Ảnh hưởng của axit boric lên khả năng sống của tế bào gốc dây chằng nha chu người in vitro

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 161 ẢNH HƯỞNG CỦA AXIT BORIC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG CỦA TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI IN VITRO Nguyễn Thị Thu Sương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ**, Phạm Anh Vũ Thụy*** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định mức độ ảnh hưởng của axit boric ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sống của tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs), nhằm cung cấp bằng chứng cho việc lựa chọn nồng độ axit boric thích hợp để ứng dụng trong lâm sàng. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Axit boric được chuẩn bị thành các dung dịch có nồng độ 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3% và 6%. Ảnh hưởng của axit boric lên hPDLSCs được xác định bằng phương pháp MTT. hPDLSCs được ủ với boric axit trong 24 giờ, sau đó, ủ trong dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide) trong 4 giờ để tạo tinh thể formazan. Dung dịch Ethanol/DMSO được thêm vào để hòa tan tinh thể formazan và tạo dung dịch màu tím hấp thu tại bước sóng 570 nm. Mức độ độc tính của axit boric được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993 - 5: 2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào và tỷ lệ tăng trưởng tương đối (relative growth rate - RGR). Kết quả: Quan sát hình thái tế bào sau khi ủ trong dung dịch axit boric 24 giờ ở các nồng độ thí nghiệm được ghi nhận như sau: Ở nồng độ 0,5% và 0,75%, tế bào đồng nhất, bám dính và trải đều, có ít tế bào co lại. Ở nồng độ 1% và 1,5%, tế bào co lại nhiều, mật độ ít, bám dính thưa thớt trên bề mặt đĩa nuôi. Ở nồng độ 3% và 6%, tế bào trải dài trên bề mặt đĩa nuôi, một số ít tế bào co lại. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nồng độ axit boric tăng dần thì trung bình RGR giảm tương ứng. Mức độ độc tính tế bào được xác định ở nồng độ 0,5% và 0,75% là cấp 1 (75% - 99%), ở nồng độ 1% và 1,5% là cấp 2 (50% - 74%), ở nồng độ 3% và 6% là cấp 4 (1% - 24%). Kết luận: Như vậy, theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào và tỷ lệ tăng trưởng tương đối nghiên cứu cho thấy axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs. Từ khóa: Axit boric, độc tính tế bào, tế bào gốc dây chằng nha chu người. ABSTRACT IN VITRO VIABILITY OF HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT STEM CELLS INFLUENCED BY BORIC ACID Nguyen Thi Thu Suong, Nguyen Thi Ngoc My, Pham Anh Vu Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 161 – 169 Objective: This study was conducted to determine the dose-dependent effect of boric acid on the viability of human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), thereby providing the basis to select appropriate boric acid concentrations for clinical application. Materials and methods: Boric acid was prepared in different concentrations of 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%, 3% and 6%. The effect of those solutions on hPDLSCs was determined by the MTT method. The hPDLSCs were incubated with boric acid solutions for 24 hours, then continuously with MTT solution (3- (4.5-dimethylthiazol- 2-yl) -2.5-diphenyl tetrazolium bromide) for 4 hours to promote the formation of Formosan crystals. The *Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ sinh học động vật, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM, *** Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. HCM. Tác giả