Tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp từ bốn loại dược liệu

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 112 TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT HỖN HỢP TỪ BỐN LOẠI DƯỢC LIỆU Phạm Đình Duy*, Trần Văn Thành*, Trương Thị Thu Trang**, Trịnh Thị Thu Loan* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Y học cổ truyền từ rất lâu đã có các bài thuốc từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an toàn, kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Tuy nhiên, các bài thuốc này thường được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương pháp truyền thống, không che được mùi vị khó chịu, bất tiện cho người bệnh. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu dưới dạng cao chiết trong cùng một dạng bào chế hiện đại, dễ sử dụng là một vấn đề đang được quan tâm. Xuất phát từ những thực tế nêu trên và nhằm góp phần đáp ứng nhu cầu điều trị hiệu quả, đa dạng hóa sản phẩm, đề tài được thực hiện với mục tiêu là tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp từ 4 dược liệu: Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Hỗn hợp cao chiết được tiêu chuẩn hoá có thể sử dụng để điều chế các dạng bào chế hiện đại hoá thuận tiện cho người dùng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao dược liệu được chiết từ sự phối hợp của 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Phương pháp nghiên cứu: Cao dược liệu hỗn hợp được chiết từ 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành được Bộ môn Dược cổ truyền, khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược Tp.HCM cung cấp sẽ được tiêu chuẩn hóa dựa theo những chỉ tiêu được qui định trong DĐVN V gồm: cảm quan, tỉ trọng, mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính, định lượng. Riêng định tính và định lượng sẽ định tính và định lượng nhóm hoạt chất chính là saponin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả: Đã tiêu chuẩn hoá được cao chiết dược liệu từ sự phối hợp của 4 loại dược liệu. Kết luận: Cao chiết dược liệu của hỗn hợp 4 loại dược liệu đã được tiêu chuẩn hoá có thể dùng làm nguyên liệu đầu vào để điều chế thành các thành phẩm bào chế. Từ khóa: cao dược liệu chuẩn hoá, cam thảo bắc, cát cánh, rẻ quạt, sâm đại hành ABSTRACT STANDARDIZATION OF THE EXTRACT FROM FOUR HERBAL PLANTS Pham Dinh Duy, Tran Van Thanh, Truong Thi Thu Trang, Trinh Thi Thu Loan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 112 - 120 Objectives: Traditional medicine has various precious remedies from medicinal herbs to treat sore throat effectively, safely and economically. Among those herbs, there are Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum, Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa. However, these remedies are often used alone and prepared according to traditional methods that can not cover unpleasant taste and unconviene for the patients. Therefore, the combination of various plant extracts and transform in modern and easy-to-use dosage form is a matter of concern. From the above mentioned arguments, this research is carried out with the goal of standardization of plant extracts containing 4 medicinal herbs. Materials and Methods: Subjects of study: Plant extract containing simultaneously four herbals: Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum, Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa. Herbal extract which was obtained from 4 medicinal herbs including Glycyrrhiza uralensis, Platycodon grandiflorum, *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Công ty Huỳnh Tấn Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Văn Thành ĐT: 0919000008 Email: [email protected] Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 113 Belamcanda chinensis, Eleutherine bulbosa, supplied by Department of Traditional Pharmaceutics, Faculty of Traditional Medicine, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City was standardized based on the criterias specified in Vietnamese pharamcopoeia V including: botanic characteristic, density, mass loss