Xây dựng quy trình xác định diethylstilbestrol, testosterone, 17β-Estradiol trong thịt bằng LC-MS/MS

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 387 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DIETHYLSTILBESTROL, TESTOSTERONE, 17β-ESTRADIOL TRONG THỊT BẰNG LC-MS/MS Trần Đại Nghĩa*, Trần Ngọc Minh Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Trong lĩnh vực chăn nuôi hiện nay, các hormone tăng trưởng được sử dụng một cách tùy tiện. Việc sử dụng thịt có tồn dư các loại hóa chất này sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân tích dư lượng các hormone này trong đó phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) có nhiều ưu điểm như: ứng dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau, ít tốn thời gian, không cần tạo dẫn xuất, có độ chọn lọc và độ nhạy cao. Mục tiêu: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) và 17β- Estradiol (ES) trong thịt bằng LC-MS/MS. Phương pháp nghiên cứu: Các hormone tăng trưởng trong thịt được chiết bằng Acetonitrile, làm sạch dịch chiết bằng kỹ thuật QuEChERS. Các hormone được phân tách trên máy sắc ký lỏng (HPLC) bằng cột C18 với pha động acetonitrile và acid formic 0,1% trong nước ở chế độ gradient và được định lượng bằng đầu dò khối phổ hai lần (MS/MS) với kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), chế độ ion dương. Nội chuẩn đồng vị Testosterone_d3 và 17β – estradiol_d3 được sử dụng để kiểm soát quá trình. Phương pháp được ứng dụng để khảo sát 15 mẫu thịt bò và 15 mẫu thịt heo đang bán tại các siêu thị tại Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 07 – 10/2015. Kết quả: Phương pháp xây dựng được có giới hạn phát hiện (MLOD) và giới hạn định lượng (MLOQ) lần lượt là 0,1 – 0,3 ng/g (TES, ES) và 1 – 3 ng/g (DES). Độ lặp lại của phương pháp ở 3 nồng độ 0,5 – 1 – 2 ng/g (TES, ES), 5 – 10 – 20 ng/g (DES) với RSD < 15% và hiệu suất thu hồi ở nồng độ tương ứng dao dộng trong khoảng 82 – 109%. Kết quả phân tích mẫu thực trên thị trường là không có mẫu thịt nào có chứa hormone tăng trưởng. Kết luận: Đã xây dựng được quy trình xác định DES, TES, ES trong thịt bằng LC-MS/MS có độ chọn lọc, độ nhạy cao, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi tốt. Từ khóa: Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES), 17β – Estradiol (ES), thịt, LC-MS/MS. ABSTRACT METHOD DEVELOPMENT FOR DETERMINATION OF DIETHYLSTILBESTROL, TESTOSTERONE, 17β – ESTRADIOL IN MEAT BY LC-MS/MS Tran Dai Nghia, Tran Ngoc Minh Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 387 - 393 Background: The residue of growth hormones in animal production can damage human health. Among the methods used for growth hormones determination, the LC-MS/MS method offers several advantages such as better selectivity, higher sensitivity, no derivatization, less time-consuming, and applicability over various food matrices. Objectives: To develop a process to determine Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) and 17β- Estradiol (ES) in meat by LC-MS/MS. Methods: The meat samples were extracted by acetonitrile, cleaned up using QuEChERS, and enriched * Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.Trần Đại Nghĩa ĐT: 0919 446 305 Email: laboass@iph.org.