Luận văn Nghiên cứu xác định tổng số và tổng dạng ASEN trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH HỒNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VÀ TỔNG DẠNG ASEN TRONG MỘT SỐ HẢI SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRẮC QUANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH HỒNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VÀ TỔNG DẠNG ASEN TRONG MỘT SỐ HẢI SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRẮC QUANG Chuyên ngành: HOÁ PHÂN TÍCH Mã số: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ ĐỨC LIÊM THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả của luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009 Tác giả Phạm Thị Thanh Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Đức Liêm - Đại học Mỏ địa chất đã giao đề tài, hƣớng dẫn khoa học và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Đức Lợi - Phòng Khoa học và Kỹ thuật phân tích, Viện Hóa học đã hƣớng dẫn khoa học, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn. Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Lan Anh và các anh chị em thuộc phòng Khoa học và Kỹ thuật phân tích, Viện Hóa học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học, các thầy cô giáo trong tổ bộ môn hóa học phân tích - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, và hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè, ngƣời thân và đồng nghiệp đã quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 9 năm 2009 Tác giả Phạm Thị Thanh Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .............................................................. 3 1.1.Khái quát về nguyên tố Asen....................................................... 3 1.1.1.Tính chất lí học của Asen ......................................................... 3 1.1.2. Tính chất hóa học của Asen và các hợp chất ............................ 5 1.1.2.1. Các phản ứng hóa học của nguyên tố Asen ........................... 5 1.1.2.2. Tính chất hóa học của các hợp chất của Asen. ...................... 6 1.2. Ứng dụng của Asen[6] ............................................................... 9 1.2. Các dạng Asen trong môi trƣờng biển: .................................... 10 1.2.1. Những dạng Asen trong nƣớc biển và nƣớc mạch bùn biển. .. 11 1.2.2. Các dạng Asen trong động vật biển ....................................... 12 1.2.3. Các dạng Asen trong mẫu trầm tích biển ............................... 13 1.3. Ảnh hƣởng của Asen đến sức khỏe [12]. .................................. 14 1.3.1. Tác động sinh hóa ................................................................. 14 1.3.2. Nhiễm độc cấp tính ............................................................... 15 1.3.3. Nhiễm độc mãn tính [12] ....................................................... 15 1.4. Các phƣơng pháp tách chiết và bảo quản mẫu trong phân tích các dạng Asen. ...................................................................................... 18 1.4.1. Một số phƣơng pháp xử lý mẫu trƣớc khi phân tích [13,14]. . 19 1.4.2. Phƣơng pháp chiết và bảo quản các dạng Asen trong các mẫu hải sản [13]. .................................................................................... 23 1.4.3. Ổn định và duy trì những dạng ban đầu của mẫu. .................. 26 1.5. Các phƣơng pháp phân tích Asen ............................................. 26 1.5.1. Phƣơng pháp đo hiện trƣờng với chất nhuộm thủy ngân Bromua ........................................................................................... 26 1.5.2. Phƣơng pháp phát xạ nguyên tử cảm ứng cộng hƣởng plasma (ICP- ASE) ..................................................................................... 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.5.3. Phƣơng pháp quang phổ hấp tụ nguyên tử kết hợp thiết bị sinh khí Hiđrua ( HVG - ASS) . .............................................................. 27 1.5.4. Phƣơng pháp dùng vi khuẩn phát sáng. ................................. 28 1.5.5. Phƣơng pháp phân tích thể tích ............................................. 28 1.5.6. Phƣơng pháp cực phổ Von- Ampe hòa tan............................. 28 1.5.8. Phƣơng pháp trắc quang [4,5,10] ........................................... 29 CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP .................... 33 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................... 33 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ ............................................................... 33 2.1.2. Hóa chất ................................................................................ 33 2.1.3. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn................................... 34 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: ......................................................... 35 2.2.1.Phƣơng pháp xác định asen : .................................................. 35 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu: ....................................................... 36 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu: ............................................................. 37 2.4. Nội dung nghiên cứu. ............................................................... 37 2.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu để xác định asen bằng phƣơng pháp đo quang: ............................................................................... 37 2.4.2. Xây dựng qui trình phân tích cho các đối tƣợng mẫu nghiên cứu. ................................................................................................ 37 2.5. Lấy mẫu và bảo quản mẫu. ....................................................... 38 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................. 39 3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình tạo hợp chất màu... 39 3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của thuốc thử: ...................................... 39 3.1.2. Khảo sát phổ hấp thụ của hợp chất màu ................................. 39 3.1.3. Khảo sát thời gian tối ƣu cho việc tạo hợp chất màu. ............. 41 3.1.4.Ảnh hƣởng của pH đến quá trình khử Asen ............................ 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.1.5. Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử (KI)tới độ hấp thụ quang(A) cúa Asen ......................................................................................... 43 3.1.6. Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử (Zn)tới độ hấp thụ quang(A) cúa Asen ......................................................................................... 43 3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác tới sự tạo hợp chất màu ........... 45 3.2.1.Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích thuốc thử. ............................ 46 3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu. ................................... 47 3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của các chất đến sự tạo hợp chất màu .... 49 3.2.4. Xây dựng đƣờng chuẩn xác định Asen. ................................. 50 3.2.5. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp ..................................... 51 3.3. Qui trình phân tích Asen tổng số. ............................................. 52 3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần và nồng độ axit tới quá trình vô cơ hóa mẫu. ....................................................................... 52 3.3.2 Khảo sát hiệu suất của quá trình vô cơ hóa mẫu. .................... 54 3.3.3. Quy trình phân tích Asen tổng số. ......................................... 56 3.3.4. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp. .............................. 60 3.4. Phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ. ...................................... 61 3.4.1 Quy trình phân tích các dạng Asen từ các mẫu hải sản. ......... 61 3.4.2. Kết quả phân tích dạng Asen vô cơ, dạng Asen hữu cơ trong một số mẫu hải sản ………………………………………………………….…..….62 KẾT LUẬN .................................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Asen là nguyên tố độc hại có mặt trong nhiều loài hải sản. Dạng Asen chính trong động vật biển là Asenobetan, một dạng muối Asen bậc bốn. Thực tế Asen dƣờng nhƣ có mặt khắp nơi trong quần thể động vật biển, tác động tới sức khỏe của con ngƣời thông qua con đƣờng ăn uống và đến đa số động vật khác hoặc lên tất cả các sinh vật biển nói chung. Vì thế, việc xác định hàm lƣợng Asen trong hải sản có ý nghĩa cực kỳ quan trọng. Độc tính của Asen phụ thuộc rất nhiều vào dạng hóa học của nó, nhìn chung, Asen ở dạng hợp chất Asen hữu cơ (Asen hữu cơ) ít độc hơn dạng hợp chất Asen vô cơ (Asen vô cơ ). Chính vì vậy, nếu chỉ phân tích hàm lƣợng Asen tổng số trong hải sản thì chƣa cho đƣợc thông tin chính xác về độc tính của Asen, do đó, việc định dạng và xác định chính xác hàm lƣợng các dạng hóa học khác nhau của Asen tạo nên tổng hàm lƣợng Asen trong một mẫu phân tích là rất cần thiết. Nó góp phần tích cực cho ngành xuất nhập khẩu hải sản và chƣơng trình an toàn thực phẩm quốc gia. Hải sản là một nguồn thực phẩm vô cùng phong phú và đa dạng, chính vì vậy, việc nghiên cứu phân tích, đánh giá đƣợc hết các dạng Asen trong tất cả các hải sản là khó khăn, đòi hỏi nhiều thời gian. Trong phạm vi của luận văn này, do thời gian có hạn, với mục tiêu đặt ra là, xác định hàm lƣợng Asen tổng số, hàm lƣợng Asen hữu cơ và Asen vô cơ trong một số loài hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang, một phƣơng pháp đơn giản về thiết bị nhƣng lại cho kết quả đáng tin cậy do phép đo có nhiều ƣu điểm cơ bản: -Độ nhạy cao( C  10 -4 -10 -7 mol/l, cỡ 1ppm), độ chọn lọc khá cao, phân tích nhanh, thuận tiện trong phép phân tích nhiều đối tƣợng khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 -Xác dịnh đƣợc định tính, định lƣợng, xác định đƣợc cấu trúc ban đầu của mẫu, dễ tự động hóa, đa năng ,thực thi do thiết bị phổ biến không đắt tiền. Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài:" Nghiên cứu xác định tổng số và tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang". Nhiệm vụ đặt ra của đề tài để đạt đƣợc những mục tiêu trên là: -Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng để đƣa ra các điều kiện thích hợp xác định hàm lƣợng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. -Xây dựng qui trình phân tích Asen với mẫu là hải sản. -ứng dụng vào phân tích một số mẫu hải sản. -Xác định hàm lƣợng tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản. -Kết luận đƣợc tính độc của Asen trong các mẫu hải sản đã phân tích. Do thời gian có hạn, nên luận văn không tránh khỏi khiếm khuyết, chúng tôi rất mong nhận đƣơc sự góp ý của thầy cô và các bạn đồng nghiệp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Khái quát về nguyên tố Asen 1.1.1.Tính chất lí học của Asen Asen hay còn gọi là thạch tín, là một á kim có màu xám kim loại, rất giòn, kết tinh dạng tinh thể. Asen lần đầu tiên đƣợc Albertus Magnus (Đức) viết về nó vào năm 1250. Asen là một Á kim gây ngộ độc mạnh. Dƣới đây là một số thông số vật lí của Asen [33]: Số hiệu nguyên tử: 33 Khối lƣợng nguyên tử: 74,2916 g.mol-1 Tỉ trọng: 5,7g.cm-3(ở 140C) Điểm nóng chảy: 8140C(36atm) Điểm sôi: 6150C Bán kính vanderwaals: 0,139nm Bán kính: 0,222 nm(-3); 0,047 nm(+5); 0,058 nm(+3) Đồng vị: 8 Lớp vỏ điện tử: [Ar] 3d10 4s2 4p3 Năng lƣợng ion hóa thứ nhất: 947kJ. Mol-1 Năng lƣợng ion hóa thứ hai: 1798kJ. Mol-1 Năng lƣợng ion hóa thứ ba: 2376kJ. Mol-1 Thế tiêu chuẩn: -0,3V(As3+/As) Asen có hai dạng thù hình là dạng kim loại và dạng không kim loại. Dạng không kim loại của Asen khi làm ngƣng tụ dạng hơi, đó là chất rắn màu vàng đuợc gọi là Asen vàng, tan trong CS2 cho dung dịch gồm những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 phân tử As4. Ở nhiệt độ thƣòng, Asen vàng dƣới tác dụng của ánh sáng nó chuyển nhanh sang dạng kim loại. Dạng kim loại của Asen có màu trắng bạc, có cấu trúc giống phốt pho đen, dẫn điện dẫn nhiệt nhƣng giòn, dễ nghiền thành bột, không tan trong CS2. Asen phân bố rộng rãi trên vỏ trái đất với nồng độ trung bình khoảng 2mg/kg. Nó có mặt trong đá đất nƣớc không khí, và một số sinh vật. Asen có thể tồn tại với 4 trạng thái oxi hóa: -3;0;+3;+5 [6]. Asen là nguyên tố cancofil dễ tạo sunfua với lƣu huỳnh, tạo hợp chất với selen, telua và đặc biệt với đồng, niken, sắt, bạc,... . Có khoảng gần 140 khoáng vạt độc lập của Asen, trong đó 60% là Asenat và 35% là sunfua. Các khoáng vật quan trọng nhất của Asen là: Asenopirit(FeAsS), Ocpirmen(As2S3), Rialga(AsS)....Asenconf kết hợp các nguyên tố khác, thay thế lƣu huỳnh trong các hợp chất nhƣ: Lơlingit( FeAs2), Smartina(As2Co), các loại hợp chất này thƣờng tạo thành ở nhiệt độ thấp. Nhờ quá trình chuyển hóa sinh học mà Asen còn tồn tại ở một số dạng hữu cơ nhƣ MMA (Monomethylarsonic axit), DMA (Dimethylarsinous acid), AsB (Asenobetaine), AsC (Asenochline), Asenosugars.....