Nhân nhanh hoa Hoàng lan bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi Soma - Bùi Thị Tường Thu

72 33(4): 72-78 Tạp chí Sinh học 12-2011 NHÂN NHANH HOA Hoàng LAN BằNG Kỹ THUậT NUÔI CấY PHÔI SOMA Bùi Thị T−ờng Thu, Trần Văn Minh Viện Sinh học nhiệt đới Vi nhân giống truyền thống trên loài hoa lan hiện nay dẫn đến một vấn đề mà các phòng thí nghiệm vi nhân giống th−ờng gặp phải đó là tốn nhiều chi phí lao động để sản xuất cây con với khối l−ợng lớn, khi đ−a ra thị tr−ờng giá thành cây con lại cao [7]. Hệ thống nhân giống bằng phôi vô tính [2] sẽ giải quyết đ−ợc rào cản nêu trên với các lợi thế: nhân nhanh d−ới dạng tế bào, phôi vô tính là một thể biệt hóa có hệ số tái sinh cao, tốn ít chi phí lao động và giá thành hạ [4]. Vật liệu khởi đầu là thể phôi giả (PLB) và bẹ lá non in vitro trong nuôi cấy phôi vô tính có vai trò đảm bảo đ−ợc đặc điểm di truyền bố mẹ và duy trì hệ số tái sinh cao trong thời gian dài [9]. Môi tr−ờng nuôi cấy phôi vô tính thích hợp chiếm vai trò quan trọng trong quá trình sinh tr−ởng và biệt hóa tế bào phôi [1]. Điều khiển quá trình biệt hóa và tái sinh phôi vô tính d−ới tác động của các chất điều hòa sinh tr−ởng BA, kinetin, TDZ, NAA đV trở thành quy luật [3]. PLB là một thể đa phôi phôi đặc biệt phát sinh trong nuôi cấy các lòai hoa lan chịu nhiều tác động của cytokinin [8]. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa, nuôi cấy tạo phôi soma, và tái sinh phôi soma là rào cản đầu tiên trong kỹ thuật nuôi cấy phôi soma [5, 10]. Bài báo này nghiên cứu nhân nhanh hoa hoàng lan thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi soma. I. PHƯƠNG PHáP nghiên cứu 1. Nguyên liệu Nguyên liệu là giống hoa hoàng lan Dendrobium cv. sonia earsakul nhập nội từ Singapore. Mẫu nuôi cấy: (i) Corm đỉnh sinh tr−ởng chồi in vitro 20 ngày tuổi; (ii) Lá non (còn bẹ lá trắng) chồi in vitro 20 ngày tuổi; (iii) PLB đ−ợc cắt lát mỏng. 2. Ph−ơng pháp Môi tr−ờng dinh d−ỡng khoáng cơ bản đ−ợc sử dụng trong nuôi cấy là MS (Murashige &. Skoog, 1962) [6]. Có bổ sung: BA (6- benzylaminopurine), TDZ (thidiazuron), kinetin (6-furfurylaminopurine), IAA (β-indolacetic acid), IBA (β-indolacetic acid), NAA (α- napthalene acetic acid), B1 (5 mg/l), n−ớc dừa, đ−ờng sucrose (30 g/l). Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng 26 ± 2oC, RH = 65%, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, c−ờng độ chiếu sáng 33,3 àmol/m2/s, tốc độ lắc 100 rpm. Thiết kế thí nghiệm: bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên, 3 lần lập lại, mỗi lần lập lại nuôi cấy 3 bình tam giác (chứa 60 ml môi tr−ờng bán rắn hay 50 ml môi tr−ờng lỏng). Số liệu đ−ợc phân tích bằng phầm mềm MSTATC (t = 0,05). II. KếT QUả Và THảO LUậN 1. Nuôi cấy tạo thể phôi PLB Chồi non hoa lan in vitro có độ tuổi 20 ngày nuôi cấy đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy là lá non còn bẹ trắng. Mẫu đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng tạo phôi PLB: MS + CW (10%) có bổ sung IAA, IBA, NAA, BAvà TDZ. Kết quả nghiên cứu cho thấy (bảng 1): Sau 45 ngày, PLB xuất hiện mạnh trên môi tr−ờng nuôi cấy MS + CW (10%) có bổ sung