Ứng dụng kỹ thuật Fish và Karyotype trên tế bào gai nhau trong 3 tháng đầu thai kỳ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 431 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH VÀ KARYOTYPE TRÊN TẾ BÀO GAI NHAU TRONG 3 THÁNG ĐẦU THAI KỲ Lê Quang Tín*, Nguyễn Vạn Thông*, Nguyễn Thị Thanh Trúc*, Đặng Lê Dung Nghi*, Phạm Thị Vân Anh*, Vũ Thị Nhung** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Chẩn đoán tiền sản được thực hiện chủ yếu trên mẫu nước ối trong 3 tháng giữa thai kỳ hoặc trên mẫu gai nhau trong 3 tháng đầu thai kỳ. Tuy nhiên, tại Việt Nam, trong khi chẩn đoán tiền sản trên mẫu nước ối được áp dụng khá rộng rãi thì chẩn đoán tiền sản trên mẫu gai nhau lại được áp dụng khá hạn chế nên cần thêm nhiều nghiên cứu để cải thiện. Mục tiêu: Đánh giá toàn diện việc ứng dụng kỹ thuật FISH và karyotype trên tế bào gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương nhằm phục vụ tốt chương trình chẩn đoán tiền sản trong 3 tháng đầu thai kỳ. Phương pháp: 67 ca được thực hiện sinh thiết gai nhau. Mẫu gai nhau sau sinh thiết sẽ được chia làm 2 phần để làm FISH và karyotype gai nhau. Kỹ thuật FISH gai nhau sử dụng mẫu dò AneuVysion để chẩn đoán nhanh các đột biến lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y. Kỹ thuật karyotype gai nhau kết hợp cả 2 phương pháp nuôi cấy flask và nuôi cấy in situ để chẩn đoán bất thường số lượng và cấu trúc của toàn bộ bộ nhiễm sắc thể tế bào gai nhau. Kết quả: 62 ca được thực hiện FISH với 100% cho ra kết quả, đồng thời 98,2% trùng khớp với kết quả karyotype. 67 ca được thực hiện karyotype với 91% số ca thực hiện thành công, tuy nhiên chất lượng tiêu bản vẫn còn thấp nếu so với tiêu chuẩn mới của ACMG. Tỷ lệ bất thường trong nghiên cứu là 23,9%, trong đó thể tam nhiễm 21 chiếm tỷ lệ cao nhất (10,4%). Kết luận: Kỹ thuật FISH gai nhau đã cho thấy tính hiệu quả, tuy nhiên kỹ thuật karyotype gai nhau vẫn chưa đạt được thành công như mong đợi nên cần phải nghiên cứu thêm để cải tiến kỹ thuật. Từ khoá: FISH, karyotype, gai nhau, sinh thiết gai nhau, chẩn đoán tiền sản ABSTRACT THE APPLICATION OF FISH AND KARYOTYPING TECHNIQUES ON CHORIONIC VILLOUS CELLS FOR FIRST TRIMESTER PRENATAL DIAGNOSIS Le Quang Tin, Nguyen Van Thong, Nguyen Thi Thanh Truc, |Dang Le Dung Nghi, Pham Thi Van Anh, Vu Thi Nhung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 3- 2018: 431- 437 Background: Prenatal diagnosis was primarily performed on samples of amniotic fluid in second trimester or of chorionic villus in first trimester of pregnancy. However, in Vietnam, while the prenatal diagnosis on amniotic fluid is applied broadly, the prenatal diagnosis on chorionic villus is applied fairly limited and needs more research to improve. Objectives: To evaluate the application of FISH and karyotyping techniques at Hung Vuong Hospital to better serve the prenatal diagnosis program in the first trimester of pregnancy. Methods: Chorionic villus sampling was performed on 67 cases. Then the samples were divided into 2 parts for FISH and karyotyping techniques. FISH technique on chorionic villus used AneuVysion probes to rapidly * Bệnh viện Hùng Vương ** Hội Phụ Sản TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: CN. Lê Quang Tín ĐT: 0908938796 Email: lequangtin264@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 432 detect the aneuploidies of chromosomes 13, 18, 21, X, Y. And the karyotyping technique combined 2 methods of flask culturing and in situ culturing to detect chromosomal abnormalities of chorionic vilous cells. Results: 62 cases were performed FISH technique with all of them were informative and 98.2% coincided with karyotype results. 