Sàng lọc chỉ thị phân tử liên kết gen quy định mùi thơm fgr để ứng dụng trong chọn tạo giống lúa thơm tại Việt Nam

9Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 Designing primers for identification of Pik-p in Vietnamese local rice varieties and their application in rice breeding Tran Thi Thuy, Nguyen Thuy Diep, Nguyen Truong Khoa, Thi Phuong Doai1, Kieu Thi Dung, Nguyen Thi Ly, Nguyen Thi Trang, Nguyen Thai Duong, Tran Dang Khanh, Khuat Huu Trung Abstract Rice blast caused by fungal pathogen Magnaporthe oryzae, is one of the most devastating rice diseases. Developing the blast resistant varieties is the main strategy to protect the crop. In this study, the sequence of blast resistant gene LOC_Os11g46210 was used as reference gene to identify the candidate genes from genome sequences of 36 Vietnamese local rice varieties. The nucleotide sequence in CDS (Coding DNA Sequence) and amino acid contents of candidate gene from OM5629 variety were found similar with that of the Pik-p reference gene. Based on the difference in nucleotide sequence of Pik-p reference gene and the candidate genes, primer pair Pikpdel16F/Pikpdel16R was designed to amplify the DNA segments of 174 bp (the candidate genes which were similar to the reference gene) and/ or 190 bp (the genes which were different from the reference gene). The study aimed to introgress candidate blast resistant gene Pik-p by using local resistant genotypes OM5629 into BC15, a high-yielding rice variety that is blast susceptible. By marker assisted selection, three lines (U6-7, U6-27, U6-31) from BC3F2 were determined to contain homozygous Pik-p and genetic background of recurrent parent BC15. These results may be useful for breeding rice blast resistant varieties. Key words: Marker-assisted selection, Pik-p, candidate genes, blast resistant gene Ngày nhận bài: 10/4/2017 Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu Ngày phản biện: 15/4/2017 Ngày duyệt đăng: 24/4/2017 1 Viện Di truyền Nông nghiệp; 2 Bộ Nông nghiệp và PTNT SÀNG LỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GEN QUY ĐỊNH MÙI THƠM fgr ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM TẠI VIỆT NAM Nguyễn Thị Nhài1, Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Nguyễn Thị Thanh Thủy2, Lê Hùng Lĩnh1 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, 3 chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen mùi thơm fgr trên nhiễm sắc thể số 8 được tìm kiếm từ các bản đồ liên kết và các công trình nghiên cứu trên thế giới. Các chỉ thị này đã được sử dụng để sàng lọc đa hình ADN giữa giống lúa Basmati mang gen fgr quy định mùi thơm với các giống lúa đang trồng tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định ba chỉ thị phân tử BAD2, RM23120 và Aro7 liên kết chặt với gen mùi thơm và cho đa hình giữa các mẫu giống lúa thơm và mẫu giống không thơm. Đây là những chỉ thị rất thích hợp cho việc chọn lọc các cá thể mang gen quy định mùi thơm fgr trong các chương trình chọn giống lúa thơm sử dụng chỉ thị phân tử (MAS). Từ khóa: BAD2, chỉ thị phân tử, gen fgr, lúa, mùi thơm I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính, có vai trò quan trọng trong lĩnh vực kinh tế và an ninh lương thực. Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Tuy nhiên, giá xuất khẩu còn khá chênh lệch với các nước khác do chất lượng gạo còn thấp. Ở một số nước, gạo thơm có giá trị cao hơn gạo thường 1,5 - 2,5 lần. Vì vậy, yêu cầu nâng cao chất lượng lúa gạo đặt ra cho nhà chọn giống nhiều thử thách phải giải quyết nhằm đáp ứng với mục tiêu xuất khẩu. Theo Nguyễn Văn Bộ (2004), để có thể đáp ứng được yêu cầu xuất khẩu gạo, việc chọn lọc các giống lúa thơm chất lượng cao là một trong những nhu cầu cấp bách hiện nay ở nước ta. Chiến lược tạo giống lúa thơm cũng cần được quan tâm hơn trong phương hướng cải tiến giống lúa ở những vùng trồng lúa chất lượng cao (Bùi Chí Bửu, 2004). Do vậy, để đáp ứng nhu cầu an linh lương thực và nâng cao giá trị hàng hóa của sản phẩm lúa gạo thì cần tạo ra những giống lúa vừa có năng suất cao, đồng thời có chất lượng tốt, trong đó mùi thơm 10 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 được đánh giá rất cao trên thị trường xuất khẩu gạo của thế giới. Chính vì vậy, việc nghiên cứu “Sàng lọc chỉ thị phân tử liên kết gen quy định mùi thơm fgr để ứng dụng trong chọn tạo giống lúa thơm tại Việt Nam” sẽ tạo cơ sở cho việc sử dụng chỉ thị ADN trong chọn tạo giống lúa thơm tại Việt Nam. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Vật liệu thực vật: 23 mẫu giống lúa vật liệu bao gồm các giống lúa địa phương và một số giống lúa cải tiến đang được trồng phổ biến trong sản xuất, cùng với giống Basmati là giống chuẩn mang gen mùi thơm do Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) cung cấp (Bảng 1). Bảng 1. Danh sách các giống lúa vật liệu sử dụng trong nghiên cứu Ghi chú: Viện DTNN: Viện Di truyền Nông nghiệp; Viện KHKTDHNTB: Viện Khoa học kỹ thuật Duyển hải Nam Trung bộ; Viện Lúa ĐBSCL: Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long; Viện CLT-CTP: Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm; Công ty Giống CTTW: Công ty Giống Cây trồng Trung ương - Các hóa chất, dụng cụ, máy móc dùng trong sinh học phân tử. 2.2. Phương pháp nghiên cứu ADN tổng số được tách nhanh theo phương pháp “NaOH extraction” của Wang và cs., (1993). Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti® 96-Well Thermal Cycler với tổng thể tích 15 µl, gồm: 5 µl ADN, 0,15 µM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq TaKaRa. Điều kiện phản ứng: 950C - 7 phút; 35 chu kỳ (940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút) và giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose 2,5% trong đệm TBE, nhuộm bằng Ethilium bromide và được soi dưới đèn UV. Số liệu ghi nhận và phân tích trên hình ảnh điện di các sản phẩm PCR để phát hiện những chỉ thị phân tử cho đa hình giữa các giống mang gen thơm với những giống lúa nghiên cứu. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập thông tin về các chỉ thị phân tử liên kết với gen fgr quy định mùi thơm ở lúa Bradbury và cs., (2005) đã phân tích mùi thơm của hai giống lúa Basmati và Jasmine với sự biểu hiện của chất 2-acetyl-1-pyrroline. Một gen lặn fgr trên nhiễm sắc thể số 8 có liên quan đến sự biểu hiện tính trạng mùi thơm này. Nhóm tác giả đã phát hiện trong vùng mã hóa của gen fgr, có một gen tương đồng với gen mã hóa Betaine aldehyde dehydrogenase (BAD) có sự đa hình ở hai kiểu hình lúa thơm và lúa không thơm). Ở cây lúa, gen lặn fgr có sự tương đồng với gen mã hóa BAD2 và có thể xem gen fgr là một dạng đột biến của gen mã hóa BAD2. Qua sự thể hiện của gen BAD2, Bradbury đã thiết