Tạo chồi in vitro lan đuôi chồn rhynchostylis retusa

Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP 73 TẠO CHỒI IN VITRO LAN ĐUÔI CHỒN Rhynchostylis retusa Hà Thị Tâm Tiến1, Nguyễn Phương Quý2, Ngô Thị Thu Thủy2, Vũ Xuân Dương1, Lê Thị Mận1 1PTN Công nghệ sinh học - Khoa Nông Lâm Ngư 2Lớp K9 ĐH Sư phạm sinh - Khoa Khoa học Tự nhiên TÓM TẮT Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tạo chồi in vitro lan Đuôi chồn. Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 8 đến 10 tháng tuổi. Phương pháp khử trùng kép bằng NaOCl 2,5% trong thời gian 5 phút lần 1 và 10 phút lần 2 thích htợp nhất đối với quả lan đuôi chồn, hiệu quả khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22%, không độc hại với con người và môi trường. Môi trường phát sinh chồi từ protocorm tốt nhất gồm: MS + 20 g sucrose + 100 ml nước dừa + 100 g khoai tây + 0,5 g than hoạt tính + 7 g agar + 0,5 mg BAP/l đạt 2,6 chồi/protocorm, chồi khỏe mạnh, hình thái bình thường, màu xanh cân đối. Từ khóa: Hạt lan, khử trùng, protocorm, Rhynchostylis retusa, tạo chồi. 1. Mở đầu Lan đuôi chồn Rhynchostylis retusa là loài lan rừng được người chơi lan rất ưa chuộng vì hoa đẹp và hương thơm. Lan đuôi chồn có thân ngắn, lá cứng, dài, xếp khít từ phần gốc. Lá có hình chữ V, rộng khoảng 2 cm - 3 cm. Đầu lá chia hai thuỳ, nhìn kỹ có gân chạy dọc trên mặt lá, lá xếp khép lại như lòng thuyền. Hoa nở thành chuỗi với nhiều hoa xếp khít nhau, hoa có màu trắng đốm tím, mùi thơm nhẹ, thường ra hoa khoảng tháng 4. Ở vườn Quốc gia Xuân Sơn, lan đuôi chồn sống bám trên những thân cây to. Hiện nay tại Việt Nam các loại lan rừng bị khai thác quá mức, đang có nguy cơ cạn kiệt. Trong tự nhiên, hạt lan phát triển rất kém ngay cả khi đã chín, chúng phụ thuộc vào sự nhiễm nấm để nảy mầm và phát triển. Phương pháp nuôi cấy không cộng sinh được phát triển sau nghiên cứu của Knudson (1922) [1], hạt lan có thể nảy mầm trong môi trường muối khoáng đơn giản có chứa đường. Tiếp sau đó, đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng hạt các loài lan khác nhau. Hạt lan Rhynchostylis retusa còn non tạo mô sẹo tốt trong môi trường Vacin and Went (VW) bổ sung 15% nước dừa và phát sinh protocorm trong môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung 1 mg/l BA, 1 mg/l NAA và 15% nước dừa [3] . Hạt lan Kim điệp (Dendrobium chrysotosum) 3 tháng tuổi được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút cho khả năng nảy mầm và phát sinh protocorm tốt [4]. Hạt đang phát triển lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum) 3 tháng tuổi, nảy mầm và phát sinh protocorm tốt nhất trong môi trường MS + 100 ml nước dừa + 10g saccharose + 6g agar/l [5]. Ngoài việc nhân giống bằng hạt, Lang và cộng sự đã tạo cây con thành công bằng sử dụng các đoạn lá và đầu rễ cây Vanda coerulea trong môi trường 1/4MS có bổ sung 0,3 mg/l TDZ và 5 mg/l 2,4D [2]. Để chủ động nguồn cây giống chất lượng cao, sạch bệnh phục vụ cho công tác bảo tồn các giống lan có giá trị tại Vườn Quốc gia Xuân Sơn Phú Thọ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về các loại hóa chất khử trùng, phương pháp khử trùng mẫu để tạo vật liệu khởi đầu sạch và tìm ra môi trường thích hợp nhất để nhân giống tạo chồi cho hạt lan đuôi chồn. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu Quả lan đuôi chồn độ tuổi 8 đến 10 tháng được thu hái tự nhiên từ những cây lan khỏe mạnh tại Vườn Quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ. Hạt được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khử trùng mẫu cấy Quả lan đuôi chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa sạch bằng dung dịch xà phòng 5% và KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 201574 rửa sạch bằng nước cất nhiều lần trước khi tiến hành khử trùng trong box cấy. Mẫu quả được xử lý bằng cồn 70% trong 1 phút sau đó khử trùng bề mặt bằng các loại hóa chất khử trùng HgCl2 (nồng độ 0,01%, 0,05% và 0,1%), H2O2 (nồng độ 1%, 5% và 10%) và NaOCl (nồng độ 1%, 2,5% và 5%) trong thời gian 15 phút đối với khử trùng đơn và 5 phút lần 1, 10 phút lần 2 đối với khử trùng kép. Cuối cùng quả được rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng. 