Bài giảng Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) - Nguyễn Đức Tuấn

Saéc Kyù Lôùp Moûng (Thin Layer Chromatography) PGS.TS. Nguyeãn Ñöùc Tuaán Boä moân Hoùa Phaân Tích – Kieåm Nghieäm Khoa Döôïc – Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Saéc Kyù Lôùp Moûng (SKLM) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Muïc tieâu: Trình baøy ñöôïc  Cô cheá chính trong SKLM  Pha tónh vaø pha ñoäng trong SKLM  Trang thieát bò duøng trong SKLM  Caùc böôùc tieán haønh trong SKLM  ÖÙng duïng cuûa SKLM trong ngaønh Döôïc Saéc Kyù Lôùp Moûng (SKLM) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Daøn baøi  Giôùi thieäu - Ñònh nghóa  Caùc cô cheá taùch trong SKLM  Pha tónh  Pha ñoäng  Trang thieát bò  Caùc böôùc tieán haønh khi thöïc hieän SKLM  Phaùt hieän caùc veát treân baûn moûng  Vaøi thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM  ÖÙng duïng cuûa SKLM  Ñaùnh giaù SKLM Giôùi thieäu – Ñònh nghóa Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  1938: Izmailov & Schraiber duøng boät oxyd nhoâm ñeå phaân tích dòch chieát alcaloid thöïc vaät  Cô cheá: haáp phuï chieám phaàn lôùn  Pha tónh: tröông nôû theo caû chieàu doïc vaø chieàu ngang  Ñònh nghóa: SKLM laø moät phöông phaùp saéc kyù duøng chaát haáp phuï laøm pha tónh traûi thaønh lôùp moûng treân taám kính, nhöïa hay kim loaïi. Quaù trình taùch caùc hôïp chaát xaûy ra khi cho pha ñoäng laø dung moâi di chuyeån qua pha tónh. Do ñoù SKLM thuoäc saéc kyù loûng - raén.  SKLM coù theå duøng ñeå tìm caùc ñieàu kieän toái öu cho söï taùch baèng saéc kyù loûng treân coät. Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Silicagel (Kieselgel – gel cuûa acid silicic)  Söû duïng roäng raûi nhaát  Kích thöôùc haït 10 ‟ 60 m, dieän tích beà maët 200 ‟ 400 m2/g  Hoaït tính haáp phuï do ‟OH treân beà maët quyeát ñònh  Haøm aåm taêng seõ laøm giaûm hoaït ñoä  Hoaït hoùa 120oC/1 giôø tröôùc khi söû duïng Si HO OH Si HO OH Si HO OH O O Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Nhoâm oxyd  Oxyd nhoâm trung tính, acid, base  Hoaït tính tuøy thuoäc löôïng nöôùc  Hoaït hoùa 120oC/1 giôø tröôùc khi söû duïng  Theo Brockman: 5 baäc oxyd nhoâm Baäc hoaït tính I II III IV V % nöôùc 0 3 6 10 15 Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Xaùc ñònh baäc hoaït tính cuûa nhoâm oxyd: döïa vaøo R f cuûa maøu chuaån „Chaát maøu „Baäc hoaït tính cuûa oxyd nhoâm theo Brockman „II „III „IV „V „Giaù trò R f „Aminoazobenzen „Sudan ñoû „Sudan vaøng „0,59 „0,00 „0,01 „0,74 „0,10 „0,25 „0,85 „0,33 „0,57 „0,95 „0,56 „0,78 Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Kieselguhr  Boät nheï, vaøng xaùm chöùa 70 ‟ 95% SiO 2  Chaát haáp phuï yeáu  Taùch caùc chaát phaân cöïc: cetoacid, lacton,  Chaát mang pha tónh trong saéc kyù phaân boá  Kieselguhr ‟ silicagel hay kieselguhr ‟ thaïch cao (1:1)  Thaïch cao  Cellulose: khoâng caàn chaát keát dính, taùch caùc chaát thaân nöôùc  Polyamid: taùch caùc phenol  Nhöïa trao ñoåi ion: silicagel sulfon hoùa Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Chaát haáp phuï ñaõ ñöôïc tieâu chuaån hoùa  Chaát haáp phuï coù chaát keát dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr G, oxyd nhoâm G troän saún 5% thaïch cao  Chaát haáp phuï khoâng keát dính: silicagel H, oxyd nhoâm H  Chaát haáp phuï coù theâm chaát chæ thò huyønh quang: silicagel GF 254 , silicagel HF 254 ,  Baûn saéc kyù traùng saún vôùi giaù ñôû: thuûy tinh, giaáy nhoâm, polymer  Öu ñieåm baûn moûng traùng saún  Ñoä oån ñònh cô hoïc cao, thao taùc ñôn giaûn vaø deã daøng hôn  Tính ñoàng nhaát cao: thích hôïp ñeå baùn ñònh löôïng, ñònh löôïng  Hieäu löïc taùch cao hôn baûn moûng traùng thuû coâng Trang thieát bò – Pha