Thiết lập chất đối chiếu palmitoyl pyrazinamid; xây dựng quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid và xác định giới hạn tạp chất pyrazinamid trong chế phẩm bột khô phun sấy

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 490 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU PALMITOYL PYRAZINAMID; XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PALMITOYL PYRAZINAMID VÀ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT PYRAZINAMID TRONG CHẾ PHẨM BỘT KHÔ PHUN SẤY Huỳnh Thị Thanh Hằng*, Phan Thị Hương Giang**, Lê Quang Hiển***, Nguyễn Trường Thịnh***, Võ Thị Quỳnh Như***, Phạm Đình Duy*, Phan Văn Hồ Nam* TÓM TẮT Mở đầu: Các tiểu phân xốp mang tiền chất thuốc kháng lao pyrazinamid (PZA), palmitoyl pyrazinamid (PP), có thể khắc phục được những khuyết điểm của PZA trong hệ thống trị liệu tại phổi. Để góp phần kiểm soát chất lượng của nguyên liệu và chế phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu PP, đồng thời xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất PP và xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy. Mục tiêu: Thiết lập chất đối chiếu PP. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất PP và xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thiết lập chất đối chiếu PP theo hướng dẫn ISO Guide 35. Giá trị ấn định, độ lệch chuẩn, độ không đảm bảo đo chuẩn được tính toán theo hướng dẫn của ISO 13528. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của ASEAN. Kết quả: PP đã được thiết lập chất đối chiếu với độ tinh khiết là 99,35%. Đã xây dựng được quy trình định lượng PP trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC: Cột sắc ký HiQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động 100% ACN, bước sóng phát hiện 268 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, nhiệt độ cột 30 °C. Đã xây dựng được quy trình định lượng tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC: cột sắc ký Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động ACN – Dung dịch acid acetic pH 3 (5:95), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, nhiệt độ cột 30 °C, giới hạn phát hiện (LOD) của PZA được xác định là 0,005 ppm. Kết luận: PP đối chiếu đạt yêu cầu của một chất chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng nguyên liệu PP và chế phẩm. Đồng thời đã xây dựng được quy trình định lượng PP và quy trình xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC. Từ khóa: Palmitoyl pyrazinamid, pyrazinamid, thiết lập chất đối chiếu. ABSTRACT ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD SYNTHESIZED PALMITOYL PYRAZINAMIDE AS WELL AS QUANTITATIVE DETERMINATION OF PALMITATE PYRAZINAMIDE AND DETERMINATION OF PYRAZINAMIDE AS IMPURITY IN SPRAY-DRIED POWDER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Huynh Thi Thanh Hang, Phan Thị Huong Giang, Le Quang Hien, Nguyen Truong Thinh, Vo Thi Quynh Nhu, Pham Dinh Duy, Phan Van Ho Nam * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 489 – 498 *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Thiết lập Chất chuẩn và Chất đối chiếu - Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố. Hồ Chí Minh ***Khoa Hóa lý, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và mỹ phẩm tỉnh Đồng Nai Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 491 Introduction: The small particles carrying the precursor of pyrazinamide (PZA), palmitoyl pyrazinamide (PP), could overcome some PZA’s imperfection in lung-distributing system. To monitor the quality of the new material and its products, the study on establishment of reference standard synthesized PP as well as quantitative determination of palmitate pyrazinamide and determination of PZA as impurity in spray-dried powder by high performance liquid chromatography was conducted. Objectives: The aim of this study was establishment of reference standard synthesized PP as well as quantitative determination of palmitate pyrazinamide and determination of PZA as impurity in spray-dried powder by high performance liquid chromatography. Materials and Methods: Establishment of PP reference standard was carried out basing on general guidelines of ISO 35. The standard uncertainty, assigned value, and standard deviation were calculated basing on ISO 13528. Development and validation of HPLC method for analysis of PZA and PP was carried out basing on ASEAN guidelines. Results: The assigned value of PP reached the purity of 99.35%. HPLC conditions for assay of PP in spray-dried powder were HiQ sil C18HS column (250 x 4.6 mm x 5 μm); column temperature of 30 oC; wavelength of 268 nm; mobile phase containing ACN 100%; flow rate of 1mL/min; injection volume of 20 μL; this method met requirements of system suitability, repeatability, linearity and accuracy. HPLC conditions for determination of PZA impurity, in spray-dried powder were Phenomenex C18 column (250 x 4.6 mm x 5 μm); column temperature of 30 oC; wavelength of 268 nm; mobile phase containing ACN – acid acetic pH 3 (5:95); flow rate of 1mL/min; injection volume of 20 μL. This method met requirements of system suitability, selectivity and the limit of PZA detection was 0.005 ppm. Conclusion: PP can be accepted as a reference standard for quality control of PP materials and products thereof. The HPLC method for qualification of PP was successfully developed. Key words: Palmitoyl pyrazinamide, pyrazinamide, establishment of reference standard. ĐẶT VẤN ĐỀ Palmitoyl pyrazinamid (PP) được sử dụng để bào chế các dạng trị liệu tại phổi nhằm hạn chế pyrazinamid (PZA) phóng thích phóng vào hệ thống tuần hoàn, tăng nồng độ thuốc tại chỗ để duy trì hiệu quả điều trị lao phổi(5-7). Để kiểm soát chất lượng của nguyên liệu và các dạng bào chế từ hoạt chất này, cũng như theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương người trong các nghiên cứu dược động học, dược lực học tiếp theo, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu thiết lập chất đối chiếu PP đồng thời xây dựng quy trình định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy nhằm góp phần trong việc tiêu chuẩn hóa sản phẩm. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu PP đã được tổng hợp và được xác định độ tinh khiết trên 99% tính trên chế phẩm nguyên trạng theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Phương và các cộng sự(5), tại bộ môn Hóa hữu cơ – Khoa Dược – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Mẫu thuốc bột khô phun sấy PP được bào chế tại Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. Công thức: Palmitoyl pyrazinamid 0,3 g; tá dược vừa đủ 4,0 g. Chất đối chiếu Pyrazinamid có hàm lượng tính trên chế phẩm khan là 99,94%, số lô 0212154 của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 492 Hóa chất – dung môi Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng (Merck), acid acetic băng đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck), ethanol đạt tiêu chuẩn phân tích (Prolabo). Trang thiết bị Hệ thống HPLC Alliance 2695e-2996, thiết bị DSC Q20 TA Instrument, hệ thống LCMS Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization (Micromass), máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FTNMR Spectrometer (Viện hóa học và Công nghệ Việt nam). Tủ đóng ống Labconco Protector Glove Box (Viện KN thuốc TP. Hồ Chí Minh). Hệ thống HPLC Shimadzu 20 AD với đầu dò PDA SPD-M20A (Nhật Bản), cân phân tích Mettler Toledo AB 265- S, độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sĩ), cân phân tích Mettler Toledo AB 204, độ chính xác 0,01 mg (Thụy Sĩ), máy đo pH Mettler DL25 (Thụy Sĩ), Hanna- HI 