Đề tài Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

Më ®Çu Virót Cóm lµ t¸c nh©n quan träng g©y bÖnh Cóm cho ng­êi trªn toµn cÇu vµ l©y truyÒn chñ yÕu qua ®­êng h« hÊp. Trong c¸c dÞch Cóm hµng n¨m, 5-15% d©n sè bÞ ¶nh h­ëng do l©y nhiÔm b»ng ®­êng h« hÊp trªn. C¸c tr­êng hîp nhËp viÖn vµ tö vong chñ yÕu x¶y ra ë nh÷ng nhãm cã nguy c¬ cao , nh­ ng­êi cao tuæi vµ ng­êi èm m¹n tÝnh. MÆc dï khã cã thÓ ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ, nh­ng c¸c sè liÖu thèng kª cho thÊy nh÷ng dÞch Cóm nµy g©y ra tõ 3 ®Õn 5 triÖu ca bÖnh vµ kho¶ng 250.000 ®Õn 500.000 ca tö vong mçi n¨m trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Theo sè liÖu cña Trung t©m KiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng (The Center for Disease Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mü) mçi n¨m ë Mü cã h¬n 200.000 ca nhËp viÖn v× biÕn chøng cña Cóm vµ 36.000 tr­êng hîp chÕt. BÖnh Cóm lan réng nhanh chãng trªn toµn thÕ giíi trong nh÷ng mïa dÞch vµ g©y ra g¸nh nÆng ®¸ng kÓ cho kinh tÕ vµ y häc. BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Dùa trªn th«ng tin thu thËp ®­îc tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t bÖnh Cóm toµn cÇu cña WHO, hµng n¨m WHO ®­a ra khuyÕn c¸o thµnh phÇn kh¸ng nguyªn cña v¾c xin tËp trung vµo 3 chñng phæ biÕn nhÊt ®ang l­u hµnh. HiÖn t¹i c¸c virót Cóm ®ang l­u hµnh g©y bÖnh cho ng­êi ®­îc ph©n chia thµnh hai nhãm A vµ B. Cóm A cã 2 ph©n týp quan träng nhÊt ®èi víi ng­êi lµ A/H3N2 vµ A/H1N1, liªn quan ®Õn nh÷ng ®¹i dÞch cã sè ng­êi tö vong nhiÒu nhÊt. HiÖn nay, tÊt c¶ c¸c nhµ s¶n xuÊt v¾c xin Cóm trªn thÕ giíi ®· vµ ®ang sö dông c«ng nghÖ truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i kh«ng mang c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ®Æc hiÖu. Tuy nhiªn, ®©y lµ mét hÖ thèng cång kÒnh víi nhiÒu ®iÓm bÊt lîi nh­: chi phÝ cao, cã thÓ lÉn c¸c t¹p chÊt g©y dÞ øng. Virót Cóm ng­êi sinh tr­ëng trªn trøng cã thÓ dÉn ®Õn sù chän läc nh÷ng biÕn ®æi trong c¸c kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tõ chñng virót gèc (14) vµ nguån cung cÊp trøng kh«ng ®¶m b¶o ®­îc thêi gian, ¶nh h­ëng ®Õn tÝnh s½n sµng cho viÖc ®èi phã víi bÖnh dÞch (29). ViÖc nu«i cÊy virót Cóm trªn tÕ bµo lµ rÊt kh¶ thi trong viÖc s¶n xuÊt v¾c xin víi nh÷ng lîi thÕ so víi trªn trøng gµ cã ph«i nh­: cho n¨ng suÊt cao vµ s¹ch do kh«ng lÉn nh÷ng t¹p chÊt nh­ trªn trøng, virót nh©n lªn trªn tÕ bµo vÉn gi÷ ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn nh­ ë chñng virót gèc. XuÊt ph¸t tõ thùc tÕ ®ã, nh»m nghiªn cøu s¶n xuÊt v¾c xin Cóm mïa bÊt ho¹t cã hiÖu lùc cao víi gi¸ thµnh h¹, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: "Nghiªn cøu thÝch øng chñng virót Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau". §Ò tµi ®­îc thùc hiÖn nh»m 2 môc tiªu: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña 3 chñng virót Cóm mïa H1N1, H3N2 vµ B trªn c¸c dßng tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t (PMKc), thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc (Vero) vµ thËn chã Madin-Darby th­êng trùc (MDCK). Nghiªn cøu cÊy truyÒn c¸c chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo thÝch hîp nh»m n©ng cao hiÖu gi¸. Ch­¬ng 1 TæNG QUAN Virót Cóm N¨m 1931, Shope vµ céng sù ®· lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®­îc virót Cóm tõ lîn bÞ nhiÔm bÖnh. H×nh 1. H×nh ¶nh virót Cóm A d­íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua. Nguån: Public Health Image Library (CDC), ID: #8160. §é phãng ®¹i 100.000 lÇn LÞch sö N¨m 1918, dÞch Cóm T©y Ban Nha ®· lµm tö vong 50 triÖu ng­êi, do virót ph©n nhãm H1N1 g©y ra, th­êng ®­îc coi lµ chñng g©y Cóm lîn nh­ng cã kh¶ n¨ng truyÒn nhiÔm. N¨m 1957 vµ 1958, H2N2 g©y nªn dÞch Cóm ch©u ¸ vµo ®· lµm chÕt kho¶ng 1 triÖu ng­êi trªn thÕ giíi. N¨m 1968, 1969 H3N2 ph¸t triÓn tõ chñng H2N2 do biÕn ®æi di truyÒn vµ g©y nªn dÞch Cóm Hång K«ng ®· g©y tö vong 750,000 ng­êi. §©y lµ ®¹i dÞch g©y tö vong lín nhÊt thÕ kû 20. N¨m 2002, víi sù bïng ph¸t ph©n nhãm H7N2 trong gia cÇm, 44 ng­êi ®· ®­îc ph¸t hiÖn lµ bÞ nhiÔm virót t¹i bang Virginia, Mü. Th¸ng 2 n¨m 2004, ë B¾c Mü, ng­êi ta ®· ph¸t hiÖn chñng virót Cóm gµ H7N3 t¹i mét sè trang tr¹i gia cÇm t¹i British Columbia. N¨m 2003 ë Hµ Lan, 89 ng­êi ®· ®­îc chÈn ®o¸n lµ nhiÔm virót Cóm H7N7 sau mét ®ît dÞch Cóm gia cÇm tõ mét sè trang tr¹i l©n cËn. Mét tr­êng hîp ®· tö vong. N¨m 2005, cã 3 tr­êng hîp ph¸t hiÖn nhiÔm H9N2 ë Trung Quèc vµ Hång K«ng cho thÊy bÞ nhiÔm virót vµ tÊt c¶ ®Òu ®· qua khái. Lo¹i virót nµy ®· ®­îc nghiªn cøu cho thÊy chØ lµ d¹ng "g©y nhiÔm thÊp". Tõ n¨m 1997, sù bïng ph¸t cña virót H5N1 ®· lµm nhiÔm bÖnh vµ chÕt hµng chôc triÖu gia cÇm. H5N1 ®­îc coi lµ t©m ®iÓm cña sù chó ý vµ c¶nh b¸o r»ng mét biÕn chñng tõ ph©n nhãm H5N1 cã thÓ tù biÕn ®æi (hoÆc t¸i tæ hîp) ®Ó t¹o thµnh mét chñng virót cã kh¶ n¨ng g©y ®¹i dÞch Cóm toµn cÇu. T×nh h×nh hiÖn nay Tõ th¸ng 2 ®Õn th¸ng 9 - 2008, ho¹t ®éng cña virót Cóm ®­îc b¸o c¸o ë ch©u Phi, ch©u Mü, ch©u ¸, ch©u ¢u vµ ch©u §¹i D­¬ng. Nh×n chung, virót Cóm ho¹t ®éng ë møc võa ph¶i (42). ë phÝa B¾c b¸n cÇu, virót Cóm tiÕp tôc l­u hµnh vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t dÞch ë ch©u ¸, ch©u ¢u vµ B¾c Mü. Ho¹t ®éng cña virót Cóm gi¶m xuèng trong th¸ng 3 ë ch©u ¢u vµ th¸ng 4 ë ch©u ¸ vµ B¾c Mü. Virót Cóm A/H1N1 l­u hµnh réng r·i vµ chiÕm ­u thÕ ë nhiÒu quèc gia. Virót Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ ë Mü vµ l­u hµnh Ýt h¬n ë ch©u ¸ vµ §«ng ¢u. Virót Cóm B l­u hµnh ®ång thêi vµ cã nh÷ng vô bïng ph¸t ë mét vµi n­íc. ë phÝa Nam b¸n cÇu, ho¹t ®éng cña virót Cóm b¾t ®Çu vµo th¸ng 3 vµ t¨ng lªn trong th¸ng 4 ë B¾c Mü, trong khi ë ch©u Phi vµ ch©u §¹i D­¬ng, ho¹t ®éng b¾t ®Çu trong th¸ng 5 vµ t¨ng lªn ë th¸ng 6. Nh×n chung, ho¹t ®éng gi¶m xuèng trong th¸ng 8 ngo¹i trõ ë Australia, Braxin vµ New Zealand. ë ch©u Phi, virót Cóm A/H1N1 chiÕm ­u thÕ vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t. ë Nam Mü, virót Cóm A/H1N1 vµ virót Cóm B cïng l­u hµnh vµ liªn quan ®Õn nh÷ng vô dÞch. ë ch©u §¹i D­¬ng, cã b¸o c¸o vÒ nh÷ng vô bïng ph¸t do virót Cóm A/H3N2 vµ Cóm B cïng l­u hµnh g©y ra. Sau 3 n¨m nghiªn cøu vÒ dÞch tÔ bÖnh Cóm t¹i Hµ Néi, tõ n¨m 2001 ®Õn 2003, c¸c nhµ khoa häc ®· thu thËp tæng céng 4078 mÉu dÞch tôy hÇu (nasopharyngeal swab) tõ bÖnh nh©n èm gièng Cóm (ILI) tr­íc khi dÞch Cóm gia cÇm A/H5N1 bïng ph¸t (10). B»ng c¸ch ph©n lËp virót Cóm, ®· ph¸t hiÖn 119 mÉu (2,5%) d­¬ng tÝnh. Virót Cóm ®­îc ph¸t hiÖn thÊy ë hÇu hÕt c¸c th¸ng trong n¨m víi ®Ønh lµ vµo th¸ng 6 ®Õn th¸ng 8 trong suèt mïa m­a, mét ®Ønh kh¸c r¬i vµo th¸ng 12 ®Õn th¸ng 1 trong suèt mïa ®«ng ë Hµ Néi. Virót Cóm B chiÕm ­u thÕ trong n¨m 2001, tiÕp theo lµ Cóm A/H3N2 trong n¨m 2002, vµ trong n¨m 2003, c¶ 3 ph©n nhãm Cóm A/H3N2, A/H1N1 vµ B cïng l­u hµnh. Kh«ng cã tr­êng hîp nµo nhiÔm virót Cóm A/H5N1 trong c¸c mÉu bÖnh phÈm nµy. Theo kÕt qu¶ cña sù gi¸m s¸t c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm quèc gia thùc hiÖn bëi Bé Y tÕ ViÖt Nam, trong giai ®o¹n 2001-2003, trung b×nh sè tr­êng hîp m¾c bÖnh mçi n¨m trªn toµn quèc lµ 2054,2/100.000 d©n vµ lµ bÖnh ®­îc xÕp h¹ng cao nhÊt trong 24 bÖnh truyÒn nhiÔm. Mçi vïng cã tÝnh mïa vµ sè ca ILI kh¸c nhau. MiÒn B¾c cã 2725,8 ca/100.000 d©n mçi n¨m, vµ thÓ hiÖn tÝnh mïa víi ®Ønh cao tõ th¸ng 5 ®Õn th¸ng 9. Trung b×nh sè ca ILI cao nhÊt ë vïng nói T©y B¾c víi 3670,6 ca/100.000 d©n víi møc ®Ønh ë th¸ng 8 vµ th¸ng 9. MiÒn Trung vµ miÒn Nam kh«ng thÓ hiÖn tÝnh mïa râ rµng, vµ c¸c ca ILI còng thÊp h¬n c¸c vïng kh¸c. Còng nh­ nh÷ng b¸o c¸o tr­íc ®©y ë quèc gia nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi ë ch©u ¸ nh­ Th¸i Lan, Indonesia, Myanma, Singapo vµ mét phÇn miÒn nam cña Trung Quèc gåm c¶ §µi Loan (9, 19), nh÷ng kÕt qu¶ nµy chØ ra r»ng virót Cóm l­u hµnh trong c¶ n¨m ë Hµ Néi víi 2 ®Ønh cao, mét trong mïa m­a vµ mét trong mïa ®«ng l¹nh. Tuy nhiªn, th«ng tin tõ nh÷ng khu vùc nµy vÉn cßn h¹n chÕ, cã thÓ do thiÕu nh÷ng m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm quèc gia, ph­¬ng tiÖn vµ nh©n viªn cã ®ñ kü n¨ng trong c¸c phßng thÝ nghiÖm vµ nguån tµi chÝnh cÇn thiÕt (31). Theo c¸c b¸o c¸o cña WHO vµ c¸c trung t©m hîp t¸c vÒ sù ho¹t ®éng cña virót Cóm, nh÷ng týp/ph©n týp chiÕm ­u thÕ ë §«ng Nam ¸ vµ ch©u §¹i D­¬ng lµ sù trén lÉn cña A/H1N1, H3N2 vµ B trong suèt n¨m 2001 vµ 2002, ®Õn n¨m 2003 th× Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ (38-40). Trong nghiªn cøu nµy, nh÷ng týp/ph©n týp virót Cóm l­u hµnh ë Hµ Néi qua thêi gian 3 n¨m cã sù kh¸c nhau Ýt h¬n so víi ë c¸c khu vùc xung quanh ë ch©u ¸, song nh÷ng ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn lµ t­¬ng tù (38-41). KÕt