tónh Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Tính chaát Caùc chaát ñöôïc Pha tónh Ñoä acid Hoaït tính Taùc duïng phaân chia duøng ñeå phaân taùch Silicagel Acid Coù hoaït tính Haáp phuï Haàu heát taát caû Daãn chaát siloxan Phaân boá Caùc chaát ít phaân cöïc Oxyd nhoâm Base Coù hoaït tính Haáp phuï Hydrocarbon, alcaloid, chaát maøu thöïc phaåm, lipid Caùt bieån Phaân boá Ñöôøng, acid beùo Kieselguhr Trung tính Khoâng coù hoaït tính Phaân boá Ñöôøng, caùc triglycerid, caùc acid beùo baäc cao Magie diphosphat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol Magie trisilicat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol Calci hydroxid Base Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol Calci phosphat Base yeáu Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol Calci sulfat Hoaït tính yeáu Haáp phuï Carotinoic, tocopherol, caùc acid beùo glycerid kî nöôùc Silicagel + oxyd nhoâm (1:1) Acid + base Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát maøu, caùc acid barbituric Saét hydroxid Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát phaân cöïc Than Coù hoaït tính Haáp phuï Caùc chaát khoâng phaân cöïc Cellulose Thöïc teá trung tính Khoâng coù hoaït tính Phaân boá Acid amin, carbohydrat, nucleotid Polyamid Trung tính Khoâng coù hoaït tính (Trao ñoåi ?) Caùc flavon Polyacrylonitril Trung tính Khoâng coù hoaït tính (Trao ñoåi, phaân boá ?) Caùc antoxyan Nhöïa trao ñoåi ion Acid + base Khoâng coù hoaït tính Trao ñoåi Acid nucleic, nucleotid, ion kim loaïi, halogenic Gel sephadex Raây phaân töû Polymer, protein, phöùc kim loaïi Pha ñoäng Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Thay ñoåi tuøy theo cô cheá taùch  Taêng cöôøng söùc röûa giaûi: thöôøng keát hôïp 2 dung moâi  Khoâng coù qui taéc cuï theå ñeå löïa choïn dung moâi  Saéc kyù sô boä ñeå thaêm doø heä dung moâi  Neân choïn heä dung moâi ñôn giaûn vaø duøng loaïi tinh khieát  Höôùng daãn löïa choïn pha tónh vaø pha ñoäng:  Tính chaát cuûa maãu phaân tích: ñoä hoøa tan, ñoä phaân cöïc, soá löôïng vaø ñaëc tính caùc nhoùm chöùc  Cô cheá saéc kyù cuûa pha tónh  Dung moâi: ñoä bay hôi, ñoä nhôùt, ñoä tinh khieát, söï phaân lôùp  Chaát phaân tích ion hay phaân cöïc: dung moâi phaân cöïc nhö butanol ‟ nöôùc, theâm acid acetic hoaëc amoniac  Pha tónh silicagel hoaëc caùc chaát haáp phuï phaân cöïc khaùc: ñoä phaân cöïc pha ñoäng quyeát ñònh toác ñoä di chuyeån vaø R f  Ñieàu chænh söùc röûa giaûi cuûa pha ñoäng ñeå R f : 0,2 ‟ 0,8 ñaït ñoä phaân giaûi cöïc trò Pha ñoäng Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Moät soá nhoùm chöùc coù khaû naêng haáp phuï taêng daàn: CH=CH < OCH 3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH 2 < OH < COOH  Dung moâi vôùi söùc röûa giaûi (söùc dung moâi) taêng daàn: Dung moâi 0 Dung moâi 0 Dung moâi 0 Ether daàu hoûa 0,01 Ether etylic 0,38 Acetonitril 0,65 Hexan 0,01 Cloroform 0,40 Pyridin 0,71 Heptan 0,01 Methylen clorid 0,42 Dimethyl sulfoxid 0,76 Cyclohexan 0,04 Dicloroetan 0,49 Isopropanol 0,82 Carbon tetraclorid 0,18 Aceton 0,56 Ethanol 0,88 Ether isopropylic 0,28 Dioxan 0,56 Methanol 0,95 Toluen 0,29 Butanol 0,56 Nöôùc 1,00 Benzen 0,32 Ethyl acetat 0,58 Trang thieát bò – Baûn moûng Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Baûn moûng dính chaéc: chaát haáp phuï ñöôïc troän theâm 5 ‟ 15% chaát keát dính (thaïch cao, tinh boät, dextrin)  Baûn moûng khoâng dính chaéc 5 x 20 10 x 20 20 x 20 (cm) Trang thieát bò – Bình saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Bình ñaùy troøn, vuoâng hoaëc chöõ nhaät Caùc loaïi bình saéc kyù Caùc böôùc tieán haønh khi thöïc hieän SKLMù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Chuaån bò baûn moûng, bình