Phân lập β-Sitosterol và tectoridin từ lá xạ can tại Việt Nam

Bùi Thị Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 51 - 54 51 PHÂN LẬP β-SITOSTEROL VÀ TECTORIDIN TỪ LÁ XẠ CAN TẠI VIỆT NAM Bùi Thị Bình1, Lê Công Huân1,*, Khổng Thị Hoa1, Nguyễn Thị Hồng1, Đặng Thu Hằng1, Nguyễn Thị Hồng Hạnh2, Đỗ Thị Hà3 1Trường Đại học Y Dược Thái Bình, 2Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên, 3Viện Dược liệu TÓM TẮT Xạ can là một dược liệu quý được dùng làm thuốc chữa các bệnh viêm đường hô hấp trên như: Ho, tiêu đờm, viêm họng, viêm amidan có nhiều đờm, khản tiếng. Trong nước, đã có nhiều bài báo nghiên cứu thành phần hóa học của rễ xạ can mà chưa có nhiều công bố về thành phần hóa học của lá. Vì vậy, trong bài báo này chúng tôi đã nghiên cứu dịch chiết ethanol từ lá xạ can Belamcada chinensis (L.) DC. Kết quả đã phân lập hai hợp chất: β-sitosterol (1), tectoridin (2). Cấu trúc các hợp chất được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu hóa lý và phân tích phổ NMR, MS, IR và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố. Từ khóa: Xạ can, lá, flavonoid, β-sitosterol, tectoridin. ĐẶT VẤN ĐỀ** Xạ can có tên khoa học là Belamcanda chinensis (L.) DC. thuộc chi Belamcada Adans họ Lay ơn (Iridaceae). Cây phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Philipin, Việt Nam[1]. Trong dân gian, lá xạ can được làm thuốc chữa ho, tiêu đờm, viêm họng, viêm amidan có nhiều đờm, khản tiếng, còn dùng chữa sốt, sưng tắc tia sữa dùng dạng thuốc sắc, bột làm viên ngậm hoặc dùng tươi [1]. Nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ xạ can cho thấy có mặt của các chất như các hợp chất stillben, các hợp chất phenolic và các triterpen, iridal triterpenoid, isoflavonoid và flavonoid, [5], [6]. Trong nước, một số tác giả bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học trong rễ xạ can cho thấy sự có mặt của các hợp chất flavonoid và triterpenoid [2], [3]. Tuy nhiên, tại Việt Nam vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học trên bộ phận lá. Trong bài báo này, chúng tôi báo cáo những kết quả nghiên cứu mới về phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất chiết được trên bộ phận lá xạ can. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu * Email: [email protected] Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là lá xạ can (Belamcada chinensis (L.)DC.) được thu hái tại huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình tháng 11/ 2014. Tên khoa học được ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, Khoa Tài nguyên - Viện Dược liệu giám định bằng phương pháp so sánh hình thái. Tiêu bản mẫu hiện được lưu tại Khoa Tài nguyên - Viện Dược liệu. Toàn bộ lá xạ can chất lượng tốt được lựa chọn, sấy ở 50oC đến độ ẩm còn dưới 2%, xay thành bột làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học. Dung môi, hóa chất Các dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập hoạt chất: ethanol, n-hexan, ethylacetat, methanol, n-butanol... Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA). Thiết bị dụng cụ Các chất được phân lập bởi các cột sắc ký (cột thủy tinh) với hạt silicagel 160 cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm (Merck). Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel GF254. Nhiệt độ nóng chảy được đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện Gallenkamp (Sanyo electrothermal digital). Phổ hồng ngoại (IR) được ghi bằng máy Impac 410-Nicolet FT-IR. Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ phun mù điện tử (MS) Hewlett Packard HP 5890. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bùi Thị Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 51 - 54 52 được ghi bằng máy Bruker AV-500 dùng DMSO-d6 làm dung môi. Độ chuyển dịch hóa học () được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS). Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập các hợp chất Phân lập các hợp chất từ lá xạ can bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel GF254. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu H2SO4 10% được phun đều khi hiện màu, hoặc dung dịch FeCl3/ethanol 5%. Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck). Phương pháp xác định các cấu trúc hóa học các hợp chất Nhiệt độ nóng chảy được đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện Gallenkamp (Sanyo electrothermal digital). Phổ hồng ngoại (IR) được ghi bằng máy Impac 410-Nicolet FT-IR. Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ phun mù điện tử (MS) Hewlett Packard HP 5890. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và 13 C-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500 dùng DMSO-d6 làm dung môi. Độ chuyển dịch hóa học () được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS). THỰC NGHIỆM Lá xạ can phơi khô ở 50oC, nghiền nhỏ (2,5 kg) lá cây được chiết nóng với EtOH 96% ở nhiệt độ 80oC, trong thời gian 3 giờ × 3 lần. Lọc và gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 420,63 g cao lá xạ can. Hòa cao trong 1 lít nước và chiết lần lượt với n-hexan (3 × 1,5 l), ethyl acetat (3 × 1,5 l), gộp các dịch chiết, sau đó đem cất quay dưới áp suất giảm, thu được các cắn n- hexan (30,49 g), ethyl acetat (18,63 g) và nước (271,63 g). Phân tách cặn n-hexan (30,49 g) bằng sắc ký cootk silicagel với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (5:1) thu được thu được 5 phân đoạn: D1-1(A-E). Phân đoạn D1-1B (2,5 g) tiếp tục được chạy sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan : aceton (2,5:1) thu được 3 phân đoạn D1-2(A- C). Trong đó, phân đoạn D1-Bs-2B cô cho bay hết dung môi, kết tinh lại trong methanol thu được 1 hợp chất ký hiệu là 1 (300 mg). Phân tách cặn trong nước tiến hành chạy qua cột Dainion HP-20 lần lượt với các dung môi nước, cồn 25o, 50o, 75o, 96o. Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn cồn 75o (6,95 g) tiếp tục được chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải DCM : MeOH : H2O (6:1:0,1) thu được 4 phân đoạn D2-2(A-D). Phân đoạn D2-2A (430 mg) tiến hành phân lập bằng sắc kí cột pha thường với hệ dung môi DCM : MeOH : H2O (10:1:0,1) thu được 3 phân đoạn D2- 5(A-C). Trong đó, phân đoạn D2-5B (80 mg) kết tinh trong hệ dung môi DCM : MeOH : H2O (1:1) thu được 1 hợp chất màu trắng kí hiệu là 2 (15 mg). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bằng các phương pháp hóa lý và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân phối hợp với các dữ liệu hóa lý và dữ liệu phổ đã công bố, chúng tôi xác định được cấu trúc của 2 hợp chất như sau: Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất 1, 2 Bùi Thị Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 51 - 54 53 Hợp chất 1: Không màu; tonc: 168-169 o C; Rf = 0,61 (DCM : MeOH = 7:1); IR (KBr, cm -1 ): 3304 (OH), 3060 (CH), 1728/ 1610 (C=O), 1509, 1471, 1426 (C=C); ESI-MS (m/z): 415,31 [M+H] + . 