67 cases were performed karyotyping technique with 91% of them successfully implemented, however the quality of the templates was lower than the new standards of the ACMG. Abnormal ratio was 23.9% in the study, including trisomy 21 accounted for the highest proportion (10.4%). Conclusion: FISH technique on chorionic villus has proved effective, however karyotyping technique has not achieved success as expected. So it need further research to improve the technology. Keyword: FISH, karyotype, chorionic villus, CVS, prenatal diagnosis ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh ra một đứa con khỏe mạnh luôn là mong muốn lớn nhất của tất cả các bậc làm cha làm mẹ. Tuy nhiên, những bất thường ở thai nhi vẫn có thể xảy ra ảnh hưởng đến sự phát triển của trẻ sau này, trong đó, bất thường di truyền luôn là mối quan tâm hàng đầu vì nó không thể điều trị được và sẽ ảnh hưởng đến suốt cuộc đời đứa trẻ. Vì vậy, các bậc phụ huynh có nhu cầu muốn biết trước rằng liệu thai nhi có bị bất thường di truyền hay không để họ có thể quyết định nên tiếp tục dưỡng thai hay sẽ chấm dứt thai kỳ. Từ đó, các xét nghiệm chẩn đoán tiền sản ra đời nhằm giúp giải quyết nhu cầu bức thiết này. Trong chẩn đoán tiền sản, kỹ thuật nhiễm sắc thể đồ (karyotype) được xem là tiêu chuẩn vàng vì nó giúp phát hiện các bất thường về số lượng cũng như cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST) thai nhi với độ chính xác cao (99,4% - 99,8%)(6). Tuy nhiên, kĩ thuật này phải trải qua quá trình nuôi cấy tế bào nên thời gian trả kết quả kéo dài khoảng 14 đến 21 ngày(6). Vào đầu thập niên 1980, kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) ra đời cho phép rút ngắn thời gian trả kết quả xuống còn 2 – 3 ngày. Kỹ thuật này dựa vào tín hiệu huỳnh quang để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên NST. Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là chỉ khảo sát được các bất thường số lượng NST thường gặp như 13, 21, 18, X, Y. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, chẩn đoán tiền sản đã phát triển mạnh mẽ và rộng khắp trên toàn thế giới. Trong đó, chẩn đoán tiền sản chủ yếu được thực hiện trên mẫu nước ối hoặc gai nhau. Chẩn đoán tiền sản trên mẫu nước ối là xét nghiệm phổ biến nhất bởi ưu điểm đơn giản, tiện lợi, tuy nhiên nó chỉ có thể thực hiện khi thai từ 16 tuần trở lên. Trong khi đó, chẩn đoán tiền sản trên mẫu gai nhau tuy phức tạp và có độ rủi ro cao hơn nhưng có thể thực hiện ngay trong 3 tháng đầu thai kỳ, nhờ đó việc chấm dứt thai kỳ trở nên đơn giản hơn khi thai bất thường cũng như làm giảm tâm lý lo lắng cho phụ huynh khi thai bình thường. Tại Việt Nam, chẩn đoán tiền sản chủ yếu được thực hiện trên mẫu nước ối. Các kỹ thuật chẩn đoán tiền sản trên mẫu gai nhau vẫn còn được áp dụng rất hạn chế. Riêng tại bệnh viện Hùng Vương, chẩn đoán