[32]. Asen là nguyên tố trong dãy chuyển tiếp,có tính chất hóa học gần giống với nguyên tố đứng trên nó là phốt pho, có tính chất gần với kim loại hơn tính á kim. Asen có hai đồng vị 75As (đồng vị bền) và 78As (đồng vị phóng xạvới chu kỳ bán rã T1/2 = 26,8 giờ). Asen có bốn dạng biến thể gồm hai biến thể kết tinh và hai biến thể ẩn tinh, trong đó bền vững là các dạng biến thể kết tinh còn gọi là Asen dạng kim loại có màu xám bạc. Asen kim loại khi bị đốt nóng đến 615,50C thì thăng hoa mà không qua giai đoạn nóng chảy, khi gặp lạnh nó ngƣng tụ thành tinh thể tà phƣơng. Tuy nhiên, dƣới áp suất cao 35,8 atm nó nóng chảy ở nhiệt độ 814-8680C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Trong không khí, Asen kim loại dễ bị oxihóa thành As2O5 dạng bột màu trắng, có mùi tỏi, rất độc đối với cơ thể sống. Asen là một chất bán dẫn, dễ nghiền thành bột.. có thể tạo ra các hợp chất bán dẫn của Asen nhƣ GaAs, có tính chất bán dẫn nhƣ Silic và Gecmani. 1.1.2. Tính chất hóa học của Asen và các hợp chất 1.1.2.1. Các phản ứng hóa học của nguyên tố Asen Asen là nguyên tố bán kim loại, có tính chất hóa học gần với tính chất của á kim, cấu hình lớp vỏ điện tử hóa trị của Asen là 4s24p3, trong cấu hình điện tử của Asen có sự tham gia của ocbital d , vì vậy, có khả năng mở rộng vỏ hóa trị. Trong các hợp chất Asen có ba giá trị số oxi hóa -3, +3, và +5, trong đó số oxi hóa -3 rất đặc trƣng cho Asen. Asen bền trong không khí khô, nhƣng bề mặt bị oxi hóa dần trong không khí ẩm thành lớp xỉn màu đồng cuối cùng thành lớp vỏ màu đen bao quanh nguyên tố. Khi đun nóng trong không khí, Asen bắt cháy tạo thành Asen trioxit- thực tế là tetraasen hexaoxit As4O6, đun nóng trong oxi tạo thành Asen pentoxit- thực tế là tetraasen đecaoxit As4O10 và As4O6. Asen không phản ứng với nƣớc trong điều kiện thiếu không khí hoặc các điều kiện thƣờng. Ở dạng bột nhỏ, Asen bốc cháy trong khí clo tạo thành triclorua: 2As + 3Cl2  2AsCl3 Khi đun nóng Asen cũng tƣơng tác với brom, iot, lƣu huỳnh. Asen đƣợc điều chế nhƣ kim loại, khi khử oxit của chúng bằng cacbon hay hiđro sẽ cho phản ứng Asen kim loại. Khi đun nóng Asen trong không khí Asen cháy tạo thành oxit, ngọn lửa màu xanh là As2O3. Nó không tác dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 với axit không có tính oxi hóa, nhƣng dễ dàng phản ứng với các axit HNO3, H2SO4 đặc. 3 As + 5HNO3 + 2 H2O 3 H2SO4 + 5NO Các halogenua đƣợc tạo ra khi Asen phản ứng với halogen, các hợp chất này dễ bị thủy phân tạo axit tƣơng ứng trong môi trƣờng nƣớc. 3As + 5Cl2 + 2H2O 2H3AsO4 + 10HCl Trong thời kỳ đồ đồng, Asen thƣờng đƣợc đƣa vào trong đồng thiếc để làm cho hợp kim trở thành cứng hơn (gọi là " đồng thiếc Asen"). 1.1.2.2. Tính chất hóa học của các hợp chất của Asen. Có rất nhiều dạng khác nhau của dạng Asen vô cơ và Asen hữu cơ. Các dạng quan trọng nhất có liên quan đến sức khỏe đƣợc đƣa ra trong bảng1.1[2]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Bảng 1.1. Một số dạng Asen vô cơ và Asen hữu cơ Tên Công thức As(III) vô cơ Asen trioxit As2O3 hoặc As2O6 Axit asenơ H3AsO3 Asenit hay muối axit H3AsO3 Asen triclorua AsCl3 Asen(III) sunfua As2S3 As(V) vô cơ Asen pentoxit As2O5 Asen asenic H3AsO4 Asenit, hay muối axit H3AsO4; H3AsO4 Asen (III) hữu cơ Axit monometylasonic CH3AsO(OH)2 Axit dimetylasinic (CH3)2AsO(OH) Trimetylasin oxit (CH3)3AsO Metylasin CH3AsH2 Đimetylasin (CH3)2AsH Trimetylasin (CH3)3As Axit asinilic (axit p- aminobenzen asonic) H2N-C6H4- AsO(OH)2 Cacbazan (axit 4 - [aminocacbonylamino]- phenylasonic (OH)2OAs-C6H4- NH(CO)NH2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Một số phản ứng đặc trƣng của As+3: Các hợp chất As+3 phổ biến nhƣ As3S4, H3AsO3, AsCl3, As2O3,... đều tan tốt trong axit HNO3 đặc nóng, NaOH, NH4OH, (NH4)2S và (NH4)2CO3. As2O3 + 8HNO3 + 4H2O 2H3AsO3 + 3H2SO4 + 8NO As2O3 + 3(NH4)2S 2(NH4)3AsS3 Cho khí H2S qua dung dịch AsCl3 có kết tủa màu vàng tƣơi là As2S3. AsCl3 là một hợp chất quan trong của Asen, nó dễ bay hơi, dễ bị thủy phân trong môi truờng nƣớc. AsCl3 + 3H2O H3AsO3 + 3HCl Khi khử H3AsO3 ta thu đƣợc khí Asin, có mùi tỏi rất độc. H3AsO3 + 3Zn + 6HCl 3ZnCl2 + AsH3 + 3H2O H3AsO3 + CuSO4 CuHAsO3 + H2SO4 CuHAsO3 có kết tủa màu vàng lục trong môi trƣờng kiềm, nó tan trong dung dịch cho màu xanh. CuHAsO3 + NaOH CuNaAsO3 + H2O Một số phản ứng đặc trƣng của As+5: Một số hợp chất quan trọng của As+5 nhƣ As2S5, H3AsO4, Ag3AsO4... . Trong đó As2S5 không tan trong nƣớc và dung dịch HCl, nó chỉ tan trong NaOH, HNO3 và NH4OH vì vậy dựa vào tính chất này có thể xác định Asen bằng phƣơng pháp khối lƣợng. As2S5 + 3(NH4)2S 2(NH4)3AsS4 Khi cho axit asenic tác dụng molidat amoni (NH4)2MoO4 trong môi trƣờng axit HNO3 sẽ cho kết tủa màu vàng, muối này dùng để định tính và định lƣợng Asen. H3AsO4 + 12(NH4)2 MoO4 + 21HNO3 (NH4)3H4[As(Mo2O7)6] + 21NH4NO3 + 10H2O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Trong hợp chất này As+5 có vai trò ion trung tâm điển hình tạo phức dị đa axit và phức dị đa axit này cũng có thể bị khử về phức dị đa màu xanh. Một số phản ứng đặc trƣng của AsH3: Trong hợp chất AsH3 , Asen thể hiện số oxi hóa -3, liên kết trong Asin là liên kết cộng hóa trị, đây cũng là đặc điểm do cấu hình điện tử của Asen. Asin là một khí độc, không màu, dễ bị phân hủy thành Asen nguyên tố trong môi trƣờng không khí. Asin có nhiệt độ nóng chảy là - 1170C, nhiệt độ sôi là - 62 0 C. AsH3 thể hiện tính khử mạnh. Tác dụng với H2SO4 loãng: 2AsH3 + 6H2SO4 6SO2 + As2O3 + 9H2O Tác dụng với I2: AsH3 + 4I2 + 4H2O H3AsO4 + 8HI Một số phản ứng đặc trƣng đƣợc dùng trong phƣơng pháp trắc quang là phản ứng tạo phức asin với đietyl đithiocacbamat bạc. 1.2. Ứng dụng của Asen[6] Asen đƣợc biết đến và sử dụng rộng rãi tại Irăc và một vài nơi khác từ thời cổ đại. Trong thời kì đồ đồng, Asen thƣờng đƣợc đƣa vào đồng thiếc để làm cho hợp kim trở nên cứng hơn (gọi là "đồng thiếc Asen"). Albertus Magnus (1193-1280) là ngƣời đầu tiên tách đƣợc Asen nguyên tố vào năm 1250. Năm 1649, Johann Schroder công bố hai cách điều chế Asen. Chì Asenat đã từng đƣợc sử dụng nhiều trong thế kỉ 20 làm thuốc trừ sâu cho các loại cây ăn quả. Lục Scheele hay Asenit đồng, đƣợc sử dụng trong thế kỉ 19 nhƣ là tác nhân tạo màu trong các loại sơn. Ứng dụng có nhiều e ngại nhất đối với cộng đồng trong xử lí chống mối mọt và bào mòn cho gỗ bằng Asenat đồng cromat, còn gọi là CCA hay tanalith. Gỗ xẻ xử lí bằng CCA vẫn còn phổ biến ở nhiều quốc gia, nó đƣợc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 sử dụng nhiều trong nửa cuối thế kỉ 20, mặc dù gỗ xẻ xử lí bằng CCA đã bị cấm ở nhiều khu vực. Việc hấp thụ trực tiếp hay gián tiếp do việc đốt cháy gỗ xử lí bằng CCA có thể gây tử vong ở động vật cũng nhƣ gây ngộ độc nghiêm trọng ở ngƣời, liều gây tử vong ở ngƣời là khoảng 20mg tro. Trong các thế kỉ 18,19 và 20 một lƣợng lớn các hợp chất của Asen đã đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Arsphenamin và neosalvarsan là những hợp chất của Asen hữu cơ đƣợc chỉ định trong điều trị giang mai, nhƣng đã bị loại bỏ bởi các loại thuốc kháng sinh hiện đại. Asen(III) oxit đã đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong suốt 200 năm qua, nhƣng phần lớn là đỉều trị ung thƣ. Cục thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa kì (FDA) vào năm 2000 đã cho phép dùng hợp chất này trong điều trị các bệnh nhân bị bạch cầu cấp tính. Đồng axeto asenit(Cu(C2H3O2)2.3Cu(AsO2)2) đƣợc sử dụng làm thuốc nhuộm màu xanh lục dƣới nhiều tên gọi khác nhau, nhƣ "lục pais" hay "lục ngọc bảo". Nó gây ra nhiều ngộ độc Asen. Gali asenua là một vật liệu bán dẫn quan trọng, sử dụng trong công nghệ chế tạo mạch tích hợp (IC), các mạch này có nhiều ƣu điểm hơn so với các mạch dùng silic. Asenat hiđro chì đã từng đƣợc sử dụng nhiều trong thế kỷ 20, làm thuốc trừ sâu cho các loại cây ăn quả. Việc sử dụng nó đôi khi tạo ra các tổn thƣơng não đối với những ngƣời phun thuốc này. 1.2. Các dạng Asen trong môi trƣờng biển: Mặc dù nồng độ Asen cao trong nƣớc biển đã đƣợc biết đến cách đây hơn 100 năm, nhƣng hàm lƣợng và tính đa dạng của các dạng Asen trong mẫu sinh vật biển chỉ đƣợc đề cập vào khoảng gần 30 năm trở lại đây. Asen trong nƣớc biển tồn tại chủ yếu ở dạng vô cơ nhƣ Asenate và Asenite, chính vì vậy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 sinh vật biển cũng không thể tránh khỏi sự phơi nhiễm bởi những dạng Asen vô cơ độc này.[13] Hiện nay, đã phát hiện ra những cơ chế lý thuyết về quá trình dịch chuyển sinh học và quá trình giải độc của các sinh vật biển. Kết quả của các quá trình này làm xuất hiện trong môi trƣờng nƣớc biển hơn 25 dạng Asen. Tuy nhiên sự phân bố những dạng này thay đổi rõ rệt giữa bốn đối tƣợng mẫu khác nhau bao gồm nƣớc biển, trầm tích biển, tảo và động vật. Trong môi trƣờng và các hệ sinh vật, Asen tồn tại ở nhiều dạng (bảng 1.1). Các nghiên cứu cho thấy nếu chỉ biết hàm lƣợng tổng số Asen sẽ thiếu cơ sở để đánh giá độc tính của Asen vì tính độc của Asen tùy thuộc vào các dạng hóa học tồn tại của Asen. Vì vậy, phát hiện ra các dạng Asen sẽ giúp chúng ta trong việc đánh giá chính xác hơn những tác động của nó đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. 1.2.1. Những dạng Asen trong nước biển. Asen trong nƣớc biển chủ yếu tồn tại dƣới dạng vô cơ, ở nồng độ khoảng 1  2  g/l. Nồng độ này cao hơn đa số các kim loại và á kim có độc tính tiềm tàng khác. Việc xác định các dạng Asen trong nƣớc biển lần đầu tiên đƣợc thực hiện vào năm 1926 bởi Atkins và Wilson [17], những kết quả của họ cho thấy ngoài thành phần chính là Asenite (As III) còn có sự hiện diện của Asenate (As V) [16]. Tính toán nhiệt động học chỉ ra rằng sự tồn tại gần nhƣ hoàn toàn dạng Asenate do sự khử sinh học, tuy nhiên, cũng có thể sản sinh ra Asenite ở những mức độ phân tích đƣợc. [35]. Nhiều thí nghiệm đã đƣợc tiến hành để xác định các hợp chất Asen trong môi trƣờng biển. Bốn dạng Asen bao gồm Asenat (V), Asenit (III), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Axitmethylarsonic (MMAA), axit dimethylasinic (DMAA), đã đƣợc phát hiện trong nƣớc biển bằng kỹ thuật HG-AAS[49]. Các nghiên cứu cho rằng, những dạng này là kết quả của quá trình dịch chuyển sinh học liên tục của Asen (V) bởi những thực vật trôi nổi [39]. Ngoài As (III), As (V), methylasonate (MA) và dimethylasinate (DMA), đã đƣợc phát hiện trong nƣớc biển còn có những dạng Asen chƣa đƣợc xác định và đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. 