liên lạc: PGS. TS. Phạm Anh Vũ Thụy ĐT: 0916 810 874 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 162 Ethanol/DMSO solution was then added to dissolve the Formosan crystals and generate a purple solution that was absorbed at a 570 nm wavelength. The cellular toxicity grades were determined according to ISO 10993 - 5: 2009, simultaneously cell morphology and the relative growth rate (RGR) were also observed. Results: Cellular morphology after incubation with boric acid solution at different concentrations for 24 hours was performed as follows: At concentrations of 0.5% and 0.75%, almost hPDLSCs were homogeneous, adherent and uniformly spread while only a handful of cells shrinkage was observed. At concentrations of 1% and 1.5%, the amount of shrinkage hPDLSCs was much more, the less cellular density and sparse adhesion was also recorded on the plates surface. At concentrations of 3% and 6%, these cells stretch over the cultured surface, with a few contracted cells. After measuring the optical density at 570 nm and processing the data, the RGR values were classified according to the cytotoxicity grades in accordance with ISO 10993 - 5: 2009; Level 0 and 1 toxicity were confirmed as zero toxic to the cells. The results supported that when the concentration of boric acid increases, the average growth rate decreases correspondingly. Cellular toxicity was determined at level 1 for 0.5% and 0.75% concentrations (75% - 99%), level 2 for 1% and 1.5% concentrations (50% - 74%); level 4 for 3% and 6% concentrations (1% - 24%). Conclusion: With the results of cellular toxicity according to ISO 10993 - 5: 2009 in combination with observed cells morphology and calculated RGR, boric acid at 0.5% and 0.75% concentrations were confirmed to be non-cytotoxic to hPDLSCs. Keywords: Boric acid, cytotoxicity, human periodontal ligament stem cells. ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nha chu là bệnh nhiễm khuẩn mạn tính ảnh hưởng đến mô nâng đỡ răng gồm dây chằng nha chu và xương ổ răng, có khả năng dẫn đến mất răng. Lấy cao răng và xử lý mặt chân răng được coi là phương pháp bắt buộc trong điều trị viêm nha chu. Tuy nhiên, phương pháp này không thể loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong những trường hợp phức tạp(12). Các phương pháp điều trị hỗ trợ hiện nay đang được sử dụng khá phổ biến như kháng sinh toàn thân hay tại chỗ, các dung dịch kháng khuẩn bơm rửa túi nha chu hay súc miệng. Trong đó sử dụng dung dịch kháng khuẩn bơm rửa kết hợp với lấy cao răng và xử lý bề mặt chân răng là biện pháp thường quy trong điều trị viêm nha chu. Vì vậy, việc nghiên cứu một dung dịch có khả năng kháng khuẩn, không có tác dụng phụ cũng như không gây độc tính cho mô nha chu là điều đáng được quan tâm. Axit boric là axit của nguyên tố boron từ lâu đã được biết như một chất kháng khuẩn nhẹ và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của y học. Những hợp chất có chứa boron gần đây đã được nghiên cứu về khả năng kháng lại một số vi khuẩn liên quan đến bệnh nha chu như Prevotella intermedia (Pi), Porphyromonas gingivalis (Pg), Eubacterium nodatum (En) và Treponema denticola (Td)(9). Nghiên cứu ứng dụng tính kháng khuẩn của axit boric để điều trị viêm nha chu đang được quan tâm ngày càng nhiều, nhưng khá ít nghiên cứu in vitro về ảnh hưởng của nó đối với tế bào của mô nha chu. Tế bào gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs) được nuôi cấy từ mô dây chằng nha chu người, biểu hiện những dấu ấn (marker) của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73, CD90 