Thu nhận protein điều chỉnh miễn dịch Fip từ hệ sợi nấm Ganoderma Colossum Donk

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 9 THU NHẬN PROTEIN ĐIỀU CHỈNH MIỄN DỊCH FIP TỪ HỆ SỢI NẤM GANODERMA COLOSSUM DONK Lê Nguyễn Uyên Chi* TÓM TẮT Mở đầu: Các hoạt chất trong nấm Hoàng chi (Ganoderma colosum Donk) của Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu, đặc biệt là loại protein điều chỉnh miễn dịch – FIP – đang được giới khoa học hết sức chú ý trong việc nghiên cứu sử dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo. Mục tiêu: Thu nhận FIP từ nuôi cấy sợi nấm Hoàng chi, xác định khối lượng phân tử và đánh giá khả năng chống ngưng kết máu của FIP. Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Sinh khối hệ sợi nấm Hoàng chi thu được từ việc nuôi cấy dịch thể. FIP được thu nhận và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Protein được định khối lượng phân tử bằng điện di SDS- PAGE. Hoạt tính chống ngưng kết máu của FIP tách chiết được chứng minh trên máu người và máu cừu. Kết quả: Mẫu protein thu được từ sợi nuôi cấy nấm Hoàng chi có khối lượng là 13,114 kiloDalton (kDa) và mang hoạt tính của họ FIP là gây ngưng kết đối với máu cừu, nhưng hoàn toàn làm tan đối với 4 nhóm máu người. Kết luận: Nghiên cứu lần đầu tiên xác định sự hiện diện của dòng protein điều chỉnh miễn dịch ly trích từ hệ sợi nuôi cấy nấm Hoàng chi ở Việt Nam. Kết quả này là cơ sở để thực hiện những nghiên cứu về tìm hiểu trình tự gen mã hóa cho FIP, ứng dụng tiếp theo trong công nghệ sản xuất FIP tái tổ hợp để bào chế dược liệu từ thảo mộc, giúp phòng và hỗ trợ điều trị bệnh. Từ khóa: Ganoderma colossum, nuôi cấy hệ sợi, FIPs. ABSTRACT AN IMMUNOMODULATORY PROTEIN EXTRACTED FROM THE MYCELIUM OF GANODERMA COLOSSUM DONK Le Nguyen Uyen Chi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 9 - 14 Background – Objectives: Active elements of the Ganoderma colossum – one type of lingzhi mushroom found in Vietnam – have not been much studied till now. One of them was the immunomodulatory protein - FIP, which was promised as an efficient medical herbal drug for treatment of diseases. Methods: FIP was isolated from the cultured mycelium of G. colossum. Its molecular weight was measured by SDS-PAGE electrophoresis. The ability of hemaglutination of FIP was tested with human and sheep red blood cells. Results: FIP’s molecular weight was 13.114 kDa. Aggregation was observed from sheep red blood cells in the presence of purified FIP of G. colossum. However, no aggregation was seen for any type of human red blood cells. Conclusions: This research was firstly determined the presence of an immunomodulatory protein isolated from cultured mycelia of G. colossum in Vietnam. This finding served as a foundation for further experiments of FIP gene, as well as the production of recombinant FIP in herbal drugs to prevent and support the treatment for diseases. Keywords: Ganoderma colossum, mycelium, FIPs. *Khoa Khoa học cơ bản, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ : TS. Lê Nguyễn Uyên Chi ĐT: 012-1639-5936 Email: uyenchile@hotmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 10 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Hoàng chi (Ganoderma colosum Donk) là một loài nấm quý hiếm của Việt Nam đã được chứng minh là có thành phần hoạt chất đa dạng với hoạt tính sinh học rất cao như kháng khuẩn(5,13), kháng HIV type I(2), ức chế tế bào ung thư gan(17). Mặc dù với thành phần hoạt chất được biết khá đa dạng, song các nghiên cứu hiện nay chủ yếu mới tập trung vào các triterpenoid như colossolactones (A-G)(2,5), phenolic(3) còn các thành phần khác vốn được biết có vai trò rất quan trọng trong họ Ganodermataceae