1.2.2. Các dạng Asen trong động vật biển Hầu hết các công bố đều cho rằng, dạng Asen hữu cơ trong động vật biển là Asenobetaine. Hợp chất này đã đƣợc xác định có trong tôm hùm Panulinuscygnus bởi phổ NMR và X-Ray sau khi đã đƣợc phân lập [26]. Sau này, hợp chất trên còn đƣợc tìm thấy trong nhiều loại động vật biển bao gồm cá mập [20], tôm hùm Mỹ [24], cá teloest, cua, tôm [41], hải sâm và vài dạng của loài chân bụng và nhuyễn thể hai vỏ [45]. Thực tế, các dạng hợp chất Asen hữu cơ dƣờng nhƣ có mặt ở khắp nơi trong quần thể động vật biển, tác động tới sức khỏe con ngƣời thông qua con đƣờng ăn uống và ảnh hƣởng đến hầu nhƣ đa số các động vật hoặc lên tất cả sinh vật biển nói chung. Trong nhiều công trình nghiên cứu, ngƣời ta đã chiết đƣợc một vài dạng Asen trong tôm bao gồm Asenocholine cũng nhƣ Asenobetaine [37]. Asenocholine đƣợc thông báo có trong con sò, hến [38], cá trong vùng ô nhiễm [42] và các sản phẩm của cá nhám [18]. Vài dạng trong mẫu cá đƣợc xác định cho thấy chúng chứa một phần nhỏ Asen ở dạng trimethylasine oxit [43]. Dạng trimethylasine oxit đƣợc xác định có trong cá da trơn Cnidoglanis macrocephalus ở cửa sông và loài cá biển Silago basseni [25]. IonTetramethylasonium, một sản phẩm của quá trình metyl sinh học, đƣợc xác định có trong sò Meretrix lusoria bằng phƣơng pháp HPLC-ICP và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 phổ H-NMR sau khi phân lập [40]. Cũng hợp chất này đã đƣợc tìm thấy từ con trai [47], cải biển và cỏ chân ngỗng [46]. Hợp chất này còn đƣợc tìm thấy trong loài nhuyễn thể chân bụng Tectus pyramidis [29]. Trimethylasine đƣợc công bố ở mức rất thấp trong vài loài cua biển ở đại dƣơng. Một phần Asen trong quần thể biển có mặt ở dạng Asen-lipit. Những mô giàu dầu của một vài động vật biển ngoài Asenobetaine còn có Asen-lipit. Hợp chất dạng Asen hữu cơ chính trong động vật biển là Asenobetaie. Từ 21 năm trƣớc đây, Asenobetaie đã đƣợc nhận ra trong tôm hùm [26]. Hợp chất muối Asen bậc bốn ổn định này, qua nhiều nghiên cứu cho thấy có mặt trong tất cả các động vật biển, và trong đa số các loài hải sản đã phân tích thì dạng Asen này chiếm ƣu thế hơn cả [28]. Khả năng tƣơng thích của kỹ thuật phân tích gần đây với giới hạn phát hiện thấp (độ nhạy cao), cũng nhƣ sự quan tâm đối với những dạng Asen phụ khác, thƣờng có trong động vật đã đƣợc tăng lên. Năm 1993, Francesconi và Edmonds [28] cũng đã chứng minh sự có mặtcủa Asenobetaine trong động vật biển. 1.2.3. Các dạng Asen trong mẫu trầm tích biển Một số thông tin [36] về Asen trong bùn đƣợc công bố bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc. Tuy nhiên, ít có thông tin về những dạng Asen tồn tại trong bùn, vì phần lớn các phƣơng pháp cần thiết để chiết Asen có vẻ đã làm thay đổi dạng hóa học của Asen. Mặc dù, nồng độ Asen trong trầm tích dƣới biển sâu (trên 450mg/kg) [28] có thể cao hơn so với lớp bùn gần bờ. Ngƣời ta cho rằng, nƣớc mạch bùn có chứa sẵn những dạng sinh học, dạng hóa học của Asen, đó chính là đề tài của một số nghiên cứu [48]. Tƣơng tự nhƣ trong nƣớc biển, trong trầm tích dạng hợp chất Asen vô cơ cũng trội hơn dạng hợp chất Asen hữu cơ. Ngoài ra, chúng còn có chứa hai dạng MMA, DMA và một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 dạng Asen trimetyl,có thể là oxit trimetylasine( TMAO),hợp chất này đã đƣợc tìm thấy trong mẫu nƣớc trầm tích [23]. Nồng độ tổng Asen hòa tan trong nƣớc trầm tích nói chung cao hơn hẳn trong nƣớc biển. Tuy nhiên, cho đến nay, sự hiểu biết về quá trình dịch chuyển sinh học các dạng Asen trong trầm tích biển và nƣớc trong trầm tích còn hạn chế. Đa số các nghiên cứu về Asen trong trầm tích chủ yếu xác định hàm lƣợng tổng Asen mà ít có nghiên cứu về các dạng Asen [21]. 1.3. Ảnh hƣởng của Asen đến sức khỏe [12]. Theo chỉ dẫn 67/548/EEC - Liên minh châu Âu thì Asen nguyên tố và các hợp chất của Asen đƣợc phân loại là "độc" và "nguy hiểm cho môi trƣờng". IARC công nhận Asen nguyên tố và các hợp chất của Asen nhƣ là các chất gây ung thƣ nhóm I, còn EU liệt kê Trioxit Asen, Pentoxit Asen và các muối Asenat nhƣ là các chất gây ung thƣ loại I. 1.3.1. Tác động sinh hóa Asen và hợp chất của Asen có mặt ở khắp mọi nơi nhƣ trong không khí đất thức ăn, nƣớc uống và có thể xâm nhập vào cơ thể theo 3 đƣờng: hô hấp, da và chủ yếu là ăn uống. Các hợp chất dễ tan của Asen hấp thụ qua đƣờng tiêu hóa vào máu tới 90% và ra khỏi máu đến các tổ chức rất nhanh, nửa giờ sau khi tiếp xúc,đã tìm thấy liên kết của Asen với protein trong gan, thận, bàng quang, sau 24 giờ, trong máu chỉ còn lại 0,1%. Asen đƣợc đào thải chủ yếu là qua nƣớc tiểu. Trong số các hợp chất của Asen thì As(III) là độc nhất. Mức độ độc hại của các chất đƣợc sắp xếp theo thứ tự: Asin > As(III)As2O3 > As(V) > Asen hữu cơ. As(III) thể hiện tính độc bằng cách tấn công lên các nhóm -SH của các enzim, làm cản trở hoạt động của enzim. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 SH -O S [Enzim] + As - O ƣ  [Enzim] As - Oƣ + 2OHƣ SH -O S Các enzim sản sinh ra năng lƣợng của tế bào trong chu trình của axit nitric bị ảnh hƣởng rất lớn. Bởi các enzim bị ức chế do tạo thành phức với As(III), dẫn đến thuộc tính sản sinh ra các phần tử ATP bị ngăn cản. Do sự tƣơng tự về tính chất hóa học với photpho, Asen can thiệp vào một số quá trình hóa sinh làm rối loạn photpho. Có thể thấy đƣợc hiện tuợng này khi nghiên cứu sự phát triển hóa sinh của chất sản ra năng lƣợng chủ yếu là ATP (ađenozintriphotphat). Asen(III) Ở nồng độ cao làm đông tụ các protein do sự tấn công các liên kết sunfua bảo toàn cấu trúc bậc 2 và 3. Nhƣ vậy Asen có 3 tác dụng sinh hóa là: Làm đông tụ protein, tạo phức với enzim và phá hủy quá trình photpho hóa. 1.3.2. Nhiễm độc cấp tính Nhiễm độc Asen cấp tính xảy ra do ăn uống phải asen với liều lƣợng lớn(1-2g). Các nghiên cứu cho thấy triệu chứng nhiễm độc rất đa dạng, phụ thuộc vào hợp chất Asen đã ăn phải. Có thể gặp các biểu hiện tổn thƣơng thận, rối loạn chức năng tim mạch, đôi khi xuất hiện phù phổi cấp, suy hô hấp, gan to... Nếu đƣợc cứu chữa kịp thời, bệnh nhân có thể sống sót, nhƣng để lại các di chứng nặng nề về não, suy tủy, suy thận, thiếu máu, giảm bạch cầu, tan huyết, xạm da và tổn thƣơng đa dây thần kinh ngoại biên.[13] 1.3.3. Nhiễm độc mãn tính Bệnh nhiễm độc Asen mãn tính do sử dụng nguồn nƣớc bị ô nhiễm Asen (asenicosis) xảy ra ở nhiều nƣớc trên thế giới. Biểu hiện gây ấn tƣợng mạnh nhất là hình ảnh "Bàn chân đen" tìm thấy đầu tiên ở Đài Loan năm 1920. Nguyên nhân gây bệnh là do dân cƣ sử dụng nguồn nƣớc bị nhiễm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Asen cao (0,35 - 1,10mg/l) từ các giếng khoan để sinh hoạt. Asen còn gây hàng loạt các bệnh nội khoa nhƣ: gây tăng huyết áp, gây tắc ngoại vi, bệnh mạch vành, mạch máu não dẫn đến thiếu máu cục bộ cơ tim và não, là những cơ quan đảm nhận chức năng sống quan trọng. Nguy cơ mắc bệnh và tử vong do nhồi máu cơ tim tăng cao. Nguy cơ mắc bệnh viêm tắc mạch ngoại biên tăng theo thời gian tiếp xúc với Asen ngay ở nồng độ > 0,02mg/l.[13] Biểu hiện lâm sàng của bệnh rất đa dạng, do Asen gây tác hại rộng rãi tới chức năng của nhiều hệ cơ quan: Thần kinh, tim mạch, tiêu hóa, hô hấp... Mức độ tổn thƣơng phụ thuộc vào độ nhạy cảm của từng cá thể, vào liều lƣợng và thời gian tiếp xúc. Quá trình phát triển bệnh âm ỉ, kéo dài. Ở giai đoạn sớm thƣờng tìm thấy các tổn thuơng da, các triệu chứng hay gặp nhƣ: Biến đổi sắc tố da (pigmentation), dày sừng (hyperkeratosis) ở lòng bàn chân, bàn tay, đối xứng hai bên, đôi khi kèm theo các vết nứt nẻ. Các tổn thƣơng có thể phát triển thành ung thƣ da. Nguy cơ mắc bệnh tăng ngay cả khi uống nƣớc có nồng độ Asen < 0,05mg/l. Bệnh thƣờng phát triển sau khi tiếp xúc một thời gian dài ủ bệnh (5 - 10 năm, có thể là lâu hơn). Ngoài ra Asen có thể làm tổn thƣơng thần kinh, ảnh hƣởng đến việc sinh sản ở phụ nữ và tăng nguy cơ mắc bênh xơ gan, thiếu máu, rối loạn chuyển hóa protein và đuờng. Điều đáng lo ngại nhất là Asen có thể gây ung thƣ da, phổi, bàng quang, thận. Nguy cơ mắc bệnh ung thƣ tăng theo thời gian tiếp xúc. Theo thống kê của trung tâm quốc gia ở Đài Loan, tỉ lệ mắc bệnh ung thƣ bàng quang tại 4 khu vực bệnh "Bàn chân đen" năm 1993 là 23,5% so với tỉ lệ toàn quốc là 2,29%. Tỉ lệ ung thƣ da và chết do ung thƣ da từ 14,01 - 32,41%. Cơ chế gây ung thƣ cho tới nay vẫn chƣa rõ. Tuy vậy, các kết quả nghiên cứu thực nghiệm đều cho thấy Asen thúc đẩy quá trình phát triển khối u, làm rối loạn quá trình tổng hợp ADN, đặc biệt là trong các nguyên bào sợi và các tế bào tủy xƣơng bạch cầu, làm giảm số lƣợng bạch cầu lympho ngoại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 vi, thay đổi khả năng miễn dịch và làm giảm sức đề kháng của cơ thể chống lại tế bào ung thƣ. Mặt khác, Asen còn có khả năng làm rối loạn gen, sai lạc nhiễm sắc thể, làm gẫy nhiễm sắc tử và nhiễm sắc thể, gây tăng tần số sinh sản của nhân và gây hiện tƣợng lệch bội. Một số nghiên cứu về các biến đổi sinh học của Asen trong cơ thể và phƣơng pháp điều trị cho thấy, khả năng tích lũy Asen trong cơ thể là rất lớn, đặc biệt là khi tiếp xúc lâu dài với liều lƣợng nhỏ. Mặc dù có tính độc nhƣ trên, song không phải tất cả các dạng Asen đều độc, và kể cả những dạng Asen có tính độc thì ở hàm lƣợng nhỏ Asen lại có khả năng kích thích sự phát triển của sinh vật. Theo các công trình nghiên cứu, thì Asen vô cơ độc hơn Asen hữu cơ. Jeffer P.Koplan cùng các đồng nghiệp cho rằng: Một số dạng hữu cơ có độc tính rất thấp và với một số dạng nó hoàn toàn không có độc tính [13]. Vì vậy biết các dạng Asen là thách thức lớn đối với các nhà khoa học nghiên cứu về môi trƣờng và sức khỏe. Theo nhiều công trình nghiên cứu, hải sản cũng có thể nhiễm kim loại nặng nhƣ: Asen, thủy ngân... do môi trƣờng ô nhiễm. Hải sản có hàm lƣợng Protein cao, các oxit béo omega 3, chất béo bão hòa thấp tốt cho sức khỏe, đặc biệt đối với ngƣời bị bệnh tim mạch, phụ nữ có thai và trẻ em. Tuy nhiên, hải sản là một trong 20 loại thực phẩm dễ gây dị ứng, ngộ độc nhất. Các triệu chứng biểu hiện thƣờng là mẩn ngứa, nổi mề đay, sổ mũi, mắt ngứa đỏ, tụt huyết áp, khó thở, nôn mửa, tiêu chảy....Nhiều ngƣời vẫn nghĩ rằng tiêu chảy do hải sản lạnh, nhƣng thực ra là do trong hải sản có chứa độc tố. Nghiên cứu mới đây của Viện Hải Dƣơng học Nha Trang cho biết, trong hải sản có thể chứa các độc tố gây nguy hiểm cho ngƣời ăn. Độc tố tảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Phycotoxins sinh sản trong các rặng san hô ven bờ, là nơi sinh sống của các loài thân mềm nhƣ nghêu, sò, cua, tôm...Các độc tố tảo này không gây nguy hại đến các loài sinh vật biển nhƣng chúng sẽ gây ngộ độc cho ngƣời nếu ăn phải. Độc tố tảo Phycotoxins không bị phân hủy khi đun nấu, có thể gây tiêu chảy, đau bụng, đau đầu, gây liệt cơ, mất trí nhớ... Hải sản cũng có thể nhiễm kim loại nặng nhƣ Asen, Thủy ngân do môi trƣờng ô nhiễm. Chất độc hại thƣờng lắng đọng ở lớp bùn nên các loài sống ở tầng đáy nhƣ ngao, sò, ốc, hến...rất dễ bị nhiễm độc. Các loài cá to cũng thƣờng bị nhiễm độc nặng hơn do quá trình tích lũy thức ăn. Từ những lí do trên, các nhà khoa học khuyến cáo rằng: Hải sản mua phải tƣơi sống, tránh mua hải sản trong vùng đang bị ô nhiễm nặng. Tuyệt đối không ăn hải sản đã chết vì chúng có thể tiết ra chất độc. Đối với cá phải làm ngay khi cá còn tƣơi và bỏ toàn bộ lòng ruột. Không nên mua các hải sản có màu sắc khác thƣờng, vì những loài sống trong vùng ô nhiễm thƣờng có màu sắc khác với các hải sản bình thƣờng. 