và sở hữu những đặc tính đa tiềm năng có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương, tế bào tạo mô mỡ và tế bào sụn(11). hPDLSCs không chỉ có có vai trò quan trọng trong việc duy trì mà còn có khả năng thúc đẩy tái tạo mô nha chu và thường là lựa chọn ưu tiên hàng đầu trong công nghệ tái tạo và sửa chữa mô nha chu trong điều trị bệnh nha chu(1,3). ISO là liên đoàn tiêu chuẩn quốc tế nhằm nâng cao sự phát triển của tiêu chuẩn hóa, hoạt động như quá trình quản lý hài hòa để đảm bào sự an toàn, chất lượng và quy trình chế tạo thiết bị y tế. ISO 10993, phần 5 đưa ra Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 163 chỉ định về quy trình đánh giá độc tính in vitro thông qua thử nghiệm MTT. MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT viết tắt 3-(4, 5- Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide sẽ chuyển thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Do đó nếu số lượng tế bào sống càng lớn sẽ tạo ra lượng formazan càng lớn và làm chỉ số mật độ quang tăng(5). Thuận lợi của thử nghiệm MTT được ghi nhận là thời gian ủ MTT ngắn (4 giờ), hình ảnh tạo tinh thể forrmazan màu tím dễ quan sát và so sánh, kết quả đo mật độ quang nhanh chóng, đơn giản, dễ dàng thực hiện và kết quả đáng tin cậy(4). Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá độc tính in vitro của axit boric trên khả năng sống của hPDLSCs trong nghiên cứu này. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng Vật liệu và dòng tế bào nghiên cứu Axit boric nguyên chất được mua từ công ty Merck – Đức. Dung dịch axit boric 6% được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6 gr axit boric trong 100 ml môi trường nuôi cấy và lọc qua màng lọc 0,22 µm vô trùng. Dung dịch này được pha loãng tiếp tục bằng môi trường nhằm đạt được các nồng độ khảo sát. Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn là môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 Medium -DMEM/F12 (Sigma, Mỹ) có bổ sung 10% Fetal bovine serum - FBS (Sigma, Mỹ) và kháng sinh (100 UI/ml Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin – Sigma, Mỹ). Dung dịch MTT 5 mg/ml được chuẩn bị bằng cách hòa tan 50 mg MTT trong 10ml Phosphate Buffer Saline – PBS (Gibco, Mỹ) 1X và lọc qua màng lọc 0,22 µm vô trùng. Dung dịch MTT dùng trong thử nghiệm MTT được chuẩn bị bằng cách pha loãng trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 1:9. Dung dịch DMSO 20% được chuẩn bị bằng cách pha loãng 2 ml DMSO trong 10 ml môi trường nuôi cấy, được sử dụng làm nhóm chứng dương gây độc cho tế bào(2). Các hóa chất khác: Enzyme tách tế bào Trypsin (Sigma, Mỹ), thuốc nhuộm tế bào Trypan blue (Sigma, Mỹ), Ethanol (Sigma, Mỹ). Nguồn hPDLSCs được cung cấp từ phòng thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh (TEBM Lab) thuộc Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, đã được chứng minh biểu hiện những dấu ấn phân tử (marker) của tế bào gốc trung mô như CD44, CD73 và CD90 và cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năng có thế biệt hóa thành những loại tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro(11). Quy trình nghiên cứu Quy trình chuẩn bị tế bào Nguồn hPDLSCs ở thế hệ tế bào P3 được nuôi tăng sinh và cấy chuyền để thu nhận tế bào P4 với số lượng cần thiết cho các thí nghiệm. Các tế bào tăng sinh và hợp dòng (đạt độ bao phủ bề mặt nuôi cấy > 80%) được thu nhận để đánh giá độc tính của axit boric. Các bước thu nhận tế bào bao gồm: loại bỏ môi trường nuôi cấy và rửa tế bào bằng dung dịch PBS, tách tế bào bám khỏi bề mặt đĩa nuôi