như polysaccharide hay protein thì vẫn còn rất ít thông tin đề cập, chẳng hạn ở nấm Ganoderma colossum đặc thù tại Việt Nam. Hiện nay, người ta đã xác định được trong nấm Linh chi có khoảng 119 loại triterpens và nhiều loại polysaccharide có giá trị. Đặc biệt là họ protein điều chỉnh miễn dịch FIPs đang được giới khoa học hết sức chú ý trong việc nghiên cứu sử dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo. FIP được phát hiện lần đầu tiên năm 1989 ở loài Linh chi chuẩn G. lucidum(6) với tên gọi LZ-8 (FIP-glu) và cũng là FIP được nghiên cứu kỹ nhất với vai trò như một loại protein chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch. Cho đến nay đã có tất cả 7 protein trong họ FIPs được tìm thấy ở các loài nấm khác nhau bao gồm FIP-glu ở G. lucidum(6), FIP-gts ở G. tsugae(11), FIP-fve ở Flammulina velutipes(7), FIP-vvo ở Volvariella volvacea(4), FIP-gja ở G. japonicum, FIP-gmi ở G. microsporum(18), và FIP-gsi ở G. sinensis(20). Bảng 1: Điểm tương đồng giữa các protein họ FIPs. Loại FIP Khối lượng (kDa) Hàm lượng đường (%) Số lượng amino acid Độ trùng lặp amino acid so với FIP-glu (%) FIP-glu 12,420 1,3 110 FIP-gts 13,000 0 110 FIP-fve 12,704 0 114 63,6 FIP-vvo 12,667 0 112 59,1 FIP-gsi 111 88,6 Các protein trong họ FIPs có sự tương đồng rất cao về mặt cấu trúc và tính năng(1,16), về số lượng, thành phần amino acid và có khối lượng trung bình từ 11 – 15 kDa(18) (bảng 1). Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tất cả các protein FIP đều có những hoạt tính tương tự nhau: không làm ngưng kết máu người(4,7,8); khả năng điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch cơ thể thông qua một số cơ chế quan trọng như tăng sinh tế bào lách, ức chế các phản ứng quá mẫn của cơ thể, kích thích cơ thể sản sinh các interleukin(4,7,9,14). Các khám phá gần đây cũng cho thấy vai trò quan trọng của họ FIPs trong chống tăng sinh và gây apoptosis các tế bào ung thư bạch cầu(12), ung thư phổi(10,15). Hoạt tính của mỗi protein cũng có sự mạnh yếu khác nhau, chẳng hạn LZ-8 có khả năng điều chỉnh sự tương tác giữa các tế bào thông qua các hệ phân tử trên bề mặt giúp cơ thể chống lại các bệnh tự miễn và quá mẫn rất mạnh trong khi FIP-vvo có hoạt tính kém hơn(4). Mặt khác, việc chiếm ưu thế của các FIPs được phát hiện trong họ Ganodermataceae (5/7 FIPs) so với các họ nấm khác cũng cho phép chúng ta thực hiện các bước khảo sát nhằm tìm kiếm các protein FIP trong các loài Linh chi thuộc họ này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận FIP từ hệ sợi nấm Hoàng chi qua nuôi cấy dịch thể và khảo sát hoạt tính chống ngưng kết máu của sản phẩm. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy hệ sợi nấm(20) Chủng nấm Hoàng chi (G. colossum) ở hệ sợi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm nuôi trồng nấm, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế. Hệ sợi nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA (200 g/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l dextrose, 1,5 g/l MgSO4.7H2O, 2,5 g/l KH2PO4, 10 mg/l vitamin B1, 20 g/l agar; pH 7,0) trong ống thạch nghiêng sau đó chuyển sang nuôi cấy trên đĩa petri có môi trường PDA ở 28oC trong 5 ngày. Hai khối agar (ϕ 9 mm) được cắt ra và chuyển vào erlen 250 ml chứa môi trường dịch thể (35 g/l sucrose, 5 g/l peptone, 2,5 g/l dịch chiết nấm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 11 men, 0,5 g/l MgSO4, 1 g/l KH2PO4, 0,05 g/l vitamin B1; pH 6,8). Điều kiện nuôi cấy có lắc 120 vòng/phút, nhiệt độ 28oC trong 14 ngày. Thu nhận protein thô Hệ sợi được thu nhận từ môi trường sau nuôi cấy bằng ly tâm ở 5000xg trong 15 phút, nghiền nhỏ trong Nitơ lỏng, và rửa nhiều lần với đệm PBS 10mM. Thu mẫu