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 388 with Nitrogen gas. The hormones separation was performed by C18 column using mobile phases: Acetonitrile (A) and Formic acid 0.1% in water (B) with gradient program. The quantitation was achieved by atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (APCI – MS/MS) in positive mode. Testosterone_d3 and 17β – estradiol_d3 were used as internal standard to control the process. The method was employed to study 15 pork samples and 15 beef samples that were collected from supermarkets in Ho Chi Minh City from July to October 2015. Results: The limits of quantitation (MLOQ) were 0.3 ng/g for TES, ES and 3 ng/g for DES. The limits of determination (MLOD) were 0.1 ng/g for TES, ES and 1 ng/g for DES. The precisions of method were respected with RSD < 15% at 3 levels of concentration: 0.5 – 1 – 2 ng/g (TES, ES), 5 – 10 – 20 ng/g (DES). The recoveries at the corresponding concentrations were in the range of 82 – 109%. The results of 30 samples were negative. Conclusion: A simple, fast, accurate, precise and sensitive method has been established to determine DES, TES, ES in meat by LC-MS/MS. Keywords: Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES), 17β – Estradiol (ES), pork, beef, LC-MS/MS. ĐẶT VẤN ĐỀ Hormone là những chất hóa học do một nhóm tế bào hoặc một tuyến nội tiết, hoặc do tiêm từ ngoài vào trong máu rồi được máu đưa đến các tế bào hoặc các mô khác trong cơ thể và gây ra các tác dụng sinh lý ở đó(18). Hormone thường được sử dụng trong chăn nuôi với mục đích kích thích sự tăng trưởng, sinh sản cũng như tích lũy nhiều nạc, mỡ nhằm đem lại lợi nhuận cao cho nhà sản xuất(11,18). Do đó, người tiêu dùng ăn thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt có tồn dư các hormone này sẽ dẫn đến nguy cơ mất cân bằng về nội tiết tố, rối loạn chuyển hóa và gây ung thư(9,11,18). Ở Mỹ, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm - Food and Drug Administration (FDA) đã cấm sử dụng Diethylstilbestrol (DES) trong chăn nuôi (1973) và trong tất cả các sản phẩm từ chăn nuôi (1979)(2,17). Năm 2003, Hội đồng Châu Âu - European Commission (EC) đã cấm nhập khẩu và sử dụng thịt và các sản phẩm chế biến từ thịt có tồn dư các hormone(17). Tuy nhiên, FDA và Ủy Ban về Phụ Gia Thực Phẩm - Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) vẫn cho phép sử dụng 6 hormone: 17β-Estradiol (ES), Progesterone, Testosterone (TES), Zeranol, Trenbolone acetate, Melengestrol acetate trong các sản phẩm chăn nuôi(17). Tại Việt Nam, mức tối đa các hormone trong thịt tươi được quy định theo TCVN 7046: 2009(21) (bảng 1). Bảng 1: Dư lượng của một số hormone theo TCVN 7046: 2009 (21) Hormone Mức tối đa (mg/kg) 17β-Estradiol 0,0005 Testosterone 0,015 Diethylstilbestrol 0,0 Hiện nay, phân tích dư lượng các hormone được thực hiện trên nhiều thiết bị khác nhau như: xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme - Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)(5,6), xét nghiệm miễn dịch đánh dấu phóng xạ - Radioimmunoassay (RIA)(3,4), sắc ký bản mỏng - Thin layer chromatography (TLC)(14), sắc ký khí ghép khối phổ - Gas chromatography – mass spectrometry (GC - MS)(7,12), sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần - Liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC - MS/MS)(8,10,11,13,15,16,19,20). Trong đó, phương pháp LC - MS/MS có nhiều ưu điểm: áp dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau, ít tốn thời gian, không cần tạo dẫn xuất, độ nhạy cao. Về xử lý mẫu, một số dung môi được sử dụng để chiết hormone như methanol, acetonitrile, ethyl acetate, acetone Để làm sạch dịch chiết, có thể sử dụng một trong số loại cột chiết pha rắn như cột C18(12,19), cột Hydrophilic Lipophilic Balanced (HLB)(8,10) hoặc QuEChERS(13). Trong đó, phương pháp chiết hormone dùng QuEChERS có ưu điểm nhanh và hiệu suất thu hồi cao(13). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 389 Trong nghiên cứu này, phương pháp sử dụng kỹ thuật QuEChERS kết hợp kiểm soát bằng nội chuẩn đồng vị TES_d3 và ES_d3(13) để tách chiết đồng thời DES, TES, ES trong nền mẫu thịt heo và thịt bò và định lượng bằng hệ thống LC-MS/MS(16) được chọn để xây dựng và xác định giá trị sử dụng. Sau đó, phương pháp được ứng dụng để khảo sát trên mẫu thịt heo và thịt bò tại các siêu thị ở Tp. Hồ Chí Minh. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) và 17β-Estradiol (ES) trong thịt bằng LC-MS/MS. Ứng dụng khảo sát quy trình trên mẫu thịt heo và thịt bò tại Tp. Hồ Chí Minh ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Quy trình xác định DES, TES, ES bằng máy sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) trong nền mẫu thịt heo và thịt bò. Hóa chất – Chất chuẩn Chuẩn Diethylstilbestrol, Testosterone, 17β – Estradiol được cung cấp bởi Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany), nội chuẩn Testosterone_d3 được cung cấp bởi Cambridge Isotope Laboratories Inc. (CIL) courtesy of CK Gas Products (Hampshire, UK) và 17β – estradiol_d3 được cung cấp bởi Toronto Research Chemicals Inc. (TRC) (Toronto, Canada). Mix II (6 g Magnesium sulfate và 1.5 g Sodium acetate) và Mix VI (0.15 g Diamino, 0.9 g magnesium sulfate và 0.15 g C18) Chromabond® QuEChERS được cung cấp bởi Macherey Nagel GmbH (Duren, Germany). Acetonitrile được cung cấp bởi J.T. Baker (New Jersey, USA) và acid formic được cung cấp bởi Merck (Darmstadt, Germany). Nước cất được lọc bởi máy cất nước Barnstead Easypure® của Thermo Scientific (San Jose, USA). Mẫu thịt 15 mẫu thịt heo và 15 mẫu thịt bò được mua từ 3 siêu thị tại Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 07 đến tháng 10 năm 2015. Chuẩn bị mẫu 10 g mẫu thịt (heo, bò) đã đồng nhất được cân trong ống tube 50 mL. 10 mL Acetonitrile và 100 µL nội chuẩn (TES_d3 100 µg/L, ES_d3 100 µg/L) được thêm vào. Tube mẫu được vortex trong 3 phút. Sau đó, Mix II QuEChERS được thêm vào ống tube, vortex trong 3 phút và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 4500 vòng/phút. Chuyển 8 mL dịch sau ly tâm vào ống tube 15 mL khác chứa Mix VI QuEChERS. Vortex ống tube trong 3 phút và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 4500 vòng/phút. 5 mL dịch sau ly tâm được chuyển vào ống tube 15 mL khác và được thổi khô bằng khí nitơ tới 0,5 mL để làm giàu nồng độ. Dịch sau khi thổi khô được lọc qua filter 0,45 µm vào vial và được phân tích trên hệ thống LC – MS/MS. Điều kiện thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC- MS/MS bao gồm khối phổ ba tứ cực AB Sciex 5500 ghép nối với hệ sắc ký lỏng Shimadzu UFLCXR bao gồm bơm Shimadzu 20ADXR, bộ tiêm mẫu Shimadzu SIL-20ACXR, bộ điều khiển Shimadzu CBM-20A. Toàn bộ hệ thống sắc ký và khối phổ được điều khiển bởi phần mềm Analyst 1.5.1 của hãng AB Sciex. Các chất phân tích được phân tách bằng cột HiQ sil C18HS-3, 4,6 x 150 mm, kích thước hạt 3 µm với bộ phận bảo vệ cột. Acetonitrile (pha động A) và 0,1% acid formic trong nước (pha động B) được dùng để rửa giải với chương trình gradient theo bảng 2. Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu là 20 µL. Bảng 2: Chương trình gradient nồng độ Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 0,01 20 80 5,00 70 30 10,00 70 30 10,1 20 80 15 20 80 Hệ thống khối phổ được vận hành với kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – atmospheric pressure chemical ionization (APCI), chế độ ion dương. Thế ion hóa – Ion spay voltage (IS) được cài đặt ở 5500 V. Điều Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 390 kiện khí Curtain Gas (CUR), Nebulizer gas (GS1), Collisionally activated dissociation (CAD) lần lượt là 20, 40, 10 psi. Cường độ dòng điện của kim - Needle current (NC) được thiết lập là 4 mA. Nhiệt độ nguồn ion hóa (TEM) là 500oC. Các chất phân tích và nội chuẩn đồng vị được định lượng ở chế