bằng enzym Trypsin-EDTA 0,25% và ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 3 phút. Môi trường nuôi cấy được bổ sung vào để bất hoạt Trypsin, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận cặn tế bào. Tế bào sau khi được thu nhận sẽ được xác định mật độ bằng cách nhuộm tế bào với trypan blue (tỉ lệ 1:1) và nạp vào buồng đếm hồng cầu được đếm dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần. Huyền phù dịch tế bào với mật độ 105 tế bào/ml vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng và nuôi tế bào ở 37ºC, 5% CO2 qua đêm. Quy trình ủ tế bào bằng axit boric Môi trường trong đĩa 96 giếng được loại bỏ. Các dung dịch axit boric thí nghiệm 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3%; 6%; môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (chứng âm) và DMSO 20% (chứng dương) được bổ sung vào các giếng tế bào và tiếp tục Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 164 nuôi cấy ở 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ. Quy trình thử nghiệm MTT Sau 24 giờ, hút hết dịch trong các giếng và thay vào đó dung dịch MTT. Sau 4 giờ, hút hết dung dịch MTT, thay vào đó dung dịch DMSO/Ethanol (tỷ lệ 1:1), huyền phù đều trong mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan tạo thành dung dịch đồng nhất và đo độ hấp thu quang học (Optical density – OD) ở bước sóng 570nm. Đánh giá kết quả Đánh giá hình thái tế bào: Hình thái tế bào sau khi cấy và sau khi ủ trong dung dịch axit boric 24 giờ được ghi nhận bằng hình ảnh chụp dưới kính hiển vi đảo pha CKX53 (Olympus, Nhật) cùng phần mềm ghi nhận hình ảnh (CellSens) và so sánh với nhóm chứng. Đánh giá ảnh hưởng của axit boric sau thử nghiệm MTT dựa theo hướng dẫn ISO 10993, chúng tôi chia mức độ độc tế bào thành năm giai đoạn bằng cách phân tích tỉ lệ tăng trưởng tương đối (RGR) được xác định theo công thức(5,8): RGR (%) = x 100% OD570e: giá trị trung bình của mật độ quang của dung dịch axit boric được đo ở bước sóng 570 nm. OD570b: giá trị trung bình của mật độ quang của môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn được đo ở bước sóng 570 nm. RGR được tóm tắt trong Bảng 1 với mức độ 0 và 1 được xác định là không gây độc cho tế bào(8). Số liệu được xử lý thống kê bằng kiểm định One Sample T-Test trên phần mềm SPSS phiên bản 20. Khác biệt có ý nghĩa thống kê được xác nhận với các trường hợp giá trị p < 0,05. Bảng 1. Mức độ gây độc tế bào theo tiêu chuẩn ISO10993-5:2009(8) RGR (%) Gây độc tế bào 100 0 75-99 1 50-74 2 25-49 3 1-24 4 0 5 KẾT QUẢ Hình thái hPDLSCs là dạng tế bào bám dính trải rộng, nhân lớn hình oval và có nhiều đuôi bào tương, hình dạng đồng đều bám dính trên bề mặt nuôi cấy (Hình 1. Mũi tên). Tế bào tăng sinh và hợp dòng có dạng trải dài và cuộn theo hình cung tròn. Những đặc điểm hình thái này được duy trì ổn định qua các thế hệ cấy chuyền tiếp theo. Sau khi ủ hPDLSCs trong dung dịch axit boric ở các nồng độ 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3% và 6% cũng như nuôi tế bào ở môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (chứng âm) và DMSO 20% (chứng dương) sau 24 giờ, chúng tôi thu được kết quả đã trình bày ở hình 2 đến hình 5 và bảng 2. A B Hình 1. Hình thái hPDLSCs khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược vật kính 4x (A) và vật kính 10x (B). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 165 Ở nhóm chứng âm (n = 3), hPDLSCs có dạng đồng nhất, bám dính và trải đều bề mặt nuôi cấy (Hình 2A). Ở nhóm chứng dương (n = 3), hình dạng tế bào thay đổi, đa số tế bào co tròn và biến dạng, bong tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 2B). Quan sát hình 3, có thể thấy được khi tăng nồng độ axit boric lên thì hình thái tế bào cũng thay đổi theo. Cụ thể ở nồng độ 0,5% và 0,75% đa số tế bào có hình dạng tương tự ở nhóm chứng âm, tế bào đồng nhất, bám dính và phủ đều bề mặt nuôi cấy, tuy nhiên có 1 ít tế bào phản ứng thay đổi hình dạng co lại một phần. Ở nồng độ 0,75%, hình ảnh tế bào tương tự ở nồng độ 0,5% nhưng có nhiều tế bào co lại hơn. Ở nồng độ 1% và 1,5%, tế bào co lại nhiều, không còn trải đều, bám dính thưa thớt trên bề mặt đĩa nuôi. Ở nồng độ 3% và 6%, các tế bào không co lại mà trải dài hơn, không có hình dạng nhất định, bám dính lỏng lẻo trên bề mặt đĩa. Sau khi được ủ với dung dịch MTT, tinh thể formazan có màu tím được hình thành do phản ứng của enzyme sucinate dehydrogenase hiện diện trong quá trình hô hấp của ti thể trong tế bào sống với chất MTT. Số lượng tế bào sống càng lớn thì lượng tinh thể formazan được tạo thành càng nhiều. Ở nhóm chứng âm (Hình 4A) ta thấy hình ảnh tinh thể formazan màu tím với mật độ cao, che phủ hầu hết bề mặt đĩa nuôi, các tinh thể này có dạng đồng nhất và tương ứng với mức độ hợp dòng của tế bào. Ở nhóm chứng dương (Hình 4B) một số ít tinh thể formazan được tạo ra tuy nhiên chúng không có hình dạng như ở nhóm chứng âm, không có sự bám dính trên bề mặt đĩa nuôi tương ứng với sự chết của tế bào khi quan sát hình thái ở trên. Khi tăng nồng độ axit boric thì sự hình thành tinh thể forrmazan giảm dần, kết quả được thể hiện đồng thời qua hình ảnh đại thể của tế bào (Hình 5) và kết quả đo RGR (Bảng 2). Cụ thể ở nồng độ axit boric 0,5% kết quả RGR = 92,03 ± 6,58% thể hiện mức độ hình thành tinh thể formazan nhiều nhất trong tất cả các nhóm thí nghiệm và gần bằng nhóm chứng âm. Ở nồng độ axit boric 0,75%, kết quả RGR thu được là 89,9 ± 5,5% cho thấy số lượng tinh thể formazan được tạo ra thấp hơn so với nồng độ axit boric 0,5% tuy nhiên sự khác biệt này không lớn (< 1%). Đối với 2 nhóm thí nghiệm 1% và 1,5% tương ứng có chỉ số RGR lần lượt giảm dần là 77,27 ± 5,02% và 64,61 ± 6,36%, cho thấy số lượng tinh thể formazan được hình thành ít hơn so với nhóm chứng âm và 2 nhóm nồng độ 0,5% và 0,75%, các tinh thể formazan thưa thớt, không phủ kín bề mặt đĩa nuôi. Trong khi đó, ở nồng độ 3% và 6%, không còn quan sát được các tinh thể formazan được tạo thành, do các tế bào đã bong tách hết khỏi bề mặt đĩa, hình ảnh được ghi A B Hình 2. hPDLSCs ở nhóm chứng âm: môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (A) và nhóm chứng dương: dung dịch DMSO 20% (B). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 166 nhận tương tự như ở nhóm chứng dương. Đồng thời, kết quả RGR cũng rất thấp và gần bằng nhóm chứng dương (3% là 14,79 ± 1,5% và 6% là 13,23 ± 1,58%). Kết quả được ghi nhận theo Bảng 2, ở nồng độ axit boric 0,5% và 0,75% mức độ độc tính ở mức độ 1, nồng độ axit boric 1% và 1,5% độc tính ở mức độ 2, nồng độ axit boric 3% và 6%, gây độc ở mức độ 4, bằng với mức độ độc tính ở nhóm chứng dương. Với mức độ độc tính được xác nhận ở mức 0 và 1 là không gây độc đối với tế bào, vì vậy, có thể kết luận axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs. Bảng 2. Trung bình phần trăm hPDLSCs sống ở các nồng độ của dung dịch axit boric. Nồng độ AB (%) 0,5 (n=3) 0,75 (n=3) 1 (n=3) 1,5 (n=3) 3 (n=3) 6 (n=3) TB ± Độ lệch chuẩn 92,03±6,58 89,9±5,5 77,27±5,02 64,61±6,36 14,79±1,5 13,23±1,58 Giá trị p 0,046 0,042 0,515 0,105 <0,001 <0,001 Mức độ độc tính (8) 1 1 2 2 4 4 p: so sánh trung bình phần trăm tế bào sống của mỗi nồng độ axit boric với 75%. Kiểm định One Sample T-Test. A B C D E F Hình 3. hPDLSCs sau 24 giờ ủ trong các nồng độ axit boric 0,5% (A), 0,75% (B), 1% (C), 1,5% (D), 3% (E) và 6% (F) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 167 A B C D E F Hình 5. Sự hình thành tinh thể formazan đối với các nồng độ axit boric 0,5% (A), 0,75% (B), 1% (C), 1,5% (D), 3% (E) và 6% (F). Hình 4. Sự hình thành tinh thể formazan đối với chứng âm: môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (A) và chứng dương: dung dịch DMSO 20% (B). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 168 0, 5% 0, 75 % 1% 1, 5% 3% 6% CM D M SO 20 % 0 50 100 150 BÀN LUẬN Thông qua thử nghiệm MTT theo tiêu chuẩn ISO10993 - 5: 2009 đánh giá ảnh hưởng của axit boric lên khả năng sống của hPDLSCs, có thể ghi nhận được khi nồng độ axit boric tăng dần thì khả năng sống của tế bào giảm dần. Hình ảnh tế bào khi ủ ở các nồng độ axit boric trong 24 giờ đều cho thấy tế bào có phản ứng thay đổi khác so với ban đầu. Điều này có thể do bản chất axit boric là một axit, nên khi hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào sẽ làm thay đổi độ pH trung tính trong môi trường này dẫn đến phản ứng của tế bào khi tiếp xúc với dung dịch. Tuy nhiên ở nồng độ 3% và 6%, tế bào không co lại mà trải dài trên bề mặt đĩa nuôi, có khả năng là do việc trực tiếp tiếp xúc với nồng độ quá cao, tế bào không kịp phản ứng co lại. Khi được ủ với dung dịch MTT trong 4 giờ, lượng tinh thể formazan tạo ra tương ứng với hình ảnh tế bào ủ trong các nồng độ axit boric, số lượng tinh thể formazan giảm dần khi nồng độ axit boric tăng dần. Kết quả RGR cũng phù hợp với những hình ảnh dược thấy sau thí nghiệm. Nghiên cứu cho thấy axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs, tuy nhiên hình dạng tế bào có thay đổi một phần. Apdik và cs (2015) đánh giá độc tính của axit boric trên tế bào gốc mô mỡ người bằng phương pháp MTS (3- (4,5-di-methyl-tiazol-2-yl) -5- (3- carboxy-methoxy-phenyl) -2 (4-sulfo-phenyl) - 2H- tetrazolium) sau 24 giờ, đã chứng minh axit boric không gây độc trên tế bào này, tuy nhiên nồng độ khảo sát ở đây rất thấp 0,005mg/ml - 2mg/ml (0,0005 % - 0,2%)(2). Nghiên cứu của chúng tôi cũng có khuynh hướng tương đồng, khi kết quả cho thấy ở nồng độ thấp nhất trong các nồng độ nghiên cứu của axit boric là 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs. Trong một nghiên cứu khác của Saglam và cs (2013) đánh giá độc tính của axit boric so với chlorhexidine qua thử nghiệm Water soluble tetrazolium salt (WST) sau 24 giờ, đã chứng minh được axit boric ở các nồng độ thấp hơn 0,75% không gây độc cho nguyên bào sợi nướu và nguyên bào sợi dây chằng nha chu(10). Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát độc tính của axit boric từ nồng độ 0,5% trở lên với mục đích tìm được nồng độ tối ưu có thể vừa có tác dụng kiềm khuẩn, diệt khuẩn trên lâm sàng mà vừa không gây độc cho tế bào, những nồng độ quá thấp sẽ không thể cho tác dụng như mong muốn. Karaarslan và cs (2005) đã chứng Các nhóm thí nghiệm Phần trăm tế bào sống Biểu đồ 1. Phần trăm hPDLSCs sống ở các nhóm thí nghiệm sau 24 giờ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 169 minh được ở nồng độ tương đương hoặc hơn 0,5% axit boric có tác dụng ức chế sự phát triển trên loài Aspergillus và Candida albicans, ở nồng độ thấp hơn dường như không có tác dụng đó(7). Một nghiên cứu khác của Saglam và cs (2013) cũng đã kết luận ở nồng độ 0,75% axit boric có tác dụng làm giảm độ sâu túi nha chu và giảm chảy máu nướu ở những bệnh nhân viêm nha chu mạn(10). Kết