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δH 5,3 (t, J = 5,1 Hz, H-6), 3,5 (d-t, J = 5,1 Hz, H-3), 0,7 (3H, s, H-18), 1,02 (3H, s, H-19), 0,9 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,8 ( 3H, t, J = 7,3 Hz, H-26), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27); 0,80 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-28), 0,81 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-29); 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): δ 38,5 (C-1), 32,4 (C-2), 72,8 (C-3), 42,0 (C-4), 155,1 (C-5), 117,9 (C-6), 32,3 (C-7), 32,7 (C-8), 52,2 (C- 9), 35,9 (C-10), 22,2 (C-11), 38,5 (C-12), 42,0 (C-13), 68,0 (C-14), 24,4 (C-15), 28,2 (C-16), 52,9 (C-17), 14,9 (C-18), 19,2 (C-19), 33,5 (C-20), 19,3 (C-21), 33,5 (C-22), 27,8 (C-23), 46,4 (C-24), 30,1 (C-25), 14,9 (C-26), 22,3 (C-27), 19,3 (C-27), 20,52 (C-29). Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm methyl δH 0,7 (3H, s, H-18), 1,02 (3H, s, H- 19); 0,80 (3H, t, J = 7,3 Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27); 0,80 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-28), 0,81 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-29). Ngoài ra phổ 1H-NMR cũng cho thấy tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,3 (t, J = 5,1 Hz, H- 6). Trên phổ 13C-NMR cho thấy xuất hiện tín hiệu của 29 carbon (3 cacbon tứ cấp, 11 nhóm CH2, 6 nhóm CH3 và 9 nhóm CH), trong đó xuất hiện tín hiệu của một nhóm metin tại δC 72,8 (C-3), tín hiệu liên kết olefin δC 155,1 (C-5) và 117,9 (C-6) cùng với tín hiệu của 6 nhóm methyl tại δC 14,9 (C-18); 19,2 (C-19); 19,3 (C-21); 14,9 (C-26); 22,3 (C-27); 20,52 (C-29). So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất 1 với hợp chất -sitosterol ở tài liệu [4]. Từ những điều này, cho phép khẳng định hợp chất 1 chính là -sitosterol, một hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên. Hợp chất 2: Màu trắng; tonc: 278-279 o C; Rf = 0,57 (DCM : MeOH = 7:1); IR (KBr, cm -1 ): 3309 (OH), 3060 (CH), 1728/ 1610 (C=O), 1509, 1471, 1426 (C=C); 1240 (C-O); ESI- MS (m/z): 328,31 [M+H] + ; 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 8,43 (1H, s, H-2); 7,40 (2H, d,J = 8,5 Hz,H-2’, H-6’); 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz,H-3’, H-5’); 6,88 (1H, s, H-8); 5,08 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1’’); 3,73 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha-6’’); 3,45 (1H, d, J = 10,5, Hb- 6’’); 3,36 (1H, m, H-2’’); 3,34 (1H, m, H- 5’’), 3,19 (1H, m, H-4’’); 3,44 (1H, m, H- 5’’); 3,80 (3H, s, OCH3); 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm): δ 154,6 (C-2); 121,09 (C-3); 180,7 (C-4); 152,8 (C-5); 132,4 (C-6); 156,5 (C-7); 94,0 (C-8); 152,4 (C-9); 106,44 (C-10); 112,04 (C-1’); 130,11 (C-2’, 6’); 115,05 (C-3’, 5’); 157,40 (C-4’); 100,17 (C- 1’’); 73,11 (C-2’’); 76,67 (C-3’’); 69,24 (C- 4’’); 77,26 (C-5’’); 60,64 (C-6’’); 60,24 (OCH3). Dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy sự có mặt của một vòng thơm thông qua sự xuất hiện của hai tín hiệu doublet tại H 7,40 ppm (H-2‘ và H-6‘) và 6,83 (H-3‘ và H-5‘) với hằng số tương tác J = 8,5 Hz và tín hiệu singlet tại 8,43 ppm (1H, s, H-2) cho thấy sự có mặt của khung isoflavon trong phân tử hợp chất 2. Ngoài ra còn thấy sự có mặt của một gốc đường glucose với các tín hiệu trên phổ 1 H-NMR tại H 5,08 ppm (d, J = 7,5 Hz, H- 1’’), 3,36 (m, H-2’’), 3,34 ppm (m, H-3’’), 3,19 ppm (dd, J = 9 Hz, 8Hz, H-4’’), 3,44 ppm (m, H-5’’), 