kế bốn đoạn mồi: ESP (external sense primer), INSP (internal non-fragrant sense primer), IFAP (internal fragrant anti-sense primer) và EAP (external anti-sense primer). Sử dụng bốn đoạn mồi này trong cùng một phản ứng PCR được gọi là phương pháp ASA (Allele Specific Amplification) có thể chọn ra những cá thể thơm đồng hợp tử, không thơm đồng hợp tử và dị hợp tử. Shu và cs., (2008) đã phân tích di truyền và lập bản đồ liên kết gen thơm sử dụng các quần thể con lai thu được từ 2 tổ hợp giữa giống lúa thơm Oryza sativa indica Chuanxiang-29B (Ch-29B) với giống lúa không thơm O. sativa indica R2 và O. sativa japonica Lemont (Le). Phân tích liên kết giữa các chỉ thị SSR và locus gen thơm fgr của quần thể F2 đã xác TT Tên giống Nguồn gốc 1 Nếp thơm Nghệ An Nghệ An 2 Dự thơm Hải Phòng Hải Phòng 3 Tám chiêm Hà Nam Hà Nam 4 Khang dân Viện DTNN 5 Bắc thơm 7 Viện DTNN 6 BC15 Công ty Giống Thái Bình 7 Jasmine Viện DTNN 8 HT1 Viện DTNN 9 J01 Viện DTNN 10 J02 Viện DTNN 11 TBR45 Viện KHKTDHNTB 12 Nàng thơm giữa Viện Lúa ĐBSCL 13 OM5472 Viện Lúa ĐBSCL 14 OM8019 Viện Lúa ĐBSCL 15 Nhỏ Hương Viện Lúa ĐBSCL 16 Trắng Tép Chùm Viện Lúa ĐBSCL 17 P6 Viện CLT-CTP 18 Nếp cái hoa vàng Viện CLT-CTP 19 Nếp mèo hương Viện CLT-CTP 20 Sơn Lâm 2 Viện CLT-CTP 21 Nàng Hương Thanh trà Viện Lúa ĐBSCL 22 Basmati IRRI 23 NB01 Viện DTNN 24 T10 Công ty Giống CTTW 11 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 định được gen thơm của giống Ch-29B trên vùng NST số 8, bởi 2 chỉ thị SSR RM23120 với khoảng cách 0,52 cM và RM3459 với khoảng cách 1,23 cM. Kết quả lập bản đồ phân tử từ hai quần thể đã chỉ ra rằng locus gen thơm của giống Ch-29B cũng chính là gen thơm được Bradbury và cs. công bố năm 2005. Tác giả đã nhận định các chỉ thị Aro7, RM23120 và RM3459 nhận biết trong công trình này có thể sử dụng hiệu quả trong việc sàng lọc tính trạng thơm trong các dòng lúa phục vụ chọn giống (Hình 1). Trong nghiên cứu này, ba chỉ thị SSR liên kết chặt với gen thơm fgr trên nhiễm sắc thể số 8 đã được thu thập thông tin và trình tự. Ba chỉ thị này được sử dụng trong nội dung khảo sát và đánh giá nguồn vật liệu (Bảng 2). Hình 1. Bản đồ liên kết gen thơm fgr trên nhiễm sắc thể số 8 ở lúa (Shu et al., 2008) (a) Bản đồ liên kết của quần thể F2 Ch-29B/R2 (b) Bản đồ liên kết của quần thể F2 Ch-29B/Le cM Makers Aro7 RM23120 RM3459 RM7556 RM7356 RM7049 RM515 RM8264 RM23097 fgr Aro7 Aro1 fgr MakerscM 0.35 0.52 1.23 a 1.86 1.71 0.72 0.71 0.57 0.29 0.29 0.14 b Bảng 2. Danh sách các chỉ thị SSR liên kết với gen quy định mùi thơm fgr ở lúa trên nhiễm sắc thể số 8 TT Tên chỉ thị liên kết Trình tự mồi Khoảng cách đến gen (cM) Tài liệu tham khảo 1 BAD2 ESP: TTGTTTGGAGCTTGCTGATG IFAP:CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC INSP: CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA EAP: AGTGCTTTACAAAGTCCCGC Khuếch đại vùng gen thơm Bradbury và cs., 2005 2 RM23120 F: AACTGTTGGATCGACAAGACCTTCC R: ACGGCGTTAAGCTAGACAGACAGAGC 0,52 Shu và cs., 2008 3 Aro7 F: ATTTGCCTCCTGAGTCTGR: GAGGATGGGGAAGATAAA 0,87 3.2. Khảo sát sự đa hình ADN vùng gen thơm fgr trong tập đoàn giống lúa vật liệu bằng chỉ thị phân tử Kết quả phân tích ADN cho thấy tất cả 3 chỉ thị đưa vào phân tích đều biểu hiện băng đa hình ADN giữa các giống lúa nghiên cứu. Theo tác giả Kumari và cs., (2012), do chỉ thị BAD2 là chỉ thị đặc hiệu khuếch đại vùng