Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex Real Time Pcr

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Chuyên Đề Nội Khoa 66 TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG PHÁT HIỆN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR Lý Khánh Vân*, Lý Văn Xuân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Do các hạn chế khó có thể vượt qua được hiện nay trong kỹ thuật nuôi cấy truyền thống các mẫu đàm nên hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào tại Việt Nam xác định đầy đủ tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị. Chính vì vậy việc áp dụng kỹ thuật multiplex real-time PCR để tìm hiểu các tác nhân vi khuẩn thật sự gây bệnh là cần thiết. Mục tiêu: Xác định các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn truyền thống và kỹ thuật multiplex real-time PCR, qua đó phân tích các kết quả thu nhận được. Đối tượng và phương pháp: Đây là nghiên cứu đa trung tâm thực hiện trên đối tượng là các bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị. Phương pháp nghiên cứu là sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật multiplex real-time PCR để phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh hiện diện trong mẫu đàm hay dịch rửa khí phế quản lấy từ bệnh nhân sau khi đánh giá mức độ rất tin cậy theo thang điểm Barlett. Kết quả: Có tất cả 271 bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng được đưa vào nghiên cứu. Kết quả multiplex real-time PCR cho thấy có đến 67,5% trường hợp được phát hiện là tác nhân vi khuẩn gây bệnh với S. pneumoniae và H. influenzae là có tỷ lệ cao nhất (23,6% và 15,5%), kế đến đó là K. pneumoniae (5,5%), A. baumannii (6,3%), E. coli (4,4%) và P. aeruginosa (3,0%). Ngoài ra còn có các tác nhân khác được phát hiện với tỷ lệ thấp hơn. Kết quả nuôi cấy không kể trường hợp nhóm S. viridans thì tỷ lệ phát hiện được tác nhân vi khuẩn gây bệnh là 44,3%, thấp hơn phương pháp multiplex real-time PCR, trong đó cao nhất là K. pneumoniae (12,2%), P. aeruginosa (9,6%), A. baumannii (7,7%) và E. coli (5,2%); không có trường hợp nào phân lập được S. pneumoniae, H. influenzae và các vi khuẩn không điển hình. Kết luận: Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR cao hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống (67,5% so với 44,3%), trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae (23,6%), kế đến là H. influenzae (15,5%), A. baumannii (6,3%) và K. pneumoniae (5,5%) trong khi vi khuẩn phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống chiếm tỷ lệ cao nhất là K. pneumoniae (15,8%), kế đến là P. aeruginosa (7,6%), A. baumannii (7,6%), E. coli (6,9%) và không có trường hợp nào phát hiện S. pneumoniae (23.6%) và H. influenza. Từ khóa: tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi cộng đồng; kỹ thuật multiplex real-time PCR ABSTRACT BACTERIA CAUSING HOSPITALIZED COMMUNITY ACQUIRED PNEUMONIA DETECTED BY MULTIPLEX REAL TIME PCR Ly Khanh Van, Ly Van Xuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 1- 2019: 66-74 Backgrounds: Today, due to the limitations that are difficult to overcome in the culture of the sputum, almost no study in Vietnam has shown all bacteria that causes the hospitalized community-acquired pneumonia. Therefore, the use of multiplex real-time PCR is essential to help in breaking these limitations down. * Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS. Lý Văn Xuân ĐT: 0908588547 Email : [email protected] Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 