bằng ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và đông cô trong điều kiện lạnh thăng hoa làm giàu protein. Tinh sạch FIP bằng sắc ký lọc gel Chạy sắc ký lọc gel xác định phân đoạn trong khoảng 11 – 15 kDa. Mỗi phân đoạn lấy 2 ml, trong 5 - 10 phút. Đo OD 280nm của mỗi phân đoạn và ghi nhận các peak tạo thành. Các ống có sự hiện diện sẽ được dồn lại từng peak để đem đi xác định hàm lượng. Điện di SDS-PAGE và xác định trọng lượng phân tử của protein 30 µl mẫu protein các peak lần lượt được nạp vào giếng của gel polyacrylamide 10%, chạy điện di ở 100V. Sau khi điện di, nhuộm gel trong dung dịch xanh Comassive. Giá trị Rf được tính là tỷ lệ khoảng cách di chuyển của protein (từ giếng đến vạch) trên khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol (từ giếng đến vạch màu cuối). Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lượng phân tử của các vạch protein mẫu có thể xác định thông giá trị Rf của chúng và ngoại suy từ đồ thị. Xác định khả năng ngưng kết hồng cầu của FIP 6 ml máu cừu hoặc máu người thuộc các nhóm A, B, AB và O được ly tâm 1200xg trong 10 phút để loại bỏ huyết tương. Thu 2 ml của dịch hồng cầu ở đáy ống ly tâm, rửa với đệm PBS 1X, sau đó tạo dịch hồng cầu với PBS (tỷ lệ 1,5% V/V). Trong mỗi giếng thử, lần lượt cho vào 25 µl protein FIP ở peak 1 hoặc peak 2, cùng với 75 µl gelatin 0,2% trong PBS và 25 µl của dịch 1,5% hồng cầu. Ủ mẫu trong 12 giờ ở 37oC và xem kết quả. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nuôi cấy Mẫu sợi nấm Hoàng chi được cấy từ ống thạch nghiêng sang môi trường PDA trong đĩa petri. Sau 5 ngày ủ ở 28oC, hệ sợi nấm mọc lan và hình thành sắc tố màu vàng (hình 1). Sinh khối nấm tiếp tục được tăng sinh trong bình erlen chứa môi trường lỏng PD, điều kiện nuôi cấy có lắc 120 vòng/phút, ở 28oC, pH môi trường ban đầu là 5. Sau 14 ngày nuôi cấy, quan sát thấy mật độ hệ sợi nấm dày hơn làm thay đổi pH môi trường là 3,8±0,09, tơ nấm có màu vàng nhạt. Tiến hành ly tâm thu sinh khối hệ sợi đạt 630±2,58 mg/100ml. Sinh khối nấm được dùng để ly trích protein tiếp theo. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 12 Hoàng chi (Ganoderma colossum) là loài đặc biệt quý hiếm vừa mới phát hiện và đã được nuôi trồng thành công tại Thừa Thiên Huế. Nó có thể được coi là loài đặc hữu của Việt Nam(5). Đến nay, phòng thí nghiệm nuôi trồng nấm, bộ môn thực vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế đã trồng thành công nhiều chủng nấm, kể cả Hoàng chi, phát triển tốt trên các giá thể, tuy nhiên, việc nghiên cứu nấm Hoàng chi nuôi trồng trong môi trường dịch thể vẫn chưa được đề cập tới. Bằng kỹ thuật nuôi ống nghiệm, chúng tôi đã nuôi thành công sợi nấm trong môi trường bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp, ở điều kiện nhiệt độ 28oC thích hợp để tơ nấm phát triển tốt. Sinh khối hệ sợi có thể nhanh chóng thu hoạch sau 14 ngày. So với một chu trình sống của nấm Hoàng chi cũng như các loài nấm đảm khác, bắt đầu từ đảm bào tử hữu tính, nảy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng, kết thúc bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm, việc nuôi thể quả (tai nấm) tuy là phổ biến vì kỹ thuật tương đối đơn giản, thể quả thu được mang tính thẩm mỹ cao dễ dàng thương mại hoá, các yêu cầu bảo quản tương đối đơn giản, nhưng đòi hỏi thời gian thu hoạch lâu dài, việc chủ động điều chỉnh thành phần hoạt chất cũng như kỹ thuật trích ly gặp nhiều khó khăn. Trong khi đó, kỹ thuật nuôi cấy huyền phù sợi nấm cho phép chủ động điều chỉnh thành phần môi trường theo ý muốn để thu nhận hoạt chất, các kỹ thuật tách chiết tương đối đơn giản hơn. Thu nhận và tinh sạch FIP Sau khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, sinh