các tổ hợp chất điều hòa sinh tr−ởng IBA+BA, IAA+BA. Bổ sung tổ hợp TDZ+NAA và TDZ cho phát sinh 3,4-8,2 PLB/ mẫu nuôi cấy; trong đó tổ hợp TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) đạt hiệu suất tạo 8,2 PLB/mẫu. PLB đ−ợc tách rời khỏi mẫu nuôi cấy, đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu vi nhân giống hay nuôi cấy tạo tế bào soma. 73 Bảng 1 ảnh h−ởng của chất điều hòa sinh tr−ởng đến phát sinh thể phôi PLB Chất điều hòa sinh tr−ởng Tỷ lệ phát sinh PLB (%) Số PLB /mẫu 2,4D (0,1 mg/l) 100 1,2 2,4D (0,2 mg/l) 100 1,5 2,4D (0,3 mg/l) 100 1,6 2,4D (0,4 mg/l) 100 1,8 2,4D (0,5 mg/l) 100 2,0 2,4D (1 mg/l) 92 2,2 2,4D (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 83 2,0 IBA (0,5 mg/l) 100 2,4 IBA (0,5 mg/l) + BA (1 mg/l) 80 3,6 IAA (0,5 mg/l) 100 2,2 IAA (0,5 mg/l) + BA (1 mg/l) 100 3,4 Kinitin (0,5 mg/l) + 2,4D (0,5 mg/l) 100 2,6 Kinitin (0,5 mg/l) + IAA (0,5 mg/l) 100 2,8 Kinitin (2 mg/l) + 2,4D (0,5 mg/l) 80 3,8 Kinitin (2 mg/l) + IAA (0,5 mg/l) 93 4,2 TDZ (1 mg/l) 92 5,8 TDZ (3 mg/l) 96 2,8 NAA (0,5 mg/l) 100 2,6 TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) 100 8,2 TDZ (3 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) 100 5,6 CV% 12,8 9,4 2. Nuôi cấy tạo dịch huyền phù mô sẹo phôi hóa Mẫu nuôi cấy là PLB đ−ợc cắt thành từng lát mỏng dày 1 mm và đ−ợc đ−a vào nuôi cấy trên môi tr−ờng phát sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (30%) có bổ sung 2.4D (0-0,3-0,5 mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy, mô sẹo hình thành trên bề mặt lát cắt, trên môi tr−ờng agar MS + CW (30%) + 2.4D (0,5 mg/l). Lát cắt có mô sẹo đ−ợc đ−a vào nuôi cấy trong môi tr−ờng lỏng MS + CW (30%) + 2.4D (0,5 mg/l), sau 8 tuần nuôi cấy, lọc lọai bỏ lát cắt PLB, đ−ợc dịch huyền phù tế bào mô sẹo. Môi tr−ờng nuôi cấy tạo mô sẹo là MS không bổ sung chất điều hòa sinh tr−ởng (0- PGR) và phát sinh tạo dịch huyền phù tốt nhất là MS + CW (30%) + 2.4D (0,3 mg/l) (bảng 2). Bảng 2 ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy đến phát sinh mô sẹo Môi tr−ờng nuôi cấy Trên agar (4 tuần) Trong lỏng (4 tuần) Tỷ lệ phát sinh mô sẹo (%) Tạo dịch huyền phù tế bào mô sẹo (mg/50ml) 2.4D (0,3 mg/l) 2.4D (0,3 mg/l) 50 1.286 2.4D (0,5 mg/l) 2.4D (0,5 mg/l) 70 1.864 2.4D (0,0 mg/l) 2.4D (0,3 mg/l) 100 1.483 CV% 12 10,8 3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào mô sẹo phôi hóa Mô sẹo từ nghiên cứu trên đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh mô sẹo phôi hóa. Khối l−ợng mô sẹo đ−a vào nuôi cấy 500 mg/mẫu. Môi tr−ờng nuôi cấy tăng sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) và 2.4D (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) và đối chứng không bổ sung chất điều hòa 74 sinh tr−ởng (0-PGR). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy, mô sẹo phôi hóa tăng sinh nhanh trên môi tr−ờng có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) đạt hệ số tăng sinh 4,6 và cao hơn so với đối chứng (hệ số tăng sinh 2,2) (bảng 3). Theo nhiều tác giả, do mô sẹo hoa hoàng lan có hiện t−ợng họai tử sau thời gian dài nuôi cấy, nên môi tr−ờng duy trì tăng sinh mô sẹo phôi hóa là môi tr−ờng nuôi cấy cách quảng có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) và 0- PGR là thích hợp. Bảng 3 ảnh h−ởng của chất điều hòa sinh tr−ởng đến tăng sinh tế bào mô sẹo Môi tr−ờng nuôi cấy NAA (mg/l) 2.4D (mg/l) Sinh khối tế bào mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy (mg) Hệ số tăng sinh sau 30 ngày nuôi cấy 0,0 0,0 1.146 2,2 0,1 - 1.425 2,8 0,5 - 1.628 3,2 1,0 - 1.846 3,6 - 0,1 1.245 2,4 - 0,5 1.672 3,2 - 1,0 1.656 3,8 0,5 0,1 2.374 4,6 0,5 0,5 2.136 4,2 CV% 12,4 9,6 4. ảnh h−ởng của mô nuôi cấy đến tái sinh mô sẹo phôi hóa Mẫu nuôi cấy là PLB đ−ợc cắt thành từng lát mỏng dày 1 mm và lá non tách rời còn bẹ trắng (chồi in vitro 10-20 mm), chồi đỉnh và hạt lai đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa. Khối l−ợng mô sẹo đ−a vào nuôi cấy tái sinh là 500 mg/mẫu. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy: Trên môi tr−ờng nuôi cấy phát sinh tạo mô sẹo phôi hóa: MS + 2.4D (0,5 mg/l) + CW (10%). Cả bốn lọai mô đ−a vào nuôi cấy đều phát sinh mô sẹo phôi hóa (72-92% mẫu tạo mô sẹo) (bảng 4). Mô sẹo phôi hóa tăng sinh nhanh trong nuôi cấy kéo dài. Mô sẹo phôi hóa đặt d−ới ánh sáng có điểm xanh. Mô sẹo phôi hóa đặt d−ới ánh sáng khuếch tán có màu trắng ngà. Mô sẹo xanh đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu tái sinh, mô sẹo vàng ngà thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh trong môi tr−ờng lỏng. Môi tr−ờng nuôi cấy tái sinh mô sẹo phôi hóa: MS + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,5 mg/l). Sau 30 ngày nuôi cấy: Mô sẹo phôi hóa từ bốn lọai mô đ−a vào nuôi cấy đều có khả năng tái sinh cao. Hiệu suất tái sinh 100% loại mẫu đ−a vào nuôi cấy. Số chồi đạt trung bình 6,2-8,6 chồi/mẫu nuôi cấy. Bảng 4 ảnh h−ởng của mô nuôi cấy đến tái sinh mô sẹo Môi tr−ờng nuôi cấy tạo mô sẹo (sau 30 ngày nuôi cấy) Mẫu nuôi cấy Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Hệ số tăng sinh cấy truyền Hiệu suất tái sinh (chồi/cụm) Lát cắt PLB 74 3,8 8,4 Bẹ lá non 92 4,2 6,2 Từ chồi đỉnh 74 3,6 8,6 Từ hạt lai 72 3,8 7,2 5. Tái sinh mô sẹo phôi hóa Mô sẹo từ nghiên cứu trên đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu tái sinh mô sẹo phôi hóa. Khối l−ợng mô sẹo đ−a vào nuôi cấy 500 mg/mẫu đV 75 đ−ợc cấy truyền 6 lần. Môi tr−ờng nuôi cấy tái sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) và 2.4D (0-0,1- 0,5-1,0 mg/l) và đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh tr−ởng (0-PGR). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh đạt 74-100% trên các nghiệm thức chất điều hòa sinh tr−ởng bổ sung. Số chồi đạt cao 6,8 chồi/cụm ở tổ hợp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l) (bảng 5). Tỷ lệ tái sinh cao ở mô sẹo, cho thấy tế bào mô sẹo phôi hóa là đơn vị nhân giống thích hợp trong nuôi cấy lỏng. Bảng 5 ảnh h−ởng của chất điều hòa sinh tr−ởng đến tái sinh mô sẹo phôi hóa Chất điều hòa sinh tr−ởng NAA (mg/l) BA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh (%) sau 30 ngày nuôi cấy Số chồi /cụm 0,0 0,0 74 2,0 0,1 - 76 3,2 0,5 - 82 2,2 1,0 - 84 1,8 - 0,1 100 3,6 - 0,5 100 4,2 - 1,0 100 3,8 0,1 0,1 