Ặc điểm sinh cellulases của chủng trichoderma VTCC-F-873

107 JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2017-0013 Natural Sci. 2017, Vol. 62, No. 3, pp. 107-113 This paper is available online at ĐẶC ĐIỂM SINH CELLULASES CỦA CHỦNG Trichoderma VTCC-F-873 Dương Minh Lam, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Kim Thảo và Nguyễn Phùng Thanh Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt. Nghiên cứu về enzyme và ứng dụng của chúng trong các quá trình công nghiệp đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Trong nghiên cứu này, chủng nấm Trichoderma VTCC-F-873 có hoạt tính CMCase đã được định loại đến loài là Trichoderma harzianum VTCC-F-873 dựa trên các đặc điểm hình thái và đặc điểm trình tự ITS đầy đủ. Điều kiện phù hợp nhất cho T. harzianum VTCC-F-873 sinh endoglucanase khi sử dụng môi trường Sabouraud có pH = 6, nhiệt độ nuôi cấy 30 oC, thời gian nuôi cấy 48 giờ (8.7 ± 0.205 U/mL). Khả năng sinh endoglucanase giảm khi môi điều kiện nuôi cấy thay đổi lên 35 oC, pH là 7 hoặc 8 và thời gian nhiều hơn 48 giờ. Những đặc điểm sinh trưởng và sinh enzyme của chủng là phù hợp cho định hướng công nghệ. Những nghiên cứu về đặc điểm của enzyme và tối ưu hóa điều kiện lên men của chủng này là cần thiết. Từ khóa: Trichoderma, cellulase, endoglucanase, VTCC-F-873. 1. Mở đầu Sử dụng cellulase và hemicellulase cho thức ăn gia súc bắt đầu từ những năm 1980 [1, 2] và đã tăng lên nhanh chóng trong trong hai thập niên qua ở các lĩnh vực công nghiệp đồ uống (bia và rượu vang), dệt, công nghiệp giấy và bột giấy [3-5]. Ngày nay, các enzyme cellulase thương mại chiếm khoảng 20 % thị trường enzyme thế giới, trong đó chủ yếu là cellulase được sinh ra bởi Trichoderma và Aspergillus [6]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Trichoderma spp. có khả năng sản xuất cellulase từ cơ chất như rơm, trấu, bã ngô và các cơ chất tương tự khác [7]. Giá thành của enzyme là yếu tố quyết định giá thành của sản phẩm chuyển hóa từ sinh khối lignocellulose [8, 9]. Hệ enzyme cần thiết để thủy phân cellulose bao gồm (1) endoglucanase phân hủy các sợi cellulose một cách ngẫu nhiên; (2) cellobiohydrolase giải phóng các phân tử đôi từ cả hai đầu của chuỗi cellulose; và (3) beta- glucosidase, sản xuất glucose từ chuỗi oligomer. Hiện nay có 265 loài Trichoderma được công nhận trong số 336 tên loài đã miêu tả [10]. Trichoderma spp. có mặt phổ biến trong môi trường đất, đặc biệt là trong đất nông nghiệp, đất rừng. Vai trò nổi bật của Trichoderma đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm và khẳng định là khả năng sinh enzyme cellulase, xylanase của chúng [11]. Trong những năm gần đây, nghiên cứu tìm kiếm enzyme từ các chủng vi sinh vật tự nhiên Ngày nhận bài: 28/2/2017. Ngày nhận đăng: 30/3/2017. Tác giả liên hệ: Dương Minh Lam, e-mail: duong.minhlam@gmail.com Dương Minh Lam, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Kim Thảo và Nguyễn Phùng Thanh 108 cũng như nghiên cứu sinh tổng hợp các loại enzyme tái tổ hợp nhằm ứng dụng vào các mục đích khác nhau được đẩy mạnh ở Việt Nam [12, 13]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày đặc điểm sinh endoglucanase của chủng Trichoderma VTCC-F-873. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu: Chủng Trichoderma VTCC-F-873 được thu thập từ bộ sưu tập giống chuẩn quốc gia, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Môi trường Sabouraud được dùng để nuôi cấy đánh giá hoạt tính endoglucanase; Môi trường PDA được dùng để nuôi cấy thu sinh khối, tách chiết ADN. Phương pháp định lượng cellulase [14]: Hoạt tính endoglucanase được xác định như sau: ống 1,5 mL chứa 450µL dung dịch 0.5% CMC trong đệm citrate 50 mM, pH = 4,8 được bổ sung 50 µL dịch nuôi cấy. Hỗn hợp được ủ ấm ở 50 oC trong 30 phút. 750 µL dung dịch DNS được bổ sung để dừng phản ứng. Toàn bộ hỗn hợp sau phản ứng được đun sôi trong vòng 5 phút. Làm nguội trong nước đá, pha loãng bằng nước cất 2 lần và xác định giá trị OD tại bước sóng ánh sáng 540 nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự nhưng với trình tự: dung dịch CMC được ủ ấm tại 50 oC trong thời gian 30 phút, sau đó bổ sung DNS trước rồi mới tới enzyme, đun sôi trong 5 phút, làm lạnh và xác định giá trị OD ở bước sóng ánh sáng 540 nm. Đường chuẩn D-Glucose: 450 µL dịch cơ chất CMC 0,5% trong đệm citrate 50 mM, pH = 4.8 được ủ ở 50 0C trong 30 phút. Sau đó, 50 µL dịch glucose đã pha loãng thành các nồng độ (0,0; 0,75; 1,25; 1,5; 1,75; và 2 mg/mL) và 750 µL DNS được bổ sung. Hỗn hợp được đun sôi trong vòng 5 phút và làm lạnh bằng nước và được đo OD ở bước sóng ánh sáng 540 nm. Tương quan giữa OD và lượng D-glucose được thể hiện qua phương trình: y = 23.84x + 1.878, với hệ số tin cậy của đường chuẩn: R2 = 0,997. Trong đó: y là hàm lượng D-glucose (mg/mL); x: là độ hấp thụ quang ở bước sóng 540 nm. 1 đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µM glucose trong điều kiện thí nghiệm. Phương pháp định danh: Tách chiết ADN theo phương pháp của Doyle and Doyle [15]; Phương pháp khuếch đại gen sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 [16]; So sánh và tìm trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI của Mỹ. Động thái sinh endoglucanase: chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường Sabouraud và hoạt tính enzyme được xác định tại các thời điểm 36 - 84 giờ, bước nhảy 12 giờ. Ảnh hưởng của pH môi trường: Môi trường được điều chỉnh pH từ 4 - 9 với bước nhảy 1 để nuôi cấy chủng nấm. Sau 72 giờ nuôi cấy, dịch được li tâm và xác định hoạt tính. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy: Môi trường được điều chỉnh nhiệt độ ở 3 mức là 25, 30 và 35 oC. Sau 72 giờ nuôi cấy, dịch được li tâm và xác định hoạt tính. 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Xác định khả năng sinh endoglucanase của chủng nghiên cứu Chủng nghiên cứu VTCC-F-873 được báo cáo là có hoạt tính CMCase và amylase. Đây là tổ hợp enzyme có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ như công nghệ chuyển hóa sinh khối thực vật, phế phụ phẩm nông nghiệp. Kết quả đánh giá định lượng khả năng sinh endoglucanase là 5.003 U/mL. Hoạt tính endoglucanase của chủng VTCC-F-873 trong điều kiện nuôi cấy như trên thể hiện mức độ khá cao so với một số Đặc điểm sinh endoglucanase của chủng Trichoderma VTCC-F-873 109 chủng đã được công bố. Gomes và cs [17] đã nghiên cứu chủng T. viride và thấy rằng chủng sinh endoglucanase mạnh nhất sau 144 giờ nuôi cấy ở 31,1 oC với hoạt tính là 3.37 U/mL. Khandoker và cs [18] đã nghiên cứu nâng cao hoạt tính của chủng T. viride tự nhiên từ 5.52 U/mL lên 11,28 U/mL với đột biến bằng tia UV và tới 14,61 U/mL với đột biến bằng EtBr . Để có những nghiên cứu sâu hơn về chủng này nhằm các định hướng ứng dụng khác nhau, định danh và nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp enzyme là cần thiết. 