due to drying, water insoluble ash, total ash, insoluble ash in hydrochloric acid, sulfate ash, bioburdern, qualitative, quantitative. Herbal extract was quantified based on the main active ingredient, saponin, by HPLC (high- performance liquid chromatography). Althought there are various active ingredients in this extract, however, only acid glycyrrhizic must be quantified due to the monograph of Glycyrrhiza uralensis in Vietnamese pharmacopoeia. There is not quantification request yet for other herbal extract as described in Vietnamese pharmacopoeia. Results: The herbal extract was standardized according to Vietnamese pharmacopoeia V. Conclusion: This herbal extract was standardized that could be used as active ingredients to make the final pharmaceutical dosage form. Keywords: glycyrrhiza uralensis, platycodon grandiflorum, iris domestica, eleutherine bulbosa ĐẶT VẤN ĐỀ Y học cổ truyền từ rất lâu đã có các bài thuốc từ dược liệu điều trị viêm họng hiệu quả, an toàn, kinh tế. Trong số các dược liệu đó, có thể kể đến Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành(3,4,5). Tuy nhiên, các bài thuốc này thường được sử dụng riêng lẻ, bào chế theo các phương pháp truyền thống (ngâm, hầm, hãm, sắc), không tiện cho việc sử dụng, không che được mùi vị khó chịu, khó bảo quản, hoạt chất không ổn định. Vì vậy, việc phối hợp các dược liệu dưới dạng cao chiết trong cùng một dạng bào chế hiện đại, dễ sử dụng là một vấn đề đang được quan tâm. Hơn nũa, cùng với xu hướng thế giới quay trở về với thiên nhiên, tận dụng nguồn dược liệu tự nhiên ưu đãi, kết hợp đông dược với công nghệ sản xuất tiên tiến, các dạng bào chế hiện đại có nguồn gốc thảo dược mang lại nhiều sự tiện lợi cho người sử dụng. Xuất phát từ những thực tế nêu trên và nhằm góp phần đáp ứng nhu cầu điều trị hiệu quả, đa dạng hóa sản phẩm, đề tài được thực hiện với mục tiêu là tiêu chuẩn hóa cao chiết hỗn hợp từ 4 dược liệu: Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành nhằm sử dụng cho việc bào chế viên ngậm trị viêm họng. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nguyên liệu, thiết bị Cao dược liệu được chiết từ sự phối hợp của 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành. Nguồn gốc: Bộ môn Bào chế, khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Acid glycyrrhizic chuẩn (Tinh khiết 97,3%, Ban NCKH - ĐHYD), petroleum ether (Trung Quốc, TC USP30), cloroform (Trung Quốc, TC USP30), ethyl acetat (Trung Quốc, TC USP30), acid acetic, n-butanol (Trung Quốc, TC USP30), anhydrid acetic (Trung Quốc, TC USP30), acid sulfuric đậm đặc (Trung Quốc, TC USP30), methanol (Merck-Đức, TK cho HPLC), acetonitril (Merck-Đức, TK cho HPLC), acid acetic (Merck-Đức, TK cho HPLC). Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ), cân xác định độ ẩm Ohaus (Thụy Sĩ), lò nung Carbolite (Anh), máy HPLC Shimadzu (Nhật), máy quang phổ UV Viber (Pháp). Phương pháp nghiên cứu Cao dược liệu hỗn hợp được chiết từ 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt, Sâm đại hành được Bộ môn Bào chế khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp sẽ được tiêu chuẩn hóa dựa theo những chỉ tiêu được qui định trong dược điển Việt Nam (DĐVN) V gồm: cảm quan, tỉ trọng, mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 114 hydrocloric, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính, định lượng. Riêng định tính và định lượng sẽ định tính và định lượng nhóm hoạt chất chính là saponin. Cảm quan Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị hơi đắng chát. Tỉ trọng Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 6.5. Mất khối lượng do làm khô Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.6. Cắn không tan trong nước Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.10. Tro toàn phần Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.8. Tro không tan trong acid hydrocloric Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.7. Tro sulfat Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 9.9. Giới hạn nhiễm khuẩn Thực hiện theo DĐVN V, Phụ lục 13.6. Định