tiền sản vẫn chủ yếu dựa trên mẫu nước ối với 2 kỹ thuật chính là FISH và karyotype. Trong đó, nhiều trường hợp thai có nguy cơ bất thường NST trong 3 tháng đầu thai kỳ nhưng do những hạn chế và khó khăn về kỹ thuật chẩn đoán tiền sản trên mẫu gai nhau nên thai phụ đành chờ đến 3 tháng giữa thai kỳ để chọc ối. Để khắc phục tình trạng này, chúng tôi quyết định thực hiện nghiên cứu này nhằm đánh giá toàn diện việc ứng dụng kỹ thuật FISH và karyotype trên tế bào gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương, từ đó đề ra những giải pháp nhằm hoàn thiện các kỹ thuật này để phục vụ tốt chương trình chẩn đoán tiền sản trong 3 tháng đầu thai kỳ tại bệnh viện Hùng Vương. Ngoài ra, nghiên cứu còn có mục tiêu phụ là xác định tỷ lệ bất thường di truyền của các thai có Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 433 chỉ định làm sinh thiết gai nhau trong tam cá nguyệt thứ nhất. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Báo cáo loạt ca Tiêu chuẩn chọn mẫu Thai phụ có thai từ 11 đến 14 tuần đến khám tại bệnh viên Hùng Vương và có 1 trong số các chỉ định sau: Kết quả sàng lọc trong quý I thai kỳ cho thấy thai có nguy cơ cao bị tam nhiễm 13, 18 và 21 (T13 hoặc T18, T21 ≥ 1/250); Siêu âm trong quý I của thai kỳ phát hiện một số dị dạng có liên quan đến các bất thường của NST; Chỉ số NT (nuchal translucency) cao (≥ 3,5 mm); Cha hoặc mẹ mang các bất thường NST cân bằng và có thể di truyền cho con. Các thai phụ được chọn lọc sẽ được tư vấn rõ ràng và đều đồng ý tham gia nghiên cứu thông qua bản cam kết đồng thuận có chữ ký của thai phụ và chồng. Tiêu chuẩn loại trừ Rối loạn đông máu, giang mai, vị trí nhau không phù hợp với sinh thiết qua ngả bụng. Cỡ mẫu Chọn mẫu toàn bộ Thời gian nghiên cứu Từ tháng 1/2013 đến tháng 10/2015 Phương pháp tiến hành Kỹ thuật sinh thiết gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương là kỹ thuật sinh thiết qua ngả bụng dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Bác sĩ sẽ gây tê tại vị trí dự định sinh thiết, tiếp đó sẽ dùng kim SpinoCan 25G đâm xuyên qua thành tử cung đến vị trí bánh nhau để lấy 1 lượng nhỏ mẫu gai nhau dưới áp lực âm. Mẫu gai nhau thu được sẽ được rửa sạch máu mẹ và sẽ được thực hiện FISH, karyotype. Trường hợp lượng mẫu quá nhỏ không đủ thực hiện cả 2 xét nghiệm thì sẽ ưu tiên thực hiện karyotype. Kỹ thuật FISH gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương gồm 5 bước chính: xử lý mẫu, trải lam, lai, rửa lai và phân tích kết quả. Trước tiên, mẫu gai nhau thu được sẽ được xử lý bằng dung dịch nhược trương sodium citrate và dung dịch cố định Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic). Dịch sau xử lý sẽ được trải lên lam và sẽ được nhỏ 1 lượng mẫu dò lên lam (mẫu dò AneuVysion của hãng Vysis với 2 loại là CEP 18/X/Y lai trên NST 18, X, Y và LSI 13/21 lai NST 13, 21). Tiếp đó, lam sẽ được biến tính ở 730C trong 3 phút rồi được lai qua đêm trong bể ổn nhiệt ở 420C. Sáng hôm sau, lam sẽ được ngâm với các dung dịch rửa lai và được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang DAPI, sau đó sẽ được phân tích kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. Mỗi lam sẽ khảo sát 100 nhân, trường hợp nghi ngờ thể khảm thì sẽ khảo sát 200 nhân. Kỹ thuật karyotype gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương trải qua 4 bước chính: nuôi cấy gai nhau, thu hoạch, nhuộm và phân tích kết quả. Trong đó, quá trình nuôi cấy gai nhau được thực hiện qua 2 giai đoạn: nuôi cấy flask (thời gian từ 9 – 15 ngày) và nuôi cấy in situ trên đĩa petri chứa lá kính (từ 5 – 6 ngày) sử dụng môi trường Aminomax đặc trưng cho tế bào gai nhau tăng sinh. Sau khi đạt được mật độ tế bào phù hợp, colcemid được thêm vào để ngưng phân bào ở kỳ giữa. Tiếp đó, mẫu gai nhau sẽ được thu hoạch bằng dung dịch nhược trương sodium citrate và dung dịch cố định Carnoy, dán lá kính lên lam. Lam sau khi thu hoạch sẽ được nhuộm band G bằng Giemsa và trypsin, sau đó sẽ được khảo sát và phân tích bằng hệ thống kính hiển vi có kết nối với máy vi tính chứa phần mềm Meta System. Dựa theo tiêu chuẩn trích trong Diagnostic Cytogenetics (1999), mỗi ca sẽ khảo sát (đếm số lượng NST và nhận biết NST giới tính) ít nhất 15 cụm NST và phân tích (xếp thành bộ karyotype hoàn chỉnh) 5 cụm NST. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 434 Thu thập và phân tích số liệu: Kết quả sẽ được thu thập và phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel và Stata SE. KẾT QUẢ Tổng cộng có 67 thai phụ tham gia nghiên cứu với đa số thai phụ trong khoảng 12 tuần tuổi (64,2%). Trong 67 ca thực hiện sinh thiết gai nhau, không có trường hợp nào không thu được gai nhau cũng như không có trường hợp nào gặp tai biến sau sinh thiết. Tuy nhiên, có 5 trường hợp lượng gai nhau thu được quá ít nên chỉ đủ làm karyotype. Vì vậy, kỹ thuật FISH chỉ thực hiện được trên 62 trong số 67 ca sinh thiết. Bảng 1: Kết quả kỹ thuật FISH gai nhau Kết quả FISH Số ca Tỷ lệ (%) N=62 N=67 Bình thường 47 75,8 70,1 Bình thường XX 20 32,3 29,9 Bình thường XY 27 43,5 40,3 Bất thường 15 24,2 22,4 Thể tam nhiễm 21 7 11,3 10,4 Thể tam nhiễm 18 3 4,8 4,5 Thể tam nhiễm 13 1 1,6 1,5 Thể đơn nhiễm X 4 6,5 6 Không thực hiện FISH 5 7,5 Tất cả các ca thực hiện FISH đều cho ra kết quả với 24,2% ca bất thường, trong đó thể tam nhiễm 21 chiếm tỷ lệ cao nhất (11,3%). Có 1 trường hợp thể khảm là thể đơn nhiễm X/ XY với tỷ lệ khảm là 37% (74/200 nhân bất thường). Bảng 2: Kết quả kỹ thuật karyotype gai nhau Kết quả karyotype Số ca Tỷ lệ (%) N=61 N=67 Bình thường 46 75,4 68,7 Bình thường XX 20 32,8 29,9 Bình thường XY 26 42,6 38,8 Bất thường 15 24,6 22,4 Bất thường số lượng NST 14 23 20,9 Bất thường cấu trúc NST 1 1,6 1,5 Không ra kết quả 6 9 Trong 67 ca thực hiện karyotype, 61 ca cho ra kết quả (91%) và 6 ca không cho ra kết quả (9%). Các trường hợp bất thường số lượng NST là thể tam nhiễm 13/18/21 và thể đơn nhiễm X. Trường hợp bất thường cấu trúc duy nhất là chuyển đoạn giữa NST 11 và NST 20: 46,XY,der(11)t(11;20)(q21;q13.1)pat. Bảng 3: Tổng hợp kết quả FISH và karyotype gai nhau Kết quả xét nghiệm gai nhau Tổng (N=67) Tỷ lệ (%) Bình thường 50 74,6 Bình thường XX 21 31,3 Bình thường XY 29 43,3 Bất thường 16 23,9 Thể tam nhiễm 21 7 10,4 Thể tam nhiễm 18 3 4,5 Thể tam nhiễm 13 1 1,5 Thể đơn nhiễm X 4 6 Bất thường cấu trúc 1 1,5 Không có kết quả 1 1,5 57 ca có cả 2 kết quả FISH lẫn karyotype, trong đó 56 ca kết quả FISH và karyotpe trùng khớp với nhau (chiếm 98,2%). Chỉ có duy nhất 1 trường hợp kết quả FISH và karyotype không