saéc kyù thích hôïp, pha ñoäng  Chaám dung dòch leân baûn moûng: 1-10g  Khai trieån saéc kyù  Phaùt hieän caùc veát treân baûn moûng  Maøu saéc töï nhieân cuûa veát  Phun thuoác thöû hieän maøu  Soi döôùi ñeøn UV 254 hoaëc 365 nm: theâm chaát phaùt huyønh quang khoâng tan vaøo pha tónh  Duøng maùy ño maät ñoä quang (densitometer): ño cöôøng ñoä tia phaûn xaï töø beà maët baûn moûng khi soi döôùi ñeøn UV. Chaát phaân tích haáp thuï böùc xaï ñöôïc ghi laïi thaønh pic saéc kyù Maãu Trieån khai saéc kyù x x x O X A F Thuoác thöû hieän maøu Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Thuoác thöû Maøu cuûa veát ÖÙng duïng phaân tích Thuoác thöû chung Acid phosphomolypdic Xanh toái Nhieàu chaát höõu cô Acid sulfuric ñaëc Naâu ‟ ñen Taát caû caùc chaát höõu cô Hôi iod Naâu Nhieàu chaát höõu cô Thuoác thöû choïn loïc Ninhydrin Hoàng ‟ tím Acid amin, caùc nhoùm chöùc amin 2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, ñoû Caùc hôïp chaát carbonyl Xanh hoaëc luïc bromocresol Vaøng Caùc acid höõu cô 2,7 fluorescein Vaøng ‟ luïc Nhieàu chaát höõu cô Vanilin/acid sulfuric Xanh ‟ luïc ‟ hoàng Alcol, ceton Rhodamin B Huyønh quang ñoû Caùc chaát lipid Anisaldehyd/SbCl 3 Nhieàu maøu Caùc chaát steroid Diphenylamin/Zn 2+ Nhieàu maøu Caùc chaát baûo veä thöïc vaät Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ R f (Retardation factor) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM 0V V d d R M R f  ===> 0  Rf  1 x x dM dR 1 2 Ñöôøng dung moâi - R f = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån, naèm taïi ñieåm xuaát phaùt - R f = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dung moâi - d R : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch - d M : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi - v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch - V 0 : vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ R f (Retardation factor) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM - Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán R f  Chaát löôïng vaø hoaït tính cuûa chaát haáp phuï  Chieàu daøy cuûa lôùp moûng, quaûng ñöôøng saéc kyù, löôïng chaát chaám  Vò trí vaø soá löôïng chaát caàn taùch treân baûn moûng  Thaønh phaàn vaø ñoä tinh khieát cuûa pha ñoäng  Phöông phaùp khai trieån saéc kyù  Ñoä baõo hoøa cuûa dung moâi trong bình saéc kyù (hieän töôïng “bôø”)  Aûnh höôûng cuûa caùc caáu töû khaùc coù trong thaønh phaàn hoãn hôïp caàn taùch  Ñoä aåm, nhieät ñoä vaø pH... Hieän töôïng “bôø” Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM: Heä soá löu giöõ R f (Retardation factor) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM - Söû duïng chaát ñoái chieáu R X R X R A OX OF OA OF OX OA s f f ( ) ( ) ( )    * Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù R f vaø R s baèng nhau. * Hai chaát phaûi coù cuøng löôïng chaám nhö nhau vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù x x x O X A F Saéc kyù ñoà saéc kyù ñoái chöùng Thoâng soá ñaëc tröng cuûa SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM f f R RM R R d dd k     1 ' 2 16        W d N R x x dM dR 1 2 Ñöôøng dung moâi WB dA dB WA W BA AB s WW dd R    ][2 Hệ số dung lượng Số đĩa lý thuyết biểu kiến Độ phân giải Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Saéc kyù moät chieàu  Saéc kyù hai chieàu Maãu phaân tích nhieàu chaát  Saéc kyù moät chieàu khoâng ñuû ñoä tin caäy Kyõ thuaät saéc kyù hai chieàu Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Saéc kyù ñoà SKLM hai chieàu cuûa moät vaøi acid amin. Dung moâi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine. Dung moâi B: Chloroform/benzyl alcohol/acid acetic. 