tính saponin trong cao dược liệu Được thực hiện theo tài liệu(1,2,5). Phản ứng tạo bọt Cân khoảng 0,5 g cao dược liệu cho vào becher 100 ml. Thêm 20 ml nước cất, đun nóng nhẹ trên bếp cách thủy, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Lấy khoảng 5 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm. Đậy nắp ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc của ống trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt. Nếu có bọt bền trong 15 phút, kết luận trong cao có saponin. Phản ứng Fontan - Kaudel Cân khoảng 0,5 g cao dược liệu cho vào becher 100 ml. Thêm 20 ml nước cất, đun nóng nhẹ trên bếp cách thủy, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 5 ml dịch lọc. Sau đó, thêm vào ống nghiệm thứ nhất 5 ml acid hydrochloric 0,1 N (pH=1) và ống nghiệm thứ hai 5 ml natri hydroxyd 0,1 N (pH=13). Đậy nắp 2 ống nghiệm và lắc với lực như nhau theo chiều dọc của ống trong 1 phút. Để yên rồi quan sát chiều cao cột bọt của 2 ống nghiệm. Nếu chiều cao cột bọt trong 2 ống tương đương nhau thì sơ bộ kết luận trong cao dược liệu có saponin nhóm triterpenoid. Phản ứng Liebermann - Burchard Cân khoảng 2 g cao dược liệu cho vào bình lắng gạn và lắc với ether dầu hỏa (3 lần, mỗi lần 20 ml). Gạn bỏ lớp ether, chuyển phần cao ra bình nón, chiết bằng methanol (3 lần, mỗi lần 20 ml methanol). Gộp chung các dịch chiết, lọc qua giấy. Cô cạn dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml anhydrid acetic rồi thêm vào 2 ml cloroform. Thêm thật chậm 1-2 ml acid sulfuric đậm đặc theo thành ống nghiệm. Nếu xuất hiện vòng ngăn cách có màu từ hồng đến đỏ tím, có thể sơ bộ kết luận trong cao dược liệu có chứa saponin nhóm triterpenoid. Sắc ký lớp mỏng Phương pháp Phân tách các chất chiết được trong cao thành ba phân đoạn có độ phân cực khác nhau, tiến hành sắc ký mỗi phân đoạn với một hệ dung môi khai triển, thực hiện song song và so sánh với 2 dược liệu chuẩn là Cam thảo bắc và Cát cánh (Viện Y Dược học dân tộc TP. Hồ Chí Minh). Điều kiện sắc ký Bản mỏng Silica gel F254 (3 x 12 cm). Hệ dung môi khai triển Hệ 1: CHCl3 - MeOH (9:1). Hệ 2: CHCl3 - MeOH (7:3). Hệ 3: n-butanol - acid acetic - H2O (4:1:5). Thể tích chấm: 5 µl. Thuốc thử phát hiện Thuốc thử vanillin – sulfuric. Chuẩn bị dung dịch thử Cân 2 g cao dược liệu cho vào bình nón 100 ml. Lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 20 ml, gạn bỏ lớp ether. Chiết phần cao còn lại bằng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 115 methanol 3 lần, mỗi lần 20 ml (đun 20 phút trên bếp cách thủy, nhiệt độ 80°C). Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn trên bếp cách thủy rồi hòa tan cắn vào 20 ml nước cất. Chuyển vào bình lắng gạn rồi lắc với 20 ml cloroform. Tách lấy lớp cloroform, đem chấm sắc ký với hệ dung môi khai triển 1. Lớp nước còn lại được lắc tiếp với 20 ml ethyl acetat. Tách lấy lớp ethyl acetat, đem chấm sắc ký với hệ dung môi khai triển 2. Phần nước còn lại được cô đến cắn rồi hòa tan cắn vào trong 5 ml methanol để chấm sắc ký với hệ dung môi khai triển 3. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu Cân 5 g mỗi dược liệu chuẩn Cam thảo bắc, Cát cánh đem chiết với methanol 3 lần, mỗi lần với 20 ml (đun 20 phút trên bếp cách thủy, nhiệt độ 80°C). Gộp các dịch chiết methanol, cô cạn trên bếp cách thủy. Hòa tan cắn trong 5 ml methanol. Tiến hành chấm sắc ký Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 ml mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi cách mép trên của bản mỏng 1 cm thì lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Lần lượt soi bản mỏng dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho vết có cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Cuối cùng là phun thuốc thử vanilin - sulfuric rồi hơ nhẹ bản mỏng trên bếp điện để hiện rõ các vết. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho vết có cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Định tính acid glycyrrhizic trong cao dược liệu bằng phương pháp HPLC Thời gian lưu của pic acid glycyrrhizic trên sắc ký đồ mẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ acid glycyrrhizic chuẩn. Định lượng saponin trong cao dược liệu Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân Nguyên tắc Chiết saponin ra khỏi cao dược liệu bằng methanol. Dựa vào khả năng kết tủa của saponin với aceton để tách riêng saponin. Cân và tính hàm lượng saponin toàn phần trong cao dược liệu. Tiến hành Cân chính xác khoảng 1 g cao dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 ml. Lắc với ether dầu hỏa (3 lần, mỗi lần 20 ml), gạn bỏ lớp ether. Chiết cao với methanol (3 lần, mỗi lần 20 ml) ở 80°C, trong 20 phút, thỉnh thoảng lắc đều, lọc qua bông. Gộp toàn bộ dịch chiết, lọc qua giấy lọc. Dịch chiết được cô trên bếp cách thủy (ở 80°C) đến khi còn khoảng 20 ml. Cho từ từ từng giọt dịch chiết cô đặc vào 1 becher chứa sẵn 100 ml aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 105°C rồi đem cân. Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức: Trong đó: X (%): hàm lượng saponin toàn phần. P (g): lượng cao đã cân ban đầu. m (g): khối lượng tủa thu được. Định lượng acid glycyrrhizic trong cao dược liệu bằng HPLC Acid glycyrrhizic là hoạt chất chính của Cam thảo bắc, đại diện cho nhóm có tác dụng trị liệu của cao dược liệu, vì vậy chọn acid glycyrrhizic là chất chỉ điểm cho việc định lượng. Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 4,8 mg acid glycyrrhizic chuẩn (độ tinh khiết 97,3%) cho vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 10 phút để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn có nồng độ 46,8 µg/ml. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 116 Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 5,36 g cao dược liệu cho vào bình định mức 50 ml, thêm 20 ml methanol, siêu âm 10 phút, thêm methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành chạy sắc ký hai dung dịch (dung dịch thử và dung dịch chuẩn), mỗi dung dịch 3 lần, ghi nhận diện tích pic và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng acid glycyrrhizic trong cao được tính theo công thức: X (%) = x Cc x x k x 100 Trong đó: X (%): hàm lượng acid glycyrrhizic trong cao dược liệu. Sc: diện tích pic trung bình của mẫu chuẩn. St: Diện tích pic trung bình của mẫu thử. Cc: nồng độ của mẫu chuẩn. F: độ pha loãng của mẫu thử. k: độ tinh khiết của chất chuẩn. H: độ ẩm của cao dược liệu. m: khối lượng cao dược liệu. Điều kiện sắc ký Pha động: Acid acetic-Acetonitril-Nước (3:41:59). Cột sắc ký: Phenomenex, C 18 (150 x 4,6 mm, 5 µm). Đầu dò: PDA, 285 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 µl. Thẩm định qui trình định lượng acid glycyrrhizic bằng phương pháp HPLC Qui trình định lượng acid glycyrrhizic được thẩm định định về tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng theo qui định chung. KẾT QUẢ Kết quả tổng hợp các thông số chỉ tiêu chất lượng của cao dược liệu về cảm quan, tỉ trọng, mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong nước, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrocloric, tro sulfat, giới hạn vi sinh, định tính, định lượng được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Bảng tổng hợp kết quả các thông số chỉ tiêu chất lượng của cao dược liệu STT Thông số Kết quả đạt được 1 Cảm quan Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị đắng chát 2 Tỉ trọng (n = 3) 1,267 ± 0,006 3 Mất khối lượng do làm khô (n = 3) 52,6 ± 0,79% 4 Cắn không tan trong nước (n =3) 2,84 ± 0,28% 5 Tro toàn phần (n = 3) 3,83 ± 0,2% 6 Tro không tan trong acid hydrocloric (n=3) 0,41 ± 0,012% 7 Tro sulfat (n = 3) 4,46 ± 0,25% 8 Giới hạn vi sinh: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ≤ 5.104 cfu/g (ml) - Tổng số Enterobacteria: ≤ 500 cfu/g (ml) - Tổng số nấm mốc và men: ≤ 500 cfu/g (ml) - Không được có Salmonella trong 10g (ml), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, S.aureus trong 1g (ml) Đạt 9 Định tính: - Saponin: +Phản ứng tạo bọt +Phản ứng Fontan - Kaudel +Phản ứng Liebermann - Burchard + Sắc ký lớp mỏng: trên sắc ký đồ, cao cho các vạch tương ứng với các vạch của dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn. - Acid