1.4. Các phƣơng pháp tách chiết và bảo quản mẫu trong phân tích các dạng Asen. Một trong những vấn đề chìa khóa của phân tích dạng là bảo quản toàn vẹn mẫu và các dạng quan tâm trong suốt quá trình lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu. Do tính chất hóa lý đặc biệt luôn thay đổi hóa trị đặc biệt giữa III và V mà Asen tồn tại trong tự nhiên dƣới nhiều dạng khác nhau [32]. Vì vậy xử lý mẫu để giữ nguyên dạng ban đầu của Asen là nhiệm vụ quan trọng đối với các nhà phân tích. Asen có nhiều dạng tồn tại. Tùy thuộc vào dạng Asen tồn tại trong các đối tƣợng mẫu khác nhau mà cần có các phƣơng pháp xử lý mẫu khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Trong phần này chúng tôi trình bày một số phƣơng pháp xử lý mẫu trong phân tích định dạng Asen với đối tƣợng là các mẫu hải sản. 1.4.1. Một số phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích [13,14]. Nguyên tắc chung khi phân tích các mẫu hải sản bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: Xử lý mẫu để đƣa nguyên tố cần xác định về dạng dung dịch theo một kỹ thuật phù hợp để có thể phân tích định dạng theo một phép đo đã chọn. Giai đoạn 2: Phân tích các nguyên tố dựa trên nguyên tắc của phép đo, trong những điều kiện thích hợp đã đƣợc nghiên cứu lựa chọn. Trong đó giai đoạn 1 là rất quan trọng đối với hầu hết các phƣơng pháp khi phân tích kim loại. Nếu xử lý mẫu không tốt có thể dẫn đến mất nguyên tố cần phân tích( gây sai số âm) hoặc làm nhiễm bẩn mẫu (gây sai số dương), làm ảnh hƣởng đến kết quả phân tích, đặc biệt khi phân tích vi lƣợng. Tùy thuộc vào bản chất của phép phân tích, đối tƣợng mẫu, điều kiện trang bị kỹ thuật... mà có các phƣơng pháp sau để xử lý mẫu. Xử lý mẫu vô cơ Phân tích dạng trao đổi (còn gọi là dạng dễ tiêu): Kim lọai ở thể này có thể tan đƣợc trong nƣớc, nhƣ dung dịch muối hoặc axit loãng. Phân tích tổng số: Để phân tích tổng số ngƣời ta phá hủy cấu trúc của mẫu để chuyển kim loại về dạng muối tan. Có thể phá hủy mẫu bằng các loại axit có tính oxihóa mạnh nhƣ axit nitric, axit sunfuaric, axit pecloric.... hoặc hỗn hợp các axit. Xử lý mẫu hữu cơ: Các chất hữu cơ rất phong phú và đa dạng. Trong các mẫu này kim loại ít khi ở dạng dễ tiêu, do đó, để phân tích các kim loại trong mẫu hữu cơ, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 thƣờng phải tiến hành phân tích tổng số. Trƣớc khi phân tích, mẫu thƣờng đƣợc xử lý bằng một trong các phƣơng pháp sau: -Vô cơ hóa khô. -Vô cơ hóa ƣớt. - Xử lý ƣớt bằng lò vi sóng. - Xử lý mẫu bằng kỹ thuật lên men. a. Phương pháp vô cơ hóa khô. Nguyên tắc: Đốt cháy các mẫu hữu cơ có trong mẫu phân tích để giải phóng kim loại ra dƣới dạng oxit hoặc muối, sau đó, tro mẫu này đƣợc hòa tan bằng axit thích hợp. Phƣơng pháp vô cơ hóa khô đơn giản, triệt để, yêu cầu tối thiểu sự chú ý của ngƣời phân tích, nhƣng có nhƣợc điểm làm mất các nguyên tố đễ bay hơi nhƣ: Hg, As, Pb... khi ở nhiệt độ cao. Để khắc phục nhƣợc điểm này, ngƣời ta thƣờng cho thêm các chất bảo vệ nhƣ MgO, Mg(NO3)2 hay KNO3 và chọn nhiệt độ thích hợp. b. Phương pháp vô cơ hóa ướt Nguyên tắc: Oxi hóa chất hữu cơ bằng một axit hoặc hỗn hợp axit có tính oxi hóa mạnh thích hợp. Phƣơng pháp vô cơ hóa ƣớt rút ngắn đƣợc thời gian so với phƣơng pháp vô cơ hóa khô, bảo toàn đƣợc chất phân tích, nhƣng phải dùng lƣợng axit khá nhiều, vì vậy các axit phải đạt yêu cầu có độ tinh khiết cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 c. Phương pháp lò vi sóng Nguyên tắc: Dùng năng lƣợng của lò vi sóng để đun nống dung môi và mẫu đƣợc đụng trong bình kín. Dƣới nhiệt độ và áp suất cao có thể dễ dàng hòa tan đƣợc mẫu. Đây là phƣơng pháp xử lý mẫu hiện đại, làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu phân tích và vô cơ hóa mẫu đƣợc triệt để, có thể vô cơ hóa cùng lúc nhiều mẫu. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đồi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền nên nhiều cơ sở phân tích không đủ điều kiện để trang bị. d. Phương pháp lên men Nguyên tắc: Hòa tan mẫu thành dung dịch hay huyền phù. Thêm men xúc tác và lên men ở nhiệt độ 370C - 400C trong thời gian từ 7 - 10 ngày. Trong quá trình lên men, các chất hữu cơ bị phân hủy thành CO2, axit, nƣớc và giải phóngkim loại trong hợp chất hữu cơ dƣới dạng cation trong dung dịch. e. Tác nhân vô cơ hóa Khi xử lý mẫu bằng phƣơng pháp vô cơ hóa ƣớt và lò vi sóng, việc lựa chọn tác nhân oxi hóaphải căn cứ vào khả năng, đặc tính oxi hóa của thuốc thử và đối tƣợng mẫu. Dƣới đây là một số tác nhân vô cơ hóa thƣơng sử dụng khi vô cơ hóa mẫu: Axit nitric (HNO3) [14] Axit nitric (HNO3) là chất đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để vô cơ hóa mẫu. Đây là tác nhân vô cơ hóa dùng để giải phóng nhanh vết nguyên tố từ các cốt sinh học và thực vật dƣới dạng các muối nitrit dễ tan. Điểm sôi của axit nitric ở áp suất khí quyển là 1200C, lúc đó chúng sẽ ion hóa toàn bộ các chất hữu cơ có trong mẫu phân tích và giải phóng kim loại dƣới dạng ion. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Loại mẫu đƣợc áp dụng: Chủ yếu là các mẫu hữu cơ nhƣ nƣớc giải khát, protein, chất béo, nguyên liệu thực vật, nƣớc thải, một số sắc tố polỉme và các mẫu trầm tích. Axit sunfuaric (H2SO4) [14] Axit sunfuaric (H2SO4) là chất có tính oxi hóa mạnh, có nhiệt độ sôi là 339 0C. Khi kết hợp với Axit nitric (HNO3) sẽ có khả năng phá hủy hoàn toàn hầu hết các hợp chất hữu cơ. Nếu sử dụng lò vi sóng thì phải vô cơ hóa trƣớc trong cốc thủy tinh hay thạch anh và giám sát quá trình tăng nhiệt độ của lò. Loại mẫu đƣợc áp dụng: mẫu hữu cơ, oxit vô cơ, hiđroxit, hợp kim, kim loại, quặng.... Axit pecloric (HClO4) [14] Axit pecloric (HClO4) có tính oxi hóa mạnh, có thể ăn mòn kim loại, không phản ứng với các axit khác, phá hủy hợp chất hữu cơ. Do axit Pecloric (HClO4) có thể gây nổ mạnh khi tiếp xúc với các nguyên liệu hữu cơ và các chất vô cơ dễ bị oxi hóa nên thƣờng phải oxi hóa mẫu trƣớc bằng axit Nitric (HNO3) sau đó mới sử dụng axit Pecloric (HClO4). Trong trƣờng hợp phá mẫu bằng lò vi sóng phải rất thận trọng vì trong bình kín, ở nhiệt độ và áp suất cao Axit pecloric (HClO4) dễ gây nổ. Loại mẫu được áp dụng: Các mẫu hữu cơ và vô cơ. Trong nhiều trƣờng hợp ta phải sử dụng hỗn hợp các axit mới có thể vô cơ hóa đƣợc hoàn toàn mẫu. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sử dụng hỗn hợp các axit trên theo một tỉ lệ nhất định để vô cơ hóa các mẫu hải sản, phân hủy hoàn toàn các nền mẫu hữu cơ và đƣa về dạng dung dịch trƣớc khi tiến hành phân tích, xác định hàm lƣợng Asen trong các mẫu hải sản đó. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 1.4.2. Phương pháp chiết và bảo quản các dạng Asen trong các mẫu hải sản [13]. Một yêu cầu thiết yếu để thu đƣợc kết quả phân tích dạng đáng tin cậy là việc bảo quản hàm lƣợng những dạng hóa học ban đầu trong mẫu trƣớc khi phân tích. Vấn đề cần xem xét đầu tiên chính là thu thập mẫu, bảo quản và cất giữ mẫu trong điều kiện tốt nhất để ngăn ngừa sự nhiễm bẩn và mất mát nhỏ nhất ở mức độ vết của phép phân tích, sao cho khi phân tích dạng, nồng độ của những dạng riêng lẻ của hỗn hợp không bị thay đổi bởi việc giữ mẫu và xử lý mẫu. Chính vì vậy, cần có sự nghiên cứu, phát triển những phƣơng pháp làm ổn định các dạng Asen trong những mẫu phân tích trong quá trình thu mẫu và cất giữ mẫu. Bên cạnh đó, việc khảo sát các điều kiện tối ƣu để giữ nguyên các dạng Asen trong các mẫu phân tích dƣới những điều kiện khác nhau là cần thiết vì một số dạng của Asen có thể chuyển đổi từ dạng này sang dạng khác hoặc mất đi trong quá trình chuẩn bị mẫu [40], ví dụ nhƣ: Những điều kiện cất giữ tối ƣu, thời gian cất giữ... để sao cho có thể hạn chế đến mức thấp nhất các rủi ro có thể dẫn đến sự biến đổi những dạng cần xác định. Đối với phƣơng pháp chiết, cần phải xem xét xem liệu phƣơng pháp chiết đó có thể sản sinh ra bất kỳ sự biến đổi nào của những dạng hiện có trong dung dịch mà cần phải đƣợc xác định hay không. Nhìn chung, nếu lấy mẫu ở cùng một địa điểm thì quá trình chiết Asen từ những mẫu rắn là hầu nhƣ không khác nhau khi mẫu đƣợc bảo quản tốt. Chuẩn bị mẫu cho những mẫu rắn nói chung có thể bao gồm những quá trình nhƣ: xắt nhỏ, đông khô, nghiền, trộn đều và rây để dùng cho quá trình chiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Một phép chiết đạt yêu cầu cần phải chiết hoàn toàn tất cả các dạng Asen mà không làm thay đổi dạng ban đầu của nó. Đồng thời, dung môi để chiết các mẫu không đƣợc gây trở ngại cho sự phân tích dạng. Dƣới đây là một số phƣơng pháp chiết đã đƣợc áp dụng trong phân tích dạng Asen: Phương pháp hòa tan (solubilization) với HCl và làm bay hơi bằng lò vi sóng: Cơ sở của phƣơng pháp hòa tan với HCl và làm bay hơi bằng lò vi sóng đƣợc trình bày thành phƣơng pháp chiết Asen vô cơ từ những sản phẩm hải sản [13]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không thích hợp để xác định những dạng AsIII và AsV vì AsV đƣợc chuyển đổi sang AsIII trong suốt quá trình thủy phân và chiết. Sự chuyển đổi giữa AsIII và AsV cũng đƣợc thấy khi sử dụng axit tricloroacetic để thủy phân những mẫu gạo [30]. Mới đây, phƣơng pháp có khả năng chiết nhanh (ASE) đƣợc áp dụng để chiết những dạng Asen trong mẫu rắn [30]. Phƣơng pháp bán tự động này sử dụng áp suất và nhiệt độ trong suốt thời gian chiết, cho thấy nó nhanh hơn và ít mất công sức hơn so với phƣơng pháp chiết truyền thống. Tuy nhiên, so sánh với phƣơng pháp chiết rung siêu âmvới hỗn hợp methanol- nƣớc (1:1) thì khả năng thu hồi Asen trong mẫu thấp hơn 10-20 % [12]. Qui trình phá mẫu enzim kết hợp với phƣơng pháp chiết đã đƣợc nghiên cứu để tăng hiệu suất chiết đối với một số mẫu sinh học, Những qúa trình chiết khác nhƣ chiết Soxhlet [13] và chiết pha rắn cũng đƣợc áp dụng. Methanol là dung môi thƣờng đƣợc sử dụng nhất để chiết những dạng Asen từ những mô sinh vật biển. Sự bay hơi của methanol và phân chia phần còn lại giữa điethyl ether/nuớc có thể cung cấp thông tin về những số lƣợng tƣơng đối của Asen hòa tan-lipid và hòa tan-nƣớc. Ngoài ra ngƣời ta có thể Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 dùng hỗn hợp methanol/choloform/nƣớc để chiết mô sinh vật nguyên bản. Cả hai quy trình thu hồi phần lớn Asen trong giai đoạn chiết.[13] Hiện nay phƣơng pháp chiết methanol: nƣớc và kết hợp rung siêu âm nhiều lần đuợc sử dụng rộng rãi nhất vì đây là một phƣơng pháp chiết rất tốt thể hiện qua hiệu suất thu hồi các dạng Asen hòa tan trong mẫu rắn lên tới 95%.[13] Nhƣ vậy đối với một số mẫu sinh vật biển hàm lƣợng Asen xác định phụ thuộc vào phƣơng pháp chiết. Asen còn lại sau khi chiết methnol có thể còn trong bã, hoặc phản ánh sự chiết không hoàn toàn vài dạng Asen phân cực hơn. Ví dụ, khi phân tích HPLC/ICP-MS dịch chiết methanol mẫu đông khô gan rùa cho thấy Asenate là vết, nhƣng chiết bằng nƣớc liên tục của cùng chất đó thì hàm lƣợng Asenate chiếm 35% toàn bộ Asen có thể chiết ra [27]. Một vài Asen hữu cơ (ví dụ Asenosugar) rất phân cực, nếu chiết bằng methanol thì chỉ tìm thấy hàm lƣợng thấp trong mẫu sinh vật biển. Nhƣ vậy, đối với một số mẫu sinh vật biển, việc xác định Asen phụ thuộc vào phƣơng pháp chiết . So với các đối tƣợng khác, số liệu về phân tích dạng Asen trong sinh vật biển có chiều hƣớng tăng. Do đó, việc đánh giá và so sánh các dữ liệu này khá đơn giản. Bên cạnh đó vì quy trình chiết đã đƣợc chuẩn hóa nên các dạng Asen đƣợc chiết ra giống nhau trƣớc khi đem đi phân tích. Tóm lại, quá trình chiết cần đạt hiệu suất cao và giảm thiểu nhỏ nhất sự phá hủy dạng Asen hiện có trong mẫu rắn, một trong những yêu cầu tiên quyết để từ đó mới có đƣợc thông tin chính xác về các dạng Asen trong các mẫu hải sản và qua đó đánh giá đƣợc tính độc của các mẫu hải sản đã đƣợc phân tích. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 1.4.3. Ổn định và duy trì những dạng ban đầu của mẫu. Một yêu cầu thiết yếu để thu đƣợc thông tin dạng đáng tin cậy là việc bảo quản hàm lƣợng những dạng nguyên bản hóa học ban đầu trong mẫu trƣớc khi phân tích. Nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để bảo toàn những dạng Asen phân bố trong mẫu tự nhiên. Những mẫu chứa hàm lƣợng AsIII và As V có nồng độ 0,5  g/l hoặc 1  g/l đƣợc bảo quản tại 40C ổn định đƣợc 21 ngày và cho thấy không có sự biến đổi nào sau 21 ngày cất giữ. Tại 250C nhận xét thấy có những dung dịch có hàm lƣợng Asen cao nhất (  20  g/l) vẫn có thể bảo quản mà không có sự mất mát đáng kể của các dạng Asen [36]. Tuy nhiên, ở tại nồng độ thấp hơn, ta quan sát thấy sự biến đổi của các dạng vào cuối tuần đầu tiên. Một số nghiên cứu cho thấy rằng bảo quản mẫu tại -200C là tốt nhất để giữ các dạng [13]. Những phƣơng pháp bảo quản trên cho các dạng ban đầu của AsIII và AsV phải thực hiện ngay lập tức sau khi thu thập mẫu thì mới có hiệu quả, nhất là khi mẫu đƣợc sử dụng để phân tích hải sản- một trong những loại mẫu rất dễ bị phân hủy dẫn đến làm sai lệch kết quả phân tích. 1.5. Các phƣơng pháp phân tích Asen Trong phân tích Asen tùy theo điều kiện hiện trƣờng mà lựa chọn phƣơng pháp phân tích phù hợp. 1.5.1. Phương pháp đo hiện trường với chất nhuộm thủy ngân Bromua +Nguyên tắc: Asen(III) và Asen(V) đƣợc chuyển thành khí AsH3 nhờ hỗn hợp khử mạnh : NH2SO3H- axit sunfamic và NaBH4 - (Natri bohiđrua). Khí Asin tạo thành sẽ tạo phức với thủy ngân bromua đƣợc tẩm trên giấy và chuyển thành màu vàng. Việc định lƣợng dựa vào màu trên giấy thử hoặc độ đậm nhạt của màu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 + Giới hạn phát hiện: 10ppb.Tuy nhiên, độ hấp thụ quang có thể bị ảnh hƣởng bởi khí H2S, Cần dùng bông lọc chứa chì axetat để hấp thụ khí này. + Ứng dụng: Đo hiện trƣờng với số lƣợng mẫu lớn, chủ yếu cho mục đích sàng lọc trên diện rộng.