3,73 ppm (d, J = 10,5Hz, Ha- 6’’), 3,45 ppm (d, J = 7,5Hz, Hb-6’’) và các tín hiệu phổ 13C-NMR tại C 100,17 ppm (C- 1’’), 73,11 ppm (C-2’’), 76,67 ppm (C-3’’), 69,24 ppm (C-4’’), 77,26 ppm (C-5’’), 60,64 ppm (C-6’’). Hằng số tương tác JH-1“/H-2“ là 7,5 Hz cho thấy sự hình thành liên kết O-glucosid và cấu hình  của proton anome. Trên phổ 13 C-NMR xuất hiện 20 tín hiệu tương ứng với 22 nguyên tử C do hai tín hiệu CH tại C 130,11 và 115,05 xuất hiện với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu C khác. Tín hiệu singlet trên phổ 1H-NMR tại H 3,80 và tín hiệu trên phổ 13C-NMR tại C 60,24 gợi ý sự có mặt của một nhóm -OCH3. Từ dữ liệu phổ thu được ở trên, kết hợp so sánh với dữ phổ công bố của hợp chất tectoridin ở tài liệu tham Bùi Thị Bình và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 51 - 54 54 khảo [3] có thể khẳng định rằng hợp chất 2 là tectoridin. KẾT LUẬN Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp phổ, chúng tôi đã phân lập và nhận dạng cấu trúc của 2 hợp chất chủ yếu bằng các phương pháp phổ (MS, 1H-NMR, 13 C-NMR) từ dịch chiết ethanol 96% của lá xạ can gồm -sitosterol (1) và tectoridin (2). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nxb KH&KT, tr. 1095-1098. 2. Đỗ Thị Thanh Huyền, Nguyễn Mạnh Cường, Ngọ Thị Phương và cs (2013), “Các hợp chất flavonoid từ thân rễ xạ can”, Tạp chí Dược liệu, 18, tr. 243-248. 3. Mingchuan Liu, Shengjie Yang, Linhong Jin, Deyu Hu, Zhibing Wu and Song Yang (2012), “Chemical Constituents of the Ethyl Acetate Extract of Belamcanda chinensis (L.) DC Roots and Their Antitumor Activities”, Molecules, 17, pp. 6156-6169. 4. Sanghuyn Lee, Jiyoung Jyu, Dongwook Son, et all (2004), “Dercusin from the Rhizome of Belamcanda chinnesis”, Nature Product Sciences, 10(2), pp. 89-91. 5. Xu M. P., He P., Duan C. X., Yang M. (2014), “Study on relieving effects of exogenous SNP, Spd on Belamcanda chinensis under salt-alkalline stress”, Phytomedicine, 39(23), pp. 4553-4558. 6. Wu C., Li Y., Chen Y., Lao X., Sheng L., Dai R., Meng W., Deng Y., (2011), “Hypoglycemic effect of Belamcanda chinensis leaf extract in normal and STZ-induced diabetic rats and its potential active faction”, Phytomedicine, 18(4), pp. 292-299. SUMMARY ISOLATION OF Β-SITOSTEROL, TECTORIDIN FROM THE LEAF OF BELAMCADA CHINENSIS (L.) DC. IN VIETNAM Bui Thi Binh 1 , Le Cong Huan 1* , Khong Thi Hoa 1 , Nguyen Thi Hong 1 , Dang Thu Hang 1 , Nguyen Thi Hong Hanh 2 , Do Thi Ha 3 1Thai Binh University of Medicine and Phamacy, 2 TNU - University of Medicine and Pharmacy, 3National Institute of Medicinal Material Belamcada chinensis (L.) DC. is a a medicinal plant that has been used to treat cough, sputum, pharyngitis, tonsillitis, phlegmatic tonsillitis. In the country, there have been many papers on the chemical composition of radish roots, but there have not been many publications on the chemical composition of leaves. Therefore, in this article we have studied the leaf extracts of Belamcada chinensis (L.) DC. As a result, two compounds were isolated: β-sitosterol (1), tectoridin (2). Their structure were determined on the basis of physiological data and analysis of NMR, MS, IR spectral analysis in comparison with the pulish data. Keywords: Belamcada chinensis, leaf, flavonoid, -sitosterol, tectoridin Ngày nhận bài: 29/5/2018; Ngày phản biện: 30/6/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018 * Email: [email protected]