2.2.2. Nảy mầm và phát sinh protocorm Hạt lan thu từ quả đã khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) có 7 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 10% nước dừa, 100 g/l khoai tây và 0,5g/l than hoạt tính. 2.2.3. Phát sinh chồi từ protocorm Các protocorm được cấy lên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm 7g/l agar, 20 g/l sucrose, 100 g/l khoai tây, 10% nước dừa, 0,5 g/l than hoạt tính và BAP với các nồng độ 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l benzylamino purine (BAP) để thăm dò khả năng hình thành chồi. Các thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi công thức bố trí 10 bình tam giác dung tích 250 ml. Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTART 5.0. 3. Kết quả 3.1. Sự nảy mầm phát sinh protocorm Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất và nồng độ hóa chất theo phương pháp khử trùng đơn đến mẫu cấy Công thức Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT1 (ĐC) 0,00 100 0,00 CT2 (HgCl2 0,01%) 21,11 65,56 13,33 CT3 (HgCl2 0,05%) 52,22 41,11 6,67 CT4 (HgCl2 0,1%) 92,22 7,78 0,00 CT5 (H2O2 1%) 7,78 92,22 0,00 CT6 (H2O2 5%) 31,11 62,22 6,67 CT7 (H2O2 10%) 37,78 52,22 10,00 CT8 (NaOCl 1%) 24,44 65,56 10,00 CT9 (NaOCl 2,5%) 71,11 28,89 0,00 CT10 (NaOCl 5%) 75,56 21,11 3,33 LSD0,05 0,93 CV% 4,4 Các hạt lan ban đầu có màu trắng được nuôi cấy in vitro sau 2 tuần đã chuyển sang màu nâu vàng và bắt đầu trương lên. Sau 4 đến 5 tuần hạt tiếp tục trương lên có hình cầu màu xanh nhạt, bóng, sau đó chuyển sang màu xanh đậm, mọng nước. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 1. Số liệu bảng 1 cho thấy, mỗi loại hóa chất khử trùng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến mẫu cấy. Quả lan được khử trùng bằng HgCl2 0,1%, NaOCl 2,5% và NaOCl 5% có tác dụng rõ rệt đối với sự nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt so với đối chứng. Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất, với tỷ lệ mẫu sống đạt 92,22%. Tiếp đó khử trùng bằng NaOCl 2,5% và 5% tỷ lệ mẫu sống đạt 71,11% và 75,56%. Cùng chất khử trùng nhưng ở nồng độ nhỏ hơn hiệu quả khử trùng sẽ kém hơn như khử trùng bằng HgCl2 0,05% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 52,22%, tỷ lệ mẫu nhiễm lên đến 41,11%; dùng HgCl2 0,01% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 21,11% trong khi đó tỷ lệ mẫu nhiễm tăng rõ rệt lên đến 65,56%; dùng NaOCl 1% tỷ lệ mẫu nhiễm là 65,56%. Khử trùng bằng H2O2 hiệu quả khử trùng kém nhất, nồng độ H2O2 khử trùng càng thấp hiệu quả khử trùng càng kém. H2O2 10% có tỷ lệ mẫu sống đạt 37,78%; H2O2 5% có tỷ lệ mẫu sống 31,11% trong khi dùng H2O2 1% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 7,78%. Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015 KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP 75 Bảng 2. Ảnh hưởng của hóa chất và nồng độ hóa chất theo phương pháp khử trùng kép đến mẫu cấy Công thức Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT11 (ĐC) 0,00 100 0,00 CT12 (HgCl2 0,01%) 11,11 82,22 6,67 CT13 (HgCl2 0,05%) 47,78 52,22 0,00 CT14 (HgCl2 0,1%) 98,89 1,11 0,00 CT15 (H2O2 1%) 0,00 100 0.00 CT16 (H2O2 5%) 5,56 87,77 6,67 CT17 (H2O2 10%) 32,22 61,11 6,67 CT18 (NaOCl 1%) 12,22 77,78 10,00 CT19 (NaOCl 2,5%) 82,22 14,45 3,33 CT20 (NaOCl 5%) 74,44 5,56 20,00 LSD0,05 0,88 CV% 4,7 Tương tự phương pháp khử trùng đơn, các hạt lan ban đầu có màu trắng được nuôi cấy in vitro sau 2 tuần đã chuyển sang màu nâu vàng. Sau 4 - 5 tuần hạt tiếp tục trương lên có hình cầu màu xanh nhạt sau đó chuyển sang màu xanh đậm, mọng nước. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 2. Số liệu bảng 2 cho thấy, khử trùng quả lan bằng HgCl2 0,1% đạt kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống đạt 98,89%, tiếp đó khử trùng bằng NaOCl 2,5% tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22%; dùng NaOCl 5% cho tỷ lệ mẫu sống đạt 74,44%. Các công thức khử trùng còn lại cho tỷ lệ mẫu sống đạt thấp. Khử trùng bằng H2O2 cho hiệu quả khử trùng thấp nhất số mẫu bị nhiễm nhiều tỷ lệ mẫu nhiễm từ 90 - 100%. Như vậy, khử trùng bằng HgCl2 cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tuy nhiên thủy ngân clorua rất độc với con người và môi trường nếu không được xử lý đúng tiêu chuẩn. Vì vậy, chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp khử trùng quả lan bằng NaOCl 2,5% có hiệu quả khử trùng khá cao, an toàn với người sử dụng. Các mẫu sống thu được ở cả hai phương pháp khử trùng đơn và khử trùng kép có hình thái giống nhau. Protocorm dạng hình cầu, màu xanh đậm, mọng nước (Hình 1) (a) (b) Hình 1. Protocorm phát sinh từ hạt lan Đuôi chồn Rhynchostylis retusa Khử trùng bằng HgCl2 0,1%; (b) Khử trùng bằng NaOCl 2,5% 3.2. Sự phát sinh chồi Kết quả phát sinh chồi từ protocorm sau 8 tuần nuôi cấy (Hình 2) cho thấy, nồng độ BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh chồi. Trên môi trường có 0,5 mg/l BAP cho số chồi/ protocorm cao nhất đạt 2,6 chồi/ protocorm, số protocorm bị chết rất ít. Các chồi phát triển trên môi trường có 0,5 mg/l BAP sinh trưởng mạnh nhất chồi to khỏe, màu xanh cân đối. Chồi phát sinh trên môi trường có 1,0 và 1,5 mg/l BAP cho số chồi /protocorm đạt 2,2 đến 2,3 chồi/protocorm, tuy nhiên chồi phát triển kém hơn bé hơn so với môi trường có 0,5 mg/l BAP và ngoài sự phát sinh chồi một số protocorm còn phát sinh mô sẹo. Môi trường đối chứng không bổ sung BAP cho số chồi/protocorm đạt 2,2 chồi/protocorm, các chồi có màu xanh cân đối nhưng nhỏ, số protocorm chết nhiều. KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 201576 (a) (b) Hình 2. Chồi hoa lan Đuôi chồn Rhynchostylis retusa phát sinh từ protocorm Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP; (b) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l BAP Kết luận Phương pháp khử trùng kép bằng NaOCl 2,5% trong thời gian 5 phút lần 1 và 10 phút lần 2 đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22%, không độc hại với con người và môi trường. Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút và 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt, tỷ lệ mẫu sống cao đạt 92,22% và 98,89%. Tuy nhiên HgCl2 độc hại với con người và môi trường. Môi trường phát sinh chồi từ protocorm tốt nhất gồm: MS + 20 g sucrose + 100 ml nước dừa + 100 g khoai tây + 0,5 g than hoạt tính + 7 g agar + 0,5 mg BAP/l đạt 2,6 chồi/protocorm, chồi khỏe mạnh, hình thái bình thường, màu xanh cân đối. Tài liệu tham khảo 1. Goh CJ, Ammirato PV, Evans DR, Sharp WR, Bajaj YPS (1990), “Orchids, Monopodials. In: Handbook of Plant cell cuture”, McGraw-Hill, New York, vol 5, pp. 598-633. 2. Lang NT, Hang NT (2006), “Using biotechnological approaches for Vanda orchid improvement”, Omonrice, 14, pp. 140-143. 3. Parab GV, Krishnan S (2012), “Rapid in vitro mass multiplication of orchids Aerides maculosa Lindl. and Rhynchostylis retusa (L.) Bl. from immature seed”, Indian Journal of Biotechnology, Vol 11, pp. 288-294. 4. Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 64, tr. 127-136. 5. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Hoàng Thảo Long Nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tập 10, số 2, tr. 263-271. SUMMARY IN VITRO SHOOT REGENERATION OF RHYNCHOSTYLIS RETUSA Ha Thi Tam Tien1, Nguyen Phuong Quy2, Ngo Thi Thu Thuy2, Vu Xuan Duong1, Le Thi Man1 1Section for Biotechnology Experiments - Faculty of Agro-forestry and Aquaculture 2K9-Graduate course in Biology Pedagogy - Faculty of Natural Sciences We carried out in vitro shoot regeneration of Rhynchostylis retusa. The seeds from 8 to 10 months old were used for propagation. The two-time sterilization treatment by 2.5% NaOCl for 5 minutes and 10 minutes was much appropriated for fruit of Rhynchostylis retusa with the best sterilization efficiency, alive protocorm rate being 82.22%, and non-toxic to humans and environment. The best shoot formation medium included MS + 20 g of sucrose + 100 ml of coconut milk + 100 g of potato + 0.5 g of activated charcoal + 7 g of agar + 0.5 mg of BAP/l . The rate of shoot induction on this medium attained 2.6 shoots per protocorm. The formed shoots were strong, green and normal in morphology. Keywords: orchid seeds, sterilization, protocorm, Rhynchostylis retusa, shoot regeneration.