khối sợi nấm được thu hoạch, phá vỡ tế bào thu protein tổng. Protein FIP được phân tách, tinh sạch bằng phương pháp chạy sắc ký lọc gel. Kết quả phân tách protein thu được 3 peak (hình 2). Hàm lượng protein trước và sau sắc ký lần lượt là 1,960 mg và 1,327 mg. Hiệu suất tinh sạch protein là tỷ lệ phần trăm của hàm lượng protein sau sắc ký trên tổng hàm lượng protein trước sắc ký, có giá trị là 67,70%. Để xác định khối lượng protein FIP của nấm Hoàng chi, chúng tôi tiến hành chạy điện di SDS-PAGE, quan sát trên gel polyacrylamide có hiện diện băng protein ở mức khoảng 13 kDa trong cả peak 1 và peak 2 đối chiếu với thang protein chuẩn (hình 3). Khoảng cách di chuyển của protein được đo và tính giá trị Rf. Từ biểu đồ chuẩn log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng, kết quả ngoại suy cho thấy mẫu protein thu được ở peak 1 và 2 có M = 13,114 kDa. Theo Wu và cộng sự (2007), các FIPs có một sự tương đồng cao về số lượng và thành phần amino acid và có khối lượng trung bình từ 11kDa - 15kDa(18). Từ đó cho thấy sản phẩm protein tách chiết từ sợi nấm Hoàng chi với băng điện di như trên tương ứng với FIP và có khối lượng phân tử là 13,114 kDa. Thử nghiệm ngưng kết máu Sử dụng hồng cầu máu người (A, B, AB và O) và hồng cầu máu cừu để khảo sát hoạt tính ngưng kết máu của protein FIP thu nhận từ hệ sợi nấm Hoàng chi. Kết quả cho thấy không có sự ngưng kết nào xuất hiện ở bất kỳ nhóm hồng cầu máu người nào với protein FIP ở cả peak 1 và peak 2. Trong khi đó, đối với máu cừu quan sát thấy có sự ngưng kết hồng cầu (hình 4). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với những công bố trước đây là protein họ FIPs không làm ngưng kết máu người(4,7,8), có thể kết luận sản phẩm protein thu từ nấm Hoàng chi là thuộc họ protein điều chỉnh miễn dịch. Ngoài hoạt tính ngưng kết máu, tất cả các protein họ FIPs còn có những hoạt tính khác như làm tăng sinh tế bào lách, ức chế các phản ứng quá mẫn của cơ thể, kích thích cơ thể sản sinh các interleukin(4,7,9,14), chống tăng sinh và gây apoptosis các tế bào ung thư bạch cầu(12), ung thư phổi(11,15). Các chức năng này cần được kiểm chứng thêm đối với protein FIP thu được, cũng như nhận diện trình tự gen mã hóa của FIP tương ứng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 13 KẾT LUẬN Protein điều chỉnh miễn dịch FIP lần đầu tiên được thu nhận và tinh sạch từ hệ sợi nuôi cấy nấm Hoàng chi. Trọng lượng phân tử là 13,114 kDa. Hoạt tính không gây ngưng kết hồng cầu người đã được chứng minh với protein thu nhận. Những nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để cải tiến thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy dịch thể, nhằm thu nhận nhanh và nhiều sinh khối sợi nấm; đồng thời cũng cần phân tích về thành phần amino acid, cấu trúc của FIP; đánh giá các khả năng điều chỉnh miễn dịch của FIP, v.v để sự dụng tốt nguồn dược liệu quý giá tại Việt Nam. Cảm ơn: Trân trọng cảm ơn GS. Ngô Anh, khoa Sinh học, đại học Khoa học Huế đã cung cấp giống nấm Hoàng chi; ThS. Ngô Bá Tư, đại học Thủ Dầu Một; ThS. Tăng Công Trường, Sở Khoa Học và Công nghệ Bình Dương đã giúp đỡ thực hiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bai YJ, Zeng L, Liu Y, Li YF, Lin ZP, Hu YL (2006). Expression of LZ-8 from Garnodum lucidum in transgenic tobacco and primary study on characteristic of recombinant LZ-8. Mol. Plant Breeding, 4: 645–649. 2. Dine RSE, Halawany AME, Nakamura N, Ma CM, Hattori M (2008). New lanostane triterpene lactones from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum (FR.) C.F.BAKER. Chem. Pharm. Bull., 56(5): 642-646. 