quả này cũng được Kanoriya và cs (2017) chứng minh tương tự khi sử dụng gel axit boric 0,75%, kết quả sau 3 - 6 tháng, độ sâu túi nha chu và tình trạng chảy máu nướu giảm hơn ở những bệnh nhân viêm nha chu mạn(6). Có thể thấy, axit boric ở nồng độ 0,75% có hiệu quả đáng kể trong điều trị viêm nha chu mạn trên lâm sàng. Trong tương lai, cần có thêm nghiên cứu lâm sàng so sánh hiệu quả hỗ trợ điều trị túi nha chu giữa hai nồng độ axit boric 0,5% và 0,75% để khẳng định nồng độ cụ thể vừa có hiệu quả trong điều trị vừa không gây độc cho tế bào mô nha chu. KẾT LUẬN Đánh giá ảnh hưởng của axit boric lên khả năng sống của tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993 - 5: 2009 thông qua quan sát hình ảnh và phương pháp MTT, nghiên cứu này cho thấy axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% đều không gây độc cho hPDLSCs, tuy nhiên tế bào có phản ứng thay đổi hình dạng một phần. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amireddy R, Rangarao S, Lavu V, Madapusi BT (2011). “Efficacy of a root conditioning agent on fibrin network formation in periodontal regeneration: A SEM evaluation”. Journal of Indian Society of Periodontology; 15(3): 228–234. 2. Apdik H, Dogan A, Demirci S, Aydın S, Sahin F (2015), “Dose- dependent effect of boric axit on myogenic differentiation of human Adipose-derived stem cells (hADSCs)”. Biological Trace Element Research; 165(2):123-30. 3. Dangaria SJ, Ito Y, Luan X, Diekwisch TG (2011). “Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces”. Stem cells and development; 20(10): 1659-1668. 4. Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M, Tuor U (1999). “The MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities”. Applied and environmental microbiology; 65(8): 3727-3729. 5. ISO E (2009). 10993-5. Biological Evaluation of Medical Devices. Part 5: Tests for In Vitro Cytotoxicity. International Organization for Standardization: Geneva, Switzerland. 6. Kanoriya D, Singhal S, Garg V, Pradeep AR, Garg S, Kumar A (2017). “Clinical efficacy of subgingivally-delivered 0.75% boric axit gel as an adjunct to mechanotherapy in chronic periodontitis: A randomized, controlled clinical trial”, Journal of investigative and clinical dentistry; 9(1): e12271. 7. Karaarslan A, Ozcan KM, Ozcan M (2005). “The efficacy of boric axit in otomycosis: an in vitro study”. The Mediterranean Journal of Otology; 1:83-6. 8. Li R, Guo W, Yang B, Guo L, Sheng L, Chen G, Li Y, Zou Q, et al (2011). “Human treated dentin matrix as a natural scaffold for complete human dentin tissue regeneration”. Biomaterials; 32(20): 4525-4538. 9. Luan Q, Desta T, Chehab L, Sanders VJ, Plattner J, Graves DT (2008). “Inhibition of experimental periodontitis by a topical boron-based antimicrobial”. Journal of dental research; 87(2): 148-152. 10. Saglam M, Arslan U, Buket Bozkurt S, Hakki SS (2013). “Boric axit irrigation as an adjunct to mechanical periodontal therapy in patients with chronic periodontitis: a randomized clinical trial”. Journal of periodontology; 84(9): 1297-1308. 11. Tran HLB, Doan VN, Le HTN, Ngo LTQ (2014). “Various methods for isolation of multipotent human periodontal ligament cells for regenerative medicine”. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal; 50(7): 597-602. 12. Waerhaug J (1978). “Healing of the dento-epithelial junction following subgingival plaque control: ii: as observed on extracted teeth”. Journal of Periodontology; 49(3): 119-134. Ngày nhận bài báo: 10/06/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018