[13] 1.5.2. Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử cảm ứng cộng hưởng plasma (ICP- ASE) + Nguyên tắc: Dung dịch mẫu đƣợc phun ở dạng sol tới vùng plasma agon có nhiệt độ từ 60000K đến 80000K, tại đó , Asen đƣợc nguyên tử hóa và phát xạ bƣớc sóng đặc trƣng. Nồng độ Asen trong mẫu đƣợc xác định dựa trên cƣờng độ của các vạch phát xạ. + Giới hạn phát hiện: 35 -50 ppb. + Ứng dụng: Phƣơng pháp này có thể xác định nhiều nguyên tố cùng một lúc và đƣợc áp dụng đối với tất cả các loại nền màu khác nhau, tuy nhiên, các mẫu rắn và mẫu lỏng chứa nhiều kết tủa phải xử lý trƣớc khi phân tích. 1.5.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử kết hợp thiết bị sinh khí Hiđrua ( HVG - ASS) . Quang phổ hấp thụ nguyên tử (ASS) là một kỹ thuật phân tích lƣợng vết các nguyên tố phổ biến, đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm với độ chọn lọc độ lặp lại cao, có thể phân tích hàng loạt mẫu trong thời gian ngắn, giá thành thiết bị không quá đắt. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng rộng rãi trong phân tích định lƣợng Asen kết hợp với thiết bị tạo khí Hiđrua. + Nguyên tắc: Asen vô cơ hòa tan trong nƣớc có thể ở dạng As(III) hay As(V), hiệu suất tạo khí Hiđrua của hai dạng này khác nhau nên tất cả các Asen trong mẫu phải đƣợc khử về As(III) nhờ tác nhân khử của KI hoặc NaI. Sau đó As(III) phản ứng với hiđro mới sinh (tạo thành khi tác nhân khử Zn hoặc NaBH4 gặp môi trƣờng axit) tạo ra hợp chất Asin - AsH3. Khí Asin sẽ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 đƣợc dẫn vào bộ phận nguyên tử hóa mẫu nhờ khí Argon tạo ra các đám hơi nguyên tử tự do. Các nguyên tử này sẽ hấp thụ các tia sáng có bƣớc sóng đặc trƣng và cho kết quả độ hấp thụ.[13] + Giới hạn phát hiện: Phƣơng pháp này có thể xác định hàm lƣợng Asen trong mẫu cỡ 0,5ppb. 1.5.4. Phương pháp dùng vi khuẩn phát sáng. Nhóm nghiên cứu thuộc Viện khoa học và Công nghệ môi trƣờng Thụy Sĩ đã lợi đụng khả năng nhạy cảm với Asen của vi khuẩn Escherichia coli để biến đổi gen sao cho chúng phát sáng khi dò thấy Asen trong nƣớc. E. Coli hiện đang đƣợc thử nghiệm tại Việt Nam, có ƣu điểm vƣợt trội so với các phƣơng pháp khác là chi phí thấp mà không giải phóng các hóa chất độc hại vào môi trƣờng. 1.5.5. Phương pháp phân tích thể tích Dùng dung dịch chuẩn I2 + KI chuẩn dung dịch Asenic (AsO3 3- ) trong môi trƣờng kiềm có thêm vài giọt hồ tinh bột. Tại điểm cuối của phép chuẩn độ dung dịch có mau xanh hồ tinh bột + iôt. Để đảm bảo độ chính xác của phép chuẩn độ cần đƣa mọi dạng tồn tai của Asen về As(III). I2 + AsO3 3- + 2OH -  AsO4 3- + 2I - + H2O 1.5.6. Phương pháp cực phổ Von- Ampe hòa tan Cơ sở của phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan là xây dựng đƣờng cong phụ thuộc giữa cƣờng độ dòng điện và hiệu điện thế giữa hai điện cực đƣợc đặt trong bình điện phân chứa chất cần nghiên cứu. Phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan gồm có các giai đoạn chính nhƣ sau: Khi điện phân làm giàu cần chọn thế thích hợp và giữ không đổi trong suốt quá trình điện phân. Thông thƣờng ngƣời ta chọn thế ứng với dòng khuyếch tán giới hạn của chất cần phân tích và tại thế đó chỉ có một số tối thiểu các chất bị oxi hóa hoặc khử trên điện cực. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Các loại phản ứng có thể dùng để kết tủa lên bề mặt điện cực có thể là: - Khử ion kim loại trên điện cực thủy ngân Me n+ + ne + Hg  Me(Hg)  - Khử ion kim loại trên điện cực rắn trơ Me n+ + ne  Me  - Phản ứng làm giàu chất điện cực dƣới dạng hợp chất khó tan hoặc với ion kim loại dùng làm điện cực hoặc với một ion nào đó trong dung dịch. - Hấp thụ điện hóa các chất lên bề mặt điện cực làm việc bằng cách thêm vào dung dịch một thuốc thử có khả năng bị hấp phụ lên bề mặt điện cực, sau khi bị hấp phụ nó sẽ tạo phức với ion cần xác định để tập trung ion đó lên bề mặt điện cực. Phƣơng pháp Von- Ampe hòa tan đƣợc phân chia thành dạng Von- Ampe hòa tan anot và Von- Ampe hòa tan catot. Nếu điện phân là quá trình khử catot ở thế không đổi ETL thì khi hòa tan cho quét thế với tốc độ không đổi, đủ lớn từ giá trị ETL về phía dƣơng hơn. Quá trình hòa tan là quá trình anot và phƣơng pháp gọi là "Von- Ampe hòa tan anot" hay viết tắt là ASV (Anodic Stripping Vontammestry). Nếu điện phân là quá trình oxi hóa anot ở thế không đổi ETL thì khi hòa tan cho quét thế với tốc độ không đổi, đủ lớn từ giá trị ETL về phía thế âm hơn. Quá trình hòa tan là quá trình catot và phƣơng pháp gọi là "Von- Ampe hòa tan catot" hay viết tắt là CSV (Catotdic Stripping Vontammestry). 1.5.8. Phương pháp trắc quang [4,5,10] Nguyên tắc : Để quan sát đƣợc phổ hấp thụ trong vùng UV - VIS ta phải có chất nghiên cứu ở dạng có màu. Các chất xác định cần chuyển vào dung dịch dƣới dạng hợp chất màu với một thuốc thử thích hợp có độ nhạy lớn trong vùng phổ UV - VIS trong các điều kiện tối ƣu ( pH, nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ thuốc thử...). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Chụp phổ hấp thụ electron của hợp chất màu ở dải sóng 200 - 1000 nm. Tại điểm độ hấp thụ quang đạt giá trị cực đại ta tìm đƣợc bƣớc sóng mà chất màu hấp thụ ánh sáng cực đại. Khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu đƣợc xác định bởi biểu thức định lƣợng của định luật Buger - Lambe - Beer: A =  .l.C Trong đó: A: Mật độ quang - Khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu.  : Hệ số hấp thụ phân tử mol. l: Bề dày cuvet có đơn vị cm. C: Nồng độ của dung dịch màu. Trong thực hành phân tích trắc quang, ngƣời ta thƣờng xây dựng đƣờng cong biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ chất màu trong dung dịch: A = f(C). Thực nghiệm cho thấy, mật độ quang chỉ phụ thuộc tuyến tính theo nồng độ ở một giới hạn C0 nhất định. Do đó, ta thƣờng xác định nồng độ chất nghiên cứu trong mẫu ở khoảng nồng độ tuyến tính OA (hình 1.1), nếu nồng độ lớn hơn C0thì ta phải pha loãng mẫu, kết quả nhân với hệ số pha loãng. C0 C(mg/l) Hình 1.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ chất hấp thụ. 0 A0 A LOL Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Phƣơng pháp đƣờng chuẩn trong phân tích trắc quang: Trong thực tế ngƣời ta chỉ sử dụng vùng tuyến tính (Đoạn OA hay còn gọi là đƣờng chuẩn), khoảng tuyến tính này rộng hay hẹp tùy thuộc vào độ nhạy của hợp chất màu. Các chất càng nhạy trong vùng phổ UV - VIS thì vùng tuyến tính càng hẹp và lùi về phía nồng độ thấp, thuận lợi cho việc định lƣợng vết chất. Các bước xây dụng đường chuẩn: Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của mật độ quang vào nồng độ, sau đó đo mẫu trong cùng điều kiện, từ đó xác định đƣợc hàm lƣợng chất cần phân tích dựa vào đƣờng chuẩn. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Chụp phổ hấp thụ phân tử của thuốc thử và hợp chất màu. Bƣớc 2: Khảo sát, chọn các điều kiệ tối ƣu cho sự tạo hợp chất màu nhƣ: thời gian, độ pH, tỉ lệ thuốc thử... Bƣớc 3: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần phân tích với hàm lƣơng tăng dần, cho vào mỗi dung dịch một lƣợng thuốc thử nhƣ nhau, các điều kiện để tạo phức nhƣ: pH, thời gian, nhiệt độ và các điều kiện khác nhƣ nhau. Sau đó, xác định mật độ quang của hợp chất màu trong khoảng nồng độ tuyến tính. Bƣớc 4: Từ giá trị mật độ quang và nồng độ, ta thiết lập đƣợc đƣờng chuẩn trong hệ tọa độ xy, xác định đƣợc hàm lƣợng chất cần nghiên cứu trong mẫu thực(Cx) bằng đƣờng chuẩn khi biết giá trị mật độ quang của mẫu(Ax). Phương pháp trắc quang với phép phân tích Asen Trong phép phân tích Asen bằng phƣơng pháp trắc quang, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại thuốc thử, trong phạm vi của luận văn này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Bạc đietylđithiocacbamat để tạo phức với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 khí Asin - AsH3, đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phân tích Asen bằng phƣơng pháp trắc quang. Qui trình của phƣơng pháp có thể tóm tắt nhƣ sau: Nguyên tắc: Các hợp chất của Asen trong mẫu đƣợc oxi hóa bằng KMnO4 hoặc K2S2O8, tiếp theo As(v) đƣợc khử về As(III) bằng KI. Sau đó Asen đƣợc khử tiếp thành khí Asin - AsH3 bằng hiđro mới sinh trong môi trƣờng axit. Asin tác dụng với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat trong piriđin hoặc clorofom tạo phức màu đỏ tím. Sau đó, đo độ hấp thụ quang của phức màu đƣợc tạo thành ở bƣớc sóng 520nm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 CHƢƠNG II THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang: GBC Cintra 40 UV - Visible spectrometer. - Máy đo pH: TOA pH METTER MODEL HM 5BS của Nhật. - Máy đông khô. - Máy cất nƣớc hai lần: MILL_ Q của Thụy Sĩ. - Cân phân tích chính xác 0,01mg: Srtocius - Thụy Sĩ. - Tủ sấy, lò nung, tủ hút, bếp khuấy từ. - Máy li tâm, bể rung siêu âm. - Bình định mức: 500ml, 250ml, 100ml, 50ml,25ml. - Cốc thủy tinh: 500ml, 250ml, 100ml, 50ml. - Pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml. - Đũa thủy tinh, giấy lọc, bình tia. - Phễu lọc, giấy siêu lọc, các bình PVE, chai thủy tinh tối màu.... - Dụng cụ thí nghiệm bằng teflon, thạch anh.... - Hệ tạo phức của Asen với thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat. - Bình đựng mẫu... Tất cả các dụng cụ dùng để phân tích đều đƣợc ngâm bằng HNO3 10% trong 24 giờ, sau đó đƣợc rửa sạch và tráng bằng nƣớc cất hai lần. 2.1.2. Hóa chất - Axit HNO3. - Axit H2SO4 - Axit HCl. - Zn hạt hoặc Zn bột sạch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 - Dung dịch chuẩn Asen 1000 ppm. - Thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat. - Methalnol - CH3OH. -Mẫu cá chuẩn Dogfish Liver Certified Reference Material for Trace Metals (DOLT-3) có hàm lƣợng Asen tổng số: 10,2  0,5(mg/kg) 2.1.3. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn. + Dung dịch chuẩn asen 10 mg/l Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc asen 1000 mg/l cho vào bình 100ml định mức đến vạch bằng nƣớc cất hai lần. + Dung dịch chuẩn Asen 100  g/l: Lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn làm việc 10ppm cho vào bình 100ml định mức đến vạch bằng nƣớc cất hai lần. + Dung dịch Axit dimetylasinic-DMA mg/l: Cân 28,57mg ( CH3)2AsNaO2.3H2O thêm nƣớc cất, định mức đến 100ml. + HNO3 : HClO4 (1: 1): Trộn 100ml HNO3 ? với 100ml HClO4 72%. + MeOH : H2O (1 : 1): Trộn 150ml MeOH với 150ml nƣớc cất hai lần. + Axit HCl 15%: Hút 101,2 ml HCl 37% cho vào định mức đến 250 ml bằng nƣớc cất đƣợc 250ml dung dịch HCl 15%. + Thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat: Pha loãng 1ml Mocfolin trong 70ml Clorofom thêm 0,3 g Bạc đietylđithiocacbamat, lắc nhẹ cho đến khi Bạc đietylđithiocacbamat tan hoàn toàn, sau đó định mức đến vạch bằng Clorofom. Dung dịch pha đƣợc có màu vàng, đƣợc bảo quản trong điều kiện không tiếp xúc với ánh sáng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 +Pha natri bo hiđrua (NaBH4): Hòa tan 0,4 gam NaOH trong 400ml nƣớc, sau đó thêm 4gam Natri bo hiđrua (NaBH4) vào dung dịch trên, lắc nhẹ cho NaBH4 tan hoàn toàn (dung dịch này chuẩn bị hàng ngày). +Axit clohiđric HCl 2M: Pha loãng 165ml Axit clohiđric đặc đến thể tích V = 1 lit bằng nƣớc cất hai lần. + Dung dịch Chì axetat: Hòa tan 10 gam (CH3COO)2Pb.2H2O trong 100ml nƣớc cất hai lần. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.2.1.Phương pháp xác định asen : Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích asen, do giá thành thiết bị cao, cùng với quy trình vận hành phức tạp, nên chỉ có ít phòng thí nghiệm ở Việt Nam sử dụng phƣơng pháp này để xác định asen. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định hàm lƣợng asen trong các mẫu hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Nguyên tắc của phƣơng pháp đƣợc tóm tắt nhƣ sau: Các dạng asen vô cơ hòa tan trong dung dịch, có thể ở dạng As (III) hoặc As (V) đƣợc khử về dạng As(III) bằng dung dịch KI vì hiệu suất tạo hydrua của As(V) thấp hơn nhiều so với As(III). Dạng asen này sẽ phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) bởi NaBH4 hoặc kẽm hạt trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat, tạo thành hợp chất màu đỏ tím có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 520 nm. AsO4 3- + 2I - + 2H +  AsO3 3- + I2+ H2O 3Zn + As 3+ + 3H +  3Zn 2+ + AsH3 AsH3+6AgSCSN(C2H5)2 6Ag +3(C2H5)2SCSNH + [(C2H5)2SCSN]As. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Sơ đồ của: Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamatnhƣ sau. - Phân tích asen tổng số: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen trong hải sản, mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng hỗn hợp các axit để chuyển tất cả các dạng asen về asen (V), sau đó asen (V) đƣợc khử về asen (III) bằng KI và xác định bằng phƣơng pháp đo quang. - Phân tích các dạng asen vô cơ: Mẫu hải sản đƣợc chiết trong hỗn hợp methanol- nƣớc bằng siêu âm, sau đó ly tâm và xác định hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong dịch chiết bằng phƣơng pháp đo quang. - Phân tích các dạng asen hữu cơ: Hàm lƣợng asen hữu cơ đƣợc tính toán dựa trên hàm lƣợng asen tổng số và hàm lƣợng asen vô cơ 2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu: - Phân tích asen tổng số: Trong mẫu hải sản, asen đƣợc liên kết chặt chẽ với các protein. Do đó trƣớc khi định lƣợng, cần phá vỡ nền protein của mẫu để đƣa các dạng asen về dạng vô cơ bằng một phƣơng pháp vô cơ hóa thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ƣớt có sử dụng hỗn hợp các axit HNO3, HClO4 và H2SO4 theo các tỷ lệ thích hợp. Hình 2.1 Hệ tạo hợp chất mầu của Asin và Bạc đietylđithiocarbamat Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 - Phân tích asen vô cơ: Để phân tích hàm lƣợng tổng asen vô cơ trong các mẫu hải sản, chúng tôi sử dụng quy trình chiết của Nguyễn Đình Thuất[13], mẫu đƣợc chiết với MeOH-H2O bằng siêu âm, sau đó ly tâm và tiến hành phân tích bằng phƣơng pháp trắc quang. 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu: Asen là nguyên tố độc hại, có khả năng tích lũy sinh học cao, đặc biệt là trong các đối tƣợng thủy hải sản, tuy nhiên mức độ độc hại của asen lại phụ thuộc vào dạng hóa học của chúng. Do vậy đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này là sự tích lũy và phân bố các dạng asen vô cơ và hữu cơ trong các loại hải sản bao gồm: Tôm, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, sao biển, vẹm xanh, ngao.. 2.4. Nội dung nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lƣợng Asen tổng số, dạng hợp chất Asen vô cơ, dạng hợp chất Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên với nội dung nhƣ sau: 2.4.1. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định asen bằng phương pháp đo quang: - Khảo sát sự hình thành hợp chất mầu của asin với thuốc thử - Khảo sát cực đại hấp thụ của hợp chất màu. - Khảo sát thời gian phản ứng. - Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu, thể tích thuốc thử. - Xây dựng đƣờng chuẩn để xác định Asen. 2.4.2. Xây dựng qui trình phân tích cho các đối tượng mẫu nghiên cứu. - Nghiên cứu, khảo sát và lựa chọn phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp để định lƣợng Asen. - Nghiên cứu, khảo sát ảnh hƣởng của các loại axit và nồng độ axit đến qui trình xử lý mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 - Xác định qui trình phân tích Asen tổng số, qui trình phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản. - Phân tích định lƣợng Asen tổng số, xác định hàm lƣợng các dạng Asen hữu cơ và vô cơ trong các mẫu hải sản theo qui trình đã xây dựng và xác định đƣợc. - Xử lý và đánh giá kết quả thực nghiệm. - Kết luận về tính độc của các hải sản đã phân tích. 2.5. Lấy mẫu và bảo quản mẫu. - Các mẫu cá, tôm sú, vẹm xanh, sao biển, ngao trƣớc khi phân tích đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất hai lần, cất vào tủ đông cho đến khi đông đá hoàn toàn, sau đó, mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô chân không để không phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu, giữ nguyên đƣợc dạng hữu cơ trong mẫu. Cuối cùng, nghiền nhỏ mẫu và bảo quản ở nhiệt độ -50C. Hình 2.1: Quy trình xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang Mẫu hải sản dạng bột Asen tổng số Dạng Asen vô cơ cơ Dạng Asen hữu cơ Mẫu đã vô cơ hóa (dạng dung dịch) Mẫu chiết (dạng dung dịch) Mẫu hải sản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình tạo hợp chất màu Để nghiên cứu sự tạo thành hợp chất màu của bạc Đietylđithiocacbamat với khí Asin- AsH3 bằng phƣơng pháp trắc quang, trƣớc hết phải biết đƣợc phổ hấp thụ của thuốc thử và của phức. Vì vậy, công việc đầu tiên là khảo sát phổ của chúng. 3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của thuốc thử: Dùng pipet lấy chính xác 10ml dung dịch HCl 15% vào bình phản ứng, thêm 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút, để yên 10 phút.. Sau đó đem đo mật độ quang của dung dịch thuốc thử với cuvet 1cm ở dải sóng 350nm-750nm. Dung dịch so sánh là Clorofom. Kết quả đo đƣợc biểu diễn trên hình 3.1. 3.1.2. Khảo sát phổ hấp thụ của hợp chất màu - Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50  g/l vào bình phản ứng của hệ tạohợp chất màu, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ của hệ tạo phức đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút. Dạng asen này phản ứng với hidro mới sinh tạo thành khí (AsH3) trong môi trƣờng axit (pH=1). Khí Asin giải phóng đƣợc hấp thụ trong dung dịch bạc đietylđithiocarbamat tạo hợp chất màu, sau đó, lấy phần hợp chất màu vừa tạo đƣợc đem đo phổ ở dải sóng 350nm - 750nm, với dung dịch so sánh là Clorofom, ta thu đƣợc phổ hấp thụ của hợp chất màu nghiên cứu ở hình 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của hợp chất màu của Asen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 - Dựa vào phổ hấp thụ của thuốc thử và phổ hấp thụ của phức màu của Asen cho thấy hợp chất màu có đỉnh hấp thụ đạt cực đại tại bƣớc sóng λ max= 520nm. Cũng tại bƣớc sóng này thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofomkhông có đỉnh hấp thụ, vì vậy, để đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của phép phân tích, chúng tôi chọn bƣớc sóng λ = 520nm, khi khảo sát mật độ quang trong các phép đo về sau. Dung dịch so sánh đƣợc sử dụng trong các phép đo là Clorofom vì tuy thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat có màu, song vì thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat và dung dịch clorofom đều không có đỉnh hấp thụ tại bƣớc sóng 520nm. Vì thế, trong các phép đo về sau chúng tôi sử dụng dung dịch so sánh là clorofom. 3.1.3. Khảo sát thời gian tối ưu cho việc tạo hợp chất màu. Để xét đến khoảng thời gian nào thì phức có độ quang ổn định, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới sự tạo hợp chất màu nhƣ sau: - Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 50  g/l vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn, đồng thời lắp bình hấp thụ đã có sẵn 4ml dung dịch bạc Đietylđithiocacbamat vào bình phản ứng. Khuấy từ ở bình phản ứng với thời gian thay đổi nhƣ trong bảng 3.1 tạo ra hơi Asin, hơi Asin giải phóng ra đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, tiếp theo, đo mật độ quang của hợp chất màu thu đƣợc ở các thời gian trên tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.1 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.2. Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian Thời gian Mật độ quang(A) 0 0,001 5 0,112 10 0,160 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 20 0,368 25 0,370 30 0,371 60 0,369 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian 0 0. 5 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 5 10 20 25 30 60 Thời gian (phút) A b s Mật độ quang( A) Hình 3.2 Ảnh hƣởng của thời gian đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.1 và đồ thị hình 3.2 cho thấy mật độ quang tăng dần trong 20 phút đầu tiên, sau 20 phút mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, hợp chất màu ổn định sau 20 phút và bền trong thời gian dài, do đó chúng tôi chọn thời gian tối ƣu để khảo sát mật độ quang sau khi tạo phức là 20 phút. 3.1.4.Ảnh hưởng của pH đến quá trình khử Asen(III) thành Asin Theo những kết quả nghiên cứu khảo sát và thu thập các tài liệu tham khảo [15,16] về phƣơng pháp phân tích Asen bằng phƣơng pháp đo quang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 cho thấy quá trình khử Asen vô cơ về AsH3 đạt hiệu suất cao nhất tại môi trƣờng Axit có pH = 1. Do đó chúng tôi chọn pH tối ƣu để khảo sát mật độ quang trong quá trình nghiên cứu và phân tích Asen là pH=1 để toàn bộ lƣợng As(III) và As(V) đều đƣợc khử thành Asin. 3.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (KI) tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Để phân tích hàm lƣợng Asen tổng số trong các mẫu hải sản thì mẫu phải đƣợc vô cơ hóa với hỗn hợp Axit. Các dạng Asen trong mẫu bị oxi hóa và tồn tại ở dạng As(V). Động học của phản ứng tạo hiđrua(AsH3) của As(V) rất chậm so với As(III), do đó cần khử As(V) về As(III) trƣớc khi tiến hành định lƣợng. Tác nhân khử As(V) về As(III) đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu[15,16] cho thấy hiệu suất khử As(V) về As(III) đạt 100% khi sử dụng 1ml dung dịch KI 10% cho 50ml dung dịch, do vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo trƣớc khi thực hiện phản ứng tạo Asin thì mẫu đƣợc thêm 1ml dung dịch KI 10%. 3.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Qua tham khảo một số tài liệu, xác định Asen bằng phƣơng pháp trắc quang ngƣời ta thƣờng sử dụng hai loại chất khử là: Natribohidrua (NaBH4) và Kẽm (Zn).Việc sử dụng NaBH4 đƣợc ứng dụng nhiều trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hóa hơi lạnh, do phản ứng khử của NaBH4 diễn ra nhanh nên đáp ứng đƣợc thời gian đo phổ hấp thụ nguyên tử của Asen. Đối với kẽm, phản ứng khử các dạng Asen vô cơ về Asin diễn ra chậm hơn nên ít đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tuy nhiên, đối với phƣơng pháp phân tích trắc quang do cần thời gian phản ứng dài để quá trình tạo hợp chất màu đƣợc triệt để, nên kẽm thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp đo quang. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kẽm là chất khử để khử As(III) thành Asin khi tiến hành xây dựng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 đƣờng chuẩn cũng nhƣ phân tích xác định Asen trong mẫu hải sản. Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử Zn đến quá trình tạo hợp chất màu chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dãy mẫu chuẩn As(III) có cùng nồng độ là 20  g/l trong nền 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và lƣợng Zn thay đổi nhƣ trong bảng. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và với phản ứng 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Các kết quả khảo sát đƣợc đƣa ra trong bảng 3.2 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.3. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn )tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. STT Lƣợng Zn(g) Độ hấp thụ(A) 1 0 0,002 2 0, 1 0,045 3 0,5 0,075 4 1 0,135 5 2 0,179 6 3 0,181 7 4 0,181 8 5 0,179 9 6 0,184 10 8 0,180 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử (Zn) tới độ hấp thụ quang (A) cuả hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 0, 1 0,5 1 2 3 4 5 6 8 Lượng Zn(g) A b s Độ hấp thụ(A) Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử(Zn)tới độ hấp thụ quang(A) cúa hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc trên bảng 3.2 và đồ thị hình 3.3. cho thấy: Mật độ quang tăng khi tăng lƣợng chất khử (Zn) từ 0,1-2 gam. Khi tiếp tục tăng lƣợng chất khử đến 2g thì mật độ quang ổn định và hầu nhƣ không thay đổi. Nhƣ vậy, độ hấp thụ quang của hợp chất màu ổn định và bền khi lƣợng chất khử từ 2gam trở lên. Tuy nhiên, khi tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn cũng nhƣ khi phân tích mẫu nồng độ của Asen có thể cao hơn, do đó, chúng tôi chọn lƣợng chất khử để tạo phức màu của Asen là 4gam trong tất cả các phép đo về sau. 3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác tới sự tạo hợp chất màu Ngoài thời gian và lƣợng chất khử còn rất nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu nhƣ: Ảnh hƣởng của thể tích thuốc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 thử, thể tích mẫu, ảnh hƣởng của các ion cản... Vì vậy, để thu đƣợc kết quả tin cậy, tiếp theo, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố này. 3.2.1.Khảo sát ảnh hưởng của thể tích thuốc thử. +Lấy 50 ml dung dịch Asen(III) 20  g/l vào bình phản ứng hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin sẽ đƣợc dẫn vào bình hấp thụ của hệ tạo phức và phản ứng với dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat có thể tích thay đổi nhƣ trong bảng 3.3 tạo đƣợc hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom , kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng 3.3, và đƣợc biểu diễn trên hình 3.4. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu. STT Thể tích As(III) chuẩn (ml) Thể tích thuốc thử C5H10AgNS2(ml) CAsen(III) chuẩn (  g/l) Mật độ quang (A) 1 50 2 20 0,195 2 50 4 20 0,180 3 50 6 20 0,178 4 50 8 20 0,170 5 50 10 20 0,150 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 2 4 6 8 10 Thể tích thuốc thử (ml) A bs Abs Hình 3.4 Ảnh hưởng của thể tích thuốc thử tới độ hấp thụ quang (A) của hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc trong bảng 3.3 và đồ thị hình 3.4 cho thấy, ở thể tích thuốc thử là 2ml hợp chất màu có độ hấp thụ quang là lớn nhất, và phép đo đạt độ nhạy cao nhất, sau đó mật độ quang giảm dần khi tăng thể tích thuốc thử. Tuy nhiên, khi sử dụng thể tích thuốc thử là 2ml, thì sau thời gian phản ứng 20 phút thì thể tích thể tích thuốc thử bị thay đổi nhiều do dung môi bay hơi, dẫn đến độ lặp lại của phép đo thấp, do vậy, vừa để đạt độ nhạy cao và độ lặp lại tốt chúng tôi sử dụng thể tích thuốc thử trong quá trình tạo hợp chất màu là 4ml . 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu. Để xác định đƣợc thể tích mẫu thích hợp nhất cho quá trình phân tích, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu theo các thí nghiệm sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 - Lấy lƣợng dung dịch chuẩn As(III) 20  g/l với các thể tích thay đổi là 50ml, 75ml, 100ml vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, lấy phần hợp chất màu vừa tạo đƣợc đem đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm, dung dịch so sánh là clorofom, kết quả thu đƣợc trong bảng 3.4 và đƣợc biểu diễn trên hình 3.5. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. STT V(ml) bạc Đietylđithiocacbamat V Asen(III) (ml) A 1 4 50 0,180 2 4 75 0,268 3 4 100 0,354 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang(A) của hợp chất màu 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 50 75 100 thể tích mẫu(ml) A b s Abs Hình 3.5. Ảnh hưởng của thể tích mẫu đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. Dựa vào kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4 và đồ thị trên hình 3.5, ta thấy mật độ quang của phức màu tăng tuyến tính khi thể tích mẫu tăng. Do phân tích mẫu phải qua quá trình vô cơ hóa mẫu và do toàn bộ lƣợng Asin giải phóng đƣợc phản ứng với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat, vì vậy để phù hợp với quá trình vô cơ hóa mẫu chúng tôi sử dụng thể tích mẫu là 50ml trong suốt quá trình nghiên cứu. 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các chất đến sự tạo hợp chất màu Các nguyên tố Cr, Co, Cu, Hg, Mo, Ni, Ag, Se là những nguyên tố có khả năng ảnh hƣởng đến quá trình tạo Asin. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 và tài liệu tham khảo [15] thì hàm lƣợng các nguyên tố này trong hải sản là rất nhỏ không ảnh hƣởng đến việc xác định hàm lƣợng Asen trong hải sản. H2S cũng tác nhân gây ảnh hƣởng mạnh đến quá trình tạo hợp chất màu với dung dịch Bạc đietylđithiocacbamat, tuy nhiên , trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích Asen trong hải sản. Trong quá trình phân tích, mẫu phải đƣợc vô cơ hóa mẫu trƣớc khi xác định hàm lƣợng Asen bằng hỗn hợp Axit có tính oxi hóa mạnh, trong môi trƣờng này vì H2S là Axit yếu nên đã đƣợc loại bỏ khỏi mẫu trƣớc khi tiến hành phân tích Asen. 3.2.4. Xây dựng đường chuẩn xác định Asen. Sau khi khảo sát các điều kiện và các yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo hợp chất màu, chúng tôi chọn các điều kiện tối ƣu để xây dựng đƣờng chuẩn nhƣ sau: + Bƣớc sóng tối ƣu: 520nm. + Thời gian tối ƣu: 20 phút. + pH tối ƣu: 1. + Thể tích của thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat: 4ml. + Thể tích dung dịch Asen chuẩn: 50ml. Xây dựng đường chuẩn xác định Asen Chuẩn bị một dãy dung dịch có nồng độ Asen thay đổi đƣợc ghi trong bảng 2.5. Các dung dịch trên đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc Asen 10ppm, cho vào bình phản ứng của hệ tạo Asin, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15% , và 4g Zn. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ của các hợp chất màu vào nồng độ Asen đƣợc đƣa ra trong bảng 3.5 và đƣờng chuẩn đƣợc biểu diễn trên hình 3.6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ vào nồng độ Asen TT 1 2 3 4 5 6 CAsen(III)(  g/l) 5 10 20 50 75 100 A 0,042 0,091 0,181 0,368 0,552 0,789 Hình 3.6. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ vào nồng độ Asen Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Y= 0,0076X + 0,0077 Hệ số tƣơng quan R2 = 0,996 Tóm lại, Đƣờng chuẩn xác định Asen có hệ số tƣơng quan lớn và có khoảng tuyến tính rộng, do vậy, cho phép phân tích hàm lƣợng Asen ở dạng vết rất nhỏ. 3.2.5. Giới hạn phát hiện của phương pháp Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc, nồng độ này lớn hơn mẫu trắng với độ tin cậy là 99%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định giới hạn phát hiện của phƣơng pháp bằng cách đo lặp lại 7 lần mẫu dung dịch Asen có nồng độ 10(  g/l), các điều kiện xác định nhƣ khi lập đƣờng chuẩn, chấp nhận sự sai khác giữa độ lệch chuẩn của mẫu và mẫu trắng là không đáng kể. Kết quả đƣợc đƣa ra ở bảng 3.6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Bảng 3.6. Khảo sát độ thu hồi của Asen TT Hàm lƣợng Asen(  g/l) Độ thu hồi (%) 1 11,02 110,2 2 10, 11 101,1 3 11,13 111,3 4 8,87 88,7 5 11,06 110,6 6 9,78 97,8 7 8,52 85,2 TB 10,07 100,7 Từ các kết quả ở bảng 3.6 ta có: Giá trị trung bình: 10,07 Độ lệch chuẩn(S): 0,154 Bậc tự do(n-1): 6 Giá trị t tra bảng với bậc tự do là 6 và độ tin cậy 99%: 3,143 Giới hạn phát hiện(GHPH): GHPH= S x t = 0,5(  g/l) 3.3. Qui trình phân tích Asen tổng số. 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần và nồng độ axit tới quá trình vô cơ hóa mẫu. Quá trình phân hủy mẫu hải sản sau khi đông khô đòi hỏi phải sử dụng các axit mạnh làm tác nhân phân hủy và oxi hóa mẫu. Do vậy, phải lựa chọn thành phần và tỉ lệ các loại axit sao cho quá trình phân hủy mẫu triệt để nhƣng không làm mất lƣợng Asen có trong mẫu phân tích. Axit HNO3 đặc và axit HClO4 có tính oxi hóa mạnh nhƣng nhiệt độ sôi thấp lần lƣợt là: 1210C và 2030C, nếu chỉ sử dụng một trong hai loại axit này để vô cơ hóa mẫu trong hệ hở thì mẫu sẽ không bị phân hủy triệt để do nhiệt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 độ sôi của 2 axit này thấp. Mặt khác, nếu chỉ sử dụng một mình axit HClO4 để xử lí mẫu dễ gây cháy nổ. Axit H2SO4 đặc có tính oxi hóa mạnh và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với 2 axit trên: 3390C. Tuy nhiên, nếu sử dụng một mình H2SO4 đặc, thì mẫu chậm sôi, các chất hữu cơ sẽ bị cháy tạo thành cặn cacbon, gây hiệu suất thu hồi thấp do Asen bị hấp thụ trên cặn Cacbon. Vì vậy chúng tôi sử dụng hỗn hợp các axit trên để phân hủy mẫu. Để khảo sát ảnh hƣởng của các axit đến quá trình phân hủy mẫu, chúng tôi tiến hành vô cơ hóa 0,1g ngao trong bình phản ứng với lƣợng Asen thêm vào là 20ml dung dịch chuẩn As(III) 10(  g/l), tiếp theo chúng tôi tiến hành vô cơ hóa mẫu với hỗn hợp axit có thành phần và tỉ lệ khác nhau nhƣ trong bảng 3.7. Sau đó thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch để khử As(III) thành Asin. Khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Hiệu quả sử dụng của các hỗn hợp axit đƣợc đánh giá thông qua độ thu hồi. Ảnh hƣởng của axit và nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi đƣợc đƣa ra ở bảng 3.7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của axit và nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi Các loại axit đặc (ml) Nhiệt độ(0C) Độ thu hồi (%) HNO3 HClO4 H2SO4 10 0 0 250 22,5 5 5 0 250 42,6 0 0 5 250 20 5 0 5 250 75,2 1 1 1 250 80,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 1 1 3 250 86,5 1 1 5 250 97,8 Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7. cho thấy: *Khi chỉ sử dụng H2SO4 đặc 98% thì độ thu hồi là 20 %. Khi chỉ sử dụng axit HNO3, độ thu hồi của Asen chỉ đạt 22,5% tại nhiệt độ 250 0 C.Khi chỉ sử dụng hỗn hợp 5ml HNO3 và 5ml HClO4 đậm đặc, độ thu hồi là 42,6%.Ở các kết quả khảo sát tiếp theo cho thấy khi sử dụng hỗn hợp axit với tỉ lệ: HNO3: HClO4:H2SO4 là 1:1:5 thì hiệu suất thu hồi tốt nhất, đạt 97,8% trong thời gian phân hủy mẫu là 30 phút. Vì vậy, chúng tôi sử dụng hỗn hợp 3 axit này với thành phần và tỉ lệ nhƣ trên để vô cơ hóa mẫu trong suốt quá trình nghiên cứu. 3.3.2 Khảo sát hiệu suất của quá trình vô cơ hóa mẫu. Để đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp và hiệu suất quá trình vô cơ hóa mẫu hải sản chúng tôi tiến hành nhƣ sau: Lấy 50ml dung dịch Asen (V) 50ppb cho vào bình phản ứng . Thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ tác dụng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. - Dùng pi pét hút lấy chính xác 0,25ml dung dịch Asen 10ppm, cho vào bình định mức 50ml, thêm 1ml nƣớc cất, 2ml hỗn hợp HNO3 : HClO4 (1:1), 5ml dung dịch H2SO4 đặc. Sau đó, đun ở nhiệt độ 250 0C trong thời gian 30 phút, để nguội, định mức tới vạch bằng nƣớc cất, lắc đều, rồi cho vào bình phản ứng, thêm 1ml dung dịch KI 10% để chuyển As(V) về As(III), 10ml dung dịch HCl 15%, 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin giải phóng phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. - Hút chính xác 0,25ml dung dịch Axit dimetylasinic DMA 10ppm cho vào bình định mức 50ml, thêm 1ml nƣớc cất, 2ml hỗn hợp HNO3:HClO4(1:1), 5ml H2SO4 đặc, đun ở nhiệt độ 250 0C, trong thời gian 30 phút, lắc đều để nguội, rồi cho vào bình phản ứng, thêm 1ml dung dịch KI 10%, 10ml dung dịch HCl 15%; 4g kẽm sạch, khuấy từ ở bình phản ứng trong thời gian 20 phút tạo ra hơi Asin, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, tiếp theo, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Kết quả các thí nghiệm để khảo sát độ thu hồi của Asen đƣợc đƣa ra trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Khảo sát độ thu hồi của Asen trong quá trình vô cơ hóa mẫu STT Dung dịch chuẩn Nồng độ (ppb) Mật độ quang (A) Hiệu suất (%) 1 As +5 50 0,364 