glycyrrhizic: thời gian lưu của pic AG trên sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu AG chuẩn. Dương tính Dương tính Dương tính Đúng Đúng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 117 STT Thông số Kết quả đạt được 10 Định lượng: - Hàm lượng saponin toàn phần (n = 3) - Hàm lượng acid glycyrrhizic (n = 3) 9,13% 0,083% Kết quả định tính saponin bằng các phản ứng (Hình 1) Đối với phản ứng tạo bọt Dung dịch sau khi lắc có bọt bền trong 15 phút. Đối với phản ứng Fontan - Kaudel Sau khi lắc mạnh rồi đề yên trong 15 phút, cột bọt trong hai ống cao ngang nhau và bền như nhau. Đối với phản ứng Liebermann - Burchard Xuất hiện vòng ngăn cách có màu từ hồng đến đỏ tím. Vậy có thể kết luận trong cao dược liệu có chứa saponin nhóm triterpenoid. Kết quả định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng ở cả 3 phân đoạn ở bước sóng UV 254 nm, UV 365 nm và sau khi phun thuốc thử Trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM), mẫu cao cho các vạch tương ứng với các vạch của dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn (Hình 2). A B C Hình 1. Kết quả định tính. A: phản ứng tạo bọt, B: phản ứng Fontan - Kaudel, C: phản ứng Liebermann – Burchard A B C Hình 2. Kết quả SKLM với 1: Cam thảo bắc, 2: Cao dược liệu, 3: Cát cánh. A: SKLM phân đoạn trong cloroform ở bước sóng UV 254, UV 365 và sau khi phun thuốc thử. B: SKLM phân đoạn trong ethyl acetat ở bước sóng UV 254, UV 365 và sau khi phun thuốc thử. C: SKLM phân đoạn trong methanol ở bước sóng UV 254, UV 365 và sau khi phun thuốc thử 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 118 Thông số kỹ thuật của cao dược liệu Bảng 2. Thông số kỹ thuật cao dược liệu STT Chỉ tiêu Mức chất lượng đạt được 1 Cảm quan Chất lỏng sánh, màu nâu đen, có mùi đặc trưng, vị đắng chát 2 Tỉ trọng 1,264 - 1,276 3 Mất khối lượng do làm khô 51,5 - 53,5% 4 Cắn không tan trong nước 2,5 - 3,5 % 5 Tro toàn phần 3,5 - 4,2 % 6 Tro không tan trong HCl 0,4 - 0,45% 7 Tro sulfat 4 - 5% 8 Giới hạn nhiễm khuẩn - Tổng số vi khuẩn hiếu khí: ≤ 5.10 4 cfu/g (ml) - Tổng số Enterobacteria: ≤500 cfu/g (ml) - Tổng số nấm mốc và men: ≤500 cfu/g (ml) - Không được có: Salmonella trong 10g (ml) Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, S.aureus trong 1 g (ml) 9 Định tính: - Saponin: +Phản ứng tạo bọt +Phản ứng Fontan - Kaudel +Phản ứng Liebermann - Burchard + Sắc ký lớp mỏng - Định tính acid glycyrrhizic Dương tính Dương tính Dương tính Trên sắc ký đồ, cao dược liệu cho các vạch tương ứng với các vạch của dịch chiết Cam thảo bắc và Cát cánh chuẩn Thời gian lưu của pic AG trên sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ AG chuẩn 10 Định lượng: - Hàm lượng saponin toàn phần - Hàm lượng acid glycyrrhizic 8-10% 0,080-0,087% Từ những kết quả nghiên cứu, thông số kỹ thuật của cao được đề nghị như sau (Bảng 2). Kết quả thẩm định qui trình định lượng acid glucyrrhizic bằng phương pháp HPLC Tính phù hợp hệ thống Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống được trình bày ở Bảng 3 cho thấy qui trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống. Bảng 3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống Lần bơm Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAu x phút) Hệ số bất đối As Số đĩa lý thuyết N 1 9,70 158671 1,183 2208 2 9,69 152524 1,176 2197 3 9,93 157457 1,150 2170 4 10,02 155486 1,146 2199 5 9,98 152960 1,149 2167 6 9,98 154150 1,135 2162 TB 9,88 155208 1,157 2184 RSD (%) 1,5 1,59 1,6 0,91 Độ đặc hiệu Kết quả độ đặc hiệu được trình bày trong Hình 3 cho thấy: Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu giả định không xuất hiện pic của acid glycyrrhizic. Sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của acid glycyrrhizic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ mẫu acid glycyrrhizic chuẩn. Vậy qui trình định lượng đạt độ đặc hiệu. Độ tuyến tính Kết quả độ tuyến tính của phương pháp được trình bày trong Bảng 4 cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ acid glycyrrhizic và diện tích pic, phương trình