Tách dòng, phân tích trình tự đoạn gen mã hóa độc tố apx ia từ actinobacillus pleuropneumoniae

Hoàng Thị Huyền Trang và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 176 - 180 177 TÁCH DÒNG, PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APX IA TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE Hoàng Thị Huyền Trang1, Nguyễn Thị Thu Ngà2, Dương Văn Cường1, Phạm Bằng Phương3 1Viện Khoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên, 2Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên, 3Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT ApxIA là đoạn gen mã hóa protein quy định cấu trúc ngoại độc tố ApxIA gây ra bệnh viêm màng phổi ở lợn. Nghiên cứu này đã tiến hành tách dòng và xác định trình tự đoạn gen ApxIA từ A.pleuropneumoniae. Kết quả cho thấy, đoạn gen được phân lập và có kích thước 801 bp mã hóa cho 120 amino acid vùng peptidase_M10_C và 147 amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain của protein ApxIA. Khi so sánh với trình tự gen ApxIA (mã số GQ369732.1) trên Genbank cho thấy trình tự đoạn gen ApxIA từ A pleuropneumoniae phân lập được có ba vị trí nucleotide sai khác so với gen ApxIA (mã số GQ369732.1). Tuy nhiên, sự sai khác này không ảnh hưởng đến trình tự amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain. Plasmid mang đoạn gen ApxIA được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về thiết kế vector biểu hiện và tinh sạch protein ApxIA. Từ khóa: Actinobacillus pleuropneumoniae, gen ApxIA, ngoại độc tố, protein ApxIA ,viêm màng phổi MỞ ĐẦU* Viêm màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae gây ra là một bệnh truyền nhiễm, có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của đàn lợn [4]. Bệnh này được đặc trưng bởi thương tích xuất huyết, tơ huyết, hoại tử phổi dẫn đến tử vong cao ở những con lợn bị nhiễm nặng hoặc những tổn thương phổi nhỏ cục bộ ở những lợn bị bệnh mạn tính. Cho đến nay, 15 kiểu huyết thanh của A. pleuropneumoniae đã được mô tả dựa trên sự khác nhau của vỏ polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào, tất cả các serotype đều có khả năng gây bệnh, tuy nhiên mức độ biểu hiện độc tính khác nhau [3]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các kiểu huyết thanh A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn này. Độc tố Apx của A. pleuropneumoniae được xếp vào nhóm RTX-toxin, bao gồm bốn loại protein ApxI, ApxII, ApxIII và Apx IV [5]. Trong đó, các chủng sản sinh ra độc tố ApxI thường có độc lực cao. ApxI là một protein có trọng lượng phân tử từ 105 -110 kDa, có * Tel: 01652 030019, Email: tranghoanghuyendhsptn@gmail.com độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính. Trước đây, ApxI được đặt tên là haemolysin I (HlyI) hay cytolysin I (ClyI) [6]. ApxI được tiết ra bởi A. pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10; 11; 14 [2]. Operon mã hóa cho ApxI được xác định là gen apxI gồm 4 cistron được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB, và apxID, trong đó C là gen hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố, B và D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự tiết độc tố qua cả hai màng [4]. Theo Inzana và đồng tác giả (1991) [1], A. pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5. Đồng thời chủng A. pleuropneumoniae này được dùng làm giống gốc sản xuất vaccine và cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5. Hoàng Thị Huyền Trang và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 176 - 180 178 Shin Min-Kyoung và đồng tác giả (2011) [7] đã chứng minh được tính kháng nguyên của vùng RTX C-terminal domain thuộc ApxIA trên 320 lợn thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, đoạn gen ApxIA mã hóa vùng RTX C-terminal domain thuộc ApxIA được tách dòng và xác định trình tự với mục đích tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho việc tạo vaccine đa giá thể phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Mẫu A. pleuropneumoniae serotype 5 do Công ty cổ phần thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet cung cấp. Các hóa chất chính được sử dụng gồm: GenJET Genomic DNA Purfication Kit của Thermo, pGEM®-T Easy Vector system II của Promega, GeneJET Plasmid miniprep Kit của Thermo. Phương pháp nghiên cứu Dựa trên trình tự gene ApxIA được công bố trên Genbank (mã số GQ369732.1). Cặp mồi đặc hiệu để phân lập đoạn gene ApxIA (có kích thước dự đoán 801 bp) được thiết kế và bổ sung thêm điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI, HindIII. ApxIAF:5’GCGGATCCGGAGACGACGG TAATGATGTA3’ ApxIAR:5’GCAAGCTTTTAAGCAGATTG TGTTAAATAATTACT 3’ Tách chiết DNA tổng số từ A. pleuropneumoniae serotype 5 theo hướng dẫn của GenJET Genomic DNA Purfication kit. Gen ApxIA được phân lập từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có chu trình như sau: 94ºC/3 phút; 30 chu kì: 94ºC/30 giây, 55ºC/30 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: Buffer -7,5 μl, dNTPs – 0,3 μl, mồi xuôi (10 pmol/μl) - 0,5 μl, mồi ngược (10 pmol/μl) - 0,5 μl, DNA khuôn - 0,5 μl, dH2O - 5,7 μl.Tổng thể tích 15 μl. Đoạn gene ApxIA sau khi phân lập được gắn vào vector tách dòng pGEM. Sản phẩm tách dòng được biến nạp vào vi khuẩn E.coli JM109. Plasmid có chứa gene ApxIA tách chiết từ các khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường kháng sinh chọn lọc. Trình tự gen được xác định trên máy ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem). Phân tích trình tự gen bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách dòng đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA Kết quả phân lập đoạn gen ApxIA bằng kỹ thuật PCR thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1 kb, tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết. Sản phẩm PCR thu được là một băng đặc hiệu, vì vậy được tinh sạch trực tiếp và sử dụng để tách dòng gen. Hình 1. Kết quả nhân gen ApxIA từ A. pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 (M: Thang DNA chuẩn 1 kb) Đoạn gen ApxIA sau tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pGEM – 3015 bp. Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào vi khuẩn E. coli JM109. Khuẩn lạc chứa plamid mang gen ApxIA được chọn lọc trên môi trường LB chứa kháng sinh ampicilin, cơ chất X-Gal và chất cảm ứng IPTG. Các khuẩn lạc trắng mang vector được nuôi tăng sinh và tách chiết plasmid. Vector tách dòng pGEM-ApxIA được cắt bằng hai loại enzyme hạn chế là BamHI và HindIII cho hai phân đoạn DNA có kích cỡ khoảng 3 kb và xấp xỉ 0,9 kb (Hình 2). Trong đó, phân đoạn DNA xấp xỉ 0,9 kb M 1 kb ~ 0,9 kb 0,75 kb Hoàng Thị Huyền Trang và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 176 - 180 179 chính là đoạn gen đích (ApxIA) cần thu nhận. Sản phẩm cắt hạn chế có kích thước khoảng xấp xỉ 0,9 kb (Hình 2) được thôi gel để thu nhận gen ApxIA phục vụ cho phân tích trình tự gen ApxIA và thiết kế vector biểu hiện. Hình 2. Kết quả cắt vector pGEM- ApxIA bằng enzyme BamHI và HindIII (M: Thang DNA chuẩn 1 kb) Phân tích trình tự gen ApxIA Gen ApxIA (GQ369732.1) dài 3066 bp, mã hóa cho 1022 amino acid. Từ vị trí amino acid 8 đến 652 tạo nên vùng RTX N-terminal domain, từ acid amin 729 đến 845 là vùng gắn Ca2+ (Ca2+-binding protein), từ amino acid 739 đến 749 là vùng peptidase_M10_C, từ amino acid 874 đến 1020 là vùng RTX C- terminal domain [2]. Đoạn gen ApxIA của A. pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 tách dòng được có kích thước 801 bp. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ApxIA tách dòng được và ApxIA (GQ369732.1) bằng chương trình BLAST trên NCBI cho thấy mức độ tương đồng giữa 2 gen là 99%. Sự tương đồng giữa 2 gen bắt đầu từ vị trí nucleotide tương ứng với vị trí nucleotide 2288 đến 3069 bp của gen ApxIA có mã số GQ369732.1 (Hình 3). Trình tự acid amin suy diễn của đoạn gen trên mã hóa cho 267 amino acid, tương ứng từ vị trí amino acid 756 đến 1022 của protein ApxIA do gen ApxIA (GQ369732.1) mã hóa. Phân tích trình tự nucleotide tương đồng giữa 2 gen cho thấy, có 3 vị trí sai khác được thể hiện trong bảng 1. Sự sai khác nucleotide ở vị trí nucleotide 2318 trên gen ApxIA (GQ369732.1) không dẫn đến sự thay đổi amino aicd, sự sai khác ở vị trí nucleotide 2321 và 2322 dẫn đến sự thay đổi amino acid Gln thành Pro. Tuy nhiên amino acid bị thay đổi là amino acid 774 không nằm trong vùng RTX C-terminal domain. Hình 3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide ApxIA của A. pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên Genbank Bảng 1. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide (Nu) của gen ApxIA của A. pleuropneumoniae serotype 5 và ApxIA (GQ369732.1) S T T Vị trí Nu Nu ApxI A Nu GQ3697 32.1 Amino acid tạo thành Amino acid bị thay đổi 1 2318 C T Glu Glu 2 2321 G T Pro Gln 3 2322 A T Như vậy, đoạn gen phân lập được có thể mã hóa 120 amino acid thuộc vùng peptidase_M10_C và trọn vẹn 147 amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain của protein ApxIA, đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3 kb 1 kb M Hoàng Thị Huyền Trang và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 180(04): 176 - 180 180 KẾT LUẬN Phân lập được đoạn gen ApxIA từ Actinobacillus pleuropneumoniae có kích thước 801 bp mã hóa cho 120 amino acid vùng peptidase_M10_C và 147 amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain của protein ApxIA. Plasmidmang gen ApxIA được sử dụng để thiết kế vector biểu hiện mang đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Inzana T. J., Todd J., Ma J., & Veit H. (1991), “Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection”, Microbial pathogenesis, 10(4), pp. 281-296. 2. Lee Ki-Eun, Hwan W. C., Ha H. K., Jae Y. S., Dong K. Y. (2015), "Prevalence and characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from Korean pigs", Journal of Bacteriology and Virology, 45(1), pp. 19-25. 3. Moon J. Y., Kang J. Y., Seo J. W., Kim W. K., Choi Y. H., Choi M. S., Hur J. (2017), “Efficacy Evaluation of Combination Vaccine of Recombinant C-Terminal Fragments of ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA in Piglets”, Sains Malaysiana, 146(2), pp. 217-221. 4. Ramjeet M., Deslandes V., Gouré J., & Jacques M. (2008), “Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines: from bacterins to new insights into vaccination strategies”, Animal Health Research Reviews, 9(1), pp. 25-45. 5. Sadilkova L., Nepereny J., Vrzal V., Sebo P., Osicka R. (2012), “Type IV fimbrial subunit protein ApfA contributes to protection against porcine pleuropneumonia”, Veterinary research, 43, pp. 2. 6. Shin M. K., Kang M. L., Cha S. B., Lee W. J., Sung J. H., & Yoo H. S. (2011), “An immunosorbent assay based on the recombinant ApxIa, ApxIIa, and ApxIIIa toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae and its application to field sera”, Journal of veterinary diagnostic investigation, 23(4), pp. 736-742. SUMMARY CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF GENE CODING FOR APXIA EXOTOXIN IN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE Hoang Thi Huyen Trang 1* , Nguyen Thi Thu Nga 2 , Duong Van Cuong 1 , Pham Bang Puong 3 1TNU - Institute of Life Sciences, 2TNU - University of Education, 3TNU - University of Agriculture and Forestry ApxIA is a gene coding for the structural regulation of ApxIA exotoxin that causes pleurisy in pigs. This study conducted the isolation and sequencing of the ApxIA gene from Actinobacillus pleuropneumoniae. Results showed that the gene was isolated and 801 bp encoded for 120 amino acid tin the peptidase_M10_C and 147 amino acids in the RTX C-terminal domain of the ApxIA protein. When compared to the ApxIA gene sequence (code GQ369732.1) on Genbank, the ApxIA gene sequence from Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from three different nucleotide positions was different from the ApxIA gene (GQ369732.1). However, this difference does not affect the amino acid sequence of the RTX C-terminal domain. Plasmid carrying the ApxIA gene are used as the basis for further studies on the expression vector design and purification of the ApxIA protein. Keywords: Actinobacillus pleuropneumoniae, ApxIA gene, Apx IA protein, exotoxin, porcine pleuropneumoniae Ngày nhận bài: 06/3/2018; Ngày phản biện: 18/4/2018; Ngày duyệt đăng: 27/4/2018 * Tel: 01652 030019, Email: tranghoanghuyendhsptn@gmail.com