1. acid aspartic, 2. acid glutamic, 3. serine, 4. - alanine, 5. glycine, 6. alanine, 7. methionine, 8. valine, 9. isoleucine, 10. cysteine. Dung moâi A Dung moâi B Saéc kyù ñoà caùc daãn chaát xanthin treân baûn moûng pha ñaõo C-18. Pha ñoäng: metanol/K 2 HPO 4 0,1 M (55:45 tt/tt). Phaùt hieän: hôi iod. Thôøi gian khai trieån: 1 giôø. Caùc giaù trò R f : theobromin 0,68; theophylin 0,56; cafein: 0,44; 3-isobutyl- metyl xanthin 0,21. Ñöôøng dung moâi Ñöôøng chaám maãu Caùc kyõ thuaät khai trieån SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Saéc kyù cheá hoùa  Taùch caùc chaát vôùi löôïng nhoû trong tröôøng hôïp khoâng theå taùch baèng caùc phöông phaùp khaùc Kyõ thuaät saéc kyù cheá hoùa (ñaùnh daáu vaø caïo rieâng töøng vuøng) Dung moâi Dung moâi CHP chöùa A CHP chöùa B phaûn haáp phuï ÖÙng duïng cuûa SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Ñònh tính vaø thöû tinh khieát  Döïa vaøo R f  Saéc kyù so saùnh chaát thöû X vôùi chaát ñoái chieáu A treân cuøng moät saéc ñoà  Ñieàu kieän X laø A: R f (X) = R f (A) vôùi caùc heä dung moâi khaùc nhau  Chaát thöû ñöôïc coi laø tinh khieát khi treân saéc kyù ñoà khoâng coù veát laï  Baùn ñònh löôïng – ñònh löôïng  Taùch chieát chaát phaân tích trong veát saéc kyù baèng dung moâi thích hôïp, laøm saïch dòch chieát, ñònh löôïng baèng kyõ thuaät thích hôïp: ít duøng, toán thôøi gian  Ñònh löôïng tröïc tieáp treân baûn moûng: ño dieän tích hay cöôøng ñoä maøu veát saéc kyù  Duøng maùy ño maät ñoä quang (Densitometer): chieáu chuøm tia vaøo veát saéc kyù vaø ño cöôøng ñoä haáp thuï hoaëc huyønh quang  Xöû lyù aûnh vôùi camera kyõ thuaät soá ñoä phaân giaûi cao: queùt baûn moûng vôùi heä thoáng phaân tích thu nhaän hình aûnh cuûa veát saéc kyù. Xöû lyù döõ lieäu aûnh baèng maùy tính SKLM hieäu naêng cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Söû duïng baûn moûng traùng saün coù beà daøy 0,1 mm  Pha tónh silica vaø pha lieân keát siloxan 5 m  Taêng ñoä tin caäy cuûa keát quaû phaân tích  Taêng ñoä phaân giaûi vaø ñoä nhaïy:  Veát saéc kyù nhoû hôn  Thôøi gian saéc kyù ngaén hôn  Löôïng dung moâi duøng ít hôn  Sai soá cuûa phöông phaùp: 5 ‟ 10% chuû yeáu do ñöa maãu leân baûn moûng SKLM hieäu naêng cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM SKLM hieäu naêng cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM SKLM hieäu naêng cao (High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ñaùnh giaù SKLM: Öu ñieåm Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Phöông phaùp ñôn giaûn: thöû tinh khieát, xaùc ñònh giôùi haïn taïp chaát, phaùt hieän caùc chaát laï, ñònh tính, baùn ñònh löôïng vaø ñònh löôïng  Söû duïng phoå bieán ñeå nghieân cöùu, saøng loïc  Kyõ thuaät vaø thieát bò ñôn giaûn  Söû duïng linh hoaït: deã thay ñoåi chaát haáp phuï, dung moâi khai trieån cuõng nhö thuoác thöû phaùt hieän, keå caû caùc loaïi thuoác thöû aên moøn maø saéc kyù giaáy khoâng duøng ñöôïc  Thôøi gian tieán haønh nhanh (15 - 30 phuùt, toái ña vaøi giôø) vaø ñoä nhaïy cao hôn saéc kyù giaáy  Laø moät phöông phaùp vi phaân tích  Coù theå duøng ñeå tìm caùc ñieàu kieän toái öu cho söï taùch baèng saéc kyù loûng treân coät  Phaïm vi öùng duïng roäng raõi: kieåm tra hieäu quaû chieát taùch cuûa caùc phöông phaùp khaùc nhö saéc kyù coät, chieát xuaát, chöng caát, taùi keát tinh,  Phaùt hieän taát caû caùc chaát keå caû caùc chaát khoâng di chuyeån theo pha ñoäng  Thöïc hieän taùch deã daøng caùc maãu coù nhieàu thaønh phaàn Ñaùnh giaù SKLM: Nhöôïc ñieåm Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Trò soá R f coù ñoä laëp laïi thaáp do thaønh phaàn pha ñoäng thay ñoåi trong quaù trình khai trieån saéc kyù  Taêng giaõn roäng vết do khueách taùn vì toác ñoä doøng pha ñoäng thaáp