độ Multiple reaction monitoring (MRM) với các thông số: thế phân nhóm - declustering potential (DP), thế đầu vào - entrance potential (EP), năng lượng va chạm - collision energy (CE), thế va chạm đầu ra - collision cell exit potential (CXP) theo bảng 3. Tính toán và xác định giá trị sử dụng phương pháp Nồng độ các chất phân tích được tính toán theo phương pháp sử dụng nội chuẩn. TES_d3 được sử dụng để định lượng cho TES, trong khi ES_d3 được sử dụng để định lượng cho ES, DES. Việc tính toán được thực hiện bởi phần mềm Analyst 1.5.1 của hãng AB Sciex. Phương pháp được xác định giá trị sử dụng thông qua các thông số: độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác và độ đúng(1). Độ chọn lọc của phương pháp LC-MS/MS được xác định dựa trên cặp ion đặc trưng của từng chất và khả năng phân tách trên cột sắc ký. Độ tuyến tính được đánh giá thông qua hệ số tương quan R2 > 0,995 của phương trình hồi quy của đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích peak sắc ký chuẩn/nội chuẩn và nồng độ chất phân tích/ nội chuẩn. Giới hạn phát hiện của mẫu tiêm – Injection limit of detection (ILOD) được tính toán dựa vào việc xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu nền – signal to noise (S/N) ≥ 3 của 10 mẫu trắng không có chất phân tích thêm chuẩn ở cùng nồng độ. Giới hạn định lượng của mẫu tiêm – Injection limit of quantitation (ILOQ) được tính toán tương tự với tỷ lệ S/N ≥ 10. Kết quả đạt được ở trên được chia với độ làm giàu của mẫu là 10 để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp – method limit of detection and quantitation (MLOD & MLOQ). Độ chính xác và độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại cùng với độ tái lặp nội bộ (RSD%) và hiệu suất thu hồi H (%) của mẫu không có chất phân tích thêm chuẩn ở 3 nồng độ: 0,5 ng/g, 1 ng/g và 2 ng/g (TES, ES); 5 ng/g, 10 ng/g và 20 ng/g (DES) (10 mẫu ở mỗi nồng độ). Độ lặp lại được thực hiện trong cùng 1 ngày trong khi độ tái lặp nội bộ được thực hiện tương tự với một nhân viên khác. Hệ số RSD (%) phải < 15% và H (%) phải nằm trong khoảng 75 – 125%. Bảng 3: Thông số MRM các chất phân tích Chất phân tích Q1 (m/z) Q3 (m/z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V) ES 1* 255,2 159,0 100 10 20 10 ES 2 255,2 133,1 100 10 20 12 ES_d3 258,2 159,0 100 10 20 10 TES 1* 289,2 97,0 100 10 30 11 TES 2 289,2 109,1 100 10 37 18 TES_d3 292,2 100,0 100 10 27 14 DES 1* 269,2 135,1 50 10 20 10 DES 2 269,2 107,0 50 10 20 10 *: Cặp ion định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Các thông số của phương pháp phân tích Độ chọn lọc Sắc ký đồ tổng của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn được mô tả theo hình 1 và sắc ký đồ từng ion của mẫu thêm chuẩn được mô tả theo hình 2. Thời gian lưu của ES (255,2 159,0; 133,1), TES (289,2  97,0; 109,1), DES (269,2  135,1; 107,0) lần lượt là 9,29; 9,93 và 10,20 phút. Nội chuẩn ES_d3 (258,2  159,0) và TES_d3 (292,2  100,0) có thời gian lưu trùng với ES và TES. Tỷ lệ giữa cặp ion định lượng và cặp ion xác nhận của ES, TES, DES lần lượt là 32,21; 29,34 và 49,92%. Kết quả cho thấy phương pháp có độ chọn lọc tốt. Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính của ES, TES là 1 – 50 ng/mL và DES là 10 – 500 ng/mL. Các phương trình hồi quy đường chuẩn của các chất đều có hệ số tương quan R2 > 0,995. Kết quả chi tiết được trình bày theo bảng 4. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 391 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp Qua việc phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp và xác định tỷ lệ S/N, ILOD và ILOQ được xác định lần lượt là 1,0; 1,0; 10,0 ng/g và 3,0; 3,0; 30,0 ng/g. Vì thế, MLOD và MLOQ của ES, TES, DES được xác định lần lượt là 0,1; 0,1; 1,0 ng/g và 0,3; 0,3; 3,0 ng/g và đã được khảo sát lại để khẳng định giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lương của phương pháp. Với kết quả thu được, phương pháp có đủ độ nhạy để đáp ứng yêu cầu TCVN 7046:2009. Bảng 4: Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp phân tích Chất phân tích Khoảng tuyến tính Phương trình hồi quy R2 MLOD (ng/g) MLOQ (ng/g) Thịt heo Thịt bò Thịt heo Thịt bò ES 1 – 50 ng/mL y = 0,087 x + 0,0138 0,9998 0,1 0,3 TES 1 – 50 ng/mL y = 0,119 x + 0,2340 0,9997 0,1 0,3 DES 10 – 500 ng/mL y = 0,115 x + 0,1130 0,9996 1,0 3,0 Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng Mẫu thêm chuẩn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 392 Hình 2: Sắc ký đồ từng cặp ion của mẫu thêm chuẩn Độ chính xác và độ đúng của phương pháp phân tích Kết quả phân tích trên cả 2 nền mẫu thịt heo và thịt bò cho thấy phương pháp có độ chính xác và độ đúng tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 15% và hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 82 – 109%. Độ lặp lại RSD (%) và hiệu suất thu hồi H (%) của 10 mẫu phân tích được thực hiện bởi nhân viên thứ nhất lần lượt là từ 2,48 đến 12,82% và 89,42 đến 107,95%. Độ lặp lại RSD (%) và hiệu suất thu hồi H (%) của 10 mẫu phân tích được thực hiện bởi nhân viên thứ hai lần lượt là từ 3,49 đến 9,16% và 82,34 đến 108,95%. Kiểm định t-test cho độ lặp lại (ttính = 1,98 < tlý thuyết = 2,10) và hiệu suất thu hồi (ttính = -0,33 < tlý thuyết = 2,10) cho thấy không có sự khác biệt giữa tay nghề hai nhân viên. Kết quả chi tiết được trình bày theo bảng 5. Bảng 5: Độ chính xác, độ đúng của phương pháp phân tích Chất phân tích Nền mẫu Nồng độ (ng/g) Nhân viên 1 Nhân viên 2 RSD1 (%) H (%) RSD2 (%) H (%) ES Thịt heo 0,5 7,65 89,42 3,49 82,34 1,0 10,88 101,41 8,05 90,13 2,0 8,68 100,35 4,06 93,50 Thịt bò 0,5 6,31 93,72 4,25 99,18 1,0 6,98 105,47 8,89 98,36 2,0 4,76 104,15 4,83 108,70 TES Thịt heo 0,5 6,74 100,16 4,82 99,00 1,0 3,64 104,52 4,25 103,48 2,0 2,48 107,05 4,17 105,95 Thịt bò 0,5 4,86 103,30 4,58 104,44 1,0 3,63 102,28 4,42 102,93 2,0 6,01 107,95 4,80 106,40 DES Thịt heo 5,0 6,71 100,20 5,87 108,20 10,0 8,87 92,04 9,16 108,95 20,0 5,38 98,00 3,77 99,45 Thịt bò 5,0 6,57 103,84 7,46 106,98 10,0 12,82 100,05 9,14 106,48 20,0 6,87 102,25 7,23 101,05 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 393 Ứng dụng phương pháp phân tích Phương pháp được ứng dụng để khảo sát trên 15 mẫu thịt heo và 15 mẫu thịt bò tại các siêu thị ở Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 07 đến tháng 10 năm 2015 với kết quả là không có mẫu nào dương tính với các chất hormone tăng trưởng. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình xác định đồng thời hàm lượng các hormone diethylstilbestrol, testosterone, 17β – estradiol trong nền mẫu thịt heo và thịt bò sử dụng kỹ thuật tách chiết bằng QuEChERS và định lượng bằng thiết bị LC-MS/MS. Phương pháp xây dựng được đơn giản, nhanh, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Phương pháp này đã được xác định giá trị sử dụng có giới hạn phát hiện, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi tốt. Phương pháp đã được ứng dụng để khảo sát trên mẫu thịt heo và thịt bò tại Tp. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 2002/657/EC (2002). Commission decision implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official journal of European Communities, p.8 - 362002/657/EC, 2002. 2. Raun AP, Preston RL (2002). History of diethylstilbestrol use in cattle. American Society of Animal Science, pp. 1–7. 