2211 (Romania), bể siêu âm Nahita 626 (Tây Ban Nha). Phương pháp nghiên cứu Quá trình thiết lập chất đối chiếu PP được thực hiện theo các bước: đóng gói, đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ sau khi đóng gói theo hướng dẫn của ISO guide 35:2006(2), đánh giá kết quả định lượng liên phòng thí nghiệm tại hai phòng thí nghiệm đạt GLP, xác định giá trị công bố và độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn của ISO 13528:2005(1). Các lọ chuẩn được đánh giá tại Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường - Viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. Điều kiện sắc ký để xác định độ tinh khiết theo phương pháp qui về 100% diện tích pic là: Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), bộ phận phát hiện PDA, bước sóng phát hiện 268 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, nhiệt độ cột 30°C, pha động ACN 100%, theo nghiên cứu của Nguyễn Duy Phương và các cộng sự(6). Đồng thời cũng dựa vào điều kiện sắc ký này để tiến hành thẩm định quy trình định lượng PP trong bột khô phun sấy theo hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích(4). Quy trình xác định tạp chất PZA trong bột khô phun sấy được tham khảo từ USP41(8): Pha tĩnh: Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), detector: PDA, bước sóng phát hiện: 268 nm, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 μl, nhiệt độ cột: 30 °C, pha động: ACN – Dung dịch acid acetic pH 3 (5:95). KẾT QUẢ Thiết lập chất đối chiếu PP PP được đóng gói trong lọ thuỷ tinh nâu, nút có lớp đệm Teflon, môi trường khí trơ N2 99,99%, độ ẩm tương đối 10%, bảo quản ở nhiệt độ 2-8 oC. 5 g PP được đóng 100 lọ, mỗi lọ 50 mg và 6 lọ được lấy ngẫu nhiên theo phần mềm excel. Kết quả xác định tính tương thích hệ thống quy trình xác định độ tinh khiết PP bằng HPLC tại 2 phòng thí nghiệm đều đạt yêu cầu, các thông số sắc ký đều có RSD  2% (Bảng 1). Kết quả đánh giá độ đồng nhất quá trình đóng lọ được trình bày trong Bảng 2 cho thấy độ lặp lại tương đối của độ tinh khiết PP giữa các lọ trong quá trình đóng gói đạt yêu cầu (RSD<1%). Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định và phù hợp, các lọ đồng nhất trong quá trình đóng gói. Bảng 1: Kết quả tính tương thích hệ thống quy trình xác định độ tinh khiết PP bằng HPLC tại 2 phòng thí nghiệm Thời gian lưu (phút) S peak (μV×s) Độ tinh khiết (%) Số đĩa lý thuyết biểu kiến Hệ số kéo đuôi PTN 1 TB 11,336 6520047 99,35 2586,66 1,18 RSD % 0,02 0,04 0,02 0,15 0,44 PTN 2 TB 11,333 6516261 99,35 2573,74 1,19 RSD % 0,03 0,03 0,02 0,31 0,48 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 493 Bảng 2: Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ trong quá trình đóng ống STT Độ tinh khiết (%) Lần 1 Lần 2 1 99,39 99,35 2 99,37 99,35 3 99,30 99,35 4 99,35 99,33 5 99,35 99,32 6 99,29 99,46 7 99,35 99,37 8 99,41 99,37 9 99,37 99,37 10 99,32 99,25 TB 99,35 99,35 RSD % 0,04 0,05 Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm TT Độ tinh khiết (%) PTN 1 PTN 2 1 99,31 99,34 2 99,37 99,38 3 99,36 99,34 4 99,37 99,35 5 99,36 99,34 6 99,34 99,37 TB 99,35 99,35 RSD % 0,02 0,02 Bảng 4: Kết quả phân tích robust A của chất đối chiếu PP Chu kì 0 1 2 3 δ = 1.5s* - 0,033 0,030 0,030 x * - δ - 99,32 99,32 99,32 x * + δ - 99,39 99,38 99,38 TB 99,35 99,35 99,35 99,35 SD 0,020 0,018 0,018 0,018 x* 99,36 99,35 99,35 99,35 s* 0,022 0,020 0,020 0,020 Sử dụng phân tích ANOVA bằng phần mềm Excel 2016 để đánh giá dữ liệu trong Bảng 3, kết quả giá trị Ftn = 0,02 < F0,05 = 4,96, kết quả thu được cho thấy kết quả xác định độ tinh khiết của PP giữa 2 phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Như vậy độ tinh khiết sắc ký không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Theo hướng dẫn của ISO 13528, từ kết quả phân tích robust A của chất đối chiếu PP sau 3 chu kì (Bảng 4), giá trị s* không thay đổi. Giá trị ấn định x*= 99,35%, độ lệch chuẩn thực của giá trị ấn định s* = 0,020. Z – score của tất cả 12 giá trị đều ≤ 2, giá trị công bố được tính từ 12 giá trị. Giá trị công bố của chất đối chiếu PP có độ tinh khiết sắc ký là 99,35 % tính trên chế phẩm nguyên trạng. Độ không đảm bảo đo là 0,007 được tính theo công thức Như vậy PP đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định 99,35 % tính theo hiện trạng. Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kmm theo phiếu kiểm nghiệm. Bảo quản ở nhiệt độ 0 – 8 oC, tránh ánh sáng. Thẩm định quy trình phân tích định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong bột phun sấy khô Quy trình định lượng và thử giới hạn tạp chất được thẩm định với các chỉ tiêu: Tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD, độ đúng và độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ASEAN (Bảng 5). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 494 A. Sắc ký đồ mẫu trắng D. Sắc ký đồ mẫu thử B. Sắc ký đồ mẫu placebo E. Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn C. Sắc ký đồ mẫu chuẩn F. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C), mẫu thử (D), mẫu placebo thêm chuẩn (E) và mẫu thử thêm chuẩn (F), khi tiến hành thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng PP trong bột khô sấy phun. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 495 A. Phổ UV-Vis của pic PP trong mẫu chuẩn B. Phổ UV-Vis của pic PP trong mẫu thử C. Tính tinh khiết pic của mẫu chuẩn D. Tính tinh khiết pic của mẫu thử Hình 2: Phổ UV-Vis của pic PP trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (A) và mẫu thử (B), và kết quả tính tinh khiết pic của mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D) được tính bằng phần mềm của hệ thống HPLC khi thẩm định tính đặc hiệu của quy trình định lượng PP trong bột khô sấy phun. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 496 A. Sắc ký đồ mẫu trắng C. Sắc ký đồ mẫu chuẩn B. Sắc ký đồ mẫu placebo D. Sắc ký đồ mẫu thử E. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn Hình 3: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C), mẫu thử (D), và mẫu thử thêm chuẩn (E), khi tiến hành thẩm định tính đặc hiệu của quy trình xác định tạp PZA trong bột khô sấy phun PP. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 497 A. Phổ UV của mẫu chuẩn B. Phổ UV của mẫu thử C. Tinh khiết pic mẫu chuẩn D. Tinh khiết pic mẫu thử Hình 4: Phổ UV-Vis của pic PP trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (A) và mẫu thử (B), và kết quả tính tinh khiết pic của mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (D) được tính bằng phần mềm của hệ thống HPLC khi thử tính đặc hiệu của quy trình định lượng PP trong bột khô sấy phun. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 498 Bảng 5: Kết quả thẩm định quy trình định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy CHỈ TIÊU YỀU CẦU QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PP QUY TRÌNH THỬ GIỚI HẠN TẠP CHẤT PZA Tính phù hợp hệ thống RSD của thời gian lưu và diện tích pic của pic chính cần phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu thử đều ≤ 2%; hệ số kéo đuôi (T) nằm trong khoảng 0,8-1,5; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) ≥ 2000. RSDtR= 0,05%; RSDSpic= 0,12%; T= 1,30; Nbk= 3211 3211 RSDtR= 0,06%; RSDSpic= 0,3%; T= 1,25; Nbk= 9670 Độ đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với mẫu chuẩn và được chứng minh không bị ảnh hưởng bởi tá dược bằng thời gian lưu và tính năng kiểm tra độ tinh khiết pic của phần mềm. Phổ UV-vis của pic trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau. Đạt (sắc ký đồ minh họa ở Hình 1, Hình 2) Đạt (sắc ký đồ minh họa ở Hình 3, Hình 4) Khoảng