qu¶ thu thËp ®­îc cho phÐp nhãm t¸c gi¶ kÕt luËn r»ng nh÷ng chñng virót ë Hµ Néi kh¸ phï hîp víi nh÷ng chñng v¾c xin toµn cÇu. Ph©n lo¹i C¸c virót Cóm thuéc hä Orthomyxoviridae, lµ nh÷ng chñng virót cã hÖ gen d¹ng sîi ®¬n ARN (-) gåm 8 ph©n ®o¹n lÇn l­ît m· hãa cho 8 lo¹i protein kh¸c nhau cña virót (Cóm A, B). Hä Orthomyxoviridae gåm 4 gièng: Virót Cóm A, virót Cóm B, virót Cóm C vµ Thogovirót. Virót Cóm B vµ C th­êng chØ g©y nhiÔm cho ng­êi trong khi phÇn lín virót Cóm A g©y nhiÔm trªn gia cÇm vµ chØ cã mét vµi ph©n týp g©y nhiÔm cho ng­êi vµ c¸c ®éng vËt kh¸c nh­ lîn, ngùa. Virót Cóm A, B vµ C kh¸c nhau vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña nucleocapsit vµ neuramidaza glycoprotein. Virót Cóm A ®­îc chia c¸c ph©n týp dùa trªn tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c ph©n tö HA vµ NA cña chóng. HiÖn nay, c¸c nhµ khoa häc ®· t×m ra 16 lo¹i HA (H1-H16) vµ 9 lo¹i NA (N1-N9). Gia cÇm thñy sinh lµ æ chøa tù nhiªn cña tÊt c¶ c¸c lo¹i virót Cóm. Chñng virót Cóm ®­îc ®Æt tªn theo nguån gèc ph©n lËp, vïng ®Þa lý ph©n lËp, sè chñng, n¨m ph©n lËp. Tõ n¨m 1983 ®Õn nay, kh«ng cã thªm ph©n týp míi nµo ®­îc ph¸t hiÖn, ®iÒu nµy cho thÊy cã mét sè giíi h¹n vÒ sù biÕn chñng cña virót Cóm A. H×nh th¸i vµ cÊu tróc cña virót Cóm Virót Cóm A vµ B cã cÊu tróc gièng nhau trong khi virót Cóm C cã cÊu tróc kh¸c biÖt víi c¸c gai glycoprotein s¾p xÕp theo h×nh 6 c¹nh. Virót Cóm A vµ B nu«i cÊy trªn tÕ bµo hoÆc trøng cã h×nh d¹ng th«ng th­êng ®­êng kÝnh 80-120nm. Ng­îc l¹i, virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ ®éng vËt sau ®ã ®­îc cÊy truyÒn mét lÇn trªn tÕ bµo th­êng cã h×nh th¸i kh¸c biÖt vµ ®a d¹ng. H×nh th¸i virót Cóm A lµ mét kiÓu gen riªng biÖt nh­ng phô thuéc rÊt nhiÒu vµo lo¹i tÕ bµo chñ khi virót nh©n lªn. §Æc ®iÓm h×nh th¸i næi bËt cña virót Cóm A lµ líp bao gåm 500 gai (10-14nm) xße ra phÝa ngoµi líp lipit. Cã 2 lo¹i gai kh¸c nhau: gai h×nh gËy lµ kh¸ng nguyªn HA vµ gai h×nh nÊm lµ kh¸ng nguyªn NA. Tû lÖ HA:NA th­êng dao ®éng nh­ng th«ng th­êng tõ 4:1 ®Õn 5:1. Protein matrix M1 ®­îc cho lµ n»m d­íi líp lipit kÐp vµ liªn kÕt víi Ribonucleoprotein (RNP) lâi cña virót. M1 lµ protein cã nhiÒu nhÊt trong virion. H×nh 2. Virion cña virót Cóm A vµ c¸c protein. Nguån: www.influenzareport.com B»ng ph­¬ng ph¸p c¾t líp máng tiªu b¶n cã c¸c h¹t virót hoÆc ph¸ vì h¹t, cÊu tróc RNP cã thÓ ®­îc chia thµnh nhiÒu líp cã kÝch th­íc kh¸c nhau vµ chøa 8 ®o¹n gen cña ARN ®¬n. C¸c RNP cã chøa 4 lo¹i protein vµ ARN. NP lµ protein tiÓu ®¬n vÞ næi tréi cña nucleocapsit vµ bao quanh ARN, cã kho¶ng 20 nucleotit trong 1 tiÓu ®¬n vÞ NP. Liªn kÕt víi RNP lµ phøc hîp ARN polymeraza phô thuéc - ARN bao gåm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA vµ chØ cã mÆt tõ 20-30 b¶n sao trong mét virion. Thµnh phÇn cña c¸c virót trong hä Orthomyxoviridae bao gåm 1% ARN, 70% protein, 20% lipit vµ 5 ®Õn 8% carbonhydrat. Axit nucleic vµ protein Virót Cóm chøa 7 ®Õn 8 ®o¹n ARN sîi ®¬n, ©m. Tæng chiÒu dµi genom lµ 12000-15000 nucleotit, ®o¹n lín nhÊt dµi 2300-2500 nucleotit, nhá nhÊt lµ 800-900 nucleotit. Tr×nh tù genome cã c¸c tr×nh tù lÆp tËn cïng, ë c¶ hai ®Çu. C¸c tr×nh tù lÆp ë ®Çu 5’ dµi 12-13 nucleotit. Tr×nh tù nucleotit cña ®Çu 3’ gièng hÖt ®Çu 5’ ë hÇu hÕt c¸c ®o¹n ARN vµ nh­ nhau trong cïng mét gièng cña cïng mét hä. Nh÷ng tr×nh tù lÆp l¹i dµi 9-11 nucleotit. Lipit Líp mµng lipit cña virót Cóm ®­îc t¹o thµnh tõ mµng bµo t­¬ng cña tÕ bµo chñ n¬i virót nh©n lªn. ¶nh h­ëng cña c¸c t¸c nh©n vËt lý vµ hãa häc Virót Cóm gia cÇm vÉn cã thÓ tån t¹i trong n­íc cÊt h¬n 102 ngµy ë 28OC vµ 207 ngµy ë 17OC vµ thêi gian tån t¹i cña virót ë 4OC ®­îc ­íc l­îng lµ h¬n 1300 ngµy (32). Nghiªn cøu kh¸c ®· chøng minh r»ng ph©n týp cña virót Cóm gia cÇm H7N3 trong n­íc peptone (pH 7.0) vÉn gi÷ ®­îc kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña nã khi ñ ë 4, 30 vµ 37OC trong 35 ngµy. Kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña virót vÉn tån t¹i sau khi chÞu t¸c ®éng cña nhiÖt ®é 56OC trong 30 phót nh­ng sÏ mÊt kh¶ n¨ng nµy sau khi chÞu t¸c ®éng ë 56OC trong vßng 60 phót. Virót cã thÓ gi÷ ë nhiÖt ®é d­íi -50OC trong vßng nhiÒu n¨m. Othomyxoviridae ®­îc xem lµ rÊt dÔ bÞ ¶nh h­ëng bëi ®é pH trong acid. §é pH thÊp t¹o ra sù thÝch nghi vµ sù thay ®æi kh¸ng nguyªn trong protein HA, cho phÐp liªn kÕt víi mµng cña c¸c tÕ bµo ký sinh. ë pH 2, nhiÖt ®é 56OC vµ trong dung dÞch 70% etanol hoÆc mét chÊt tÈy ®Æc hiÖu, ho¹t tÝnh cña virót Cóm bÞ bÊt ho¹t trong thêi gian d­íi 30 phót (20). C¸c lo¹i kh¸ng nguyªn HA Tªn gäi cña protein HA (hemagglutinin) xuÊt ph¸t tõ kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu cña virót b»ng c¸ch g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic. HA cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sao chÐp virót. §Çu tiªn HA g¾n víi thô thÓ cã chøa axit sialic trªn bÒ mÆt tÕ bµo vµ t¹o thµnh sù g¾n kÕt gi÷a virót vµ tÕ bµo. TiÕp ®ã HA chÞu tr¸ch nhiÖm cho sù x©m nhËp cña virót vµo tÕ bµo b»ng c¸ch gi¸n tiÕp t¹o nªn sù hßa mµng endocytosed cña virót vµ mµng néi bµo lµm cho nucleocapsit virót gi¶i phãng vµo trong bµo t­¬ng. HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh cña virót Cóm, bao gåm c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµ A, B (mang vÞ trÝ g¾n thô thÓ), C, D vµ E. C¸c vÞ trÝ nµy n»m ë phÇn ®Çu ph©n tö HA, trong khi phÇn cuèi ®­îc g¾n vµo trong líp lipid. Khi bÞ nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ ®¸p øng miÔn dÞch víi kh¸ng nguyªn HA b»ng c¸ch sinh ra c¸c kh¸ng thÓ trung hßa. Nh÷ng thay ®æi ë c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµm gi¶m hay øc chÕ sù g¾n kÕt cña c¸c kh¸ng thÓ trung hßa, do ®ã cho phÐp mét ph©n týp míi lan réng trong quÇn thÓ kh«ng cã kh¶ n¨ng miÔn dÞch. HiÖn t­îng nµy gäi lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm (antigenic drift). §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh (antigenic shift) xuÊt hiÖn khi HA bÞ thay ®æi trong mét virót, ch¼ng h¹n H1 thay thÕ bëi H5 dÉn tíi sù h×nh thµnh mét chñng virót Cóm míi. §iÒu nµy cã thÓ x¶y ra khi mét tÕ bµo nhiÔm bëi 2 chñng virót Cóm kh¸c nhau vµ trao ®æi c¸c ®o¹n genome cña chóng trong qu¸ tr×nh nh©n lªn. Nh­ vËy HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh t¹o nªn kh¸ng thÓ trung hßa vµ c¸c vô dÞch Cóm ®Òu liªn quan ®Õn thay ®æi cÊu tróc kh¸ng nguyªn. NP NP lµ protein cÊu tróc chÝnh phèi hîp víi c¸c ®o¹n ARN t¹o thµnh RNP. NP cßn lµ kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu týp, kh¸c nhau gi÷a virót Cóm A, B vµ C. MÆc dï lµ mét protein ®Æc hiÖu týp nh­ng NP cña virót Cóm A vÉn biÓu hiÖn sù biÕn ®æi kh¸ng nguyªn. NP cã Ýt nhÊt 3 vïng liªn kÕt kh¸ng thÓ kh«ng chång lªn nhau, mét trong sè nµy cã tÝnh b¶o thñ cao. Kh¸ng thÓ ®¬n dßng g¾n vµo vÞ trÝ nµy g©y øc chÕ phiªn m· ARN virót trong phßng thÝ nghiÖm. NP cã mét vµi quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tÕ bµo T ®­îc b¶o tån trong sè c¸c virót Cóm A ë ng­êi. NA NA lµ glycoprotein thø hai ®Æc hiÖu cho ph©n týp cña virót Cóm A, B. NA do ®o¹n gen ARN thø 6 m· hãa vµ lµ mét homotetramer. NA quan träng do ho¹t tÝnh sinh häc lo¹i bá axit sialic tõ glycoprotein. NA cã thÓ cho phÐp vËn chuyÓn virót qua mµng mucin ë trªn ®­êng h« hÊp, gióp hç trî virót tÊn c«ng tÕ bµo biÓu m« ®Ých. NA cña virót Cóm A cã 4 vÞ trÝ kh¸ng nguyªn, mçi vÞ trÝ bao gåm nhiÒu quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn (epitop). Nh÷ng cÊu tróc kh¸ng nguyªn cña N9 NA ®­îc nghiªn cøu nhiÒu nhÊt. Ph©n tÝch cÊu tróc cña phøc hîp N9 NA tõ chñng A/tern/Australia/G75 víi m¶nh Fab cña kh¸ng thÓ ®¬n dßng NC41 (34) cho thÊy r»ng kh¸ng thÓ tiÕp xóc NA qua mét bÒ mÆt cã diÖn tÝch 900Ǻ2, bao gåm 19 axit amin n»m trªn 5 vßng polypeptit bao quanh vÞ trÝ ho¹t ®éng cña enzym. Trong sè nµy, chØ cã mét vµi axit amin cung cÊp nh÷ng ®iÓm tiÕp xóc quyÕt ®Þnh cÇn cho sù nhËn diÖn cña kh¸ng thÓ (24). Trong sù l©y nhiÔm tù nhiªn, miÔn dÞch ®èi víi NA chØ cã vai trß kh«ng ®¸ng kÓ b¶o vÖ con ng­êi khái nhiÔm Cóm. Cã thÓ lÊy vÝ dô minh häa tõ ®¹i dÞch 1968, khi ®ã t¸c nh©n g©y bÖnh cã NA tõ mét virót Cóm ng­êi l­u hµnh tr­íc ®ã, sù miÔn dÞch ®èi víi NA ®· kh«ng thÓ ng¨n con ng­êi khái ®¹i dÞch Cóm. Ngoµi c¸c kh¸ng nguyªn chñ yÕu trªn, virót Cóm cßn cã c¸c kh¸ng nguyªn protein polymeraza (PB1, PB2, PA), M1, M2, NS1 vµ NS2 ®­îc nhËn diÖn bëi c¸c tÕ bµo T trong c¬ thÓ ng­êi nhiÔm virót Cóm. Sù t¸i tæ hîp cña virót Cóm Virót Cóm A, B, C cã thÓ t¸i tæ hîp trong tù nhiªn gi÷a c¸c thµnh viªn cïng týp nh­ng kh«ng x¶y ra gi÷a c¸c týp kh¸c nhau. Sù xuÊt hiÖn cña chñng ®¹i dÞch lµ hËu qu¶ cña viÖc t¸i tæ hîp t¹o ra chñng ph©n týp míi cã NA hoÆc HA kh¸c h¼n víi chñng l­u hµnh tr­íc ®ã. Virót Cóm B kh¸c víi virót Cóm A lµ kh«ng cã æ chøa ®éng vËt. MÆc dï virót Cóm B nguyªn thñy thÝch øng trªn ng­êi dÔ dµng h¬n virót Cóm A nh­ng tû lÖ ®ét biÕn vµ thay ®æi chØ b»ng mét nöa virót Cóm A (43). Cã nhiÒu b»ng chóng cho r»ng virót Cóm trong loµi thñy cÇm l©y truyÒn cho lîn, ngùa, gia cÇm vµ ®éng vËt cã vó ë biÓn; g©y nªn nh÷ng vô dÞch nghiªm träng (36). Virót Cóm gia cÇm kh«ng lan truyÒn trªn quÇn thÓ ng­êi vµ ng­îc l¹i, virót cña ng­êi kh«ng l©y truyÒn sang quÇn thÓ chim, ®iÒu nµy cho thÊy hµng rµo gi÷a chim vµ ng­êi rÊt chÆt chÏ. Tuy nhiªn, nhiÒu b»ng chøng cho thÊy loµi lîn cã thÓ c¶m nhiÔm dÔ dµng víi c¶ hai lo¹i virót Cóm ng­êi hoÆc gia cÇm (12) vµ hµng rµo loµi gi÷a lîn vµ gia cÇm hoÆc gi÷a lîn vµ ng­êi láng lÎo h¬n nhiÒu, v× vËy lîn cã thÓ ®ãng vai trß nh­ lµ vËt chñ trung gian ®Ó t¹o ra gièng virót Cóm míi trªn ng­êi (6). Virót Cóm H3N2 ®· ®­îc ph©n lËp trªn lîn ë kh¾p thÕ giíi. Nh÷ng virót nµy cã ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn vµ gen gièng nh­ nh÷ng chñng ®· l­u hµnh trªn ng­êi tr­íc khi ph©n lËp ë lîn (23). Sù t¸i tæ hîp cña ®o¹n ARN virót trong khi nhiÔm trïng kÐp víi hai chñng Cóm ng­êi vµ gia cÇm lµ c¬ chÕ ®Ó t¹o ra chñng míi. QuÇn thÓ ng­êi kh«ng cã kh¸ng thÓ trung hßa víi kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót míi t¹o ra do ®ã kh«ng ®­îc b¶o vÖ. Virót míi cã thÓ lan truyÒn dÔ dµng g©y ra ®¹i dÞch. §¸p øng miÔn dÞch víi virót Cóm H×nh 3. §¸p øng miÔn dÞch thÓ dÞch vµ qua trung gian tÕ bµo khi nhiÔm virót Cóm. Nguån: www.influenzareport.com Nh¸nh thÓ dÞch cña hÖ thèng miÔn dÞch bao gåm c¸c tÕ bµo lympho B (tr¸i), sau khi t­¬ng t¸c víi virót Cóm sÏ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt kh¸ng thÓ. §¸p øng qua trung gian tÕ bµo (ph¶i) b¾t ®Çu víi tr×nh diÖn KN th«ng qua c¸c ph©n tö MHC I (mµu ®en) vµ II (mµu xanh) bëi c¸c tÕ bµo tua, lµ tÕ bµo sau ®ã sÏ dÉn tíi sù ho¹t ho¸, t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ c¸c tÕ bµo T ®Æc hiÖu kh¸ng nguyªn (CD4 hoÆc CD8). Nh÷ng tÕ bµo nµy cã chøc n¨ng gióp tÕ bµo xö lý (effector cell) qua phãng thÝch trùc tiÕp c¸c cytokin hoÆc trung gian tÝnh ®éc tÕ bµo sau khi ®· nhËn diÖn kh¸ng nguyªn. §¸p øng miÔn dÞch dÞch thÓ C¸c kh¸ng thÓ ®­îc c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt, n»m trong giai ®o¹n cuèi cïng cña sù ph¸t sinh tÕ bµo B, ®ßi hái tÕ bµo B ph¶i nhËn diÖn ®­îc kh¸ng nguyªn vµ ®­îc tÕ bµo T CD4 vµ c¸c cytokin ph¸t sinh tõ tÕ bµo T. Kh«ng gièng nh­ tÕ bµo T, tÕ bµo B cã thÓ nhËn ra kh¸ng nguyªn d­íi d¹ng tù nhiªn cña chóng. TÝnh ®Æc hiÖu cña kh¸ng nguyªn lµ do sù t¸i s¾p xÕp ngÉu nhiªn c¸c gen m· ho¸ cho vïng siªu biÕn cña c¸c Ig trong tÕ bµo khi tÕ bµo cßn n»m trong tuû x­¬ng. C¸c tÕ bµo B non (naive B cell) sau ®ã ®i vµo hÖ tuÇn hoµn råi theo m¸u vµ h¹ch b¹ch huyÕt ®Õn c¸c m« vµ c¬ quan lymph«. T¹i c¸c h¹ch lymph«, tÕ bµo B non sÏ nhËn diÖn kh¸ng nguyªn, sau ®ã tÕ bµo B ®­îc ho¹t ho¸, chuyÓn s¶n xuÊt tõ Ig M sang IgG, lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu vµ ¸i lùc cña globuline miÔn dÞch vµ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma hoÆc tÕ bµo B nhí khi tÕ bµo tiÕp tôc ph©n chia d­íi sù hiÖn diÖn cña c¸c cytokin. Trong lóc Ig A ®­îc vËn chuyÓn xuyªn qua líp biÓu m« cña ®­êng h« hÊp trªn, lµ n¬i IgA sÏ trung hoµ vµ lo¹i trõ virót g©y nhiÔm, th× IgG chñ yÕu chØ cã vai trß b¶o vÖ ®­êng h« hÊp d­íi. Khi nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ sÏ t¹o ra c¸c kh¸ng thÓ ®èi víi c¶ 2 glycoprotein HA vµ NA, còng nh­ protein M vµ NP. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao nhÊt vµo gi÷a tuÇn thø 4-7 sau khi nhiÔm, vµ sau ®ã gi¶m dÇn. Kh¸ng thÓ vÉn cßn cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc nhiÒu n¨m sau ®ã dï kh«ng bÞ t¸i ph¬i nhiÔm. C¸c hiÖu gi¸ øc chÕ HA huyÕt thanh tõ 1/40 trë lªn, hoÆc hiÖu gi¸ trung hoµ huyÕt thanh tõ 1/8 trë lªn ®­îc coi nh­ cã kh¶ n¨ng b¶o vÖ. ë ng­êi giµ, ®Ó ®­îc b¶o vÖ hoµn toµn, cÇn ph¶i cã møc kh¸ng thÓ cao h¬n. Ng­îc l¹i víi kh¸ng thÓ kh¸ng HA, kh¸ng thÓ kh¸ng NA kh«ng trung hoµ ®­îc tÝnh g©y nhiÔm cña virót, nh­ng thay vµo ®ã kh¸ng thÓ nµy sÏ ng¨n kh«ng cho c¸c tÕ bµo bÞ nhiÔm phãng thÝch virót ra ngoµi. §ã lµ do t¸c dông ph©n c¾t acid sialic cña NA n»m trªn thô thÓ tÕ bµo. Kh¸ng thÓ kh¸ng NA cã thÓ b¶o vÖ c¬ thÓ khái tr¸nh nhiÔm bÖnh vµ lµm gi¶m sù th¶i tiÕt virót còng nh­ møc ®é trÇm träng cña c¸c triÖu chøng. §¸p øng miÔn dÞch mµng niªm chèng l¹i virót Cóm, c¨n cø theo l­îng dÞch tiÕt ë mòi, cã sù hiÖn diÖn cña IgA vµ IgG1 chèng l¹i HA. C¸c nghiªn cøu cho thÊy r»ng sù ®Ò kh¸ng t¸i nhiÔm chñ yÕu ®­îc trung gian qua IgA, mÆc dï IgG còng cã phÇn liªn quan. Trong miÔn dÞch, kh¸ng thÓ t¸c ®éng chèng l¹i virót Cóm b»ng c¸ch trung hoµ virót hoÆc ly gi¶i tÕ bµo bÞ nhiÔm th«ng qua bæ thÓ hoÆc tÝnh ®éc tÕ bµo phô thuéc vµo kh¸ng thÓ. §¸p øng miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo Ng­êi ta ®· chøng minh c¸c tÕ bµo tua ®ãng vai trß trung t©m trong viÖc khëi ®Çu vµ thóc ®Èy c¸c ®¸p øng tÕ bµo T. §©y lµ nhãm b¹ch cÇu ph¸t sinh tõ tuû x­¬ng, di ®éng, ph©n bè th­a thít, chuyªn tr¸ch viÖc thu nhËn, vËn chuyÓn, xö lý vµ tr×nh diÖn kh¸ng nguyªn cho tÕ bµo T. Khu«n mÉu c¬ b¶n cho lo¹i tÕ bµo nµy lµ c¸c tÕ bµo tua n»m ë phæi b¾t gi÷ kh¸ng nguyªn tõ t¸c nh©n g©y bÖnh bªn ngoµi x©m nhËp vµo, ho¹t ho¸ vµ sau ®ã tËp trung vÒ c¸c h¹ch lymph«. Kh¸ng nguyªn sau ®ã ®uîc xö lý vµ g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo tua d­íi d¹ng c¸c peptit, c¸c peptit nµy ®­îc c¸c ph©n tö MHC. T¹i c¸c h¹ch lymph«, c¸c tÕ bµo tua lóc nµy sÏ khëi ®éng mét ®¸p øng miÔn dÞch bëi bÊt cø tÕ bµo T nµo cã thô thÓ ®Æc hiÖu cho phøc hîp MHC n»m trªn bÒ mÆt tÕ bµo tua. C¸c tÕ bµo T võa míi ®­îc kÝch ho¹t sÏ di chuyÓn tíi vÞ trÝ bÞ nhiÔm virót n»m ë phæi, n¬i mµ c¸c tÕ bµo nµy sÏ lµm trung gian cho c¸c ho¹t ®éng chèng virót. §¸p øng tÕ bµo T ë ng­êi ®¹t ®Õn ®Ønh vµo kho¶ng ngµy 14 sau khi nhiÔm vµ ë ng­êi lín, l­îng tÕ bµo T ®éc ®Æc tr­ng cho virót Cóm t­¬ng øng víi møc ®é sao chÐp cña virót gi¶m dÇn qua thêi gian. C¸c tÕ bµo T nhí CD8 nhí cã thÓ ®ãng vai trß lµm gi¶m nhÑ møc ®é trÇm träng cña bÖnh vµ lµm cho sù håi phôc nhanh h¬n khi bÞ nhiÔm l¹i. §iÒu quan träng lµ, nh÷ng tÕ bµo nµy cã kh¶ n¨ng ®¸p øng l¹i c¸c tÝn hiÖu ®Çu tiªn khi bÞ nhiÔm víi l­îng virót x©m nhËp ë møc rÊt thÊp. Trong khi kh«ng thÓ t¨ng sinh ®Ó ®¸p øng víi t×nh tr¹ng nhiÔm trïng, c¸c tÕ bµo nµy cã thÓ s¶n xuÊt ra c¸c cytokin ®Ó lµm k×m h·m kh«ng cho virót sao chÐp vµ lan réng trªn biÓu m«. Giai ®o¹n 2 cña ®¸p øng qua trung gian tÕ bµo T nhí lµ c¸c tÕ bµo nµy tËp trung nhanh chãng ë ®­êng h« hÊp trong mét vµi ngµy ®Çu tiªn cña ®¸p øng. Giai ®o¹n 3 lµ sù më réng c¸c tÕ bµo T nhí d­íi t¸c ®éng cña kh¸ng nguyªn x¶y ra ë c¸c c¬ quan lymph« thø cÊp. Sù nh©n lªn cña virót Cóm Virót Cóm còng gièng nh­ c¸c virót kh¸c, nã b¾t buéc ph¶i nh©n lªn trong tÕ bµo c¶m thô. Trong c¬ thÓ sèng, virót Cóm g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo biÓu m« trong phæi vµ cæ häng, tuy nhiªn trong nu«i cÊy tÕ bµo virót Cóm g©y nhiÔm vµ nh©n lªn kh«ng ph¶i lµ tÕ bµo biÓu m«. Sù l©y nhiÔm virót Cóm b¾t ®Çu khi HA virót g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic trªn tÕ bµo chñ (b­íc 1). Ng­êi ta thÊy r»ng nh÷ng virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ lîn ­u tiªn g¾n víi vÞ trÝ SA-α2,6-Gal, trong khi ®ã nh÷ng virót ph©n lËp tõ chim vµ ngùa l¹i g¾n tèt h¬n vµo vÞ trÝ SA-α2,3-Gal (2, 5). Sù g¾n ®Æc hiÖu cña HA lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quyÕt ®Þnh ®Õn qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo vËt chñ cña virót (16, 18). §Ó virót cã thÓ x©m nhËp ®­îc vµo tÕ bµo, HAO ph¶i ®­îc ph©n c¾t bëi mét serine proteinaza nh­ trypsin ë mét vÞ trÞ ®Æc hiÖu, ®­îc m· hãa bëi mét axit amin ®¬n c¬ b¶n (th­êng lµ arginin), t¹o thµnh hai tiÓu ®¬n vÞ HA1 (khèi l­îng ph©n tö 36 kDa) vµ HA2 (khèi l­îng ph©n tö 27 kDa) g¾n víi nhau b»ng liªn kÕt céng hãa trÞ bëi cÇu disulfide. Sù ph©n c¾t HA lµ ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cho sù l©y nhiÔm cña virót nh»m ®Ó lé ra ®Çu amin kþ n­íc cña HA2 lµm trung gian cho sù hßa mµng cña vá ngoµi virót vµ mµng néi bµo (37). Virót ®i vµo tÕ bµo b»ng c¬ chÕ nhËp bµo. Trong thÓ néi bµo cã tÝnh axit, mét phÇn protein HA hßa tan mµng virót víi mµng kh«ng bµo, gi¶i phãng c¸c ph©n tö vARN, c¸c protein phô vµ enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµo tÕ bµo chÊt (b­íc 2). Nh÷ng protein nµy vµ vARN t¹o thµnh mét phøc hîp ®­îc vËn chuyÓn vµo nh©n tÕ bµo, n¬i enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN b¾t ®Çu phiªn m· sîi vARN d­¬ng bæ sung (b­íc 3a vµ 3b). vARN hoÆc ®­îc vËn chuyÓn vµo trong tÕ bµo