98,37 2 As +5 (không oxi hóa) 50 0,370 100 3 DMA 50 0,362 97,83 Từ kết quả chỉ ra trên bảng 3.8. cho thấy khi tiến hành vô cơ hóa mẫu dung dịch Asen chuẩn và dung dịch Axit dimetylasinic-DMA có cùng nồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 độ thì độ hấp thụ quang của hợp chất màu của các dung dịch trên có giá trị xấp xỉ bằng độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn As+5 không bị oxi hóa. Nhƣ vậy, hiệu suất của quá trình vô cơ hóa mẫu đạt khá cao, và quá trình vô cơ hóa mẫu với tỉ lệ thể tích HNO3 : HClO4 : H2SO4(đặc) = 1: 1: 5 không ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của hợp chất màu. Lƣợng Asen mất đi trong quá trình vô cơ hóa mẫu là không đáng kể. Vì vậy, chúng tôi sử dụng quy trình vô cơ hóa mẫu trên để tiến hành vô cơ hóa các mẫu hải sản trong quá trình nghiên cứu. 3.3.3. Quy trình phân tích Asen tổng số. Từ những kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ƣu: các loại axit, nồng độ axit, ảnh hƣởng của quá trình vô cơ hóa mẫu, quy trình phân tích Asen đƣợc đƣa ra nhƣ sau: Mẫu hải sản mang về rửa sạch bằng nƣớc cất 2 lần, cất vào tủ đông cho đến khi đông đá hoàn toàn, sau đó mẫu đƣợc làm khô bằng phƣơng pháp đông khô chân không. Tiếp theo mẫu đƣợc nghiền nhỏ, rồi cân chính xác 0,1g mẫu cho vào bình phản ứng 50ml, thêm 1ml nƣớc cất 2 lần, 2ml hỗn hợp HNO3 : HClO4 đặc (1 : 1), 5ml dung dịch H2SO4 đặc, đun ở nhiệt độ 250 0 C trong vòng 30 phút. Mẫu sau khi phân hủy hết, để nguội, định mức đến 50ml, sau đó chuyển As(V) thành As(III) với 1ml dung dịch KI 10%, khử As(III) thành Asin với 10ml dung dịch HCl 15% 4g kẽm, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ sẽ tác dụng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat trong bình hấp thụ tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Qui trình phân tích Asen tổng số được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 3.7. Quy trình phân tích Asen tổng số Làm sạch Đông khô Nghiền nhỏ 2ml HNO3 và HClO4. 5ml H2SO4. Đun nóng ở 250 0 C trong thời gian 30 phút. Định mức đến 50ml. Dung dịch 1 ml KI 10%, 10ml HCl 15%, 4 g Zn. Asin Mẫu hải sản 0,1g mẫu Mẫu đã đƣợc vô cơ hóa Đo quang 4ml Bạc đietylđithiocacbamat Hợp chất màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Sau khi đã xác định đƣợc quy trình vô cơ hóa mẫu để phân tích Asen tổng số chúng tôi đã áp dụng để vô cơ hóa và phân tích các mẫu hải sản bao gồm: tôm sú, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, vẹm xanh, sao biển, ngao. Số lần làm với mỗi mẫu là 3 lần, từ các kết quả thí nghiệm thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xử lý thống kê để đánh giá độ chính xác của phép đo theo các công thức sau: Giá trị trung bình cộng: n Xi X n i   1 Độ lệch chuẩn của đại lƣợng trung bình cộng: )1( )( 2     nn XX S i X Kết quả phân tích Asen tổng số trong mẫu hải sản đƣợc đƣa ra ở bảng 3.9: Tên mẫu Lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S )(n=3) Tên mẫu Lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S ) (n=3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Bảng 3.9. Kết quả phân tích Asen tổng số trong mẫu hải sản Từ kết quả thu đƣợc trên bảng 3.9. cho thấy hàm lƣợng Asen tổng số tìm thấy sau mỗi lần thí nghiệm là xấp xỉ nhau và ổn định, trong đó, lƣợng Asen tìm thấy trong ngao là cao nhất và thấp nhất là cá ngừ. Điều này có thể giải thích đƣợc là do ngao là động vật đáy, môi trƣờng sống của ngao là bùn. Qua nhiều tài liệu và công trình nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng Asen trong bùn và trầm tích cao hơn hẳn trong các môi trƣờng khác, do đó mức độ tích tụ dần Asen trong ngao do quá trình trao đổi chất sẽ cao hơn các hải sản khác. Vẹm xanh 11.72  0,068 Cá khoai 8,43  0,035 Sao biển 10,48  0,034 ngao 15,36  0,029 Cá ngân 9,17  0,041 Tôm sú 7,47  0,049 Cá thu 7,21  0,032 Cá ngừ 5,41  0,041 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 3.3.4. Đánh giá độ chính xác của phương pháp. Để đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp đang nghiên cứu, chúng tôi sử dụng mẫu cá chuẩn Dogfish Liver Certified Reference Material for Trace Metals (DOLT-3) để vô cơ hóa theo qui trình trên, sau đó chuyển As(V) thành As(III) với 1ml dung dịch KI 10%, khử As(III) thành Asin với 10ml dung dịch HCl 15% và 4g kẽm, hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, sau đó, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Kết quả phân tích đƣợc chỉ ra ở bảng 3.10. Bảng 3.10: Kết quả phân tích Asen trong mẫu cá chuẩn TT Kí hiệu mẫu Hàm lƣợng Asen tổng(  /g) Độ thu hồi (%) Giá trị chứng chỉ(  g/g) Kết quả phân tích(  g/g) ( X X S ) (n=3) 1 Mẫu DOLT-3 10,2  0,05 10,05  0,04 98,52% Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 3.10. cho thấy: Độ thu hồi của Asen là 98,52%. Điều đó chứng tỏ phƣơng pháp vô cơ hóa mẫu và phân tích Asen chúng tôi đang tiến hành có độ chính xác cao, đáp ứng đƣợc yêu cầu phân tích Asen tổng số trong các mẫu hải sản, do đó các kết quả phân tích Asen tổng số thu đƣợc ở trên là đáng tin cậy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 3.4. Phân tích dạng Asen hữu cơ và vô cơ. 3.4.1 Quy trình phân tích các dạng Asen từ các mẫu hải sản. Dựa trên nguyên tắc các hợp chất Asen hữu cơ không tạo phức với thuốc thử Bạc đietylđithiocacbamat nên để xác định hàm lƣợng Asen hữu cơ từ Asen tổng số trong một số mẫu hải sản, chúng tôi tiến hành chiết các dạng Asen, sau đó tạo phức, rồi đem đo quang tại các điều kiện tối ƣu, xác định đƣợc hàm lƣợng của dạng Asen vô cơ. Lấy hàm lƣợng Asen tổng số xác định đƣợc trừ đi hàm lƣợng dạng Asen vô cơ vừa xác định đƣợc, chúng tôi thu đƣợc hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ. Từ nguyên tắc đó, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm theo quy trình chiết sau: Mẫu hải sản: Cân chính xác 1g mẫu cho vào ống li tâm, thêm 10ml hỗn hợp MeOH : H2O (1:1), cho ống mẫu vào bể rung siêu âm 15 phút, chuyển ống mẫu sang máy li tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, tách phần dung dịch ở trên vào bình định mức 50ml, lặp lại quá trình này 3 lần, sau đó định mức đến 50ml bằng nƣớc cất 2 lần rồi tiến hành tạo Asin với 1ml dung dịch KI 10%, 4g kẽm sạch và 10ml dung dịch HCl 15% trong bình phản ứng, hơi Asin hơi Asin đƣợc dẫn vào bình hấp thụ và phản ứng với 4ml dung dịch thuốc thử Bạc đietylđithiocacbmat tạo hợp chất màu, đo mật độ quang của hợp chất màu tại bƣớc sóng 520nm với dung dịch so sánh là clorofom. Hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ trong mẫu đƣợc tính dựa trên hàm lƣợng Asen tổng số và hàm lƣợng dạng Asen vô cơ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Quy trình phân tích Asen vô cơ ở trên được tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 3.8.: Quy trình phân tích Asen vô cơ. Mẫu hải sản 10ml MeOH-H2O(1:1) Lắc trong vòng 15 phút. Dịch chiết Li tâm trong 10 phút Dịch chiết Chiết ra bình định mức. Dịch chiết (chứa Asen dạng vô cơ+hữu cơ) Định mức đến 50ml. 1ml KI 10% 10ml HCl 15%, 4g Zn Asin Đo quang 4ml bạc Đietylđithiocacbamat Hợp chất màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 3.4.2. Kết quả phân tích dạng Asen vô cơ, dạng Asen hữu cơ trong một số mẫu hải sản Áp dụng quy trình phân tích trên vào phân tích các mẫu hải sản bao gồm: tôm sú, cá ngừ, cá thu, cá khoai, cá ngân, vẹm xanh, sao biển, ngao. Kết quả phân tích Asen vô cơ của các mẫu hải sản đƣợc đƣa ra trên bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả phân tích Asen vô cơ Tên mẫu Hàm lƣợng Asen vô cơ (  g/g) ( X X S ) (n=3) Hàm lƣợng Asen tổng số(  g/g) ( X X S ) (n=3) % Vẹm xanh 0,110  0,046 11,72  0,068 0,938 Sao biển 0,086  0,024 10,48  0,034 0,820 Cá ngân 0,020  0,074 9,17  0,041 0,218 Cá thu 0,262  0,031 7,21  0,032 3,633 Cá ngừ 0,104  0,051 5,41  0,041 1,922 Cá khoai 0,270  0.087 8,43  0,035 3,202 Ngao 0,020  0,085 15,36 0,029 0,130 Tôm sú 0,197  0,012 7,47 0,049 2,637 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Từ kết quả phân tích hàm lƣợng Asen vô cơ trên bảng 3.10 cho thấy lƣợng Asen vô cơ trong các mẫu hải sản là rất nhỏ, cao nhất cá khoai cũng chỉ là 0,27  g/l. Từ kết quả phân tích dạng Asen vô cơ, chúng tôi tính đƣợc hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ trong các mẫu hải sản trên. Kết quả tính toán đƣợc chỉ ra trên bảng 3.12. Bảng 3.12. Kết quả phân tích dạng Asen hữu cơ Kí hiệu mẫu Hàm lƣợng Asen hữu cơ (  g/g) ( X X S ) (n=3) Hàm lƣợng Asen tổng số (  g/g) ( X X S ) (n=3) % Vẹm xanh 11,61  0,052 11,72  0,068 99,06 Sao biển 10,394  0,077 10,48  0,034 99,17 cá ngân 9,15  0,024 9,17  0,041 99,78 Cá thu 6, 948  0,062 7,21  0,032 96,36 Cá khoai 8,16  0,009 8,43  0,035 96,79 Ngao 15,34  0,012 15,36 0,029 99,86 Tôm sú 7,273  0,087 7,47  0,049 97,36 Cá ngừ 5,306  0,007 5,41 0,041 98,07 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Qua kết quả phân tích thu đƣợc trên bảng 3.12. cho thấy hàm lƣợng dạng Asen hữu cơ chiếm chủ yếu trong các hải sản đã phân tích. Theo một số tài liệu nhƣ của Langston W.J(1980) và của LieuJ, D.H. O'Brien và K.J. Irgolie(1996)... thì các dạng hữu cơ chủ yếu này là Asennobetan, Asennocholin và Đimetyl Asenic, là những dạng hữu cơ ít độc cho con ngƣời, nhất là Asennobetan- chất này dễ dàng đƣợc đào thải ra ngoải cơ thể. Tôm, ngao, cá... là những thức ăn phổ biến cho con ngƣời và cho các động vật khác trong chuỗi dinh dƣỡng. Vì thế, việc xác định đƣợc Asen trong hải sản là một khâu chủ yếu để qua đó đánh giá chất lƣợng hải sản vì trong hải sản có khả năng tích lũy kim loại nặng cao mà Asen là kim loại chiếm phần lớn. Hàm lƣợng Asen nằm trong các mẫu hải sản đã phân tích nằm trong khoảng từ 5,41 đến 15,36(  g/g) (bảng 2.8). Mức độ Asen tìm thấy trong luận văn nằm trong phạm vi đã đƣợc trình bày trƣớc đó cho các dạng Asen trong một số hải sản [14,15]. Phần tỉ lệ dạng Asen hữu cơ trong các mẫu nghiên cứu của luận văn đã giải quyết một phần về yếu tố độc tính của Asen trong hải sản. Có thể bƣớc đầu kết luận, các mẫu hải sản trên là an toàn với sức khỏe con ngƣời. Trên đây là các thí nghiệm phân tích đã đƣợc thực hiện trong suốt quá trình nghiên cứu và các kết quả thu đƣợc sau khi làm các thí nghiệm phân tích tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Toàn bộ quy trình đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ sau: Hình 3.9: Quy trình xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phương pháp trắc quang Mẫu hải sản Rửa sạch Đông khô Nghiền nhỏ Mẫu hải sản dạng bột HNO3-HClO4-H2SO4 (1:1:5) Đun ở 2500C trong 30 phút Định mức đến 50ml. 1ml KI 10%, 10ml HCl 15% + 4g Zn, 4ml bạc Đietylđithiocacbamat Đo quang. Định mức đến 50ml. 1ml KI 10%, 10ml HCl 15% + 4g Zn, 4ml Bạc Đietylđithiocacbamat Đo quang Asen tổng số Dạng Asen vô cơ Dạng Asen hữu cơ Mẫu đã vô cơ hóa (dạng dung dịch) Mẫu chiết (dạng dung dịch) MeOH-H2O(1:1) Rung siêu âm Lắc li tâm Chiết lấy phần dung dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 KẾT LUẬN Với đề tài Nghiên cứu, xác định tổng số, tổng dạng Asen trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang, sau một thời gian nghiên cứu, luận văn đã đạt đƣợc những kết quả sau: 1. Đã khảo sát, nghiên cứu các điều kiện có ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang của phức màu của Asen nhƣ: Bƣớc sóng tối ƣu, pH tối ƣu, thời gian tạo phức, tỉ lệ thuốc thử.... Xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn để xác định Asen bằng phƣơng pháp trắc quang. Từ đó, phân tích đƣợc hàm lƣợng Asen trong một số hải sản một cách chính xác, ổn định. - Qua khảo sát cho thấy, độ hấp thụ quang của phức màu tốt nhất tại bƣớc sóng 520nm, pH để tạo phức tốt nhất bằng 1, với thời gian tạo phức là 20 phút, thể tích thuốc thử: 4ml và thể tích mẫu là 50ml, lƣợng chất khử Zn là 4gam. 2. Đã khảo sát nghiên cứu và đƣa ra qui trình xác định hàm lƣợng Asen tổng số trong một số hải sản bằng phƣơng pháp trắc quang. Độ sai lệch lớn nhất của phƣơng pháp khi phân tích so sánh với mẫu chuẩn quốc tế khôn