gen thơm và cây lúa có thể ở trạng thái thơm đồng hợp tử, không thơm đồng hợp tử và dị hợp tử. Do vậy nếu các giống lúa biểu hiện băng ADN ở vị trí đặc hiệu 257bp là mang gen thơm fgr đồng hợp tử. Các giống lúa biểu hiện băng ADN ở vị trí đặc hiệu 355bp được xác định là không mang gen thơm fgr đồng hợp tử và các giống lúa biểu hiện băng ADN ở vị trí đặc hiệu 257bp và 355bp được xác định là không mang gen thơm fgr dị hợp tử. Để nhận biết giống lúa thơm hay không thơm ngoài việc xác định sự có mặt của băng ADN đặc hiệu ở vị trí 257bp cần sử dụng thêm phương pháp phân tích hóa sinh với dung dịch 1,7% KOH để khẳng định sự biểu hiện của tính trạng mùi thơm ở các giống lúa (Sood và cs., 1978). Kết quả phân tích với chỉ thị BAD2 khuếch đại vùng gen thơm trong nghiên cứu này đã cho thấy giống Basmati cho một băng ADN ở vị trí 257 bp, phù hợp với kết quả đã công bố của tác giả Kumari và cs., (2012) cho rằng băng đặc hiệu ở vị trí 257 bp khuếch đại vùng gen thơm fgr. Trong số các giống lúa đưa vào phân tích, có 8 giống biểu hiện 2 băng sản phẩm PCR ở vị trí 257bp và 585 bp, đó là các giống: Dự thơm Hải Phòng, Bắc thơm 7, Jasmine, HT1, Nhỏ Hương, Sơn Lâm 2, Nàng Hương Thanh trà và giống T10. 13 giống còn lại cho 2 băng ADN ở vị trí 355bp và 585 bp, đó là các giống Nếp thơm Nghệ An, Tám chiêm Hà Nam, Khang dân, BC15, J01, J02, TBR45, Nàng thơm giữa, Trắng Tép Chùm, P6, Nếp cái hoa vàng, Nếp mèo hương và NB01 (Hình 2). 12 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 Chỉ thị RM23120 liên kết chặt với gen fgr với khoảng cách 0,52cM (Shu et al., 2008). Kết quả cho thấy giống Basmati cho 3 băng ADN ở vị trí 435bp, 380bp và 350bp. Trong số 23 giống lúa đưa vào phân tích, có 7 giống xuất hiện 3 băng sản phẩm PCR tương tự giống Basmati, đó là: Nếp thơm Nghệ An, Dự thơm Hải Phòng, Khang dân, Jasmine, HT1, J01 và J02. Tuy chỉ thị RM23120 liên kết chặt với gen thơm fgr, nhưng kết quả cho thấy giống lúa Khang Dân không có mùi thơm vẫn biểu hiện băng ADN tương tự giống Basmati mang gen thơm fgr. Phân tích này cho thấy chỉ thị RM23120 liên kết chặt gen thơm fgr nhưng không cho đa hình giữa giống lúa mang gen thơm (Basmati) và giống không thơm (Khang Dân), do vậy nếu sử dụng cặp bố mẹ giữa giống mang gen thơm fgr và giống Khang Dân, chỉ thị này sẽ không có ích cho sàng lọc thế hệ con lai. Hình 2. Kết quả phân tích chỉ thị BAD 2 trên các giống lúa nghiên cứu Từ trái qua phải: 1-21, 23-24: các giống lúa nghiên cứu; Bas: giống Basmati mang gen thơm fgr, thang ADN chuẩn 1kb+ Hình 3. Kết quả phân tích chỉ thị RM23120 trên các giống lúa nghiên cứu Từ trái qua phải: thang ADN chuẩn 1kb+, 1-21, 23-24: các giống lúa nghiên cứu; Bas: Giống Basmati mang gen thơm fgr Chỉ thị Aro7 liên kết chặt với gen fgr với khoảng cách 0,87cM (bản đồ liên kết của quần thể F2 Ch-29B/R2) với băng ADN đặc hiệu ở vị trí 280bp (Shu và cs., 2008). Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu này cho thấy giống Basmati cho 2 băng ADN ở vị trí 280bp và 270bp. Trong số 23 giống lúa đưa vào phân tích, có 15 giống biểu hiện 1 băng ADN ở vị trí 280bp hoặc cả hai băng sản phẩm PCR tương tự giống Basmati, đó là các giống: Nếp thơm Nghệ An, Dự thơm Hải Phòng, Tám chiêm Hà Nam, Jasmine, HT1, J01, J02, TBR45, OM5472, Nhỏ Hương, Trắng Tép Chùm, Nếp cái hoa vàng, Nếp mèo hương, Sơn Lâm 2, Nàng Hương Thanh trà, 9 giống còn lại cho băng ADN ở vị trí 270bp (Hình 4). Kết quả phân tích cho thấy, việc lựa chọn chỉ thị Aro7 trong chọn giống lúa thơm cũng phụ thuộc vào kết quả sàng lọc đa hình giữa giống cho gen và giống nhận gen (Hình 4). IV. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã xác định được 3 chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen mùi thơm fgr là BAD2, RM23120, Aro7 và cho đa hình giữa giống lúa Basmati mang gen mùi thơm với những giống lúa nghiên cứu. Chỉ thị BAD2 khuếch đại vùng gen thơm nên chỉ thị này sẽ được sử dụng để sàng lọc những cá thể mang gen quy định mùi thơm fgr trong các nghiên cứu tiếp theo. BAD2 21 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Bas 23 24 1kb+ RM23120 21 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Bas 23 241kb+ 500bp 300bp 200bp 500bp 200bp 100bp 13 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 4(77)/2017 Hình 4. Kết quả phân tích chỉ thị Aro7 trên các giống lúa nghiên cứu Từ trái qua phải: thang ADN chuẩn 50bp, 1-21, 23-24: các giống lúa nghiên cứu; Bas: Giống Basmati mang gen thơm fgr LỜI CẢM ƠN Công trình nghiên cứu này là một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa có giá trị hàng hóa cao cho các vùng trồng lúa chính trong toàn quốc” thuộc chương trình: “Phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020”- Bộ Nông nghiệp và PTNT. TÀI LIỆU THAM KHẢO Louis M. T. Bradbury, Robert J. Henry, Qingsheng Jin, Russell F. Reinke and Daniel L. E. Waters, 2005. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. Molecular Breeding, 16: 279-283. Pummy Kumari, Uma Ahuja, Sunita Jain and R. K. Jain, 2012. Fragrance analysis using molecular and biochemical methods in recombinant inbred lines of rice. African Journal of Biotechnology, Vol. 11(91), pp. 15784-15789. Shu Xia Sun, Fang Yuan Gao, Xian Jun Lu, Xian Jun Wu, Xu Dong Wang, Guang Jun Ren and Hong Luo, 2008. Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L. Cyperales, Poaceae). Genetics and Molecular Biology, 31, 2, 532-538. Sood BC, Siddiq EA, 1978. A rapid technique for scent determination in rice. Indian J. Genet. Plant Breed, 38: 268-271. Wang H., Meiqing Qi and Adrian J. Cutler, 1993. A simple method of preparing plant samples for PCR, Nucleic Acids Research, 21 (17): 4153-4154. Screening of molecular markers linked to fragrant gene for application of MAS in aromatic rice breeding in Vietnam Nguyen Thi Nhai, Nguyen Thi Minh Nguyet, Nguyen Thi Thanh Thuy, Le Hung Linh Abstract In this study, 3 molecular markers closely linked to fragrant gene on chromosome 8 which were found from linkage mapping of some previous studies. These markers were used to identify polymorphisms among Basmati variety bringing fgr gene and Vietnamese popular rice varieties. As a result, 3 markers including BAD2, RM23120 and Aro7 were found to be closely linked to fragrant gene and gave polymorphism among aromatic and non-aromatic rice varieties. Therefore, these markers could be selected for the further study on aromatic rice breeding by using marker- assisted selection (MAS). Key words: BAD2, molecular marker, fgr gene, rice, aroma Ngày nhận bài: 6/4/2017 Người phản biện: TS. Nguyễn Thúy Kiều Tiên Ngày phản biện: 20/4/2017 Ngày duyệt đăng: 24/4/2017 Aro7 300bp 50bp 21 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Bas 23 24 200bp 100bp