chÊt vµ dÞch m· (b­íc 4), hoÆc vÉn ë l¹i trong nh©n. C¸c protein virót míi ®­îc tæng hîp hoÆc ®­îc ®­a ra bÒ mÆt tÕ bµo th«ng qua bé m¸y Golgi (trong tr­êng hîp cña HA vµ NA, b­íc 5b) hoÆc vËn chuyÓn trë l¹i vµo trong nh©n ®Ó g¾n víi vARN vµ t¹o thµnh nh÷ng h¹t genome cña virót míi. C¸c protein kh¸c cña virót thùc hiÖn nhiÒu c«ng viÖc trong tÕ bµo chñ, bao gåm ph©n hñy mARN cña tÕ bµo vµ sö dông c¸c nucleotit ®­îc gi¶i phãng ®Ó tæng hîp vARN vµ øc chÕ dÞch m· mARN cña tÕ bµo chñ. vARN ©m t¹o nªn genome cña virót t­¬ng lai, cïng víi enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµ c¸c protein kh¸c cña virót ®­îc l¾p r¸p vµo trong mét virion. C¸c ph©n tö HA vµ NA tËp hîp l¹i thµnh mét chç låi ra trong mµng tÕ bµo. vARN vµ c¸c protein virót chñ yÕu rêi nh©n vµ ®i vµo trong phÇn nh« lªn nµy cña mµng (b­íc 6). Virót tr­ëng thµnh n¶y chåi ra khái tÕ bµo trong mét khèi cÇu cña mµng photpholipit, cã c¸c ph©n tö HA vµ NA trªn líp ¸o mµng nµy (b­íc 7). Sau khi gi¶i phãng virót Cóm míi, tÕ bµo chñ sÏ chÕt ®i. H×nh 4. Chu tr×nh nh©n lªn cña virót Cóm. Nguån: en.wikipedia.org Sù ph¸t triÓn cña virót trªn tÕ bµo Virót cóm ®Çu tiªn ®­îc nu«i trªn trøng gµ cã ph«i. Sau nµy, c¸c virót cóm cã thÓ ®­îc nu«i cÊy trªn trøng gµ cã ph«i hoÆc trong mét sè hÖ nu«i cÊy tÕ bµo tiªn ph¸t. ViÖc nu«i cÊy virót trªn trøng gµ cã ph«i vÉn ®­îc lùa chän lµm quy tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin cóm trªn thÕ giíi. HiÖn nay, c¸c hÖ nu«i cÊy tÕ bµo nh­ thËn khØ tiªn ph¸t hay thËn chã th­êng dïng ®Ó ph©n lËp virót cóm tõ mÉu bÖnh phÈm cña ng­êi. Sù ph¸t triÓn cña virót trªn nu«i cÊy tÕ bµo g©y ra sù hñy ho¹i tÕ bµo vµ t¹o ra c¸c ®¸m ho¹i tö trong mét sè dßng tÕ bµo nh­ tÕ bµo thËn khØ, thËn bª, thËn chuét ®ång, thËn gµ. Ngoµi ra nÕu sö dông c¸c dßng tÕ bµo th­êng trùc th× trypsin ph¶i ®­îc bæ sung ®Ó ho¹t hãa c¸c ph©n tö protein HA trong qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo tÕ bµo chñ cña virót. Sinh bÖnh häc C¸c nghiªn cøu ®· ®­a ra nh÷ng b»ng chøng chøng minh r»ng sinh bÖnh häc cña virót Cóm lµ tÝnh tr¹ng ®a gen. §iÒu nµy cã nghÜa lµ s¶n phÈm cña tÊt c¶ c¸c gen cña virót ®Òu tham gia vµo qu¸ tr×nh nhËn d¹ng tÕ bµo vËt chñ vµ g©y ®éc tÝnh trong qu¸ tr×nh x©m nhËp ph¸ vì tÕ bµo. Trong ®ã gen HA ®ãng vai trß trung t©m vÒ tÝnh ®éc cña virót gåm 2 ph©n týp H5, H7, cã ®éc tÝnh m¹nh nªn g©y tû lÖ chÕt cao. Protein HA cña c¸c virót nµy kh¸c c¸c HA cña c¸c ph©n nhãm kh¸c lµ cã mét tr×nh tù nhiÒu axit amin ë ®Çu carboxyl cña HA1. §iÒu nµy cho phÐp c¸c enzyme proteaza cña tÕ bµo nhËn biÕt tr×nh tù ®ã ®Ó c¾t HA thµnh HA1 vµ HA2, lµ giai ®o¹n cÇn thiÕt cho virót x©m nhËp tÕ bµo vµ ph¸t triÓn lan ra. §©y còng lµ c¬ së gi¶i thÝch tÝnh g©y ®éc cña virót Cóm ë ng­êi. DÞch tÔ häc Sù l©y truyÒn vµ sù thay ®æi theo mïa BÖnh Cóm chñ yÕu ®­îc l©y truyÒn tõ ng­êi sang ng­êi qua nh÷ng h¹t nhá (®­êng kÝnh > 5 µm) tõ mòi vµ häng khi ng­êi bÞ nhiÔm khi ho vµ h¾t h¬i. C¸c sol khÝ nµy kh«ng l¬ löng trong kh«ng khÝ vµ cÇn ph¶i cã tiÕp xóc gÇn ®Ó cã thÓ lan truyÒn ®­îc (tõ 1-2 mÐt). Sù l©y truyÒn còng cã thÓ x¶y ra qua tiÕp xóc ngoµi da trùc tiÕp hoÆc tiÕp xóc gi¸n tiÕp víi dÞch tiÕt h« hÊp (tay ch¹m vµo c¸c bÒ mÆt bÞ nhiÔm sau ®ã sê lªn m¾t, mòi hoÆc miÖng). Ng­êi nhiÔm Cóm cã thÓ ph¸t t¸n virót tõ 2 ngµy tr­íc ®Õn 5 ngµy sau khi cã triÖu chøng. TrÎ em cã thÓ l©y lan virót ®Õn 10 ngµy hoÆc l©u h¬n. BÖnh Cóm l©y lan m¹nh nhÊt vµo mïa ®«ng vµ bëi phÝa B¾c vµ Nam b¸n cÇu cã mïa ®«ng ë nh÷ng thêi ®iÓm kh¸c nhau trong n¨m nªn trong thùc tÕ cã hai mïa Cóm kh¸c nhau mçi n¨m. §iÒu nµy gi¶i thÝch t¹i sao WHO ®­a ra nh÷ng khuyÕn c¸o ®èi víi s¶n xuÊt hai lo¹i v¾c xin kh¸c nhau mçi n¨m, mét cho phÝa B¾c, vµ mét cho phÝa Nam b¸n cÇu. Cã nhiÒu lý do ®Ó gi¶i thÝch t¹i sao bÖnh Cóm th­êng bïng ph¸t vµo mïa ®«ng nh­ ®é Èm vµ nhiÖt ®é t­¬ng ®èi thÊp gióp virót Cóm cã thÓ sèng l©u h¬n, mäi ng­êi th­êng xuyªn ë trong nhµ dÉn ®Õn sù tiÕp xóc gÇn gòi h¬n t¹o ®iÒu kiÖn virót l©y lan. Mét gi¶ thiÕt kh¸c lµ do l­îng vitamin D trong c¬ thÓ xuèng thÊp trong mïa l¹nh còng lµm cho con ng­êi dÔ m¾c Cóm h¬n. Tuy nhiªn, nh÷ng thay ®æi theo mïa trong c­êng ®é l©y nhiÔm virót Cóm còng x¶y ra ë nh÷ng vïng nhiÖt ®íi, sù l©y lan cao nhÊt chñ yÕu diÔn ra trong suèt mïa m­a. DÞch vµ ®¹i dÞch Mçi n¨m, c¸c vô dÞch Cóm g©y ra 3-5 triÖu ca bÖnh vµ tõ 300.000-500.000 tö vong trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Nh÷ng virót Cóm míi lu«n lu«n ®­îc sinh ra do ®ét biÕn hay t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn. Nh÷ng ®ét biÕn cã thÓ g©y ra nh÷ng thay ®æi nhá trong c¸c kh¸ng nguyªn HA vµ NA trªn bÒ mÆt virót. §ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm, t¹o ra nhiÒu chñng Cóm qua thêi gian cho tíi khi mét trong nh÷ng biÕn thÓ ®¹t tíi sù thÝch øng cao h¬n vµ l©y lan nhanh chãng trong céng ®ång, g©y ra bÖnh dÞch. Ng­îc l¹i, khi c¸c virót Cóm ®­îc sinh ra cã nh÷ng kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn, ch¼ng h¹n sù t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn gi÷a c¸c chñng Cóm gia cÇm vµ c¸c chñng Cóm ng­êi; ®ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh. NÕu mét chñng virót Cóm ng­êi cã c¸c kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn xuÊt hiÖn, tÊt c¶ mäi ng­êi sÏ bÞ c¶m nhiÔm vµ virót Cóm míi sÏ lan trµn kh«ng thÓ kiÓm so¸t, g©y ra ®¹i dÞch. Ng­îc l¹i víi vô dÞch, ®¹i dÞch lµ nh÷ng biÕn cè Ýt gÆp, x¶y ra cø mçi 10 hoÆc 50 n¨m. Nh÷ng ®¹i dÞch ®· ®­îc ghi nhËn tõ thÕ kû thø 16, vµ trong vßng 400 n¨m trë l¹i ®©y, ®· cã 3 ®¹i dÞch Cóm x¶y ra (b¶ng1). ThiÖt h¹i vÒ ng­êi cña c¸c ®¹i dÞch nµy thay ®æi tõ møc tµn ph¸ sang võa hoÆc nhÑ. B¶ng 1. §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh vµ c¸c ®¹i dÞch (11, 25) N¨m Tªn chñng virót Møc ®é Sè ng­êi chÕt 1889 H3N2 Võa ph¶i 1 triÖu 1918 H1N1 ("Spanish") Nghiªm träng 40 - 100 triÖu 1957 H2N2 ("Asian") Võa ph¶i 1 - 1,5 triÖu 1968 H3N2("Hong kong") NhÑ 0,75 - 1 triÖu ? C¸c ®¹i dÞch Cóm lu©n chuyÓn trªn toµn cÇu theo nhiÒu ®ît kÕ tiÕp nhau, vµ kh«ng cã c¸ch nµo ®Ó ng¨n ngõa sù lan réng cña mét virót g©y ®¹i dÞch Cóm míi. Mét ®Æc ®iÓm cña Cóm trong ®¹i dÞch lµ sè tö vong chuyÓn sang nhãm tuæi trÎ h¬n. Mét nöa sè tö vong cã liªn quan ®Õn Cóm trong ®¹i dÞch 1968 vµ phÇn lín nh÷ng ca tö vong liªn quan ®Õn Cóm trong c¸c ®¹i dÞch 1957 vµ 1918, ®Òu x¶y ra ë ng­êi < 65 tuæi. Kinh nghiÖm trong qu¸ khø chØ ra r»ng kh«ng cã quy t¾c chung cho c¸c ®¹i dÞch vµ còng kh«ng cã c¬ së tin cËy nµo ®Ó dù ®o¸n thêi gian vµ n¬i ®¹i dÞch cã thÓ xuÊt hiÖn. Trong suèt thÕ kû 20, c¸c ®¹i dÞch x¶y ra ë nh÷ng kho¶ng thêi gian t­¬ng ®èi dµi vµ kh«ng thÓ dù ®o¸n tr­íc ®­îc, tõ 9 ®Õn 39 n¨m trong suèt c¸c ®¹i dÞch 1918 (H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) vµ 1977 víi quy m« nhá h¬n. Trong n¨m 1957, virót H2N2 ®· thay thÕ hoµn toµn virót H1N1 tr­íc ®ã, vµ trong n¨m 1968, H3N2 thay thÕ H2N2. Sù t¸i xuÊt hiÖn cña H1N1 n¨m 1977 kh«ng g©y ra mét ®¹i dÞch thËt sù, bëi nhiÒu ng­êi sinh tr­íc n¨m 1957 ®· ®­îc miÔn nhiÔm mét phÇn. H¬n thÕ n÷a, virót H1N1 kh«ng thay thÕ H3N2. Tõ n¨m 1968, c¶ hai ph©n týp H1N1 vµ H3N2 l­u hµnh ®ång thêi víi virót Cóm B g©y ra nh÷ng vô dÞch bïng ph¸t trªn ng­êi trong giai ®o¹n tiÒn ®¹i dÞch. Dù phßng vµ kiÓm so¸t BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Tuy nhiªn, hiÖu qu¶ phßng bÖnh cña v¾c xin kh«ng cao ®èi víi trÎ em vµ ng­êi giµ. Víi nh÷ng giíi h¹n cña v¾c xin hiÖn cã, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ph¸t triÓn nh÷ng t¸ chÊt tèt h¬n ®Ó t¨ng c­êng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm còng nh­ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc. Mét trong nh÷ng b­íc tiÕn høa hÑn lµ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc b»ng thÝch øng nhiÖt ®é l¹nh. Tuy nhiªn, mÆc dï v¾c xin nµy cã hiÖu qu¶ ë trÎ em vµ ng­êi trÎ tuæi th× l¹i qu¸ gi¶m ®éc lùc ®Ó kÝch thÝch sinh kh¸ng thÓ b¶o vÖ ë ng­êi giµ (8). Sù ph¸t triÓn cña kü thuËt di truyÒn ng­îc sö dông hÖ thèng chuyÓn nhiÔm ribonucleoprotein (RNP) cho phÐp thay thÕ c¸c gen cña virót Cóm vµ t¹o thµnh ph©n tö ARN t¸i tæ hîp in vitro. Mét sè t¸ chÊt kh¸c nhau còng ®· ®­îc sö dông ®Ó t¨ng c­êng kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm. V¾c xin Cóm bÊt ho¹t b»ng formaldehyt hoÆc v¾c xin chøa glycoprotein bÒ mÆt tinh khiÕt ®­îc s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i ph¶i thay ®æi chñng s¶n xuÊt hµng n¨m ®Ó ®¸p øng víi tÝnh ®a d¹ng cña virót. Chñng virót lµ mét trong nh÷ng thµnh phÇn quan träng nhÊt cña s¶n xuÊt v¾c xin Cóm. Chñng virót ph¶i kh«ng cã c¸c yÕu tè ngo¹i lai, cã chøa thµnh phÇn HA vµ NA phï hîp víi chñng g©y dÞch trong n¨m vµ ph¶i cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt. Dùa