67 Objectives: Define community-acquired pneumonia bacteria by both traditional bacterial cultures and multiplex real-time PCR methods. Methods: This is a multicenter study conducted on the hospitalized patients with community-acquired pneumonia. The method of the study was to use the traditional bacterial culture and multiplex real-time PCR to detect bacterial pathogens presented in the sputum or bronchial lavage fluid taken from patients immediately after delivery to the study. Results: A total of 271 patients with community-acquired pneumonia (CAP) was included in the study. Multiplex real-time PCR results showed that up to 67.5% of the cases were found the bacterial pathogens in which S. pneumoniae and H. influenzae were at the high rates (23.6% and 15.5%), followed by K. pneumoniae (5.5%), A. baumannii (6.3%), E. coli (4.4%) and P. aeruginosa (3.0%), The others were also detected with the lower rates. About the culture results, regardless of the group of the S. viridans, the detection rate of pathogens was 44.3%, lower than that of multiplex real-time PCR, in which the highest was K. pneumoniae (12.2%), followed by P. aeruginosa (9.6%), A. baumannii (7.7%) and E. coli (5.2%); No case of S. pneumoniae, H. influenzae and atypical bacteria was isolated. Conclusions: The rate of bacterial pathogens detected by multiplex real time PCR is higher than that of traditional culture (67.5% compared with 44.3%), in which the highest is S. pneumoniae (23.6%), followed by H. influenzae (15.5%), A. baumannii (6.3%) and K. pneumoniae (5.5%). Keywords: bacterial pathogens causing community acquired pneumonia; multiplex real-time PCR detecting community acquired pneumonia ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi mắc phải cộng đồng là một bệnh rất phổ biến xảy ra khắp nơi và ở mọi lứa tuổi mà nguyên nhân thường gặp là do vi khuẩn. Tuy nhiên việc xác định đúng tác nhân vi khuẩn gây bệnh gặp không ít khó khăn bởi bệnh phẩm chủ yếu để phát hiện vi khuẩn là đàm (hoặc chất có đàm) được lấy từ bệnh nhân. Bệnh phẩm thường bị tạp nhiễm vì phải qua đường hầu họng nên việc nuôi cấy theo phương pháp truyền thống để phát hiện vi khuẩn gây bệnh bị hạn chế do nhiều lý do(9). Đó là đa số bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó nên dù vi khuẩn vẫn còn sống trong dịch lót của biểu mô phế quản, phế nang nhưng trong mẫu đàm thì vi khuẩn gây bệnh đã chết. Ngoài ra còn các nguyên nhân chủ quan của phòng xét nghiệm cũng làm cho khả năng cấy được vi khuẩn gây bệnh giảm đi như là: phòng xét nghiệm không có đủ môi trường thích hợp để phân lập được các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu lại khó nuôi cấy; mẫu bệnh phẩm không được cấy ngay để tăng cơ hội phát hiện vi khuẩn gây bệnh; kỹ thuật viên chưa đủ kinh nghiệm để chọn đúng khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh mọc trên mặt thạch để phân lập; cuối cùng bệnh phẩm không được đánh giá độ tin cậy để loại bỏ các mẫu không phải là đàm mà là nhầy nhớt vùng hầu họng trước khi tiến hành nuôi cấy phân lập. Để không gặp những khó khăn, trở ngại như trên cũng như để xác định đúng vi khuẩn gây bệnh, kỹ thuật Multiplex real time PCR được sử dụng như một phương pháp tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, dựa trên nguyên tắc vừa nhân bản, vừa phát hiện trình tự nucleic acid đặc hiệu của vi khuẩn có trong mẫu bệnh phẩm, đồng thời định được số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh chính và vi khuẩn phối hợp(10). Mục tiêu nghiên cứu Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây viêm phối mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện. Xác định tỷ lệ phối hợp giữa các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng động. Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn gây bệnh giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật Multiplex real time PCR. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Chuyên Đề Nội Khoa 68 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang trên đối tượng là bệnh nhân người lớn nhập viện tại khoa hô hấp Bệnh viện Cần Thơ, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định và Bệnh viện Nguyễn Tri Phương trong thời gian từ tháng 06/2016 đến tháng 02/2017. Mẫu bệnh phẩm đàm lấy từ bệnh nhân được đánh giá rất tin cậy (> 3 điểm theo thang điểm Barlett) mới tiến hành nghiên cứu. Để có cơ sở so sánh với kỹ thuật Multiplex real time PCR, mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy theo phương pháp truyền thống tại các khoa vi sinh ở các bệnh viện nêu trên và được giữ ở tủ đông ít nhất -180C, sau đó chuyển đến phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa để thực hiện kỹ thuật Multiplex real time PCR. Kết quả phát hiện và định lượng tác nhân vi khuẩn được xác định là tác nhân gây bệnh khi số định lượng > 100.000 copies. Riêng vi khuẩn không điển hình do không có tiêu chuẩn nên chúng tôi cho là tác nhân gây bệnh khi số định lượng > 5.000 copies. Tác nhân vi khuẩn được cho là tác nhân chính nếu số lượng cao nhất còn tác nhân có số lượng ít hơn được cho là tác nhân phối hợp. KẾT QUẢ Qua nghiên cứu 271 mẫu bệnh phẩm đàm và bệnh phẩm có chứa đàm của bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện điều trị, chúng tôi ghi nhận kết quả phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật real time PCR và bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống như sau: Bảng 1: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh chính và tác nhân vi khuẩn phối hợp phát hiện được bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR Tác nhân Chính Phối hợp Tổng N % N % N % S. pneumoniae 64 23,6 29 10,7 93 34,3 H. influenza 42 15,5 13 4,8 55 20,3 H. influenza B 3 1,1 3 1,1 M. catarrahlis 7 2,6 1 0,4 8 3,0 Streptococci nhóm A 1 0,4 1 0,4 Streptococci nhóm B 2 0,7 2 0,7 4 1,5 Stresptococcus faecalis 2 0,7 3 1,1 5 1,8 Stresptococcus. faecium 3 1,1 5 1,8 8 3,0 Methicillin resistant Staphylococci 2 0,7 2 0,7 Methicillin resistant S. aureus 1 0,4 7 2,6 8 3,0 Methicillin supceptible S. aureus 1 0,4 3 1,1 4 1,5 Methicillin resistant S. epidermidis 1 0,4 4 1,5 5 1,8 Methicillin supceptible S. epidermidis 1 0,4 2 0,7 3 1,1 E. coli 12 4,4 6 2,2 18 6,6 K. pneumoniae 15 5,5 16 5,9 31 11,4 P. aeruginosa 8 3,0 9 3,3 17 6,3 A. baumannii 17 6,3 12 4,4 29 10,7 M. pneumoniae 2 0,7 2 0,7 4 1,5 C. pneumoniae 1 0,4 1 0,4 L. pneumophila 1 0,4 1 0,4 2 0,7 Dương tính 183 67,5 118 43,5 Tổng số ca 271 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 69 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh chính phát hiện được (dương tính) là 67,5% trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae (23,6%), kế đến là H. influenza (15,5%). Trong nhóm vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn K. pneumoniae chiếm tỷ lệ cao nhất là 5,5%, kế đến là E. coli chiếm tỷ lệ 4,4%. Trong nhóm vi khuẩn không đường ruột, vi khuẩn A. baumannii chiếm tỷ lệ cao nhất là 6,3%, kế đến là P. aeruginosa với tỷ lệ 3,0%. Nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ thấp nhất là 0,4 – 0,7%. Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp là 43,5%, trong đó vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae với 10,7%, kế đến là K. pneumoniae với tỷ lệ 5,9%, H. influenza 4,8%, A. baumannii 4,4%. Nhóm Staphylococci và nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,7 – 2,6%. Bảng 2: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân đơn thuần viêm phổi cộng đồng phát hiện kỹ thuật multiplex real- time PCR Tác nhân Chính Phối hợp Tổng N % N % N % S. pneumoniae 32 22,1 9 6,2 41 28,3 H. influenza 20 13,8 7 4,8 27 18,6 H. influenza B 1 0,7 1 0,7 M. catarrahlis 4 2,8 4 2,8 Streptococci nhóm A 1 0,7 1 0,7 Streptococci nhóm B 1 0,7 1 0,7 2 1,4 Stresptococcus faecalis 2 1,4 3 2,1 5 3,4 Stresptococcus faecium 5 3,4 5 3,4 Methicillin resistant Staphylococci 1 0,7 1 0,7 Methicillin resistant S. aureus 1 0,7 2 1,4 3 2,1 Methicillin supceptible S. aureus 1 0,7 2 1,4 3 2,1 Methicillin resistant S. epidermidis 1 0,7 3 2,1 4 2,8 Methicillin supceptible S. epidermidis 1 0,7 1 0,7 2 1,4 E. coli 6 4,1 5 3,4 11 7,6 K. pneumoniae 11 7,6 10 6,9 21 14,5 P. aeruginosa 4 2,8 4 2,8 8 5,5 A. baumannii 8 5,5 7 4,8 15 10,3 M. pneumoniae 2 1,4 1 0,7 3 2,1 C. pneumoniae 1 0,7 1 0,7 L. pneumophila 1 0,7 1 0,1 Dương tính 97 66,9 62 42,8 Tổng 145 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh chính phát hiện (dương tính) là 66,9% trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae (22,1%), tiếp theo là H. influenza (13,8%). Trong nhóm vi khuẩn đường ruột thì K. pneumoniae chiếm tỷ lệ cao nhất là 7,6%, kế đến là E. coli chiếm tỷ lệ 4,1%. Trong nhóm vi khuẩn không đường ruột thì A. baumannii chiếm tỷ lệ cao nhất là 5,5%, kế đến là P. aeruginosa chiếm tỷ lệ 2,8%. Nhóm vi khuẩn chiếm tỷ lệ thấp nhất là nhóm Staphylococci và nhóm vi khuẩn không điển hình với tỷ lệ là 0,7 – 1,4%. Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp là 42,8%, trong đó vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất là K. pneumoniae với 6,9%, kế đến là S. pneumoniae với tỷ lệ 6,2%, H. influenza 4,8% và A. baumannii cùng tỷ lệ 4,8%. Nhóm Staphylococci và nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,7 – 1,4%. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Chuyên Đề Nội Khoa 70 Bảng 3: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân COPD viêm phổi cộng đồng phát hiện được bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR Tác nhân Chính Phối hợp Tổng N % N % N % S. pneumoniae 32 25,4 20 15,9 52 41,3 H. influenza 22 17,5 6 4,8 28 22,2 H. influenza B 2 1,6 2 1,6 M. catarrahlis 3 2,4 1 0,8 4 3,2 Streptococci nhóm A Streptococci nhóm B 1 0,8 1 0,8 2 1,6 Stresptococcus. Faecalis Stresptococcus. Faecium 3 2,4 3 2,4 Methicillin resistant Staphylococci 1 0,8 1 0,8 Methicillin resistant S. aureus 5 4,0 5 4,0 Methicillin supceptible S. aureus 1 0,8 1 0,8 Methicillin resistant S. epidermidis 1 0,8 1 0,8 Methicillin supceptible S. epidermidis 1 0,8 1 0,8 E. coli 6 4,8 1 0,8 7 5,6 K. pneumoniae 4 3,2 6 4,8 10 7,9 P. aeruginosa 4 3,2 5 4,0 9 7,1 A. baumannii 9 7,1 5 4,0 14 11,1 M. pneumoniae 1 0,8 1 0,8 C. pneumoniae L. pneumophila 1 0,8 1 0,8 Dương tính 86 68,2 56 44,4 Tổng 126 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh chính được phát hiện (dương tính) là 68,2% trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae (25,4%), tiếp theo là H. influenza (17,5%). Trong nhóm vi khuẩn đường ruột, E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất là 4,8%, kế đến là K. pneumoniae với tỷ lệ là 3,2%. Trong nhóm vi khuẩn không đường ruột, vi khuẩn A. baumannii chiếm tỷ lệ cao nhất là 7,1%, kế đến là P.aeruginosa với tỷ lệ 3,2%. Nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ thấp nhất là 0,8%. Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp là 44,4%, trong đó vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae với tỷ lệ 15,9%, kế đến là K. pneumoniae và H. influenza cùng tỷ lệ 4,8%. Vi khuẩn E. coli và nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,8%. Tỷ lệ vi khuẩn phát hiện (dương tính) là 56,1%. Nếu không kể nhóm S. viridans là vi khuẩn thường trú ở hầu họng thì tỷ lệ dương tính là 44,3% (120/271), trong đó vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất là K. pneumoniae (12,2%), kế đến là P. aeruginosa (9,6%), A. baumannii (7,7%). Các vi khuẩn H. influenza, vi khuẩn Gram âm khác và nhóm Staphylococci chiếm tỷ lệ thấp. Không có trường hợp nào phát hiện vi khuẩn không điển hình (Bảng 4). Tỷ lệ vi khuẩn phát hiện phù hợp giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật real time PCR chỉ có 23,7% (36/152). Nếu không kể nhóm S. viridans là vi khuẩn thường trú ở hầu họng thì tỷ lệ phù hợp là 30% (36/120) (Bảng 5). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 71 Bảng 4: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng phát hiện được bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống Tác nhân CAP CAP/COPD Tổng N % N % N % H.influenza 3 2,4 3 1,1 H.parainfluenza 2 1,4 6 4,8 8 2,9 M.catarrahlis 1 0,7 1 0,4 Nhóm Streptococcus.viridans 23 15,8 9 7,1 32 11,8 Staphylococcus aureus 3 2,1 3 1,1 Staphylococcus epidermidis 1 0,7 1 0,4 E. coli 10 6,9 4 3,2 14 5,2 K. pneumoniae 23 15,8 10 7,9 33 12,2 P. aeruginosa 11 7,6 15 11,9 26 9,6 A. baumannii 11 7,6 10 7,9 21 7,7 E. aerogenes 1 0,7 1 0,8 2 0,7 E. cloacae 2 1,4 2 0,7 Gram negative rods khác 1 0,7 5 4,0 6 2,2 Dương tính 89 61,4 63 50,0 152 56,1 Tổng 145 126 271 Bảng 5: Số trường hợp và tỷ lệ vi khuẩn phát hiện phù hợp giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống và real-time PCR Tác nhân Nuôi cấy Phù hợp kết quả PCR N N % H. influenza 3 3 100 H. parainfluenza 8 M. catarrahlis 1 1 100 Nhóm S. viridans 32 S. aureus 3 S. epidermidis 1 E. coli 14 8 57,1 K. pneumoniae 33 5 15,6 E. aerogenes 2 E. cloacae 2 P. aeruginosa 26 9 34,6 A. baumannii 21 10 47,6 Gram negative rods 6 Dương tính 152 36 23,7 BÀN LUẬN Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh (tỷ lệ dương tính) ở kỹ thuật real time PCR là 67,5% (183/271), trong đó tỷ lệ dương tính ở bệnh nhân CAP là 66,9% (97/145) và ở bệnh nhân CAP/COPD là 68,2% (86/126). Sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật real time PCR ở hai nhóm bệnh nhân trên không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Kết quả nuôi cấy theo phương pháp truyền thống cho thấy tỷ lệ dương tính là 56,1%, trong đó tỷ lệ dương tính ở bệnh nhân CAP là 61,4% (89/145) và ở bệnh nhân CAP/COPD là 50% (63/126). Sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống giữa hai nhóm bệnh nhân trên có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Tuy nhiên, nếu loại trừ nhóm vi khuẩn S viridans là các vi khuẩn thường trú ở hầu họng thì tỷ lệ dương tính ở bệnh nhân CAP là 45,5% (66/145) và ở bệnh nhân CAP/COPD là 42,9% (54/126) thì sự khác biệt giữa tỷ lệ dương tính ở bệnh nhân CAP và ở bệnh nhân CAP/COPD không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Kết