3. Dine RSE, Halawany AME, Ma CM, and Hattori M (2009). Inhibition of the dimerization and active site of HIV-1 protease by secondary metabolites from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod., 72: 2019-2023. 4. Hsu HC, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1997). Fip-vvo, a New Fungal Immunomodulatory Protein Isolated from Volvariella volvacea. J. Biol. Chem., 323: 557-565. 5. Kleinwachter P, Anh N, Kiet TT, Schlegel B, Dahse HM, Hartl A, Grafe U (2001). Colossolactones, New triterpenoid metabolites from a Vietnamese muhsrooms Ganoderma colossum. J. Nat. Prod, 64(2): 236-239. 6. Kino K, Yamashita A, Yamaoka K, Watanabe J, Tanaka S, KerKry O, Shimizu K, Tsunoo H (1989). Isolated and characterization of a new immunomodlatory protein lingzhi-8 (LZ-8) from Ganoderma lucidum. J. Biol. Chem, 264: 472-478. 7. Ko JL, Hsu CI, Lin RH, Kao CL, Lin JY (1995). A new fungal immunomodulatory protein FIP-fve isolated from the edible mushroom, Flammulian velutlpes and its complete amino acid sequence. Eur. J. Biochem., 228: 244–249. 8. Li SL, Hu YP, Su JC, Song J, Guo YW, Qi ZG (2009). Cloning and expression of LZ-8 gene from Ganoderma lucidum, an immunomodulatory protein. Journal of Hebei Normal University (Natural Science Edition), 33:677–681 9. Li QZ, Wang XF, Chen YY, Lin J, Zhou XW (2010). Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungal immunomodulatory proteins (FIP-gsi) in mouse spleen cells. Appl. Biochem. Biotech., 162: 1403-1413. 10. Liao CH, Hsiao YM, Lin CH (2008). Induction of premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae. Food Chem. Toxicol., 46: 1851– 1859. 11. Lin WH, Hung CH, Hsu CI, Lin JY (1997). Dimerization of the N-terminal Amphipathic a-Helix Domain of the Fungal Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 14 Immunomodulatory Protein from Ganoderma tsugae (Fip-gts) Defined by a Yeast Two-hybrid System and Site-directed Mutagenesis. J. Biol. Chem, 272: 20044-20048. 12. Lin JW, Hao LX, Xu GX, Sun F, Gao F, Zhang R, Liu LX (2008). Molecular cloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris. World J. Microbiol. Biotechnol., 25: 383–390. 13. Ofodile LN, Kokubum NU, Grayer ORJ, Ogundipe OT, Simmonds MSJ (2005). Antimicrobial Activity of Some Ganoderma Species from Nigeria. Phytotherapia Research, 19: 210-213. 14. Paaventhan P, Joseph JS, Seow SV, Vaday S, Robinson H, Chua KY, Kolatkar PR (2003). 1.7 Å structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family. J. Mol. Biol., 332: 461–471. 15. Sun YF, Chang SQ, Yu DS (2006). The study progress on functional proteins of Flammulina velutipes. J. Microbiol., 26: 50–54. 16. Tanaka S, Ko K, Kino K, Tsuchiya K, Yamashita A, Murasugi A, Sakuma S, Hajime T (1989). Complete amino acid sequence of an immunomodulatory protein, lingzhi-8 (LZ-8). J. Biol. Chem., 264: 16372-16377. 17. Weng CJ, Fang PS, Chen DH, Chen KD, and Yen GC (2010). Anti-invasive effect of a rare mushroom, Ganoderma colossum on human hepatoma cells. J. Agric. Food Chem., 58: 7657-7663. 18. Wu MY, Hsu MF, Huang CS, Fu HY, Huang CT, Yang CS (2007). A 2.0 Å structure of GMI, a member of the fungal immunomodulatory protein family from Ganoderma microsporum. Protein Crystallography, 2:132. 19. Zhou XW, Li QH, Zhao JY, Tang KX, Lin JA, YinYZ (2007). Comparison of Rapid DNA Extraction Methods Applied to PCR Identification of Medicinal Mushroom Ganoderma spp. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 37: 369-380. 20. Zhou XW, Xie MQ, Hong F, Li QZ, Lin J (2009). Genomic cloning and characterization of a FIP-gsi gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma sinensis zhao et al (Aphyllophoromycetideae). Int. J. Med. Mushroom, 11: 77–86. Ngày nhận bài báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016