lan Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch không có rêu bám trên thành chậu. Thông thường các nhà vườn trồng Lan với số lượng lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớn, xơ dừa, mút... làm giá thể để trồng Lan Hồ Điệp. Có rất nhiều cách trồng Lan Hồ Điệp tùy theo từng vùng; nhưng có điểm chung là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu. Cách trồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt. Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá nhanh có thể thay chậu sớm hơn. 1.3.5. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp 1.3.5.1. Giá trị kinh tế của Lan Hồ Điệp Lan Hồ Điệp không chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, Lan Hồ Điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành công nghiệp trồng hoa ở Hà Lan. Chúng còn là những món quà xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản. Ngoài ra các loài hoa đẹp, xa xỉ cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng quà tặng cao cấp. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 25 Ngày nay, hoa Lan cắm chậu đã trở nên khá phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới. Người ta có thể thấy Lan Hồ Điệp ở mọi nơi, trên truyền hình, trong nhà, trong vườn, tạp chí thậm chí nơi bạn làm việc. Chứng tỏ, càng ngày con người càng nhận thức được tầm quan trọng của những chậu hoa trong cuộc sống thường nhật của mình. Lan Hồ Điệp, là một loài Lan có độ bền hoa cao trong điều kiện thích hợp, cũng là một loài cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Hơn nữa, trong vài thập kỉ gần đây nền công nghệ trồng Lan phát triển giúp người trồng đã giảm giá thành đáng kể đối với loại Lan này nên giá cả phù hợp với những người mê hoa hay người mới tập trồng. Lan Hồ Điệp rất được ưa chuộng và được trồng ở nhiều nơi. Trước đây, Lan Hồ Điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hoá cao cấp trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, công nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các ngày lễ. Thêm vào đó, công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu hoa, kích thước hoa… Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi Lan và tạo nên những cơn sốt hoa Lan trên thị trường thế giới. Lan Hồ Điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con lại được xuất khầu cho các nước khác với cả Mỹ để trồng ra hoa. Hàng ngàn các giống được lai và tạo dòng rất có giá trị trên thị trường. Các nhà nhân giống đã gieo hạt được rất nhiều giống Lan Hồ Điệp có chất lượng hoa và cây giống rất có giá trị như các tính trạng qui định màu sắc hoa, và cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, và gần đây là các giống có hương thơm. Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 26 đến một hệ quả là các giống có giá trị hiện nay có thể không còn giá trị chỉ trong vài năm nữa. Màu sắc hoa tập trung ở các màu chủ đạo như: trắng, vàng, xanh, màu mơ chín, hồng, đỏ tươi hay nâu sẫm. Hoa có thể chỉ có một màu hay sự pha trộn giữa các màu này với nhau, chủ yếu là khác nhau ở vùng giữa, hay mép cánh hoa với nhiều cấu trúc khác nhau như chấm hay sọc trên từng cánh hoa. Loại hoa mới được lai tạo gần đây nhất là Harlequin, có màu trắng hay vàng với các mép cánh bông được điểm xuyết bởi các chấm tròn ngẫu nhiên có giá rất cao trên thị trường hiện nay. 1.3.5.2. Tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp Lan Hồ Điệp là loài hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao, là sản phẩm được cả thị trường trong nước và thế giới ưa chuộng, là loài Lan nhiệt đới, đơn thân, chu kỳ sinh trưởng ngắn (thời gian từ trồng đến ra hoa khoảng 18 - 20 tháng tùy thuộc điều kiện chăm sóc và vùng trồng), dễ áp dụng sản xuất theo qui mô công nghiệp. Vì vậy từ lâu Lan Hồ Điệp đã được rất nhiều nhà sản xuất hoa trong nước quan tâm. Tuy nhiên việc sản xuất loài hoa này ở nước ta hiện nay vẫn còn rất hạn chế do nhiều nguyên nhân. TP. HCM mấy năm gần đây được xem như là đơn vị đi đầu trong cả nước về sản xuất hoa Lan cắt cành theo qui mô tập trung. Chiến lược phát triển nông nghiệp của Thành phố năm 2010 là sản xuất được 300 ha trồng hoa Lan phục vụ cho nhu cầu nội địa và xuất khẩu. Hoa Lan trồng ở TP. HCM chủ yếu là giống Mokara nhập từ Thái Lan, hiện nay loại hoa này đang bị xuống giá mạnh do sản phẩm của chúng trên thị trường hoa trong nước gần đạt tới mức bão hòa. Vì vậy nhiều nhà vườn, trang trại đang chuyển dần sang trồng hoa Lan chậu có giá trị kinh tế cao hơn như Phalaenopsis, Onadium, Catleya... đáp ứng cho thị trường. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 27 Tuy nhiên, các cơ sở sản xuất cây giống hoa Lan trong nước hiện nay còn rất hạn chế, không đủ cây giống cung cấp cho sản xuất. Vì vậy các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ một số nước trong khu vực như: Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc... bằng nhiều hình thức khác nhau để sản xuất. Phần lớn các cây giống nhập nội bị nhiễm bệnh, chất lượng kém, một số đã bị loại thải từ nước ngoài do bị nhiễm bệnh hoặc kiểu dáng lỗi thời. Trong khi các cơ quan kiểm dịch thực vật trong nước chưa có các qui chế cụ thể để kiểm soát mặt hàng cây giống mới này. Điều này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến ngành sản xuất hoa Lan ở TP. HCM nói riêng và cả nước nói chung nếu không có giải pháp kịp thời. Hiện nay tại TP. HCM cây Lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lược trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi. Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao gấp 2- 3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu... Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp thì cây Lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả. Không chỉ đẹp về màu sắc, hình dáng, lâu tàn... giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng và nuôi trồng. Tại TP. HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Lan Hồ Điệp với qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là Công ty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và Công ty Kim Ngân chuyên trồng về Lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài nghìn đến vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán. Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý. Về nguồn cây giống thì nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan... Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 28 Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng Lan phát triển như Đài Loan, Thái Loan... thì ngành trồng Lan ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 1.3.6. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp 1.3.6.1. Phương pháp nhân giống truyền thống + Nhân giống hữu tính bằng hạt: Hiện tượng giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với hầu hết các loài Lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ Lan có số lượng chủng loại rất phong phú. Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn bố mẹ. Trong thiên nhiên sự thụ phấn của Lan do côn trùng thực hiện. Cánh môi của Lan có cấu tạo và hình dạng đặc biệt thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang phấn đi. Thông thường, muốn đạt tỷ lệ thụ phấn thành công cao, con người cần chủ động thụ phấn cho cây. Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã khám phá ra được nguyên nhân làm cho hạt Lan có thể nảy mầm liên quan đến sự có mặt của nấm rễ, nếu không có nấm cộng sinh Rhizoctonia thì hạt Lan không thể nảy mầm. Với vai trò là nguồn cung cấp đường cho hạt Lan, hệ thống rễ sợi của nấm xâm nhập vào trong phôi và cung cấp nguồn carbon cho phôi phát triển. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn tùy giống. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật ở các cây họ Lan là biến dị xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp đem lại sự đa dạng cho các loài Lan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì cây con tạo thành từ hạt không đồng nhất về mặt di truyền. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 29 + Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết: Phương pháp này dùng để tách các chậu Lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới. Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loài Lan là vào đầu mùa tăng trưởng; trong điều kiện ẩm độ tốt hoặc trồng trong các nhà kính có khí hậu nhân tạo thì có thể tách chiết quanh năm. Vào thời kỳ cuối mùa sinh trưởng của cây, cây được cắt rời thành từng đơn vị và vẫn giữ nguyên trong chậu. Sau một thời gian, lấy cây ra đem cắt bỏ các rễ hư, rồi rửa bằng dung dịch khử trùng để diệt hết mầm mống gây bệnh; sau đó, đặt các đơn vị Lan vừa tách chiết vào giữa chậu mới. Để cây ở nơi có điều kiện ẩm độ và ánh sáng thích hợp với từng loài cụ thể để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Đối với những loài đơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió. Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to. Phần bên gốc cây đã cắt sẽ nảy ra 2 - 3 cây con (Keiki) ở nách lá, gần chỗ cắt. Có thể dùng kẽm cột siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc lên 2 - 3 keiki. Khi keiki có 2 - 3 rễ mạnh thì cắt ra trồng, mở dây kẽm ra, cây mẹ vẫn sống bình thường. Hoặc khi hoa tàn thì cắt bỏ và chừa 3 - 4 mắt phía trên phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên keiki. Phalaenopsis trồng lâu năm cũng có thể ra keiki từ các nách lá ở gần dưới gốc. Khi keiki có bộ rễ khỏe và có 2 - 3 lá (sau khoảng 6 tháng), ta có thể chiết cây trồng vào chậu. Sử dụng phương pháp nhân giống này có thể giúp Phalaenopsis ra hoa trong khoảng 18 tháng đến 2 năm. Phương pháp này dễ dàng thao tác, ít tốn công và vốn; tuy nhiên cây con dễ bị nhiễm bệnh do thao tác và không thể đáp ứng một số lượng giống lớn, đồng thời theo mô hình trồng theo công nghiệp. Bên cạnh đó, thời gian Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 30 nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao. 1.3.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại (phương pháp in vitro) + Phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường thạch: Hiện nay, phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường thạch được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam nuôi cấy in vitro hoa Lan chủ yếu là nuôi cấy trên môi trường thạch. Phương pháp này giúp ta có thể tạo ra một số lượng lớn cây con, đồng nhất về di truyền... cung ứng nguồn cây giống cho các nhà vườn. Tuy nhiên do kỹ thuật nuôi cấy in vitro ở nước ta chưa đạt hiệu quả tốt nên chất lượng cây con cũng không cao; thường thì phải nhập cây giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan... + Phương pháp nuôi cấy lỏng có sục khí (Bioreactor): Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm chung là mẫu cấy đều phát triển trên môi trường đặc. Thiết bị nuôi cấy có kích thước nhỏ nên môi trường nuôi cấy không đủ đáp ứng cho sự phát triển lâu dài của mẫu cấy. Hơn nữa khi nuôi cấy trên môi trường đặc, môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở phần đáy của bình nuôi cấy. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, mẫu cấy có khả năng tăng trưởng nhanh hơn so với môi trường đặc. Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trong môi trường nên có thể hấp thu tốt hơn các chất dinh dưỡng từ môi trường. Ngày nay, hệ thống nuôi cấy Bioreactor với cấu trúc của các bình lên men nhưng các cánh khuấy bằng kim loại được thay thế bằng các ống silicon sục khí, có thể điều khiển được tốc độ dòng khí vào để hạn chế sự tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Do đó, hệ thống Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 31 Bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là nuôi cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ cây nhân sâm. + Phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng: Phương pháp này được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Vi nhân giống bằng phương pháp quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống như thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ giá thành cây in vitro. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, không sử dụng các chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất không được cho vào môi trường. Sở dĩ như vậy vì chúng có thể sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với với cơ quan diệp lục tố. + Phương pháp nuôi trong hệ thống ngập chìm tạm thời: Nguyên lý hoạt động của hệ thống này khá đơn giản. Trong bình kín, chồi cây được ngập trong dung dịch dinh dưỡng khoảng vài phút, dung dịch này sau đó được rút cạn đi một cách tự động. Những chu kỳ ngập rồi khô như vậy được lặp đi lặp lại đều đặn mỗi 6h nhờ một chiếc máy bơm không khí đã được lập trình từ trước. Toàn bộ hệ thống hoạt động khép kín và được khử trùng, tránh được sự ngoại nhiễm trong quá trình thao tác. Mặt khác vì bơm không khí vào hệ thống nên ta có thể điều tiết thành phần không khí, tạo nên môi trường tối ưu cho mầm cây con. Trong một Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 32 chiếc bình 1 lít có thể tạo ra hàng trăm chồi cây Lan Hồ Điệp khỏe mạnh sau 3 - 6 tháng. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như tạo ra nguồn mẫu in vitro dồi dào nhờ hệ số nhân của mẫu cấy rất cao, tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống cao, giảm tỉ lệ nhiễm, giảm chi phí nhân công, rút ngắn thời gian, tiết kiệm và giảm chí phí môi trường nuôi cấy do sử dụng ít môi trường trên một mẫu cấy và không sử dụng agar. 1.4. Giới thiệu hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS 1.4.1. Giới thiệu Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật nhất là cây cảnh trong ống nghiệm rất được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới. Để khắc phục hệ số nhân thấp của cây trên môi trường thạch, nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc. Kỹ thuật này cho phép đạt được hệ số nhân chồi, tạo phôi soma, PLB nhiều hơn so với trên môi trường thạch. Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, mẫu cấy bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể do ngập quá lâu trong môi trường, ngoài ra mẫu còn bị những tổn thương do quá trình lắc. Vì vậy để kết hợp những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy trên thạch với nuôi cấy lỏng, vào năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker. Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền. Ngoài ra còn có một số hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 33 Hiện nay đáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® của hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Một số hệ thống cũng xuất hiện gần đây là hệ thống Plantima® của Công ty Atech, Đài Loan. Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, khoai tây, hoa Lan... 1.4.2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: - Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy. - Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ. - Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ. - Hạn chế sự dịch chuyển. - Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động. - Hạn chế sự nhiễm. - Giá thành hạ. Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường. Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 34 - Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại. - Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập. - Hệ thống ống dẫn và van điều khiển. - Các màng lọc. - Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh. Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau. 1.4.3. Phân loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Hệ thống ngập chìm sử dụng trong vi nhân giống thực vật được mô tả và phân loại theo 4 nhóm chính theo cách thức vận hành như sau: hệ thống nuôi cấy ngập nghiêng lắc, hệ thống ngập hoàn toàn có sự thay mới môi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập một phần có sự thay mới môi trường dinh dưỡng, hệ thống ngập hoàn toàn trong đó môi trường dinh dưỡng được bơm nhu động vào khu vực nuôi cấy và không có sự thay mới môi trường. Các hệ thống ngập chìm được phân loại dựa trên các yếu tố về kích thước bình nuôi cấy, loại giá đỡ, có hay không có sử dụng hệ thống máy vi tính để điều khiển hay chỉ đơn giản điều khiển bằng các máy hẹn giờ, cách thức vận chuyển môi trường (sử dụng bơm nhu động, bơm khí hay di chuyển bình chứa). Những điểm khác biệt khác giữa các hệ thống ngập chìm là có hay không có việc tái sử dụng môi trường dinh dưỡng, sử dụng hai bình riêng biệt để dự trữ môi trường và tăng sinh mẫu cấy hay chỉ sử dụng một bình. Đặc điểm chung của các hệ thống này là sử dụng những bình chứa có dung tích lớn hơn những bình chứa truyền thống, trong suốt và có thể hấp Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 35 khử trùng được. Việc vận hành hệ thống này đơn giản hơn các Bioreactor truyền thống và cho phép kéo dài thời gian cấy chuyền. Những hệ thống nuôi cấy ngập chìm cho phép lập trình chế độ ngập của mẫu cấy (ngập một phần hay ngập toàn phần). Các hệ thống ngập chìm được chia làm 4 kiểu thiết kế như sau: 1.4.3.1. Hệ thống thùng nghiêng và hệ thống Rocker Có 2 hệ thống thuộc dạng này đã được thiết kế bởi Harris và Mason (1983). Hệ thống thùng nghiêng sẽ kéo bình tam giác nghiêng một góc 30o theo hai hướng ngược nhau, một máy có thể kéo nghiêng khoảng 400 bình erlen dung tích 50 ml hoặc 320 bình tam giác dung tích 125 ml. Hệ thống Rocker xoay 70o bình trụ tròn miệng rộng có thể tích 910 ml trên các khay của hệ thống một góc 30 - 40o cứ sau mỗi 30 giây. Hai hệ thống này đều không có hệ thống bổ sung môi trường mới. 1.4.3.2. Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy lớn có thể nâng lên hạ xuống, môi trường được bơm vào và rút ra khỏi buồng nuôi cấy theo chu kỳ nhất định trong điều kiện vô trùng. Hệ thống nuôi cấy thực vật tự động (APCS, hình 1.7) bao gồm hệ thống ống bằng silicone, hai bơm đẩy, hai bình thủy tinh chứa môi trường, một van inox ba chiều bằng thép không gỉ, một buồng nuôi cấy và một bảng Hình 1.7. Hệ thống APCS của Tisserat và Vandercook, 1985. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 36 điều khiễn có gắn các rờ le điện. Hệ thống này có thể sử dụng để nuôi cấy thực vật in vitro trong một thời gian dài. 1.4.3.3. Hệ thống ngập một phần và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng Trong hệ thống này mô thực vật luôn được đặt nằm trên phía trên giá đỡ (agar, màn propylene, cellulose). Môi trường lỏng được bổ sung và rút khỏi bình nuôi cấy. Chỉ có phần dưới của mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường. Hệ thống này có 2 mô hình: - Mô hình 1: Mô hình Aitken - Christie và Jones (1987) và Aitken - Christie và Davies (1988) gồm một hệ thống bình chứa điều khiển bán tự động bằng polycarbonate có kích thước 250 x 390 x 120 mm (Hình 1.8a). Trong hệ thống này, chồi Pinus spp. được nuôi trên môi trường với giá thể agar với hệ thống bổ sung rút và bổ sung môi trường lỏng bằng hệ thống bơm theo một chu kỳ nhất định. Môi trường lỏng từ nơi chứa tiếp xúc với mẫu cấy trong khoảng thời gian 4 đến 6 giờ bằng cách sử dụng máy hút chân không, sau đó môi trường sẽ được rút cạn. Mô hình này hoạt động trên cơ sở ảnh hưởng tích cực của việc bổ sung môi trường lỏng hoặc auxin vào môi trường bán rắn ở giai đoạn cuối của nuôi cấy in vitro mà Maene và Debergh (1985) đã chỉ ra trước đó. - Mô hình 2: mô hình do Simonton và cộng sự (1991) thiết kế gồm hệ thống bơm điều khiển bằng hệ thống vi tính có thể bơm môi trường lỏng vào bình nuôi cấy có thể tích 7 lít theo chu kỳ (hình 1.8b). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuôi cấy. Quá trình điều khiển thực hiện ở việc nạp môi trường, độ sâu mực chất lỏng, chu kỳ tuần hoàn môi trường lỏng và được điều chỉnh theo lịch trình trong suốt quá trình nuôi cấy. Hệ thống có khả năng điều khiển đồng thời 4 bình nuôi cấy. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 37 1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử dụng bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cấy. Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ. Môi trường lỏng được đẩy từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cấy và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể a b Hình 1.8a. Hệ thống của Aitken - Christie và Davies (1988). Hình 1.8b. Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 38 tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây. Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 - 6 tuần. Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống đôi (BIT®) và hệ thống Plantima. 1.4.4. Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1.4.4.1. Hệ thống RITA® Hệ thống RITA® (hình 1.9) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích 1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở dạng ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí được sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cấy, áp suất vượt mức sẽ đẩy không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 39 Hình 1.9. Hệ thống RITA® Bao gồm: - Pha 1: mô không ngập trong môi trường. - Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy. - Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®. - Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới. 1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT® Hệ thống bình đôi BIT® (hình 1.10) do Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma; thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp hơn. Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh hay plastic có dung tích từ 250 ml - 1000 ml bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 40 Hình 1.10. Hệ thống bình đôi BIT® 1.4.4.3. Hệ thống Plantima® Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A - tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 1.11, Hình 1.12) Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 41 Hình 1.12. Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập Hình 1.11. Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 42 1.4.5. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống trên thế giới và ở Việt Nam Sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuôi cấy và chất lượng của mẫu cấy; so sánh giữa chúng với những mẫu được nuôi cấy trong hệ thống thông thường. 1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới Hệ thống ngập chìm tạm thời TIS là một trong những phương pháp vi nhân giống đầy triển vọng trong sản xuất cây giống thương mại. + Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn cắt in vitro Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự nảy chồi. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyền mẫu cấy. Hình 1.13. Hệ thống Plantima a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 43 Chồi thu được khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên môi trường bán rắn. Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhóm AAH). Đồng thời Alvard và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân Chuối. - Chồi Chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt. - Chồi trên môi trường bán rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1. - Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Các tác giả này đã thu được kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA® với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhóm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đôi (Teisson và cộng sự, 1999). Tương tự như vậy, Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy. Hệ số nhân được gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần 5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy. Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các in vitro trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 - 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 44 Khi sử dụng hệ thống RITA® hệ số nhân tương tự có thể được đạt tới chỉ trong vòng 5 - 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995). + Trong sự tạo củ bi in vitro Sự sinh trưởng và sự hình thành củ Khoai tây Solanum tuberosum L. được đẩy mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ thống bình đôi (Akita và Takayama, 1994). Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 - 960 củ sau 10 tuần nuôi cấy nhiều hơn những kết quả trong các công trình trước đó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và Takayama, 1993). Trọng lượng tổng số và tính đồng nhất của củ cũng được gia tăng. Ngược lại trong điều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không có bất cứ sự hình thành củ nào. Teisson và Alvard (1999) đã kiểm chứng lại hiệu quả của nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự tạo củ Khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA® đôi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình đôi. Ba củ bi được hình thành trên một đốt trong 10 tuần nuôi cấy. Năm mươi phần trăm củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g. Hệ thống này rất có hiệu quả và nhanh chóng do có từ 3 đến 4 chồi nảy lên từ một củ. + Trong sự phát sinh phôi Gia tăng sự phát sinh phôi: - Các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được chứng minh thành công hơn trong nuôi cấy phát sinh phôi khi được so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác. - Tisserat và Vandercook (1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây Cà rốt và cây Chà Là (Phoenix dactylifera) trong hệ thống APCS trong đó thời gian ngập chìm là 5 - 10 phút sau mỗi 2 giờ. So sánh với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây Cà rốt, và 4 lần đối với cây Chà Là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 45 tạm thời. Thêm vào đó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con Cà rốt được nâng lên. Sự phát triển phôi: - Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều đối tượng khác nhau đã được cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời. - Đối với cây Cao Su Hevea brasiliensis sự hình thành phôi soma trên môi trường rắn cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phôi soma không đáng kể (Etienne và cộng sự, 1997). Sự tạo phôi soma trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp đến 4 lần so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn với hơn 400 phôi/g trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy phát sinh phôi. - Nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phôi bị bất thường còn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phôi phát triển lên tiếp. Hệ thống này có thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phôi lên tới trên 60%, tỷ lệ hình thành trụ trên lá mầm là 35%. Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150 phôi soma cây Cao Su ở giai đoạn có lá mầm đã thu được trong một hệ thống RITA® từ tuần thứ tư đến tuần thứ tám sau khi bắt đầu chuyển giai đoạn phát sinh phôi vào trong hệ thống này. - Tuy nhiên để tái sinh thành cây hoàn chỉnh, những phôi nảy mầm cần được chuyển vào trong môi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, đòi hỏi phải đặt cây con luôn đứng thẳng hướng lên trên cùng hướng phát triển của cây. Trong hệ thống RITA® không thể đạt được yêu cầu trên vì cây luôn di chuyển mỗi khi môi trường dâng lên ngập theo chu kỳ. Sự tạo phôi đồng loạt: - Trên các cây thuộc họ cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng đã cải thiện tính đồng bộ trong quá trình phát sinh phôi nhờ Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 46 khả năng ức chế sự phát sinh phôi thứ cấp (Cabasson và cộng sự, 1997). - Hệ thống này cũng cải thiện sự đồng bộ trong suốt quá trình phát triển và nảy mầm phôi Cao Su và Cà Phê Arabica so với quá trình này trên môi trường bán rắn (Etienne và cộng sự, 1997; Etienne-Barry và cộng sự, 1999). 1.4.5.2. Thành tựu ở Việt Nam Thế giới đã ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây trồng từ lâu tuy nhiên công nghệ này mới được thực hiện tại Việt Nam trong những năm gần đây. Hệ thống này đã được tiến hành khảo sát trên các đối tượng như hoa Lan, cây thu hải đường và các giống kiểng lá... Năm 2005, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM đã tiến hành nhân giống cây Lan Hồ Điệp lai trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Đến năm 2007, Th.S. Cung Hoàng Phi Phượng và cộng sự đã hoàn thiện qui trình nhân giống Lan Phalaenopsis bằng hệ thống Plantima. Kết quả đạt được như sau: tỉ lệ nhân PLB gấp 2,27 lần sao với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với môi trường lỏng lắc; tỉ lệ chồi gấp 3,37 lần khi so sánh với nuôi cấy trên môi trường đặc, 1 chồi ban đầu thu nhận được 10 chồi mới, cây con tạo thành phát triển mạnh. Cùng với những ưu điểm của hệ thống Plantima và phát huy kết quả đạt được của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM đã tiến hành ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation thuộc họ Araceae đã cho kết quả ban đầu rất khả quan. Sau 2 tháng nuôi cấy, các mẫu cấy sống 100% và có khả năng tái sinh chồi, chồi thu được có từ 3 - 4 lá, xanh mướt. Xét về số lượng chồi thu được hệ số nhân chồi gấp 4 lần trên môi trường thạch. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 47 Đồng thời vào năm 2008, KS. Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam đã ứng dụng thành công hệ thống Bioreactor dạng TIS trong nhân chồi và PLBs hoa Lan Dendrobium và Phalaenopsis. Kết quả thu được lượng chồi, PLBs sản xuất cao hơn 3 đến 20 lần so với nuôi cấy môi trường thạch, chồi khỏe, PLBs có màu xanh đậm. Những thành công bước đầu trong việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô góp phần phát triển nguồn cây giống nước ta lên tầm cao mới; và phục vụ tốt cho việc sản xuất theo qui mô công nghiệp trong thời gian tới. 1.4.6. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1.4.6.1. Ưu điểm Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống Bioreactor thông thường. Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn. Từ đó cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm. Có thể nói hệ thống TIS đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 48 Chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống. Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể. Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời so với hệ thống Bioreactor thông thường. Hệ thống TIS tiết kiệm được công lao động và không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất. Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể. 1.4.6.2. Nhược điểm Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng. Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy. Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này. Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác. Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 49 những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành. Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời rộng rãi trong sản xuất cây giống. 1.5. Môi trường nuôi cấy in vitro 1.5.1. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố rất quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô. Không có môi trường nào là môi trường chuẩn tuyệt đối cần thiết cho sự phát triển của tất cả các tế bào và do đó sự thay đổi môi trường là cần thiết, tùy thuộc vào từng loại mô nuôi cấy khác nhau, hoặc phương pháp nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, môi trường nuôi cấy bao gồm các khoáng vô cơ, các chất hữu cơ như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, đường, nước dừa, nấm men, khoai tây... trong đó, các khoáng vô cơ là quan trọng nhất trong các thành phần của môi trường nuôi cấy. 1.5.2. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy in vitro - Môi trường của Murashige và Skoog (1962): môi trường MS. - Môi trường Lloyd và McCown (1980): môi trường WP. - Môi trường Vacin và Went (1949): môi trường VW. - Môi trường Gamborg et al. (1968): môi trường B5. - Môi trường Nitsch và Nitsch (1969): môi trường N6. - Môi trường Knudson C (1946): môi trường KNC. - Môi trường White (1963) Các thành phần hóa chất trong môi trường trên thường nhiều và được sử dụng với một lượng rất ít nên khóa khăn cho việc cân hóa chất nên cần Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 50 phải pha dung dịch mẹ để sử dụng. Việc bảo quản dung dịch mẹ cũng khó khăn vì phải giữ ở nhiệt độ 4oC. 1.5.3. Thành phần các chất khoáng vô cơ 1.5.3.1. Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính như: N, P, K. + Đạm (N): Giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu cây sinh trưởng kém, cằn cỏi... Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau: - CO(NH2)2 : Urea (46% N). - (NH4)2SO4 : Ammonium Sunfate tức SA (22% N). - KNO3 : Potassium Nitrate (14% N). - NH4NO3 : Ammonium Nitrate (34% N). - NaNO3 : Sodium Nitrate (16,4% N). - Ca(NO3)2 : Calcium Nitrate (15,5% N). + Lân (P): Giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng... Các chất có thể cung cấp Lân như: - Super Lân : (20% P2O5). - (NH4)2HPO4 : Diamonium Hydrogen Phosphate (46% P2O5). - (NH4)3HPO4. 3H2O : Triamonium Hydrogen Phosphate (15,21% P). - KH2PO4 : Monopotassium Phosphate (10,35%P). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 51 + Kali (K): Tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa... Các chất cung cấp Kali như: - KCl : Potassium Chlorua (60% K2O). - K2SO4 : Potassium Sunfate (48% K2O). - KNO3 : Potassium Nitrate (44% K2O). - KH2PO4 : Monopotassium Phosphate (40% K2O). Ngoài ra cũng cần các nguyên tố: Ca, Mg và S + Calcium (Ca): Tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc... Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm nhiều sẽ trở nên quá mập, tàn lá rợp xuống, dễ bị gãy. Thiếu Ca cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được. Các chất cung cấp Ca như: - CaCl2 : Calcium Chlorua - Ca(NO3)2 : Calcium Nitrate + Magnesium (Mg): Thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. Nếu dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị khô héo. Thiếu Mg bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá. + Sulfur (S): Thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng. Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4... Thiếu S thì cây Lan cằn cõi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 52 1.5.3.2. Khoáng vi lượng Nhóm này rất cần thiết cho Lan mặc dù Lan cần rất ít (không quá 5mg/lít). Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo, Mn, Fe... + Sắt (Fe): Đóng vai trò diệp lục tố, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu Fe làm lá cây có màu xanh lợt, cây không quang hợp tốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. + Đồng (Cu): Thiếu Cu dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc. Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. + Kẽm (Zn): Giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây đồng thời giảm tưới lân. + Mangan (Mn): Thiếu Mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 (Mangan Sunfate) để cung cấp Mn cho cây. + Molyden (Mo): Điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (Sodium Molybdate) để cung cấp Mo cho cây. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 53 Bảng 1.1. Thành phần các chất khoáng vô cơ trong một số môi trường nuôi cấy thông dụng (mg/l) Hóa chất White B5 N6 WP MS VW KNC NH4NO3 400 1650 500 (NH4)2SO4 134 463 500 500 Mg2SO4.7H2O 720 246 185 370 370 122 122,15 KCl 65 250 KNO3 80 2528 2830 1900 525 KH2PO4 400 170 170 250 250 K2SO4 990 NaH2PO4.H2O 19 150 Na2SO4 200 CaCl2.2H2O 150 166 96 440 Ca(NO3)2.4H2O 300 556 241,3 Ca3(PO4)2 200 Na2EDTA.2H2O 37,2 37,2 37,2 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8 25,0 Fe2(SO4)3 2,5 Fe2(C4N4O6)3 23,13 Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 54 H3BO3 1,5 3 1,6 6,2 6,2 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 CuSO4.5H2O 0,001 0,025 0,25 0,025 MnSO4.H2O 10 5,68 5,68 MnSO4.4H2O 7 4,4 22,3 22,3 MoO3 0,0001 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 KI 0,75 0,75 0,8 0,83 ZnSO4.7H2O 3 2 1,5 8,6 8,6 White (1963) B5 : Gamborg et al. (1968) N6 : Nitsch và Nitsch (1969) WP : Lloyd và McCown (1980) MS : Murashige và Skoog (1962) VW : Vacin và Went (1949) KNC : Knudson C (1946) 1.5.4. Carbon và nguồn năng lượng Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 55 Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. 1.5.5. Vitamin Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật. Vitamin thường có chức năng xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô là Thiamine (vitamin B1), Acid Nicotinic (B3), Pyridoxine (B6) và Myo - inositol, B5, B12. 1.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay còn gọi là Phytohormone đóng vai tròn điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh các thực vật từ những tế bào và mô tách rời. Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà loại và liều lượng sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau. Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Trong đó 2 chất điều hòa quan trọng là auxin và cytokinin quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro. - Nhóm auxin (gồm IAA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T...) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ. Ở liều lượng cao, auxin thường gây nên các đột biến. - Nhóm cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin...) đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. 1.5.7. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô Lan 1.5.7.1. Các chất hấp phụ phenol Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống Phalaenopsis, vấn đề thường gặp nhất là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 56 phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nươi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flemee và Boesman, 1977; Fast, 1979). Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol, polyvinylpyrrolidone (PVP), than hoạt tính và nhiều loại chất hấp thụ khác. Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 - 3 tuần sang môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô Lan trong môi trường lỏng thường bổ sung chất PVP.   Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định và môi trường nuôi cấy Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park và cộng sự, 2000). 1.5.7.2. Nước dừa và các dịch chiết khác Nước dừa là nguồn cung cấp đạm dồi dào do thành phần chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ. Ngoài ra, nước dừa còn chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose và fructose. Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo). Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của chất có hoạt tính trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh chứa zeatin (Letham, 1974). Khi nuôi cấy Lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegaty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Với Dendrobium, nước dừa không ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của phôi ở các giai đoạn đầu nảy mầm (Kotomori và Murashige, 1965). Một số trường hợp Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 57 khác, phôi Phalaenopsis lại tăng sinh mô sẹo và chậm phát sinh cơ quan khi bổ sung nước dừa vào môi trường (Ernst, 1967). Bên cạnh đó, nước chiết cà chua là cũng một nguồn dinh dưỡng tốt cho phôi Lan nảy mầm và tăng trưởng (Meyer, 1945; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957). Tác dụng kích thích tăng trưởng của nước cà chua được thấy rõ ở phôi Cattleya Sudan x C. Percivaliana, các phôi tăng trưởng giới hạn và biệt hóa thành cơ quan , tạo cụm mô phân sinh và tăng sinh bình thường. Các nhà trồng Lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái cây khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1947; Mariat, 1952; Withner, 1953). Nhưng đáng tiếc là hiệu quả tác dụng của các loại dịch chiết dinh dưỡng này lên sự tăng trưởng của phôi vẫm chưa được biết rõ, có thể trong thành phần các dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển bình thường của phôi. Vì phôi Lan có nhu cầu đặc biệt về nguồn đạm, do vậy có thể các thành phần đạm trong dịch chiết có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của phôi. 1.5.7.3. Yếu tố làm đặc môi trường Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường. Nguyên liệu phổ biến nhất trong nuôi cấy mô là agar; người ta hòa agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 60oC) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra tùy thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo. Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum. Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 58 những tác động sinh lý trên mô thực vật. Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991; Debergh, 1983; Halquist et al, 1983). Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60- 100oC, đặc lại khi nhiệt độ 35oC vì vậy agar ổng định trong tât cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sủ dụng và pH của môi trường. 1.5.7.4. Ảnh hưởng của pH Arditti (1967) đã tóm tắt ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của một số phôi Lan. Đối với phần lớn các giống nghiên cứu thì pH khoảng 5- 6 là phù hợp. Nồng độ H+ trong môi trường dường như quyết định vào thời điểm nảy mầm của phôi, vì sau khi nảy mầm pH môi trường thấp hơn vẫn không gây độc cho sự tăng trưởng (Knudson, 1951). Tuy nhiên có qua nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để nuôi cấy phôi, do vậy ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của phôi Lan vẫn chưa được khẳng định rõ ràng. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 59 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM, cây số 1900 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu Phát hoa của 5 giống Lan Hồ Điệp được thu khi hoa đã nở hết trên cành. Chọn những phát hoa to khỏe, cắt những đốt chứa mắt ngủ dài 4cm, tách bỏ vỏ bao quanh mắt ngủ (nhẹ nhàng, không làm tổn thương mắt ngủ). Tình trạng mắt ngủ phải còn trắng xanh hay hơi đỏ của màu phát hoa, loại bỏ những mắt ngủ bị hóa đen và bị trầy xước. Tiến hành khử trùng mẫu chọn thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho tỉ lệ mẫu sống và vô trùng cao nhất. Có 5 giống Lan Hồ Điệp được dùng trong các thí nghiệm: - Dtps. Taida Salu. - Dtps. Taida Firebird. - Dtps. Salu Spots. - Dtps. Black Jack. - Dtps. Metor pulcherrim Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 60 Hình 2.1. Các giống Lan Hồ Điệp sử dụng trong các thí nghiệm Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 61 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường MS (Murashine và Skoog, 1962), với khoáng đa lượng được được giảm đi ½, các yếu tố khoáng vi lượng và vitamin được giữ nguyên. Các chất bổ sung gồm: - Chất điều hòa sinh trưởng: NAA (Naphatalenacetic acid), BA (6- Benzy - aminopurine) - Tryptone. - Sucrose. - PVP (Polyvinylpyrolidone). - Nước dừa (CW). - Peptone. - Agar. - Than hoạt tính (CA). 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm trên hệ thống ngập chìm tạm thời được thực hiện trong một phòng nuôi riêng với điều kiện như sau: - Nhiệt độ : 25 ± 2oC. - Độ ẩm trung bình : 80 - 85%. - Thời gian chiếu sáng : 12 giờ/ngày. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Cách pha môi trường 2.3.1.1. Cách pha dung dịch mẹ Để tiết kiệm nguyên liệu và công lao động cho đề tài, ta cần pha dung dịch mẹ trước khi pha môi trường nuôi cấy. Pha dung dịch mẹ dựa vào môi trường khoáng MS (Murashine và Skoog, 1962). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 62 Các chất điều hòa sinh trưởng: cân 0,1 g BA pha và hòa tan trong 1 ml NaOH 1N rồi định mức 100 ml bằng nước cất vô trùng, lượng dùng lá hút 1 ml tương ứng cho 1 mg BA. Tương tự cho chất NAA. 2.3.1.2. Cách pha môi trường cấy Bước 1: Tùy theo thể tích cần pha ta hút dung dịch mẹ gồm các khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và nhóm vitamin. Cân các chất: đường, tryptone, peptone và hút BA, NAA. Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất theo thể tích đã định sẵn. Bước 2: Định mức và đo pH 5,9 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N hay HCl 1N). Bước 3: Cân than hoạt tính và agar cho vào môi trường, nấu chín môi trường đến khi agar được tan hết. Bước 4: Cho vào mỗi chai thủy tinh khoảng 30 ml môi trường. Bước 5: Ghi rõ ngày tháng và tên (kí hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn. 2.3.2. Hấp khử trùng 2.3.2.1. Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy Môi trường sau khi được cho vào chai thủy tinh sẽ được cho vào nồi hấp vô trùng, chỉnh nhiệt độ ở 121oC, 1 atm; thời gian hấp khoảng 15 – 20 phút. Sau khi hấp xong chờ cho nhiệt độ nồi hấp giảm còn khoảng 45oC mới lấy môi trường ra. Chuyển môi trường đã hấp khử trùng sang phòng nuôi cấy. Giữ 2 ngày ở 25oC để kiểm tra. 2.3.2.2. Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy mô như: kẹp lớn, nhỏ, dao, giá để dụng cụ, giấy cấy... được gói bằng giấy và nylon chịu nhiệt. Sau đó hấp khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Dụng cụ sau khi hấp khử trùng được bảo quản trong phòng cấy để tránh nhiễm khi cấy. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 63 2.3.3. Các thao tác trong phòng cấy Rửa sạch tay bằng xà bông trước khi thao tác, mặc áo blouse, khẩu trang và mang găng tay. Mở đèn cực tím UV, 5 phút sau mở quạt gió. Đèn UV mở trong 15 - 30 phút trước khi cấy rồi tắt. Sau 10 phút bắt đầu khử trùng tủ cấy. Lấy một miếng gòn tẩm alcool 70o hoặc 96o, lau kỹ tất cả các thành đứng và ngang ở bên tủ cấy, lau cẩn thận bàn làm việc của tủ cấy. Lau cồn 70o tất cả các bình đựng môi trường, chai mẫu và các vật dụng trước khi đưa vào tủ cấy. Khi thao tác cấy, đặt dụng cụ vào ống nghiệm chứa cồn 960 sao cho 1/3 dụng cụ không bị ngập trong cồn. Ống nghiệm chứa cồn nên được để một miếng bông gòn ở đáy để hạn chế bể ống nghiệm. Đặt ống nghiệm chứa cồn này vào một erlen hoặc bercher, lót 1 miếng gòn ở đáy bình để hạn chế sự va chạm giữa 2 dụng cụ thủy tinh. Nhúng các dụng cụ cấy vào alcool 96o. Đốt các dụng cụ thao tác cùng một lúc, hơ qua lửa 2 - 3 lần cho thật nóng, để nguội dần trên một giá bằng kim loại. Sau khi dụng cụ cấy đã nguội dần, gắp giấy cấy từ trong gói giấy ra, mở nắp chai hoặc ống nghiệm có mẫu thì dùng ngón tay áp út và ngón tay út cầm lấy nút cao su, không đặt nút cao su xuống bàn cho đến khi gắn nó trở lại vào chai môi trường. Rút mẫu từ ống nghiệm đặt lên giấy cấy. Tiến hành cắt mẫu thành từng đốt và lát mỏng (ở giai đoạn nhân chồi), hay tách cụm chồi nhỏ để cấy vào môi trường vươn thân (ở giai đoạn vươn thân). Sau đó, đặt mô thực vật trên môi trường cấy thích hợp trong thời gian ngắn nhất. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 64 Tất cả các mô bị rơi trên mặt bàn hay tiếp xúc với các vật liệu khác ngoài dụng cụ cấy và giấy khử trùng đều được loại bỏ Hơ qua ngọn lửa cổ bình nuôi cấy sau khi đã cấy mẫu vào. Mẫu sau khi được cấy vào bình, dùng bút lông ghi lại tên giống và ngày cấy, tên môi trường. Ghi lại các thông tin này trong sổ thí nghiệm của phòng. Sau khi cấy xong, lau tủ cấy bằng cồn, dọn dẹp sạch sẽ nơi làm việc, giữ nguyên vị trí các dụng cụ có trong tủ cấy từ trước. Tắt đèn, quạt trong tủ cấy. Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng cấy. 2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm 2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống. + Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB. Mục đích: - Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá của các chồi lan Hồ Điệp - Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB. - Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB. Phương pháp thí nghiệm: Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá - Tiến hành trên 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ khoảng 100 mảnh, mỗi mảnh có kích thước 5 x 5 mm. - Tiến hành cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (NAA, Adenin, BA). Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 65 Bảng 2.1. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá Môi trường Nồng độ NAA (mg) Nồng độ adenine (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) MSII1 1 10 0 MSII2 1 0 10 MSII3 1 10 10 Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự nhân nhanh PLB: - Các mẫu PLB được cắt đôi và cấy vào môi trường MS ½ có bổ sung BA, NAA ở những nồng độ khác nhau; sucrose (30 g/l), CW 15%, CA 1g/l, Agar 8g/l. - Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mật độ mẫu cấy là 10 mẫu/bình. Bảng 2.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân PLB Ký hiệu môi trường Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) NAA BA NB1 0,5 1 NB2 0,5 2 NB3 1 1 NB4 1 2 NB5 1 3 NB6 1 4 NB7 2 1 Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 66 Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB - Chọn ra tỉ lệ BA và NAA thích hợp nhất tiếp tục thí nghiệm trênnhững nồng độ đường khác nhau với vật liệu là PLB của giống số 1 và giống số 2 Bảng 2.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLB. Ký hiệu môi trường Sucrose (g/l) Glucose (g/l) SG1 30 0 SG2 25 5 SG3 20 10 SG4 15 15 SG5 10 20 SG6 5 25 SG7 0 30 Từ kết quả ở thí nghiệm này ta chọn môi trường thích hợp nhất để sử dụng cho tất cả thí nghiệm nhân PLB về sau. Chỉ tiêu theo dõi: - Tỉ lệ mẫu lá hình thành PLB của 5 giống Hồ Điệp lai sau 8 tuần nuôi cấy. - Số lượng PLB tạo thành của 2 giống Hồ điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) sau 8 tuần nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cũng như trên các môi trường có 2 loại đường ở các nồng độ khác nhau. + Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB. Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 67 Vật liệu: Các PLB của 2 giống Hồ Điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) thu được trong thí nghiệm 1.1 Phương pháp thí nghiệm : Các PLB được nuôi cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung: - Peptone (2 g/l), CW (15%), PVP (500 mg/l). - Sucrose (20 g/l), khoai tây (30 g/l). - Agar (8 g/l), CA (1 g/l), pH 5,9. - Tùy theo nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung BA 0; 0,5 và 1 mg/l. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ PLB phát triển thành chồi. + Thí nghiệm 1.3: Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan Hồ Điệp. Phương pháp thí nghiệm: Các chồi tái sinh từ PLB được đặt nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau (0; 0,5 và 1 mg/l). Chỉ tiêu theo dõi: - Số lượng rễ hình thành - Chiều dài rễ 2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan Mục đích: Bước đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, các bước tiến hành khử trùng dụng cụ và thiết bị nuôi cấy. Tiến hành nuôi cấy thử nghiệm Phương pháp thí nghiệm: Môi trường MS ½ có bổ sung pepton, dịch chiết khoai tây, nước dừa Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 68 Lắp ráp thiết bị và cho máy vận hành không có mẫu chỉ có môi trường, theo dõi tỉ lệ nhiễm, tìm nguyên nhân và đưa ra các biện pháp khắc phục sự nhiễm của hệ thống. Sau đó tiến hành thử nghiệm nuôi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống Hồ Điệp số 1 Dtps. Taida salu. Các bình Plantima chứa thể tích môi trường 200 ml được sử dụng. Cho vào mỗi bình 20 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo chu kỳ và tần xuất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ. 2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan Vật liệu: Các cụm PLB của Giống Hồ điệp Số 1 (Dtps. Taida Salu) được sử dụng cho thí nghiệm trong hệ thống Plantima Môi trường nuôi cấy: MS ½ có bổ sung BA 3mg/l, NAA 1mg/l, nước dừa 10%, pepton 1g/l và PVP 1g/l, sucrose 15g/l, glucose 15g/l. + Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima. Cho PLB với các mật độ: 2 g, 4 g, 6 g, 8 g vào các bình Plantima có thể tích môi trường 200 ml và cho hệ thống bơm hoạt động theo tần suất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 5 phút, nghỉ 2 giờ. Từ thí nghiệm về mật độ PLB nuôi cấy chọn mật độ thích hợp nhất cho kết quả nhân PLB tốt và và phát triển đủ không gian bình Plantima để làm thí nghiệm về thể tích môi trường ở các mức : 150 ml, 200 ml và 250 ml. Tần suất ngập chìm là ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần. Đối chứng: 1,5 g PLB được nuôi trên môi trường thạch trong các bình tam giác 250 ml có thể tích môi trường là 50 ml. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 69 + Thí nghiệm 3.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima Sử dụng mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 4.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB: Ngập 10 phút trong chu kỳ 1 giờ; ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ, ngập 10 phút trong chu kỳ 2 giờ. 2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu Số liệu trong các bảng được thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0.05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn. 2.5. Chuyển cây con ra vườn ươm Mục đích: Theo dõi tỉ lệ sống sót và phát triển của các cây con có nguồn gốc nuôi cấy trong bình Plantima và bình tam giác khi mang ra ngoài vườn ươm. Phương pháp: Các cây con có bộ rễ khỏe mạnh thu được từ thí nghiệm ra rễ trên hệ thống Plantima và bình tam giác được lấy ra và rửa sạch, sau đó được trồng trong các vỉ nhựa với giá thể là dớn. Trong tuần lễ đầu, phun sương nước cho cây con nhiều lần trong ngày để giữ ẩm cho cây, kết hợp phun B1 2 lần /tuần. Sau đó phun phân bón NPK 30 - 10 - 10 2 lần/ tuần. Theo dõi tỉ lệ sống và sự phát triển của cây con trong vườn ươm. Khoùa Luaän Toát Nghieäp GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh SVTH: Öng Thò Myõ Tieân MSSV: 0811110086 70 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Thiế