quả phát hiện vi khuẩn gây bệnh ở bệnh nhân CAP và CAP/COPD bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống của một số tác giả trong nước cho thấy tỷ lệ dương tính thay đổi từ 48 – 58%(5,8,14,15) nghĩa là tương đương với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Nhưng nếu so sánh tỷ lệ dương tính ở nghiên cứu của chúng tôi bằng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Chuyên Đề Nội Khoa 72 kỹ thuật real time PCR (67,5%) và bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống (44,3% không kể nhóm S. viridans) cho thấy sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Về tỷ lệ các loại vi khuẩn theo kết quả trình bày ở bảng 1, tỷ lệ vi khuẩn phát hiện được bằng kỹ thuật real time PCR cao nhất là S .pneumoniae (34,3%), kế đến là H. influenza (20,3%), K. pneumoniae (11,4%), A. baumannii (10,7%), E. coli (6,6%) và P. aeruginosa (6,3%). Các vi khuẩn Staphylococci và nhóm vi khuẩn không điển hình chiếm tỷ lệ rất thấp. Theo kết quả trình bày ở Bảng 4, vi khuẩn phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống (không kể nhóm S. viridans là vi khuẩn thường trú ở hầu họng) có tỷ lệ cao nhất là K. pneumoniae (12,2%), kế đến là P. aeruginosa (9,6%), A. baumannii (7,7%), E.coli (5,5%). Các vi khuẩn nhóm Staphylococci chiếm tỷ lệ rất thấp. Không có trường hợp nào phát hiện vi khuẩn không điển hình. Mặc dù cách tính tỷ lệ các loại vi khuẩn trong các công trình nghiên cứu trong nước của các tác giả có khác nhau, như tính tỷ lệ vi khuẩn phát hiện trên tổng số các trường hợp nghiên cứu, tỷ lệ vi khuẩn trên tổng số các vi khuẩn phát hiện được, tỷ lệ vi khuẩn trên số vi khuẩn Gram âm hoặc trên số vi khuẩn Gram dương. Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống của hầu hết các tác giả trong nước đều cho thấy vi khuẩn K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii chiếm tỷ lệ cao hơn các vi khuẩn S. pneumoniae, S. aureus, H. influenza(3,4,5,14,15). Nghiên cứu của chúng tôi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống cũng cho kết quả tương tự (Bảng 4). Trái lại, kết quả ghi nhận các tác nhân vi khuẩn phát hiện được bằng kỹ thuật real time PCR trong các công trình nghiên cứu ở nước ngoài cho thấy các vi khuẩn S. pneumoniae, S .aureus, K. pneumoniae, H. influenza chiếm tỷ lệ cao hơn các vi khuẩn đường ruột và P.aeruginosa, đồng thời còn phát hiện các vi khuẩn không điển hình như: M. pneumoniae, C. pneumoniae, L.pneumophila với tỷ lệ ngày càng tăng(1,2,6,11-13). Nghiên cứu của chúng tôi bằng kỹ thuật real time PCR cũng cho kết quả tương tự (Bảng 1). Phân tích tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh phát hiện được bằng kỹ thuật real time PCR ở bệnh nhân CAP và ở bệnh nhân CAP/COPD (bảng 1) cho thấy vi khuẩn S. pneumoniae, H. influenza, A. baumannii chiếm tỷ lệ cao ở cả hai nhóm bệnh nhân nhưng ở bệnh nhân CAP thì K.pneumoniae chiếm tỷ lệ cao hơn (14,5% so với 7,9%). Ngược lại ở bệnh nhân CAP/COPD vi khuẩn P.aeruginosa chiếm tỷ lệ cao hơn (7,1% so với 5,5%). Phân tích tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh (từ nhóm S. viridans) phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống ở bệnh nhân CAP và ở bệnh nhân CA/COPD (bảng 4) cho thấy vi khuẩn K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli chiếm tỷ lệ cao ở cả hai nhóm bệnh nhân. Tuy nhiên có sự khác nhau về tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh ở hai nhóm bệnh nhân trên. Đó là ở bệnh nhân CAP, vi khuẩn K. pneumoniae chiếm tỷ lệ cao hơn (15,8% so với 7,8%) và ở bệnh nhân CAP/COPD thì vi khuẩn P. aeruginosa chiếm tỷ lệ cao hơn (11,9% so với 7,6%). Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp được phát hiện bằng kỹ thuật real time PCR nhờ thực hiện đếm số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh chính và vi khuẩn phối hợp, trong khi phương pháp nuôi cấy truyền thống không xác định vi khuẩn phối hợp do không đếm được số lượng vi khuẩn. Trong các vi khuẩn phối hợp được xác định thì vi khuẩn S. pneumoniae chiếm tỷ lệ cao nhất là 10,7%, kế đến là K.pneumoniae với tỷ lệ 5,9%, H.influenza 4,8%. Phân tích vi khuẩn phối hợp ở từng nhóm bệnh nhân thì ở nhóm bệnh nhân CAP vi khuẩn S. pneumoniae chiếm với tỷ lệ 6,2% nhưng ở nhóm bệnh nhân CAP/COPD thì S. pneumoniae nhiếm ưu thế với tỷ lệ 15,9%. Sự khác biệt về tỷ lệ vi khuẩn phối hợp S. pneumoniae giữa nhóm bệnh nhân CAP và CAP/COPD có ý nghĩa thống Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 73 kế. Trái lại ở bệnh nhân CAP, vi khuẩn K.pneumoniae chiếm tỷ lệ 6,9% và ở nhóm bệnh nhân CAP/COPD, K. pneumoniae chỉ chiếm 4,8%. Sự khác biệt về tỷ lệ K. pneumoniae giữa nhóm bệnh nhân CAP và nhóm bệnh nhân CAP/COPD không có ý nghĩa thống kê. Sự phù hợp vi khuẩn giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật real time PCR. Theo kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy chỉ có 23,7% vi khuẩn phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống là phù hợp với vi khuẩn phát hiện được bằng kỹ thuật real time PCR. Phân tích cho thấy vi khuẩn E.coli chiếm tỷ lệ phù hợp cao nhất là 57,1%, còn ngoại trừ trường hợp vi khuẩn H. influenza và M. catarrahlis với số lượng phát hiện ít, các vi khuẩn khác thường gặp trong viêm phổi mắc phải cộng động như K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii có tỷ lệ phù hợp không đến 50%. Đặc biệt đối với vi khuẩn S. pneumoniae là vi khuẩn được ghi nhận là tác nhân chiếm tỷ lệ cao trong viêm phổi mắc phải cộng đồng nhưng kết quả nuôi cấy bằng phương pháp truyền thống không có sự phù hợp với kỹ thuật real time PCR vì không có trường hợp nào được phát hiện. Đây là loại vi khuẩn khó phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống vì nhiều lý do như đã trình bày ở phần đặt vấn đề. KẾT LUẬN Tỷ lệ dương tính ở kỹ thuật real time PCR là 67,5% và ở phương pháp nuôi cấy truyền thống là 56,1%. Sự khác biệt tỷ lệ dương tính giữa kỹ thuật real time PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Vi khuẩn phát hiện bằng kỹ thuật real time PCR có tỷ lệ cao nhất là S. pneumoniae (34,3%), kế đến là K. pneumoniae (11,4%), A. baumannii (10,7%), E. coli (6,6%), P. aeruginosa (6,3%). Các vi khuẩn còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp. Vi khuẩn phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống có tỷ lệ cao nhất là K. pneumoniae (12,2%), kế đến là P. aeruginosa (9,6%), A. baumannii (7,7%), E. coli (5,5%). Các vi khuẩn khác chiếm tỷ lệ rất thấp, đặc biệt không có trường hợp nào phát hiện S. pneumoniae. Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp được phát hiện bằng kỹ thuật real time PCR với tỷ lệ 43,7% trong đó ở nhóm bệnh nhân CAP là 42,8% và ở nhóm bệnh nhân CAP là 44,4%. Sự khác nhau về tỷ lệ vi khuẩn phối hợp giữa nhóm bệnh nhân CAP và nhóm bệnh nhân CAP/COPD không có ý nghĩa thống kê. Ở nhóm bệnh nhân CAP/COPD, vi khuẩn phối hợp S. pneumoniae chiếm tỷ lệ 6,2% trong khi ở nhóm bệnh nhân CAP/COPD có tỷ lệ 15,9%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Chỉ có 23,7% vi khuẩn phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống là phù hợp với vi khuẩn phát hiện bằng kỹ thuật real time PCR, trong đó vi khuẩn E.coli có tỷ lệ phù hợp cao nhất là 57,1%. Các vi khuẩn gây bệnh khác có tỷ lệ phù hợp thấp hơn 50%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arancibia F, Bauer TT, Ewig S et al (2002). “Community acquried pneumonia due to Gram-negative bacteria and Pseudomonas aeruginosa: incidence, risk and prognosis. Arch Intern Med, 162, pp 1849-1858. 2. Blasi F (2004). Atypical pathogen and respiratory tract infections. Eur respir J, 24 (1), pp 171-181. 3. H’ Nương Niê (2016). “Các vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện và tình hình kháng thuốc tại khoa Hồi sức tích cực-chống độc, bệnh viện đa khoa tỉnh ĐăkLăk từ 10/2015 đến 4/2016”. Luận văn Thạc sĩ y học chuyên ngành Vi sinh y học, Đại học y dược TP.Hồ Chí Minh, tr 44-49. 4. Lê Tiến Dũng (2010). “Khảo sát đặc điểm và sự đề kháng invitro vi khuẩn gây viêm phổi cộng đồng tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2008”. Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh, 14(2), trang 47-57. 5. Lê Tiến Dũng, Phạm Hùng Vân (2010). “Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi công đồng”. Tạp chí Y học TP.HCM, 14(2), trang 53-60. 6. Lui G, Ip M, Lee N, Rainer TH, Man SY et al (2009). Role of “Atypical pathogens” among adult hospitalized patients with community-acquired pneumonia. Respiratory, 14: 1098-1105 7. Nair Girish B, Niederman Michael S (2011). “Community – acquired pneumonia”. Medical clinics of North America, 95(6), pp 1143-1161. 8. Nguyễn Văn Thành (2005). “Kháng sinh trị liệu trong viêm phổi cộng đồng người lớn nhập viện: một số phân tìch từ góc độ vi trùng học”. Tạp chí Y học thực hành, Công trình nghiên cứu khoa học hội nghị bệnh phổi toàn quốc, Cần Thơ tháng 6/2005, Bộ y tế (513) tr 130-108. 9. Phạm Hùng Vân (2005). Các kỹ thuật lấy và làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau. Tài liệu giảng dạy sinh viên, học viên chuyên khoa vi sinh, lưu hành nội bộ, tr 54-58. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 1 * 2019 Chuyên Đề Nội Khoa 74 10. Phạm Hùng Vân (2009). “PCR và real time PCR : Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp”. NXB Y học chi nhánh TP.HCM, trang 9-35. 11. Pinar A, Bozdemir N, Kocagoz T, Alacam R (2004). Rapid detection of bacteral atypical pneumonia agents by multiplex PCR. Cent Eur J Publ Health; 12(1): 3-5d. 12. Schuller M, et al (2010). “PCR for clinical microbiology”. Springer publisher, p 11-48. 13. Takahashi K, Suzuki M et al (2013). “The incidence and etiology of hospitalized community – acquired pneumonia among Vietnam adults : a prospective surveillance in central Vietnam”. Infectious Disease, 13, pp 296-299. 14. Trần Anh Đào (2011). “Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của viêm phổi mắc phải cộng đồng tại khoa Hô hấp bệnh viện Nhân dân Gia Định”. Luận văn Thạc sĩ y học chuyên ngành Lao, Đại học y dược TP.Hồ Chí Minh, tr 63-64 và 106-107. 15. Võ Đức Chiến (2007). “Đặc điểm lâm sàng và vi khuẩn học của viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện bệnh viện Nguyễn Tri Phương từ tháng 8/2005 đến 8/2006”. Luận văn tốt nghiệp chuyên khoa cấp 2 chuyên ngành Lao và bệnh phổi, Đại học y dược TP.Hồ Chí Minh, tr 49-51 và 90-91. Ngày nhận bài báo: 08/11/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/12/2018 Ngày bài báo được đăng: 10/03/2019