tuyến tính Sử dụng phân tích hồi quy với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy. R 2 ≥ 0,998 Phương trình tương quan hồi quy: ŷ = 29161x; R 2 = 0,9995. Khoảng tuyến tính của PP là: 0,6 – 150,0 µg/mL - Độ đúng Độ hồi phục trong khoảng ở 3 mức 80, 100, 120% là 98-102% RSD ≤ 2%. Tỉ lệ phục hồi là 98,54%; RSD= 1,27% 1,27 - Độ chính xác - Độ lặp lại RSD ≤ 2% Hàm lượng PP trong mẫu thử là 8,16%. RSD= 0,32%. Độ chính xác trung gian Các kết quả thu được không được khác nhau có ý nghĩa thống kê (sử dụng F-test với khoảng tin cậy 95% để kiểm tra) RSD ≤ 2% Hàm lượng PP trong mẫu thử là 8,17%; RSD= 0,41% LOD Xác định nồng độ tối thiểu mà tại đó có thể đọc được đáp ứng của chất phân tích - 0,005 ppm BÀN LUẬN Vì PP và PZA có độ phân cực hoàn toàn ngược nhau, logP của PP và PZA lần lượt là 4,39(6) và -0,06(3), trên thực tế PP hoàn toàn không tan trong pha động ACN – Dung dịch acid acetic pH 3 (5:95), còn PZA thì hoàn toàn không bị lưu giữ khi sử dụng pha động ACN – CH3COOH 1% (95:5) (Hình 5). Do vậy quy trình phân tích được xây dựng để xác định PP hoàn toàn không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của PZA và ngược lại. Việc sử dụng ACN 100% làm pha động trong quy trình phân tích PP được cân nhắc giữa lợi ích và nguy cơ, đảm bảo có thể áp dụng trên thực tiễn. Bao gồm thời gian phân tích là rút ngắn còn 10 phút khi sử dụng ACN 100% so với 30 phút khi sử dụng hệ dung môi ACN – CH3COOH 1% (95:5) (Hình 5) và quá trình giảm số đĩa lý thuyết biểu kiến khoảng 5% sau 50 lần tiêm mẫu. Hình 5: Sắc ký đồ của hỗn hợp gồm PP (30 ppm) và PZA (ppm) trong ACN, khi tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký của quy trình định lượng PP trong bột sấy phun sử dụng pha động ACN – CH3COOH 1% (95:5). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 499 KẾT LUẬN PP đã được thiết lập chất đối chiếu với độ tinh khiết 99,35 % tính trên chế phẩm nguyên trạng độ không đảm bảo đo 0,007, độ lệch chuẩn 0,020 (n=12), đạt yêu cầu của một chất chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng nguyên liệu PP và chế phẩm. Quy trình định lượng PP và quy trình xác định giới hạn tạp chất PZA trong chế phẩm bột khô phun sấy bằng HPLC đã được thẩm định và đã đạt các yêu cầu theo hướng dẫn của ASEAN. Có thể ứng dụng quy trình định lượng PP và thử giới hạn tạp chất PZA vào việc tiêu chuẩn hóa hệ thống phân phối thuốc đến phổi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ISO 13528:2005, (2005). Statisticamle thods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, p.64. 2. ISO Guide 35:2006, (2006). Reference materials — General and statistical principles, pp.48. 3. National Center for Biotechnology Information, PubChem Compound Database, (2005). Pyrazinamide [online]. [cited May 23, 2005]. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1046. 4. NCL ASEAN Experts, (2012). Asean guidline for validation of analytical procedures, pp.1-17. 5. Nguyễn Duy Phương, Phạm Đình Duy, Phạm Ngọc Tuấn Anh (2018). Nghiên cứu tổng hợp Palmitoyl Pyrazinamid. Chuyên đề Dược, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, phụ bản 22(2): tr.13-17. 6. Nguyễn Duy Phương, Phạm Đình Duy, Phan Văn Hồ Nam (2018). Xây dựng quy trình định lượng Palmitoyl pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố log P của Palmitoyl pyrazinamid. Chuyên đề Dược, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, phụ bản22(2): tr.197-203. 7. Pham DD, Grégoire N, Couet W, Gueutin C, Fattal E, Tsapis N (2015). Pulmonary delivery of pyrazinamide- loaded large porous particles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 94: pp.241-250. 8. United States Pharmacopeial Convention, (2018). Pyrazinamide [online]. [cited May 25, 2018]. Available from: Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019