2.2.2. Định loại chủng Trichoderma VTCC-F-873 Trình tự đoạn ITS (Internal Transcribed Spacer) đầy đủ của chủng Trichoderma VTCC-F-873 gồm 583 nucleotide. Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng sử dụng tính năng nBlast trên dữ liệu ngân hàng gen của NCBI cho thấy trình tự của chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng 100% với chủng Trichoderma harzianum CTCCSJ-DK40554, 00111-1 và Hypoxylon lixii, trạng thái hữu tính của T. harzianum (Bảng 1). Kết quả tìm kiếm hiển thị tới 50 trình tự tương ứng xuất hiện đầu tiên, với độ phủ nucleotide so sánh là 99% và mức độ tương đồng là 100% đều là T. harzianum, cùng với đặc điểm hình thái của chủng nghiên cứu (kết quả không trình bày ở đây), cho phép chúng tôi khẳng định chủng là T. harzianum VTCC-F-873. Kết quả này phù hợp với kết quả nBlast search sử dụng trình tự đoạn 28S của chủng được công bố trên thông tin của chủng [19]. Trichoderma harzianum được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu và sản xuất enzyme và được đánh giá là an toàn cho người và động vật [20]. Như vậy, có thể sử dụng chủng T. harzianum VTCC-F-873 để tiếp tục nghiên cứu nâng cao hoạt tính và ứng dụng. Bảng 1. Trình tự tương đồng với trình tự ITS của Trichoderma VTCC-F-873 trên nBlast 2.2.3. Động thái sinh enzyme của chủng T. harzianum VTCC-F-873 Đánh giá động thái sinh enzyme của chủng luôn là thông tin quan trọng cần có trong các quy trình công nghệ. Trong nghiên cứu này, kết quả đánh giá động thái sinh enzyme của chủng T. harzianum VTCC-F-873 được thể hiện trong Hình 1. Dương Minh Lam, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Kim Thảo và Nguyễn Phùng Thanh 110 Hình 1. Động thái sinh endoglucanase của chủng T. harzianum VTCC-F-873 Kết quả nghiên cứu cho thấy trong điều kiện nuôi cấy, thời điểm sinh endoglucanase khá sớm từ 36 giờ hoạt tính đã lên tới 7.071 U/mL đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ (8,163 ± 0.236 U/mL). Sau đó, hoạt tính endoglucanase giảm dần tại các thời điểm kiểm tra 60, 72 và 84 giờ. Thời điểm đạt hoạt tính endoglucanase cực đại như vậy là rất nhanh so với các nghiên cứu trước đây ở chủng T. viride (144 giờ) [17] và tương ứng với thời gian nuôi cấy sinh của T. viride trong nghiên cứu của Khandoker và cs [18] là 48 giờ và ngắn hơn so với nghiên cứu của de Castro và cs [4] trên chủng T. harzianum IOC-3844 (72 giờ). 2.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh enzyme của T. harzianum VTCC-F-873 Giá trị pH của môi trường nuôi cấy là một trong những điều kiện quan trọng đối với vi sinh vật nói chung và đối với các chủng nấm được sử dụng trong công nghiệp nói riêng. T. harzianum VTCC-F-873 thích hợp với điều kiện môi trường có pH = 6. Tại các môi trường nuôi cấy có pH dưới 6, hoạt tính endoglucanase của chủng nghiên cứu là rất thấp. Trái lại, hoạt tính enzyme đạt tốt nhất khi nuôi cấy tại môi trường pH = 6 và giảm dần khi pH môi trường tăng lên 7, 8 hoặc 9, tương ứng (Hình 3). Hình 2. Khả năng sinh endoglucanase của T. harzianum VTCC-F-873 ở môi trường có pH khác nhau En do gl uc an as e (U /m L) Thời gian (giờ) En do gl uc an an se (U /m l) pH môi trường nuôi cấy Đặc điểm sinh endoglucanase của chủng Trichoderma VTCC-F-873 111 Đặc điểm sinh endoglucanase theo pH của chủng nghiên cứu khác biệt so với chủng T. viride trong nghiên cứu của Khandober và cs [18], thích hợp nhất tại 30 oC và pH = 4. Trong khi đó, chủng T. harzianum IOC-3844 sinh endoglucanase mạnh nhất tại giá trị pH = 5 [4]. 