trªn th«ng tin tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm toµn cÇu, hµng n¨m vµo th¸ng Hai, Tæ chøc Y tÕ ThÕ Giíi (WHO) ®· xem xÐt 2 lÇn trong mét n¨m t×nh h×nh dÞch tÔ vÒ Cóm trªn toµn thÕ giíi, khuyÕn c¸o sö dông c¸c chñng virót Cóm míi. Theo khuyÕn c¸o cña WHO th× th­êng xuyªn cÇn thiÕt ph¶i ph¸t triÓn c¸c chñng virót v¾c xin chuÈn cã c¸c tÝnh chÊt kh¸ng nguyªn cña loµi chñng mµ WHO khuyÕn c¸o, vµ cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt ®Ó viÖc s¶n xuÊt v¾c xin cã hiÖu qu¶. HiÖn t¹i, ®èi víi Cóm mïa, v¾c xin ®­îc cÊp phÐp trªn toµn thÕ giíi ph¶i chøa 2 ph©n týp Cóm A ®ang l­u hµnh lµ H3N2, H1N1 vµ mét chñng Cóm B (42). HiÖn nay trªn thÕ giíi còng ®· rÊt nhiÒu n­íc nh­ Mü, Ph¸p, NhËt B¶n, Trung Quèc, Hungaria víi c¸c h­íng c«ng nghÖ ®ang ®­îc c¸c nhµ s¶n xuÊt lùa chän hiÖn nay bao gåm: 1/ Tõ trøng gµ cã ph«i SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trªn c¸c dßng tÕ bµo ®éng vËt (MDCK); 3/ Sèng gi¶m ®éc lùc vµ 4/ Trªn tÕ bµo Vero (dïng chñng ®éc lùc hoang d¹i). ThÝch øng cña chñng Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau TÕ bµo Vero Mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo ®· ®­îc nghiªn cøu kh¸ kÜ lµ dßng tÕ bµo Vero, thÝch hîp cho viÖc s¶n xuÊt c¸c v¾c xin virót ë ng­êi, nh­ c¸c v¾c xin phßng bÖnh b¹i liÖt vµ bÖnh d¹i (21). Tr­íc ®©y, chØ cã dßng tÕ bµo tiªn ph¸t vµ tÕ bµo l­ìng béi ®­îc sö dông s¶n xuÊt c¸c lo¹i v¾c xin cho ng­êi lµ ®­îc cÊp phÐp. Dßng tÕ bµo th­êng trùc kh«ng ®­îc sö dông bëi nh÷ng lo ng¹i liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng lµm xuÊt hiÖn c¸c khèi u vµ sù l©y nhiÔm virót cña nh÷ng dßng tÕ bµo nµy. TÕ bµo Vero, dßng tÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc, ®· ®­îc kiÓm nghiÖm trong khÝa c¹nh nµy vµ ng­êi ta còng ®· x©y dùng mét ng©n hµng tÕ bµo Vero ®­îc chÊp thuËn bëi WHO (21). §iÒu nµy chøng minh kh«ng cã t¸c nh©n cña virót vµ kh«ng cã kh¶ n¨ng g©y khèi u ë nh÷ng ®êi cÊy truyÒn trªn dßng tÕ bµo nµy (4, 13, 35). TÕ bµo Vero mÉn c¶m víi mét phæ virót réng nh­ng ë nh÷ng lÇn thö nghiÖm ®Çu tiªn, virót Cóm kh«ng ph¸t triÓn thµnh c«ng trªn tÕ bµo nµy (17, 22). Tuy nhiªn, nh÷ng nghiªn cøu sau ®ã ®· chøng minh r»ng thªm trypsin nhiÒu l©n vµo m«i tr­êng nu«i cÊy cña tÕ bµo Vero ®· nhiÔm virót Cóm phôc håi kiÓu nh©n lªn nhiÒu lÇn cña virót Cóm A vµ B (7, 15). Nghiªn cøu cña Govorkova vµ céng sù cho thÊy dßng tÕ bµo Vero lµ mét hÖ thèng vËt chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c virót Cóm A (7). HiÖu qu¶ ph©n lËp nh÷ng chñng ®ang l­u hµnh hiÖn nay A/H3N2 lµ t­¬ng tù ë tÕ bµo Vero vµ MDCK. Trong 72 chñng thÝch øng trªn trøng, 90,3% ®­îc ph¸t hiÖn cã hiÖu gi¸ HA trªn tÕ bµo Vero sau lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn vµ 51,4% sau lÇn thø hai. Nh÷ng tr×nh tù axit amin cña vïng HA1 cña c¸c virót Cóm A ®­îc ph©n lËp vµ cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt nh­ c¸c virót sinh tr­ëng trªn tÕ bµo MDCK. ë nång ®é g©y nhiÔm thÊp, ng­êi ta thu ®­îc s¶n l­îng virót cao b»ng c¸ch thªm nhiÒu lÇn trypsin vµo m«i tr­êng. Sau 20 lÇn cÊy truyÒn chñng A/H1N1, ng­êi ta thu ®­îc l­îng protein cña virót cao nh­ trªn tÕ bµo MDCK. Nh÷ng nghiªn cøu ban ®Çu víi mét sè l­îng chñng giíi h¹n ®· cho thÊy tÕ bµo Vero hç trî tèt cho sù ph©n lËp vµ nh©n lªn cña c¸c chñng virót Cóm A . Nhãm t¸c gi¶ nµy còng ®· chØ ra Vero lµ mét tÕ bµo chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c chñng virót Cóm B vµ x¸c ®Þnh nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc vµ di truyÒn häc cña c¶ virót Cóm A vµ B trªn tÕ bµo Vero. §ång thêi m« t¶ ®Æc ®iÓm c¸c thô thÓ trªn tÕ bµo Vero so víi nh÷ng thô thÓ nµy trªn tÕ bµo MDCK. Ph©n tÝch tr×nh tù ®· kh¼ng ®Þnh HA cña virót Cóm B trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt víi HA trªn tÕ bµo MDCK, nh­ng kh¸c víi virót sinh tr­ëng trªn trøng ë c¸c vÞ trÝ axit amin 196 ®Õn 198. TÕ bµo MDCK TÕ bµo thËn chã Madin Darby ®­îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1958 vµ ®· ®­îc sö dông réng r·i trong s¶n xuÊt v¾c xin thó y. Chóng cã thÓ s¶n sinh ra khèi l­îng lín virót Cóm (33). Còng nh­ tÕ bµo Vero, MDCK lµ dßng tÕ bµo b¸m dÝnh vµ cã thÓ nu«i cÊy trong m«i tr­êng kh«ng cã serum. MDCK lµ dßng tÕ bµo ®­îc WHO khuyÕn c¸o sö dông ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ mÉu bÖnh phÈm cña c¸c tr­êng nghi ngê m¾c Cóm. Reina vµ céng sù b¸o c¸o mét b¶n nghiªn cøu so s¸nh cña c¸c dßng tÕ bµo MDCK, Vero vµ MRC-5 trong sù ph©n lËp virót Cóm A. Trong 746 mÉu nghiªn cøu mÉu cã 60 virót Cóm A ®­îc ph©n lËp. Dßng tÕ bµo MDCK thÓ hiÖn sù nh¹y c¶m víi virót Cóm lµ 100%, dßng tÕ bµo Vero lµ 71,4% vµ dßng tÕ bµo MRC-5 lµ 57,1% (26). Qua thèng kª, tÕ bµo MDCK ®· tá râ sù kh¸c nhau ®¸ng kÓ ®èi víi Vero vµ MRC-5. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng chØ ra dßng tÕ bµo MDCK nh¹y c¶m h¬n h¼n nh÷ng dßng tÕ bµo kh¸c. Cã vÎ nh­ dßng tÕ bµo MDCK vÉn lµ mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo tèt nhÊt ®­îc khuyÕn c¸o ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm ®­êng h« hÊp. Mét nghiªn cøu kh¸c vÒ tr×nh tù axit amin vµ nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc cña HA cña ba biÕn thÓ cña chñng virót Cóm X-31 (H3N2) khi nu«i cÊy trªn tÕ bµo MDCK. Trong hai biÕn thÓ, cã 2 vÞ trÝ axit amin thay ®æi ë HA1 lµ c¸c axit amin ë vÞ trÝ thø 8 vµ 144 lÇn l­ît t­¬ng øng víi mÊt vÞ trÝ glycosin hãa vµ nh÷ng thay ®æi ®Æc biÖt trong tÝnh kh¸ng nguyªn. Nh­ c¸c virót thÝch øng trªn trøng kh¸c cña ph©n týp H3, virót Cóm X-31 còng nh©n lªn kÐm trªn tÕ bµo. Khi kh«ng cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö hÇu nh­ kh«ng thÓ nh×n thÊy vµ rÊt khã cã thÓ ®Õm ®­îc. Khi cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö thÊy ®­îc râ rµng cã ®­êng kÝnh tõ 1 ®Õn 2 mm. Trong ®iÒu kiÖn nµy, sè l­îng ®¸m ho¹i tö ®· t¨ng lªn Ýt nhÊt 100 lÇn (27). TÕ bµo PMKc ViÖc sö dông tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ®Ó trong s¶n xuÊt v¾c xin phßng virót Cóm lµ mét c«ng nghÖ míi víi c¶ thÕ giíi, ViÖt Nam còng kh«ng ph¶i ngo¹i lÖ. HiÖn nay, thÕ giíi chñ yÕu ®ang sö dông c«ng nghÖ v¾c xin truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i. Tuy nhiªn c¸c nhµ khoa häc cña C«ng ty V¾c xin vµ Sinh phÈm sã 1 ®· s¶n xuÊt v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t. Qu¸ tr×nh thÝch øng chñng rgH5N1 cã hiÖu qu¶ trªn tÕ bµo PMKc vµ nghiªn cøu ph¸t triÓn v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn dßng tÕ bµo nµy ®· cã nh÷ng thµnh c«ng nhÊt ®Þnh (1). KÕt qu¶ nµy còng ®ång thêi còng høa hÑn kh¶ n¨ng thÝch øng tèt nh÷ng chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo nµy. Ch­¬ng 2 VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU VËT LIÖU CHUNG PhiÕn 24 giÕng (Nunc - §an M¹ch) Chai 25cm2 vµ 75cm2 (Nunc - §an M¹ch) Tñ Êm 37oC (Memmert - §øc) Tñ Êm CO2 (Sanyo - NhËt) Hèt v« trïng (Biosyt - Ph¸p) KÝnh hiÓn vi lén ng­îc (Olympus - NhËt) TÕ bµo TÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t mét líp (Do Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¾c xin vµ sinh phÈm y tÕ cung cÊp. TÕ bµo nµy ®­îc chuÈn bÞ tõ nguån khØ s¹ch ®· ®­îc kiÓm tra kh«ng cã c¸c t¸c nh©n ngo¹i lai nh­: SV40, SFV, SIV, virót B, M. tuberculosis) TÕ bµo MDCK (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) TÕ bµo Vero (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) Chñng virót Chñng virót Cóm A H1N1 A/New Caledonia 20/99 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm A H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) M«i tr­êng vµ hãa chÊt MEM (Gibco) FBS (Gibco) PBS (-) (Gibco) Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Trypsin-TPCK (Sigma) Hank’s (Gibco) Ph­¬ng ph¸p chuÈn bÞ tÕ bµo LÊy tÕ bµo tõ nit¬ láng ChuÈn bÞ chai nu«i tÕ bµo 75 cm2 hoÆc 25 cm2 (tuú môc ®Ých sö dông) ®· cã s½n m«i tr­êng nu«i (vÝ dô: MEM 10% FBS) ë 37oC hoÆc ë nhiÖt ®é phßng. TiÕn hµnh lÊy èng tÕ bµo khái nit¬ láng, lµm ®«ng tan. V« trïng èng tÕ bµo tr­íc khi më n¾p èng. Hót dÞch tÕ bµo tõ èng (cßn l¹nh) chuyÓn sang chai nu«i ®· cã s½n m«i tr­êng. L¸ng nhÑ ®Ó tÕ bµo ph©n bè ®Òu trong dÞch m«i tr­êng. Nu«i tÕ bµo trong 37oC trong 6-8h hoÆc qua ®ªm ®Ó tÕ bµo b¸m vµo bÒ mÆt chai. Thay m«i tr­êng cho tÕ bµo b»ng m«i tr­êng nu«i sau 24h (tuú thuéc dßng tÕ bµo vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm, vÝ dô: MEM 5% FBS cho tÕ bµo MDCK ). T¸ch tÕ bµo Nu«i tÕ bµo kÝn mét líp. Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 370C kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho MEM 5% FBS vµo chai, hót lªn hót xuèng vµi lÇn. Ph©n chia ra c¸c chai míi tïy thuéc tû lÖ t¸ch. Thªm vµo mçi chai cho ®ñ l­îng m«i tr­êng MEM 10% FBS. ñ ë 370C cho ®Õn khi tÕ bµo kÝn mét líp. Ph­¬ng ph¸p g©y nhiÔm virót Cóm Pha lo·ng virót b»ng Hank’s ®Õn nång ®é cÇn g©y nhiÔm (vÝ dô 0,01PFU/tÕ bµo). Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng Hank’s. G©y nhiÔm hçn dÞch virót ®· pha lo·ng vµo chai nu«i tÕ bµo, chai cßn l¹i lµm chøng (-) cho Hank’s. L¸ng nhÑ cho hçn dÞch dµn ®Òu trªn bÒ mÆt tÕ bµo. HÊp phô virót ë nhiÖt ®é phßng trong 1h, cø 20 phót l¸ng 1 lÇn. ChuÈn bÞ m«i tr­êng nu«i cÊy virót: pha TPCK-trypsin trong m«i tr­êng MEM. Nu«i virót ë 37oC trong 72-96h. Theo dâi møc ®é hñy ho¹i cña virót hµng ngµy. Ph­¬ng ph¸p gÆt virót Sau 72-96h g©y nhiÔm, thu lÊy hçn dÞch virót trong èng eppendorf v« trïng. Ly t©m 8000 vßng/phót trong 5 phót, 4oC ®Ó lo¹i bá x¸c tÕ bµo, thu n­íc næi. B¶o qu¶n virót ë -80oC PH¶N øNG NG¦NG KÕT HåNG CÇU ChuÈn bÞ hång cÇu LÊy 1ml m¸u gµ vµo èng falcon chøa dung dÞch b¶o qu¶n Alsever. Ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C. Hót n­íc næi, thªm 5ml PBS (-) vµo èng. TiÕp tôc ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C, lÆp ®i lÆp l¹i 4 lÇn. Pha dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ trong PBS (-). TiÕn hµnh HiÖu gi¸ virót sau khi gÆt sÏ ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA). LÊy phiÕn thö, viÕt tªn mÉu theo thø tù: (-), (+) vµ c¸c mÉu thö. Cho vµo mçi giÕng 50µl PBS (-). Hót 50µl mÉu vµo c¸c giÕng ®Çu tiªn, giÕng (-) cho 50µl PBS (-). Pha lo·ng mÉu b»ng c¸ch hót 50µl mÉu tõ giÕng ®Çu tiªn chuyÓn sang giÕng tiÕp theo, ®Õn giÕng cuèi cïng còng hót bá 50µl vµ bá ®Çu c«n. Mçi giÕng hót lªn hót xuèng 5 lÇn. Thªm vµo mçi giÕng 50µl dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ. Vç nhÑ vµo phiÕn vµ ®Ëy n¾p. §Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 30 phót vµ ®äc kÕt qu¶. KÕt qu¶ HiÖu gi¸ HA lµ nång ®é pha lo·ng thÊp nhÊt cña mÉu cßn cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu. C¸c giÕng cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt HA lµ c¸c giÕng khi nghiªng, hång cÇu ch¶y xuèng cã h×nh giät lÖ. C¨n cø vµo chøng (-) vµ (+) ®Ó ®¸nh gi¸ thö nghiÖm. QUY TR×NH CHUÈN §é HIÖU GI¸ Virót Cóm VËt liÖu TÕ bµo MDCK. M«i tr­êng Hank’s: pH 6,8 - 7,2 Dung dÞch Trypsin 0,25% Trypsin (Gibco - Mü) 2,5g EDTA (BDH - Anh) 1g PBS d¹ng bét (Sigma - Mü) 1 gãi N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml M«i tr­êng nu«i cÊy MEM (Gibco) M«i tr­êng MEM 2X MEM d¹ng bét (Gibco - Mü) 1 gãi Sodium bicarbonate (Gibco - Mü) 20 ml Aminoacid (Gibco - Mü) 10 ml L - Glutamin 200 mM/ml (Gibco - Mü) 5 ml Gentamicin 10 mg/ml 2 ml Fungizone 250 µg/ml (Gibco - Mü) 0,5 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 500 ml M«i tr­êng phñ th¹ch MEM 2X 10 ml MgCl2.6H20 4.1M/1 (Wako - NhËt) 0,2 ml Agarose 1,2% (Seakem - Mü) 10 ml FBS (Sigma - Mü) 0,4 ml Thuèc nhuém Crystal violet Crystal violet (Merck - §øc) 0,325 g Isopropyl alcohol (Amresco - Mü) 12,5 ml Formaldehyde (BDH - Anh) 75 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK M«i tr­êng EMEM 2X ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK ra phiÕn 24 giÕng: Hót hÕt m«i tr­êng trong chai . Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 37oC kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho 5ml MEM 10% FBS vµo chai hót lªn hót xuèng nhiÒu lÇn. Cho thªm 30ml MEM 10% FBS vµo chai, trén ®Òu. Cho vµo 3 phiÕn, mçi phiÕn 12ml, 0,5ml/giÕng. Cho vµo tñ CO2, 37oC. ChuÈn bÞ m«i tr­êng phñ th¹ch: cho 1 phiÕn EMEM 2X 10ml DW 3,8ml 1% DEAE-dextran 0,2ml Trypsin 1,2ml Agarose 2% 6ml 2.9.2.2. TiÕn hµnh MÉu thö ®­îc pha lo·ng bËc 10 ë 8 nång ®é g©y nhiÔm tõ 10-1 ®Õn 10-8 b»ng Hank’s. LÊy phiÕn ra khái tñ Êm, viÕt tªn vµ ®é pha lo·ng trªn n¾p giÕng. Hót bá m«i tr­êng theo c¹nh giÕng. Röa c¸c giÕng tÕ bµo b»ng c¸ch cho 0,5ml Hank’s vµo tÊt c¶ c¸c giÕng, l¸ng ®Òu Hank’s trªn bÒ mÆt tÕ bµo. L¾c qua l¾c l¹i nhÑ nhµng ®Ó lo¹i bá tÕ bµo chÕt. Hót hÕt Hank’s ë trong giÕng tÕ bµo. Cho 200µl Hank’s vµo giÕng tÕ bµo chøng vµ 100µl Hank’s vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm. Hót 100µl dung dÞch ë c¸c ®é pha lo·ng vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm theo s¬ ®å phiÕn thö S¬ ®å phiÕn thö: 1 2 3 4 5 6 A TÕ bµo chøng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 B TÕ bµo chøng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 C TÕ bµo chøng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 D TÕ bµo chøng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 §Ëy kÝn phiÕn tÕ bµo ®· g©y nhiÔm, ®Ó hÊp phô 2 giê trong tñ Êm 5% CO2, nhiÖt ®é 37oC. Lo¹i bá n­íc næi trong c¸c giÕng. Cho vµo mçi giÕng 0,6ml dung dÞch phñ th¹ch. §Ó vµo tñ Êm CO2/37oC trong 3 ngµy. Nhuém th¹ch b»ng thuèc nhuém Crystal violet, 400µl/giÕng. ñ ë tñ Êm 37oC. Sau 3-4h röa líp th¹ch phñ, ®äc kÕt qu¶. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ C¸c ®¸m ho¹i tö lµ nh÷ng ®èm tr¾ng cã thÓ nh×n thÊy b»ng m¾t th­êng n»m ë mÆt ®¸y cña c¸c giÕng khi soi trªn ®Ìn. §Õm c¸c ®¸m ho¹i tö ë mçi giÕng råi ghi l¹i. HiÖu gi¸ virót Cóm = sè ®¸m ho¹i tö (PFU)/ ml C«ng thøc tÝnh hiÖu gi¸ cña virót Cóm: Số đám hoại tử trung bình PFU/ml = Độ pha loãng thấp nhất còn gây hoại tử × số ml cấy Ch­¬ng 3 KÕT QU¶ Vµ BµN LUËN ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña virót Cóm a/h1n1, a/h3n2 vµ b trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau Sù nh©n lªn cña virót Cóm trªn tÕ bµo Vero TÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm víi ba chñng virót Cóm mïa A/H1N1, A/H3N2 vµ Cóm B. Quan s¸t sù nh©n lªn cña virót trong khi nu«i cÊy b»ng d­íi kÝnh hiÓn vi ®Ó kiÓm tra møc ®é hñy ho¹i (CPE) vµ ®¸nh gi¸ nhanh hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn virót th«ng qua ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA) t¹i nh÷ng thêi ®iÓm: 24 giê, 48 giê, 72 giê vµ 96 giê sau khi g©y nhiÔm. H×nh 5. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 24 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). B¶ng 2. Møc ®é hñy ho¹i (% CPE) trªn tÕ bµo Vero qua c¸c lÇn cÊy truyÒn LÇn cÊy truyÒn (Vn) Møc ®é hñy ho¹i (%CPE) H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h V1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 H×nh 6. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 48 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). H×nh 7. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 72h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). . H×nh 8. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 96h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). ¶nh chôp cho thÊy tÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm vµ tÕ bµo chøng kh«ng cã sù kh¸c biÖt. TÕ bµo vÉn mäc kh¸ dµy vµ kh«ng thÊy sù ph¸t triÓn cña virót. KÕt qu¶ thu ®­îc cho thÊy virót gÇn nh­ kh«ng hñy ho¹i tÕ bµo Vero tõ nh÷ng lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn ®Õn nh÷ng lÇn cÊy truyÒn cuèi cïng. Do ®ã thö nghiÖm HA cña virót gi¶i phãng vµo n­íc næi còng kh«ng ®em l¹i kÕt qu¶ (b¶ng 3). B¶ng 3. So s¸nh hiÖu gi¸ HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero LÇn cÊy truyÒn (Vn) HiÖu gi¸ HA H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h V1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nh­ vËy sau 10 ®êi nu«i cÊy, cã thÓ rót ra kÕt luËn c¶ 3 chñng virót Cóm mïa ®Òu kh«ng thÝch øng ®­îc trªn tÕ bµo Vero. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi mét sè nghiªn cøu ban ®Çu vÒ sù thÝch øng cña virót Cóm trªn tÕ bµo Vero. C¸c thö nghiÖm ®Òu cho thÊy virót Cóm kh«ng thÓ nh©n lªn tèt trªn dßng tÕ bµo th­êng trùc nµy (17, 22). Tuy nhiªn nh÷ng b¸o c¸o gÇn ®©y l¹i cho nh÷ng kÕt qu¶ kh¶ quan h¬n. Mét nghiªn cøu cho r»ng r»ng ho¹t tÝnh trypsin kh«ng ®ñ trong m«i tr­êng nu«i cÊy cã thÓ lµ nguyªn nh©n lµm ngõng sù ph¸t triÓn cña virót Cóm (6). Sù øc chÕ ho¹t tÝnh trypsin ®­îc sinh ra bëi mét nh©n tè tiÕt. Sù mÊt ho¹t tÝnh nµy cã thÓ xuÊt ph¸t tõ sù tiÕt cña tÕ bµo cña mét nh©n tè øc chÕ vµo m«i tr­êng hoÆc tõ mèi liªn hÖ trùc tiÕp gi÷a trypsin vµ tÕ bµo. §¸ng ng¹c nhiªn lµ hiÖn t­îng mÊt ho¹t tÝnh trypsin ë møc ®é thÊp h¬n so víi Vero còng x¶y ra ë c¸c dßng tÕ bµo kh¸c (thËn khØ n©u LLC-MK2, thËn lîn SwK) nh­ng Ýt ®­îc tuyªn bè h¬n tÕ bµo Vero (15). Trong sè nµy cã c¶ tÕ bµo MDCK, tÕ bµo ®­îc sö dông réng r·i trong nh÷ng nghiªn cøu virót Cóm. Nh÷ng ¶nh h­ëng bÊt lîi do mÊt ho¹t tÝnh trypsin cã thÓ kh¾c phôc ®­îc b»ng c¸ch thªm trypsin nhiÒu lÇn suèt giai ®o¹n g©y nhiÔm. L­îng m«i tr­êng nu«i cÊy lín h¬n ®­îc thªm vµo còng cã thÓ c¶i thiÖn sù ph¸t triÓn cña virót ë nång ®é g©y nhiÔm thÊp nång ®é thÊp h¬n cña nh©n tè bÊt ho¹t trypsin cã trong m«i tr­êng. Trong nghiªn cøu nµy, trypsin-TPCK còng ®­îc thªm vµo m«i