trùng khớp khi FISH cho ra bất thường thể khảm đơn nhiễm X/ XY (37%) trong khi karyotype lại cho ra kết quả bất thường toàn bộ (9 cụm NST được khảo sát). Có 1 ca không có cả 2 kết quả do không thực hiện FISH đồng thời karyotype cũng thất bại. Với 2 trường hợp trên, thai phụ được đề nghị chọc ối. Kết quả karyotype có 15 ca bất thường trong khi kết quả tổng hợp lại có 16 ca bất thường là do 1 trường hợp kết quả FISH cho ra thể đơn nhiễm X nhưng karyotype lại không cho ra kết quả (mẫu bị nhiễm). Thai phụ được đề nghị chọc ối và kết quả xét nghiệm nước ối trùng khớp với kết quả FISH gai nhau. Tương tự, kết quả FISH có 15 ca bất thường trong khi kết quả tổng hợp có 16 ca bất thường là do 1 trường hợp bất thường cấu trúc không thể phát hiện bằng kỹ thuật FISH mà chỉ phát hiện được bằng karyotype (chuyển đoạn giữa NST 11 và 20). Như vậy, tỷ lệ bất thường trong nghiên cứu là 23,9%, trong đó, thể tam nhiễm 21 vẫn là bất thường phổ biến nhất với 10,4% (chiếm 43,8% trong số các trường hợp bất thường). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 435 BÀN LUẬN Kết quả sinh thiết gai nhau Trong số 67 ca thực hiện sinh thiết gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương, không có trường hợp nào gặp tai biến sau thủ thuật. Đây là một kết quả khá khả quan, tuy nhiên tỷ lệ sẩy thai theo lý thuyết là khoảng 1%(5).. Vì vậy, nếu muốn chứng minh mức độ an toàn của kỹ thuật sinh thiết gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương, cần phải nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn rất nhiều. Kết quả FISH gai nhau Kỹ thuật FISH gai nhau trong nghiên cứu này được thực hiện trên 62 ca với 100% số ca cho ra kết quả. Nếu so với kết quả karyotype, trong số 57 ca có cả 2 kết quả FISH lẫn karyotype, tỷ lệ tương thích giữa FISH và karyotype là 98,2% (KTC 95% 0,91 – 0,99) với chỉ duy nhất 1 ca kết quả FISH không trùng khớp với karyotype. Đó là trường hợp kỹ thuật FISH cho ra kết quả thể khảm đơn nhiễm X/ XY (74/200 nhân bất thường chiếm 37%) trong khi karyotype cho ra bất thường toàn bộ. Do karyotype được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán tiền sản nên kết quả karyotype có độ tin cậy rất cao. Tuy nhiên, trong xét nghiệm gai nhau, kết quả đôi khi có sai lệch mà nguyên nhân không phải xuất phát từ vấn đề kỹ thuật mà là do những hạn chế của xét nghiệm gai nhau. Do có sự khác biệt về nguồn gốc của nhau và thai khi thai có nguồn gốc từ khối tế bào trong (ICM: inner cell mass), trong khi nhau có nguồn gốc từ khối tế bào trong lẫn nguyên bào nuôi (trophoblast) trong giai đoạn blastocyst(10). Vì vậy, nhiều khả năng kết quả về mặt di truyền của thai và nhau sẽ khác nhau. Trong đó, không loại trừ khả năng kết quả gai nhau là bất thường trong khi thai là bình thường tạo thành hiện tượng khảm khú trú bánh nhau (CPM: confined placental mosaicsm)(3). Do đó, để đảm bảo tính chính xác của kết quả, những ca xét nghiệm gai nhau cho kết quả khảm nên tiếp tục xét nghiệm nước ối để làm đối chứng(3,10). Với trường hợp trong nghiên cứu, nếu kết quả chọc ối là thể đơn nhiễm X (toàn bộ hoặc khảm) thì đây là trường hợp khảm thật sự. Nếu kết quả chọc ối là bình thường thì đây là trường hợp khảm khu trú bánh nhau loại II hoặc III (bất thường tồn tại trên tế bào gai