3. Anna MA and Niels ES (1999). Exposure to exogenous estrogens in food: possible impact on human development and health. European Journal of Endocrinology 140, pp. 477–485. 4. Arts CJM, Baak MJV, Berg HVD, Schilt R, Berende PLM, Hartog JMPD (1990). Concentrations of the endogenous steroid hormone oestradiol-17 beta, testosterone and progesterone in veal calves in connection with the control for illegal administration. Arch. Lebensm. 41 (3): pp. 58–62. 5. Barbara W (2002). Hormone residues control in slaughtered animals in Poland in 2000 – 2001. Bull. Vet. Inst. Pulawy 46, pp. 331–335. 6. Bülent N, Hilal Ç, Ali A, Hamparsun H (2005). The Presence of Some Anabolic Residues in Meat and Meat Products Sold in Istanbul, Turk J Vet AnimSci 29, pp. 691–699. 7. Daeseleire E, Vandeputte R, Van Peteghem C (1998). Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle, Analyst 123 (12): pp. 2595–2598. 8. Wiellogorska E, Elliott CT, Danaher, Chevallier O, Connolly L (2015). Validation of an ultra high performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry method for detection and quantitation of 19 endocrine disruptors in milk. Food Control 48, pp. 48–55. 9. Ellin D (2000). Human Safety of Hormone Implants Used to Promote Growth in Cattle. Food Research Institude. University of Wisconsin, USA, pp. 1–24. 10. George K, Georgios T (2013). Rapid multi – method for the determination of growth promoters in bovine milk by liquid chromatography – tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B 930, pp. 422–29. 11. Jack JL, Wendy CA, Christine RC, Sherri BT, Mark RM (2013). Analysis of Stilbene residues in aquacultured finfish using LC/MS/MS. J.Agric.Food Chem, 61, pp. 2364–2370. 12. Jin-qing J, Lei Z, Guang-ling L (2011). Analysis of 19- nortestosterone residue in animal tissues by ion-trap gas chromatography-tandem mass spectrometry. J Zhejiang Univ. Sci.B 12 (6): pp. 460–467. 13. Masayo Y, Mia S, and Michael SY (2012). QuEChERS sample preparation for LC/MS/MS determination of steroid hormones in meat and milk. Waters application note, pp. 1 - 4. 14. Medina MB, Schwartz DP (1992). Thin-layer chromatographic detection of zeranol and Estradiol - 17β in fortified plasma and tissue extracts with fast Corinth V. Journal of Chromatography, 581 (1): pp. 119–128. 15. Meenakshi D, Nidhi D (2014). Development and validation of LC-MS/MS method for simultaneous quantitation of testosterone, trenbolone, salbutamol and taleranol in chicken muscle. Indian Journal of Chemistry Vol 53B, pp. 1211–1217. 16. Paul Z and Christine M (2002). Identification of steroids in water by ion trap LC/MS/MS, Agilent. Agilent Technologies application notes 5988 – 6926EN, pp. 1–12. 17. Reneé J (2015). The U.S.-EU Beef Hormone Dispute, Congressional research service report, pp. 1–34. 18. Sang HJ, Daejin K, Myung WL, Chang SK and Ha JS (2010). Risk Assessment of Growth Hormone and Antimicrobial Residues in Meat, Toxicol. Res.,Vol. 26 (4), No. 4, pp. 301–313. 19. Siji J (2010). LC/MS/MS quantitation of β – Estradiol 17 – acetate using an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS working in ESI negative in mode. Agilent Technologies application notes 5990 – 5877EN, pp. 1–8. 20. Szabolcs S, Vien N, Laszlo P (2013). Separation of dansylated 17β – estradiol, 17α – estradiol, and estrone on a single HPLC column for simultaneous quantitation by LC-MS/MS. Anal Bioanal Chem 405, pp. 3399–3406. 21. TCVN 7046: 2009 (2009). Thịt tươi – yêu cầu kỹ thuật (lần 2). Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia, Bộ khoa học và công nghệ, tr. 1–10. Ngày nhận bài báo: 15/6/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21/7/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016