hồi qui có dạng ŷ = 7510,3 x (hệ số b không có ý nghĩa, p = 0,098 > 0,05). Bảng 4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính Mẫu 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 5,353 10,705 21,410 53,525 107,050 Diện tích pic 25363 61687 155598 373289 792938 Độ chính xác Kết quả định lượng 6 mẫu thử được trình bày trong Bảng 5 cho thấy qui trình định lượng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 119 acid glycyrrhizic đạt độ chính xác. Độ đúng Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày trong Bảng 6 cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng. A B C D Hình 3. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu: (A) mẫu trắng, (B) mẫu giả định, (C) mẫu chuẩn, (D) mẫu thử Bảng 5. Kết quả khảo sát độ chính xác Mẫu 1 2 3 4 5 6 TB RSD Diện tích pic 79980 79457 78856 79032 79238 78225 Hàm lượng (mg) 0,1160 0,1164 0,1137 0,1131 0,1141 0,1152 0,1148 1,15 Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng Mức khảo sát (%) Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỉ lệ phục hồi (%) Tỉ lệ phục hồi trung bình 80 2,28 2,259 99,08 100,02 2,29 2,277 99,43 2,30 2,335 101,54 100 2,70 2,733 101,22 101,56 2,71 2,756 101,70 2,68 2,727 101,75 120 3,29 3,299 100,27 100,30 3,33 3,347 100,51 3,30 3,304 100,12 BÀN LUẬN Cao chiết của hỗn hợp 4 dược liệu được đánh giá các chỉ tiêu chung theo hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam V. Các chỉ tiêu cảm quan, tỉ trọng, cắn không tan trong nước, tro toàn phần, tro sulfat, giới hạn nhiễm khuẩn là các chỉ tiêu cần được yêu cần chung cho tất cả các chiết xuất dược liệu. Trong cao chiết hỗn hợp này, acid glycirrhizic là chất có tác động kháng viêm, kháng khuẩn và tăng sức đề kháng được qui định định lượng trong Dược điển Việt Nam V nên được sử dụng là chất chỉ điểm trong định lượng. Tuy nhiên, phương pháp định lượng trong Dược điển Việt Nam V không thể áp dụng cho cao chiết hỗn hợp nên chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp định lượng acid glycyrrhizic bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định đạt các yêu cầu như tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại. Đối với các dược liệu còn lại, trong Dược điển Việt Nam V chỉ yêu cầu định tính bằng các phản ứng hoá học. Phản ứng định tính hoá học cho Rẻ quạt và Sâm đại hành bị nhiễu khi có sự Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 120 hiện diện của các dược liệu còn lại nên không được thực hiện. Cũng vì lý do tương tự nên việc khảo sát để chọn hệ dung môi chạy định tính trên sắc ký bản mỏng cũng không thể tiến hành với dược liệu Rẻ quạt và Sâm đại hành. KẾT LUẬN Cao hỗn hợp được chiết từ 4 loại dược liệu gồm Cam thảo bắc, Cát cánh, Rẻ quạt và Sâm đại hành đã được tiêu chuẩn hóa. Những thông số kỹ thuật của cao đã được xác định. Cao đã được dùng trong bào chế viên nén ngậm trị viêm họng (sẽ được công bố ở công trình khác). Phương pháp HPLC định lượng acid glycyrrhizic trong cao cũng đã được xây dựng và thẩm định, phương pháp đạt yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng. Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn ThS. Phạm Thị Hóa đã cung cấp cao dược liệu để thực hiện đề tài này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y học Hà Nội, pp.131-137. 2. Bộ Y tế (2019). Dược điển Việt Nam V. NXB Y học Hà Nội, PL- 1.20, PL-6.5, PL-9.6, PL-9.7, PL-9.8, PL-9.9, PL-11.3, PL-11.6, PL- 13.6. 3. He J, Chen L, Heber D, et al (2006). “Antibacterial compounds from Glycyrrhiza uralensis”. Journal of Natural Products, 69:121- 124. 4. Maiti B, Nagori BP, Singh R, et al (2011). “Recent trends in herbal drugs: a review”. International Journal of Drug Research and Technology, 1(1):17-25. 5. Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011). Dược liệu học, NXB Y học Hà Nội, 1:205-211, 215-221, 227-231, 256, 424-425. 6. Ren P, Sun G (2008). “HPLC determination of glycyrrhizic acid and glycyrrhetic acid in Fuzilizhong Pills”. Asian Journal of Traditional Medicines, 3(3): 110-116. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019