tr­êng nu«i cÊy khi g©y nhiÔm nh­ng kh«ng c¶i thiÖn ®­îc kh¶ n¨ng ph¸t triÓn cña virót trªn tÕ bµo. Sù nh©n lªn cña virót Cóm trªn tÕ bµo MDCK Ngay tõ lÇn g©y nhiÔm ®Çu tiªn, c¶ ba chñng Cóm mïa ®· hñy ho¹i tÕ bµo MDCK rÊt râ rµng. Trong ba chñng nµy, virót Cóm B thÓ hiÖn kh¶ n¨ng hñy ho¹i tèt nhÊt, tiÕp ®Õn lµ virót Cóm A/H1N1, kÐm nhÊt lµ Cóm A/H3N2 (b¶ng 4). ë nh÷ng lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn, sau 72 giê g©y nhiÔm, duy nhÊt chØ cã H3N2 lµ ch­a hñy ho¹i hÕt tÕ bµo (b¶ng 4). Hai chñng virót cßn l¹i ®Òu hñy ho¹i gÇn nh­ hoµn toµn tÕ bµo sau 3 ngµy nu«i cÊy. Tuy nhiªn, ë nh÷ng ®êi cÊy truyÒn cuèi, H3N2 còng ®· hñy ho¹i hoµn toµn toµn tÕ bµo MDCK. H×nh 9. ¶nh chôp TÕ bµo MDCK sau 24 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 8 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). H×nh 10. ¶nh chôp TÕ bµo MDCK sau 48 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 8 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). . H×nh 11. ¶nh chôp TÕ bµo MDCK sau 72 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 8 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). B¶ng 4. Møc ®é hñy ho¹i (%CPE) trªn tÕ bµo MDCK qua c¸c lÇn cÊy truyÒn LÇn cÊy truyÒn (Mn) Møc ®é hñy ho¹i (% CPE) H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h M1 40 70 100 20 40 80 60 90 100 M2 40 60 70 20 40 80 50 80 100 M3 50 70 100 20 40 80 30 50 100 M4 30 70 100 40 70 90 40 80 100 M5 30 50 90 40 70 90 50 90 100 M6 40 70 100 40 70 90 40 90 100 M7 30 70 95 40 70 95 40 70 100 M8 40 80 100 40 80 100 40 90 100 M9 40 80 100 40 80 100 40 80 100 M10 40 80 100 40 80 100 40 90 100 M11 40 80 100 30 60 100 40 90 100 M12 40 80 100 40 80 100 40 90 100 KÕt qu¶ b­íc ®Çu cho thÊy virót Cóm ®· thÝch øng vµ nh©n lªn kh¸ tèt trªn tÕ bµo MDCK, tiÕp tôc c¸c thö nghiÖm HA vµ t¹o ®¸m ho¹i tö ®Ó ®¸nh gi¸ hiÖu gi¸ virót qua c¸c lÇn cÊy truyÒn. Sù nh©n lªn cña virót Cóm trªn tÕ bµo PMKc KÕt qu¶ thu ®­îc cho thÊy ngay ®êi nu«i cÊy ®Çu tiªn (h×nh 9), sau 72 giê g©y nhiÔm, H1N1 vµ B ®· hñy ho¹i gÇn nh­ hoµn toµn tÕ bµo PMKc. Riªng chñng H3N2 cã thêi gian hñy ho¹i l©u h¬n, sau 96 giê vÉn ch­a hñy ho¹i hÕt tÕ bµo (h×nh 12). H×nh 12. ¶nh chôp TÕ bµo PMKc sau 24 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 1 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). . H×nh 13. ¶nh chôp TÕ bµo PMKc sau 48 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 1 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). H×nh 14. ¶nh chôp TÕ bµo PMKc sau 72 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 1 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). . H×nh 15. ¶nh chôp TÕ bµo PMKc sau 96 giê ë lÇn cÊy truyÒn thø 1 víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). ë nh÷ng ®êi nu«i cÊy tiÕp theo, CPE cña H3N2 b¾t ®Çu ®­îc c¶i thiÖn dÇn vµ tÕ bµo PMKc bÞ hñy ho¹i hÕt ë 96 giê. Hai chñng H1N1 vµ B vÉn duy tr× tèt kh¶ n¨ng hñy ho¹i cña m×nh ë 72 giê (b¶ng 5) B¶ng 5. Møc ®é hñy ho¹i (%CPE) trªn tÕ bµo PMKc qua c¸c lÇn cÊy truyÒn LÇn cÊy truyÒn (Pn) Møc ®é hñy ho¹i (%CPE) H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h P1 20 40 100 10 20 30 70 30 70 100 P2 30 50 100 20 30 70 100 20 70 100 P3 30 50 100 10 30 40 90 20 70 100 P4 20 50 100 10 30 60 100 30 70 100 P5 30 40 100 20 30 60 100 30 80 100 P6 30 50 100 20 30 50 100 30 70 100 P7 30 70 100 20 40 60 100 30 70 100 P8 30 70 100 20 40 60 100 30 80 100 P9 30 80 100 20 40 60 100 30 80 100 P10 40 80 100 20 50 70 100 30 80 100 Còng nh­ MDCK, tÕ bµo PMKc b­íc ®Çu ®· cho thÊy hç trî sù ph¸t triÓn tèt cña c¸c chñng virót Cóm, tiÕp tôc ®¸nh gi¸ hiÖu gi¸ virót qua c¸c lÇn cÊy truyÒn b»ng thö nghiÖm HA vµ t¹o ®¸m ho¹i tö . KÕT QU¶ NGHI£N CøU CÊY TRUYÒN chñng virót Cóm mïa Nghiªn cøu cÊy truyÒn ba chñng virót Cóm A H1N1 A/New Caledonia 20/99, H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 vµ Cóm B B/Malaysia/ 2506/2004 trªn dßng tÕ bµo PMKc vµ MDCK qua 10 lÇn liªn tôc, víi môc ®Ých mong muèn cã ®­îc c¸c chñng virót Cóm ®¹t hiÖu gi¸ cao, æn ®Þnh cho viÖc s¶n xuÊt v¾c xin Cóm mïa. KÕt qu¶ nghiªn cøu cÊy truyÒn chñng virót Cóm mïa trªn tÕ bµo MDCK B¶ng 6. So s¸nh hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo MDCK LÇn cÊy truyÒn (Mn) HiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h M1 16 ±64 128 ±8 16 16 64 128 128 M2 - - - ±8 16 16 32 128 256 M3 32 64 256 ±8 16 32 64 128 128 M4 16 64 128 16 32 128 32 64 128 M5 16 32 64 16 32 128 64 128 256 M6 16 64 256 16 32 256 64 256 512 M7 16 64 256 16 32 128 32 256 512 M8 32 256 512 16 64 256 64 256 1024 M9 32 256 512 16 64 256 32 256 512 M10 32 256 1024 16 256 512 64 256 1024 M11 32 512 2048 32 256 1024 64 512 1024 M12 32 512 2048 16 256 1024 64 512 1024 KÕt qu¶ cho thÊy ë nh÷ng ®êi ®Çu tiªn, hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cña H3N2 t­¬ng ®èi thÊp so víi 2 chñng cßn l¹i. Tuy nhiªn nh÷ng lÇn cÊy truyÒn tiÕp theo, hiÖu gi¸ HA cña c¶ 3 chñng lu«n gi÷ ë møc cao, riªng H1N1 thÓ hiÖn sù t¨ng dÇn ®Òu tõ sau ®êi thø 5 (®å thÞ 1). §å thÞ 1. HiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn MDCK Nh÷ng nghiªn cøu thÝch øng trªn tÕ bµo th­êng kÕt thóc ë ®êi thø 10 nh­ng do ch­a æn ®Þnh vÒ mÆt hiÖu gi¸ nªn chóng t«i quyÕt ®Þnh tiÕp tôc cÊy truyÒn thªm ®Õn ®êi thø 12 nh»m t¹o ra sù thÝch øng tèt h¬n cña virót trªn tÕ bµo MDCK. ë ba lÇn cÊy truyÒn cuèi cïng, c¶ 3 virót ®· cho hiÖu gi¸ æn ®Þnh vµ dõng l¹i ë møc kh¸ cao H1N1 lµ 2048, H3N2 vµ B lµ 1024. KÕt qu¶ (b¶ng 7) cho thÊy hiÖu gi¸ virót ®Þnh l­îng b»ng thö nghiÖm t¹o ®¸m ho¹i tö t¨ng lªn tõ lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn ®Õn nh÷ng lÇn cuèi cïng. ë nh÷ng ®êi thø nhÊt, hiÖu gi¸ vµo kho¶ng 105 (H1N1) vµ 106 (B), thÊp nhÊt lµ H3N2 víi hiÖu gi¸ chØ lµ 103. Tuy nhiªn hiÖu gi¸ cña H1N1 vµ H3N2 ®· cã nh÷ng b­íc t¨ng hiÖu gi¸ kh¸ æn ®Þnh, nhÊt lµ H1N1 gi÷ møc t¨ng liªn tôc tõ ®êi thø 5 vµ B lu«n ë møc cao (®å thÞ 2). B¶ng 7. So s¸nh hiÖu gi¸ virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo MDCK LÇn cÊy truyÒn (Mn) HiÖu gi¸ virót thêi ®iÓm 72h (PFU/ml) H1N1 H3N2 B M1 0,5´105 103 106 M2 104 103 2´106 M3 1,5´106 1,5´ 103 1,5´106 M4 105 105 2´106 M5 1,5´104 1,5´105 2´106 M6 2´106 2´106 0,5´107 M7 0,5´107 106 0,5´108 M8 1,5´107 2´106 108 M9 2´107 1,5´106 1,5´108 M10 0,5´108 0,5´108 1,5´108 M11 108 1,5´108 1,5´108 M12 1,5´108 108 1,5´108 §å thÞ 2. HiÖu gi¸ cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo MDCK. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi nh÷ng nghiªn tr­íc ®©y cho r»ng, trong sè nh÷ng dßng tÕ bµo ®éng vËt cã vó ®­îc thö nghiÖm ®Ó nu«i cÊy virót Cóm A vµ B, MDCK lµ tÕ bµo cã kh¶ n¨ng hç trî sù ph©n lËp vµ ph¸t triÓn tèi ­u cña virót (3, 30). KÕt qu¶ nghiªn cøu cÊy truyÒn chñng virót Cóm mïa trªn tÕ bµo PMKc §å thÞ 3. HiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo PMKc. KÕt qu¶ cÊy truyÒn cho hiÖu gi¸ HA sau 72 giê g©y nhiÔm cña chñng H1N1 vµ B vµ 96 giê g©y cña chñng H3N2 kh¸ æn ®Þnh vµ t¨ng dÇn ë nh÷ng lÇn cÊy truyÒn cuèi cïng (®å thÞ 4). §Õn ®êi nu«i cÊy thø 8, 9 vµ 10 ®¹t hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cao nhÊt, ë c¸c chñng H3N2 vµ B lµ 512, chñng H1N1 lµ 1024 (b¶ng 8). B¶ng 8. So s¸nh hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo PMKc LÇn cÊy truyÒn (Pn) HiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA H1N1 H3N2 B 24h 48h 72h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h P1 16 64 256 8 16 32 64 32 64 128 P2 32 128 256 16 32 256 512 16 64 128 P3 32 128 256 8 32 64 256 16 64 128 P4 16 128 256 8 32 128 256 32 64 128 P5 32 64 256 16 32 128 256 32 64 256 P6 32 128 256 16 32 64 256 32 64 256 P7 32 128 512 16 32 256 512 32 64 256 P8 32 256 1024 16 64 256 512 32 128 512 P9 32 256 1024 16 64 256 512 32 128 512 P10 32 256 1024 16 64 256 512 32 128 512 HiÖu gi¸ virót cña chñng H1N1 vµ B ë 72 giê vµ chñng H3N2 ë 96 giê sau khi g©y nhiÔm ®­îc thÓ hiÖn ë b¶ng 9. Sau 10 ®êi cÊy truyÒn, hiÖu gi¸ virót cã t¨ng nh­ng víi møc ®é kh«ng cao, nh­ H3N2 ®· b¾t ®Çu æn ®Þnh hiÖu gi¸ ë ®êi thø 2 (®å thÞ 4). ë ®êi cÊy truyÒn cuèi, hiÖu gi¸ cña chñng H1N1 lµ 1,5´108 PFU/ml, hai chñng cßn l¹i H3N2 vµ B lµ 2´107 PFU/ml (b¶ng 9). B¶ng 9. So s¸nh hiÖu gi¸ virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo PMKc LÇn cÊy truyÒn (Pn) HiÖu gi¸ virót thêi ®iÓm 72h vµ 96h (PFU/ml) H1N1 H3N2 B P1 0,5´107 105 106 P2 0,5´107 107 0,5´106 P3 107 107 1,5´106 P4 107 0,5´107 0,5´107 P5 1,5´107 0,5´107 107 P6 2´107 107 0,5´107 P7 0,5´108 1,5´107 0,5´107 P8 1,5´108 2´107 107 P9 2´108 1,5´107 1,5´107 P10 1,5´108 2´107 2´107 §å thÞ 4. HiÖu gi¸ virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo PMKc Nh­ vËy, cã thÓ kÕt luËn c¶ ba chñng Cóm H1N1, H3N2 vµ B ®· thÝch øng tèt vµ cho hiÖu gi¸ cao trªn tÕ bµo PMKc. Trong qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót Cóm, giai ®o¹n virót x©m nhËp vµo tÕ bµo chñ ®ßi hái ph¶i cã sù ph©n c¾t protein HA thµnh HA1 vµ HA2. V× vËy trong m«i tr­êng nu«i virót Cóm th­êng ph¶i cã trypsin, enzym thùc hiÖn sù ph©n c¾t nµy. §èi víi virót cÊy truyÒn trªn c¸c dßng tÕ bµo th­êng trùc nh­ Vero vµ MDCK th× m«i tr­êng nu«i virót cã sö dông TPCK-trysin, cßn trªn PMKc th× trong m«i tr­êng nu«i kh«ng cÇn cã trypsin bëi v× b¶n th©n c¸c tÕ bµo tiªn ph¸t lu«n s¶n sinh ra proteaza. §©y chÝnh lµ mét trong nh÷ng ­u ®iÓm cña PMKc ®­îc sö dông lµm nguån tÕ bµo cho s¶n xuÊt v¾c xin Cóm, so víi Vero vµ MDCK. KÕT luËn C¶ ba chñng virót Cóm mïa A H1N1 A/New Caledonia 20/99, H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 vµ Cóm B B/Malaysia/ 2506/2004 thÝch øng nhanh trªn tÕ bµo MDCK vµ PMKc. Sau 72 giê vµ 96 giê g©y nhiÔm, virót hñy ho¹i 100% tÕ bµo. Kh«ng cã chñng virót nµo thÝch øng trªn tÕ bµo Vero. ViÖc cÊy truyÒn ba chñng chñng virót Cóm A H1N1 A/New Caledonia 20/99, H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 vµ Cóm B B/Malaysia/2506/2004 trªn hai dßng tÕ bµo MDCK vµ PMKc ®· ®¹t ®­îc kÕt qu¶ tèt. HiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA vµ hiÖu gi¸ virót Cóm ë 3 ®êi cÊy truyÒn cuèi cïng kh¸ cao vµ æn ®Þnh. §èi víi tÕ bµo MDCK, hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA rÊt cao ®¹t tõ 1024 ®Õn 2048 vµ hiÖu gi¸ virót lµ 108 PFU/ml. §èi víi tÕ bµo PMKc, hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn HA tõ 256 ®Õn 1024 vµ hiÖu gi¸ virót ®¹t 107 PFU/ml. KiÕn nghÞ KÕt qu¶ nghiªn cøu cã thÓ øng dông trong viÖc s¶n xuÊt chñng gèc gièng vµ chñng s¶n xuÊt ®Ó ph¸t triÓn v¾c xin Cóm mïa trªn hai dßng tÕ bµo PMKc vµ MDCK. Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt NguyÔn Thu V©n, Hoµng Thuû Nguyªn, NguyÔn TuyÕt Nga, §inh Thuý V©n, NguyÔn Kim Dung, NguyÔn Hoµng Mai (2006), “Nghiªn cøu thÝch øng chñng virót RGH5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t”, TC Y häc thùc hµnh, sè 7. TiÕng Anh Connor R.J., Kawaoka Y., Webster R.G., Paulson J.C. (1994), “Receptor specificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates”, Virology, 205(1), pp. 17-23. Frank, A. L., R. B. Couch, C. A. Griffits, B. D. Baxter. (1979), “Comparison of different tissue cultures for isolation and quantitation of influenza and parainfluenza viruses”, J. Clin. Microbiol, 10, pp. 32-36. Furesz J., Fanok A., Contreras. G. and Becker B. (1989), “Tumorogenicity testing of various cell substrates for production of biologicals”, Dev. Biol. Stand., 70, pp. 233-243. Gambaryan A.S., Karasin A.I., Tuzikov A.B., et al. (2005), “Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells”, Virus Res., 114 (1-2), pp. 15-22. Gorman O.T., Bean W.J., Kawaoka Y., Donatelli I., Guo Y., Webster R.G. (1991), “Evolution of influenza viurs nucleoprotein genes: implications for the origin of H1N1 human and classical swine viruses”, J. Virol., 65, pp. 3704-3714. Govorkova E.A., Murk G., Meignier B., De Taisne, C, Webster R.G. (1996), “African Green Monkey Kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for Influenza A and B virus”, J. Viral., 70, pp. 5519-5524. Grose G.J., Otto E.E., Powers D.C., Chambers G.W., Eickhoff C.S., Newman F.K. (1996), “Introdution of mucosal antibodies by live attenuated and inactivated influenza viurs vaccines in the chronically ill elderly”, J. Infect. Dis., 173, pp. 285-290. Hampson AW (1999), “Epidemiological data on influenza in Asian countries”, Vaccine, 17, pp. 19-23. Hang L.K. Nguyen, Reiko Saito, Ha K. Ngiem, Makoto Nishikawa, Yugo Shobugawa, Doan C. Nguyen, Long T. Hoang, Lien P. Huynh, Hiroshi Suzuki (2007), “Epidemiology of influenza in Hanoi, Vietnam, from 2001 to 2003”, Journal of Infection, 55, pp. 58-63. Hilleman M. (2002), "Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control", Vaccine, 20, pp. 3068-3087. Hinshaw V.S., Webster R.G., Easterday B.C., Bean W.J. (1981), “Replication of avian influenza viruses in mammals”, Infect. Immun., 34, pp. 354-361. Horaud F. (1992), “Absence of viral sequences in the WHO-Vero cell bank: a collaborative study”, Develop. Biol. Stand., 76, pp. 43-46. Katz J.M., Webster R.G. (1989), “Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs”, J Infect Dis, 160(2), pp. 191-198. Kaverin N. V., Webster R.G (1995), “Impairment of Multicycle Influenza Virus Growth in Vero (WHO) Cells by Loss of Trypsin Activity”, Journal of Virology, pp. 2700-2703. Klenk H.D., Rott R., et al. (1975), Activation of influenza A viruses by trypsin treatment, Virology, 68, pp. 426-39. Lau S.C., Scholtissek C (1995), “Abortive infection of Vero cells by an Influenza A virus (FPV)”, Virology, 212, pp. 225-231. Lazarowitz S.G., Choppin P.W. (1975), Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide, Virology, 68, pp. 440-454. Li C.K., Choi B.C., Wong T.W. (2006), “Influenza-related deaths and hospitalizations in Hong Kong: a subtropical area”, Public Health, 120, pp. 517-524. Lu H., Castro A.E., et al. (2003), “Survival of avian influenza virus H7N2 in SPF chickens and their environments”, Avian Dis, 47, pp. 1015-1021. Montagnon B.J., Fanget B., Nicholas A.J. (1987), “The largescale cultivation of Vero cells in microcarrier culture for virus vaccine production. Preliminary results for killed poliovirus vaccine”, Dev. Biol. Stand., 47-55. Nakamura K., Homma M. (1981), “Protein synthesis in Vero cells abortively infected with Influenza B virus”, J. Gen. Viral., 56, pp. 199-202. Nerome K., Kanegae Y., Shortridge K.F., Sugita S., Ishida M. (1995), “Genetic analysis of porcine H3N2 viruses originating in southern China”, J. Gen. Virol., 76, pp. 1247-1249. Nuss J.M., Whitaker P.B., Air G.M (1993), “Identification of critical contact residues in the NC41 epitope of a subtype N9 influenza virus neuraminidase. Proteins”, 15, pp. 121-32. Potter C.W. (2001), "A History of Influenza", Journal of Applied Microbiology, 91(4), pp. 572-579. Reina J., Fernandez-Baca V., et al. (1997), “Comparison of Madin-Darby canine kidney cells (MDCK) with a green monkey continuous cell line (Vero) and human lung embryonated cells (MRC-5) in the isolation of influenza A virus from nasopharyngeal aspirates by shell vial culture”, J. Clin Microbiol, 35(7), pp. 1900-1901. Rott R., M. Orlich, Kienk H.D., Wang M. L. (1984), “Studies on the adaptation of influenza viruses to MDCK cells”, The EMBO Journal, 3(13), pp. 3329-3332. Rott R., Reinacher M., Orlich M. and Klenk H..D. (1980), “Cleavability of hemagglutinin determines spread of avian influenza viruses in the chorioallantoic membrane of chicken embryo”, Arch. Viral., 65, pp. 123-133. Rowe, P.M. (1995), “Pandemic influenza (un)preparedness described”, The Lancer , 346, 1699. Schepetiuk S. K., T. Kok (1993), “The use of MDCK, MEK and LLCMK2 cell lines with enzyme immunoassay for the isolation of influenza and parainfluenza viruses from clinical specimens”, J. Virol. Methods, 42, pp. 241-250. Simmerman J.M., Chittaganpitch M., Erdman D., Sawatwong P., Uyeki T.M., Dowell S.F. (2006), “Field performance and new uses of rapid influenza testing in Thailand”, Int J Infect Dis., 24, pp. 4417-4426. Stallknecht D.E., et al. (1990), “Persistence of avian influenza viruses in water”, Avian Diseases, 34, pp. 406-411. Tree J.A., Richardson C., Fooks A.R., Clegg J.C., Looby D. (2001), “Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains”, Vaccine, 19, pp. 3444-3450. Tulip W.R., Varghese J.N., et al. (1992), “Refined crystal structure of the influenza virus N9 neuraminidase-NC41 Fab complex”, J Mol Biol, 227, pp. 122-148. Vincent Falquet J.C., Peyron L., Souvras M., Moulin J.C., Tektoff J. and Patet (1989), “J. Qualification of working cell banks for the Vero cell line to produce licensed human vaccines”, Dev. Biol. Stand., 70, pp. 153-l 56. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawoaka Y. (1992), “Evolution and ecology of influenza A viruses”, Microbio. Rev, 56, pp. 152-179. White J.M. (1992), Membrane fusion, Science, 258, pp. 917-924. WHO (2001), Weekly epidemiological record, 76, pp. 357-360. WHO (2002), Weekly epidemiological record, 77, pp. 358-361. WHO (2003), Weekly epidemiological record, 78, pp. 393-396. WHO (2004), Weekly epidemiological record, 79, pp. 385-388. WHO (2008), Weekly epidemiological record , 83, pp. 365-372. Yamashita M., Krystal M., Fitch W.M., Palese P. (1987), “Influenza B virus evolution: cocirculating lineages and comparison of evolutionary pattern with those of influenza A and C viruses”, Virology, 163, pp. 112-122.