nhau nuôi cấy nhưng không tồn tại trong thai)(3). Đáng tiếc là thai phụ đã quyết định bỏ thai thay vì chọc ối, do đó ta không thể biết chính xác thai nhi rơi vào trường hợp nào. Dù vậy, với việc thể đơn nhiễm X tồn tại ở cả kết quả FISH lẫn karyotype, đồng thời cũng phù hợp với kết quả siêu âm (nang thanh dịch vùng gáy) nên cũng cho thấy độ tin cậy của 2 kỹ thuật này. Nếu so với các nghiên cứu khác trên thế giới như của Brydorf (1996), Quilter (2001), Goumy (2004), Toutain (2009) thì các nghiên cứu này cũng tương tự như nghiên cứu của chúng tôi với 100% số ca thực hiện cho ra kết quả và gần như tất cả đều trùng khớp với karyotype(1,2,7,9). Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật FISH gai nhau là gần như tuyệt đối, khi không có trường hợp dương tính giả hay âm tính giả nào được ghi nhận. Do đó, có thể khẳng định FISH gai nhau là một công cụ chẩn đoán nhanh, hiệu quả và chính xác. Trong số các xét nghiệm tiền sản nhanh hiện nay, bên cạnh kỹ thuật FISH, kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) tuy ra đời muộn hơn nhưng ngày càng trở nên phổ biến nhờ các ưu điểm như đơn giản, có thể tự động hoá, lượng mẫu sử dụng ít, có thể trả kết quả trong ngày... Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi hệ thống PCR và hệ thống điện di mao quản đắt tiền trong khi kỹ thuật FISH chỉ cần hệ thống kính hiển vi huỳnh quang thường có tại các trung tâm tế bào di truyền(6). Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH rất có hiệu quả trong chẩn đoán các trường hợp thể khảm do khảo sát từng nhân tế bào nên sẽ cho ra cụ thể tỷ lệ bất thường. Số lượng nhân tế bào được khảo sát trong trường hợp thể khảm sẽ tăng lên (khoảng 200 nhân) để cho ra tỷ lệ bất thường chính xác, điều mà kỹ thuật QF-PCR rất khó để xác định. Vì vậy, kỹ thuật FISH vẫn còn đóng vai trò quan trọng, đặc biệt ở các trung tâm di truyền vừa và nhỏ(6). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 436 Kết quả karyotype gai nhau Trong số 67 ca thực hiện karyotype, có 56 ca đạt tiêu chuẩn (chiếm 83,6%), 11 ca không đạt tiêu chuẩn, trong đó có 3 ca không có tế bào. Trong 8 ca còn lại, có 5 ca có kết quả bất thường và cả 5 ca đều trùng với kết quả FISH nên vẫn có thể trả kết quả. Tổng cộng có 61 ca cho ra kết quả karyotype và 6 ca không cho ra kết quả. Như vậy, tỷ lệ thành công của karyotype gai nhau trong nghiên cứu này là 91% (KTC 95% 0,82 – 0,97). Trong số các ca thực hiện thành công, kết quả các cụm được khảo sát đều trùng khớp với nhau và trùng khớp với kết quả FISH (không tính trường hợp thể khảm). Trong số 6 ca thất bại có 1 ca không làm FISH, vì thế không có kết quả để trả và thai phụ được đề nghị chọc ối. Trong 5 ca còn lại, có 3 ca thai phụ muốn chọc ối làm xét nghiệm và cả 3 ca kết quả đều trùng khớp với kết quả FISH gai nhau. Trong số 6 ca thất bại, có 1 ca bị nhiễm khuẩn, 2 ca tế bào không phát triển và 3 ca không đủ số lượng cụm NST để trả kết quả. Trường hợp bị nhiễm có thể do sơ suất trong quá trình thao tác. Nguyên nhân tế bào không phát triển là do lượng mẫu thu được quá ít, vì vậy không thể phân biệt được đó là gai nhau hay là màng rụng của mẹ. Do đó, nhiều khả năng mẫu cấy không phải là gai nhau nên tế bào không thể tăng sinh trong môi trường nuôi cấy. Với 3 ca có