2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh enzyme của T. harzianum VTCC-F-873 Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn tới trao đổi chất của vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, T. harzianum VTCC-F-873 được nuôi cấy tại 3 giá trị nhiệt độ gần với điều kiện tự nhiên của Việt Nam là 25, 30 và 35 oC. Kết quả đánh giá khả năng sinh endoglucanase của chủng nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3. Hình 3. Khả năng sinh cellulase của chủng T. harzianum VTCC-F-873 ở các nhiệt độ khác nhau Gia nhiệt là một trong những trở ngại lớn trong công nghiệp khi sử dụng các chủng ưa lạnh hoặc ưa nhiệt. Kết quả nghiên cứu trên thể hiện dải nhiệt độ khá rộng phù hợp cho nuôi cấy và sinh tổng hợp enzyme của chủng nghiên cứu. Tuy nhiên, chủng nghiên cứu sinh endoglucanase tốt nhất ở nhiệt độ 30 oC (7.83±0.392 U/mL). Ở nhiệt độ 25 oC chủng vẫn có khả năng sinh tổng hợp enzyme (5.39 ± 0.233 U/mL) nhưng khả năng này yếu hơn so với ở nhiệt độ ngưỡng cao tại 35 oC (7.14 ± 0.25U/mL). Với khả năng thích ứng tốt với điều kiện nuôi cấy tại nhiệt độ ≥ 30, T. harzianum VTCC-F-873 có nhiều ưu điểm trong quá trình lên men, năng lượng điều khiển nhiệt độ sẽ giảm xuống, thuận lợi công nghệ, giảm giá thành. Nhiệt độ 30 oC là nhiệt độ phù hợp cho hầu hết các chủng nấm Trichoderma sinh enzyme [4, 17, 18]. 3. Kết luận Chủng Trichoderma VTCC-F-873 được định danh là Trichoderma harzianum và kí hiệu là T. harzianum VTCC-F-873 dựa trên đặc điểm hình thái và dữ liệu trình tự ITS đầy đủ. Chủng có khả năng sinh endoglucanase tốt nhất (8.7 ± 0.205 U/mL) tại điều kiện pH môi trường 6, ở 30 oC trong thời gian 48 giờ. Chủng có khả năng sinh trưởng và sinh enzyme tại điều kiện nhiệt độ 35 oC (hoạt tính enzyme vẫn trên 90% so với tại điều kiện 30 oC) và tại pH môi trường là 7 hoặc 8 (hoạt tính enzyme đạt 69 và 64 % tương ứng so với tại giá trị pH = 6). Lời cảm ơn. Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo đã cấp kinh phí thực hiện nghiên cứu này thông qua đề tài mã số B2015-17-78. En do gl uc an as e (U /m L) Nhiệt độ môi trường nuôi cấy (oC) Dương Minh Lam, Trương Thị Chiên, Nguyễn Thị Kim Thảo và Nguyễn Phùng Thanh 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thomke SM, Hesselman RK. 1980. The effect of feeding high-viscosity barley to pigs. Proceedings of the 31st meeting of the European Association of Animal Production, Commission on Animal Production, Munich, Germany, p5. [2] Vorage AGJ, Wolters H, Verdonschot T, Rombouts FM, Pilnik W. 1986. Effect of juicereleasing enzymes on juice quality. In: International Fruit Juice Symposium, The Hague(NL), May 1986. Zurich: Juris Druck Verlag, 453-462. [3] Wong KKY, Saddler JN. 1993. Applications of hemicellulasesin the food, feed, and pulp and paper industries. In: CoughlanMP, HazlewoodGP, editors. Hemicelluloseand hemicellulases. London: Portland Press, 127-143. [4] De Castro AM, Ferreira MC, da Cruz JC, Pedro KCNR, Carvalho DF, Leite SGF, Pereira N. 2010. High-yield endoglucanase production by trichoderma harzianum ioc-3844 cultivated in pretreated sugarcane mill byproduct. Enzyme Research, Article ID 854526, 8 pages doi:10.4061/2010/854526. [5] Idris ASO, Pandey A, Sukumaran RK. 2016. Production of endoglucanase from Trichoderma reesei RUT C30 and its application in deinking of printed office waste paper. Biologia, 71(3): 265-271. [6] Juturu V, Wu JC. 2014. Microbial cellulases: Engineering, production and applications. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 33: 188-203. [7] Chen Y, Huang J, Li Y, Zeng G, Zhang J, Huang A, Zhang J, Ma S, Tan X, Xu W, Zhou W. 2015. Study of the rice straw biodegradation in mixed culture of Trichoderma viride and Aspergillus niger by GC-MS and FTIR. Environmental Sciences and International Pollution Research, 22(13): 9807-15. [8] Wilson BD. 2009. Cellulase and biofuels. Current Opinion in Biotechnology 20: 295-299. [9] Zhang YHP. 2011. What is vital (and not vital) to advance economically- competitive biofuels production. Process in Biochemistry, 46: 2091-2110. [10] 59f0df4e7ff2a69017bd. [11] Diniz APD, Siqueira FDF, Facchin S, Campolina C, Horta R, Victória JMN, Kalapothakis E. 2014. Survey of microbial enzymes in soil, water, and plant microenvironments. The OpenMicrobiology Journal, 8: 25-31. [12] Đặng Thị Kim Anh, Thân Thị Hương, Nguyễn Thanh Thủy, Đặng Tất Thành, Vũ Nguyên Thành, Lisbeth Cecilia Olsson. 2016. Biểu hiện gen mã hóa endo- 1,4-β- xylanase chịu nhiệt, hoạt động trong môi truognwf axit nhằm ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14(3): 400-408. [13] Mai Thi Hang, Phuong Phu Cong, Ngo Thanh Xuan, Tran Huu Phong, Pham Cong Thieu, Nguyen Thanh Dat. 2008. Efficacy of hydrolytic enzyme preparation from Aspergillus spp. on the fattening broiler chicken fed with corn soybean based diets. International Journal of Poultry Science, 7 (10): 984-989. [14] Ghose TK. 1987. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry, 59: 257-268. Đặc điểm sinh endoglucanase của chủng Trichoderma VTCC-F-873 113 [15] Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19: 11-15. [16] Vilgalys R, Hester M. 1990. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteria, 172: 4238-4246. [17] Gomes IJ, Steiner W, Esterbauer H. 1992. Production of cellulase and xylanase by a wild strain of Trichoderma viride. Applied Microbiology and Biotechnology, 36 (5): 701-707. [18] Khandoker N, Mamun AA, Nafiz TN, Khan SN, Hoq DH. 2013. Strain improvement of Trichoderma viride through mutation for enhanced production of cellulase. Bangladesh Journal of Microbiology, 30: 43-47. [19] emid=44 [20] Muindi PJ, Hansen JF. 1981. Protein enrichment of cassava root meal by Trichoderma harzianum for animal feed. Journal of Science of Food and Agriculture, 32: 655-661. ABSTRACT Characteristics of endoglucanase production of Trichoderma VTCC-F-873 Dương Minh Lam, Trương Thi Chien, Nguyen Thi Kim Thao, Nguyen Phung Thanh Faculty of Biology, Hanoi National University of Education Research on enzymes and their application in industrial processes has attracted attention of many scientists. In this study, the strain Trichoderma VTCC-F-873 which possesses CMCase activity was identified into species as Trichoderma harzianum VTCC- F-873 based on morphological and ITS sequence analysis. T. harzianum VTCC-F-873 showed highest activity of endoglucanase in Sabouraud medium at pH = 6, incubation temperature 30 oC, incubation time of 48 hours (8.7 ± 0.205 U/mL). The endoglucanase production capacity slightly decreased when the culture conditions changed to 35 oC, at pH of 7 or 8 and more than 48 hours. The growth and enzyme production characteristics of the strain are suitable for technological orientation. Studies on the characteristics of the enzyme and optimizing the fermentation conditions of this strain are necessary. Keywords: Trichoderma, cellulase, endoglucanase, VTCC-F-873.