số lượng cụm NST ít (12, 13, và 10 cụm NST), do không phù hợp với tiêu chuẩn đã đề ra (15 cụm) nên không thể trả kết quả. Nếu so với các nghiên cứu của Iqbal (1998), Sikkema- Raddatz (2000), Jorge (2014) thì kết quả karyotype trong nghiên cứu này vẫn còn thấp hơn so với các nghiên cứu khác trên thế giới (mức độ thành công lần lượt là 99,6; 99,7 và 93,7%)(4,5,8). Đồng thời, theo tiêu chuẩn mới nhất của ACMG công bố năm 2009, karyotype gai nhau nên khảo sát ít nhất là 20 cụm NST đến từ 2 nuôi cấy độc lập tức cao hơn tiêu chuẩn hiện tại của phòng chúng tôi. Tuy nhiên, trong điều kiện của bệnh viện Hùng Vương hiện nay rất khó để áp dụng tiêu chuẩn này mà nguyên nhân chủ yếu là do trang thiết bị còn hạn chế. Khác với nuôi cấy tế bào ối, nuôi cấy gai nhau khó khăn hơn nhiều đồng thời cũng có những đòi hỏi cao hơn về trang thiết bị và hóa chất sử dụng. Bên cạnh đó, vấn đề giá thành của 1 ca nuôi cấy gai nhau cần phù hợp với kinh tế của người dân Việt Nam. Nếu như theo tiêu chuẩn mới này, trong số 67 ca thực hiện karyotype, chỉ có 32 ca đạt chuẩn về số lượng cụm NST chiếm tỷ lệ 47,8%. Vì vậy, trước mắt chúng tôi chưa thể áp dụng tiêu chuẩn mới của ACMG. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn sẽ tiếp tục nghiên cứu cải tiến nhằm hướng đến tiêu chuẩn mà ACMG vừa công bố. Tóm lại, do những hạn chế về trang thiết bị và hóa chất, chất lượng karyotype gai nhau vẫn chưa đạt được thành công như mong đợi. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu cải tiến sao cho kỹ thuật karyotype gai nhau có thể cho ra chất lượng tốt nhất trong điều kiện cơ sở vật chất thiết bị phòng xét nghiệm di truyền của bệnh viện Hùng Vương hiện nay. Như vậy, nếu tổng hợp cả kết quả FISH lẫn karyotype gai nhau, trong số 67 ca trong nghiên cứu, có 50 ca bình thường chiếm tỷ lệ 74,6% và 16 ca bất thường chiếm 23,9%, trong đó thể tam nhiễm 21 có số lượng nhiều nhất (chiếm 43,8% trong các ca bất thường). Điều này phù hợp với y văn do thể tam nhiễm 21 là bất thường di truyền phổ biến nhất(1,9). Nhìn chung, tỷ lệ bất thường của các ca làm sinh thiết gai nhau cao hơn nhiều so với các ca chọc ối (vốn chỉ chiếm từ 3 – 5% theo số liệu từ phòng Di truyền – Bệnh viện Hùng Vương). Nguyên nhân là do nhiều trường hợp bất thường NST trong tam cá nguyệt thứ nhất sẽ sẩy thai trước khi bước qua tam cá nguyệt thứ 2. Do đó, số ca bất thường NST được phát hiện trong tam cá nguyệt thứ nhất sẽ cao hơn trong tam cá nguyệt thứ 2. Bên cạnh đó những ca có chỉ định sinh thiết gai nhau thường có tỷ lệ bất thường trên siêu âm cao hơn so với chỉ định chọc ối. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2018 437 Nguy cơ nhiễm tế bào mẹ Nhiễm tế bào mẹ là một vấn đề lớn trong chẩn đoán tiền sản vì có thể làm sai lệch kết quả. Trong xét nghiệm gai nhau, màng rụng và máu chính là nguồn tế bào mẹ trong mẫu nhau(10). Tuy nhiên, vấn đề không quá nghiêm trọng như xét nghiệm nước ối do mẫu nhau thu được bằng kỹ thuật sinh thiết gai nhau sẽ trải qua quá trình tách máu và màng rụng trước khi xét nghiệm(2). Nếu quá trình phân tách ban đầu tốt thì tế bào mẹ nếu còn sót lại cũng chỉ nằm trong khoảng từ 1,8 – 4%, không ảnh hưởng nhiều đến kết quả. KẾT LUẬN Qua 67 trường hợp thực hiện sinh thiết gai nhau tại bệnh viện Hùng Vương, tỷ lệ bất thường là 23,9%, trong đó thể tam nhiễm 21 chiếm tỷ lệ cao nhất (10,4%). Kỹ thuật FISH đã cho thấy tính hiệu quả với 100% số ca cho ra kết quả, đồng thời sự tương thích giữa kết quả FISH và karyotype gai nhau là 98,2% (KTC 95% 0,91 – 0,99). Kỹ thuật karyotype gai nhau tuy có tỷ lệ thành công 91% (KTC 95% 0,82 – 0,97) thấp hơn so với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới, đồng thời chất lượng tiêu bản cũng thấp hơn so với tiêu chuẩn của ACMG. Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu lớn hơn nhằm cải tiến quy trình karyotype gai nhau để nâng cao chất lượng kỹ thuật. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bryndorf T, Christensen B, Vad M, Parner J, Carelli M, Ward B, Klinger K, Bang J, Philip J (1996), "Prenatal detection of chromosome aneuploidies in uncultured chorionic villus samples by FISH", Am J Hum Genet, 59 (4), 918-926. 2. Goumy C, Bonnet-Dupeyron M, Cherasse Y, Laurichesse H, Jaffray J, Lacroute G, Geneix A, Lemery D, Vago P (2004), "Chorionic villus sampling (CVS) and fluorescence in situ hybridization (FISH) for a rapid first-trimester prenatal diagnosis", Prenatal Diagnosis, 24 (4), 249-256. 3. Grati F, Grimi B, Frascoli G, Di Meco A, Liuti R, Milani S, Trotta A, Dulcetti F, Grosso E, Miozzo M, Maggi F, Simoni G (2006), "Confirmation of mosaicism and uniparental disomy in amniocytes, after detection of mosaic chromosome abnormalities in chorionic villi", European Journal of Human Genetics, 14 (3), 282–288. 4. Iqbal M, Manko G, Trabin J, Virelles C, Jackson L (1998), "Cytogenetic evaluation of 1000 cases of chorionic villus sampling", Annals of Saudi Medicine, 18 (6), 506-510. 5. Jorge P, Mota-Freitas M, Santos R, Luz Silva M, Soares G, Fortuna A (2014), "A 26-Year Experience in Chorionic Villus Sampling Prenatal Genetic Diagnosis", Journal of Clinical Medicine, 3 (3), 838-848. 6. Nguyễn Vạn Thông, Khổng Hiệp, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2011), "Ứng dụng và kinh nghiệm sử dụng kỹ thuật chẩn đoán nhanh (FISH, MLPA và QF-PCR) các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp trong chẩn đoán trước sinh", Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 15 (2), 39-44. 8 7. Quilter C, Holman S, Al-Hammmandi R, Theodorides D, Hasting R, Delhanty J (2001), "Aneuploidy screening in direct chorionic villus samples by flourescence in situ hybridisation: the uses of commercial probes in a clinical setting", British Journal of Obstetrics and Gynaecology, 108 (2), 215-218. 6 8. Sikkema-Raddatz B, Bouman K, Verschuuren-Bemelmans C, Stoepker M, Mantingh A, Beekhuis J, de Jong B (2000), "Four years' cytogenetic experience with the culture of chorionic villi", Prenatal Diagnosis, 20 (12), 950-955. 7 9. Toutain J, Epiney M, Begorre M, Dessuant H, Vandenbossche F, Horovitz J, Saura R (2010), "First-trimester prenatal diagnosis performed on pregnant women with fetal ultrasound abnormalities: The reliability of interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) on mesenchymal core for the main aneuploidies", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 149, 143-146. Ngày nhận bài báo: /10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: /10/2017 Ngày bài được đăng: 20/04/2018