100 6,8 0,1 0,5 100 4,4 0,1 1,0 100 4,2 CV% 10,6 8,8 6. Nuôi cấy tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa: Mô sẹo từ nghiên cứu trên đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa. Khối l−ợng mô sẹo đ−a vào nuôi cấy 1g/50ml thể tích môi tr−ờng đV đ−ợc cấy truyền 6 lần. Môi tr−ờng lỏng nuôi cấy tăng sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0-0,1-0,5-1,0 mg/l) và 2.4D (0- 0,1-0,5-1,0 mg/l) và đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh tr−ởng (0-PGR). Bảng 6 ảnh h−ởng của chất điều hòa sinh tr−ởng đến tăng sinh dịch huyền phù mô sẹo Môi tr−ờng nuôi cấy NAA (mg/l) 2.4D (mg/l) Sinh khối dịch huyền phù tế bào mô sẹo (mg) Hệ số tăng sinh 0,0 0,0 2.248 3,2 0,1 - 5.672 5,6 0,5 - 4.274 4,2 1,0 - 2.834 2,8 - 0,1 5.896 5,8 - 0,5 4.688 4,6 - 1,0 3.282 3,2 0,5 0,1 11.496 11,4 0,5 0,5 8.224 8,2 CV% 14,2 8,8 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy, dịch huyền phù mô sẹo phôi hóa tăng sinh nhanh trên môi tr−ờng có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l), đạt hệ số tăng sinh 11,4 và cao hơn so với đối chứng (hệ số tăng sinh 2,2) (bảng 6). Theo nhiều tác giả, do mô 76 sẹo hóa hoàng lan có hiện t−ợng họai tử sau thời gian dài nuôi cấy, nên môi tr−ờng duy trì tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa là môi tr−ờng nuôi cấy cách quVng có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) và 0-PGR là thích hợp hơn cả. 7. Nuôi cấy cảm ứng phát sinh phôi Nuôi cấy cảm ứng phát sinh phôi là nuôi cấy kích thích mô sẹo phôi hóa biệt hóa thành phôi soma trong môi tr−ờng nuôi cấy lỏng. Dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa đ−ợc cấy truyền 6 lần đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy. Khối l−ợng tế bào đ−a vào nuôi cấy là 10 g/50 ml thể tích môi tr−ờng. Môi tr−ờng nuôi cấy họat hóa phát sinh phôi MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0,1 mg/l) + BA(0,1 mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy, hiệu suất họat hóa phát sinh phôi (tế bào phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi) đạt cao nhất 88,4% trên môi tr−ờng nuôi cấy MS + CW (10%) + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l) (bảng 7). Tốc độ tăng sinh giảm nhanh, ng−ợc lại tốc độ phân hóa phôi tăng nhanh. Dịch huyền phù phân hóa phôi cao sau 4 tuần nuôi cấy, sau giai đọan này tế bào mô sẹo tăng sinh khối, làm giảm hiệu suất họat hóa (42,4% sau 6 tuần nuôi cấy). Bảng 7 ảnh h−ởng của thời gian nuôi cấy đến hiệu suất họat hóa cảm ứng phát sinh phôi Thời gian nuôi cấy (tuần) Mật độ tế bào hoạt hoá (CFU/ml) sau 4 tuần Hiệu suất hoạt hoá (%) so với mật độ tế bào ban đầu 1 0,8 ì 104 58,0 2 0,9 ì 104 68,3 3 1,2 ì 104 82,6 4 1,4 ì 104 88,4 5 0,8 ì 104 50,6 6 0,7 ì 104 42,4 CV% 12,4 9,2 8. Trải và tái sinh tế bào phôi soma trên môi tr−ờng agar Bảng 8 ảnh h−ởng của chất điều hòa sinh tr−ởng đến tái sinh phôi Môi tr−ờng nuôi cấy có bổ sung NAA (mg/l) BA (mg/l) TDZ (mg/l) Tỷ lệ tái sinh (%) Số chồi /5ml dịch huyền phù tế bào phôi - - - 86 12 0,1 - - 68 10 0,2 - - 72 8 - 0,1 - 100 16 - 0,2 - 100 18 - - 0,1 92 14 - - 0,2 78 16 0,1 0,1 - 100 22 0,1 0,2 - 100 24 0,1 - 0,1 100 15 0,1 - 0,2 100 18 CV% 10.8 10 Dịch huyền phù tế bào phôi hóa đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy. Thể tích trải nuôi cấy 5 ml/60 ml môi tr−ờng nuôi cấy bán rắn. Môi tr−ờng nuôi cấy trải và tái sinh dịch 77 huyền phù phôi soma MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0,1-0,2 mg/l), TDZ (0,1-0,2 mg/l), BA(0,1-0,2 mg/l), và đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh tr−ởng (0-PGR). Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 45 ngày nuôi cấy: TDZ ức chế quá trình phát sinh mô sẹo, tế bào bị họai tử cao, hạn chế tỷ lệ tái sinh. Môi tr−ờng nuôi cấy có bổ sung tổ hợp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l) và môi tr−ờng 0- PGR, cho phát sinh mô sẹo đi đôi với tái sinh (bảng 8). Số chồi đỉnh đạt cao (24 chồi đỉnh/5 ml dịch huyền phù tế bào phôi nuôi cấy) trên môi tr−ờng MS + CW (10%) có bổ sung tổ hợp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l). Sau 60 ngày nuôi cấy, mô sẹo phát triển nhanh trên môi tr−ờng có bổ sung tổ hợp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l), đi đôi với sự hình thành cụm chồi từ mẫu mô phôi nuôi cấy. III. KếT LUậN Nuôi cấy tạo thể phôi PLB: Chồi non hoa lan in vitro có độ tuổi 20 ngày nuôi cấy đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy là lá non còn bẹ trắng. PLB xuất hiện mạnh trên môi tr−ờng nuôi cấy MS + CW (10%) có bô sung tổ hợp TDZ (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) đạt hiệu suất tạo 8,2 PLB/mẫu. PLB đ−ợc tách rời khỏi mẫu nuôi cấy, đ−ợc sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu vi nhân giống hay nuôi cấy tạo tế bào soma. Nuôi cấy tạo dịch huyền phù mô sẹo phôi hóa: Mô sẹo hình thành trên lát cắt PLB trên môi tr−ờng agar MS + CW (30%) + 2.4D (0,5 mg/l) sau 4 tuần nuôi cấy. Lát cắt PLB có mô sẹo đ−ợc đ−a vào nuôi cấy trong môi tr−ờng lỏng MS + CW (30%) + 2.4D (0,5 mg/l), sau 8 tuần nuôi cấy, thu nhận dịch huyền phù tế bào mô sẹo. Nuôi cấy tăng sinh tế bào mô sẹo phôi hóa: Môi tr−ờng nuôi cấy tăng sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) đạt hệ số tăng sinh 4,6 cao hơn so với đối chứng 2,2. ảnh h−ởng của mô nuôi cấy đến tái sinh mô sẹo phôi hóa: Sau 30 ngày nuôi cấy: Trên môi tr−ờng nuôi cấy phát sinh tạo mô sẹo phôi hóa: MS + 2.4D (0,5 mg/l) + CW (10%). Cả bốn lọai mô đ−a vào nuôi cấy đều phát sinh mô sẹo phôi hóa. Trên môi tr−ờng nuôi cấy tái sinh mô sẹo phôi hóa: MS + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,5 mg/l). Mô sẹo phôi hóa từ hai lọai mô nuôi cấy đều có hiệu suất tái sinh 100%, đạt 6-8 chồi/mẫu nuôi cấy. Tái sinh mô sẹo phôi hóa: Môi tr−ờng nuôi cấy tái sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l). Sau 30 ngày nuôi cấy: Tỷ lệ tái sinh đạt 74-100% trên các nghiệm thức. Số chồi đạt cao 6,8 chồi/cụm. Nuôi cấy tăng sinh dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa: Môi tr−ờng lỏng nuôi cấy tăng sinh mô sẹo phôi hóa MS + CW (10%) có bổ sung NAA (0,5 mg/l) + 2.4D (0,1 mg/l) có hệ số tăng sinh 11,4 và cao hơn so với đối chứng (hệ số tăng sinh 2,2) sau 30 ngày nuôi cấy. Nuôi cấy cảm ứng phát sinh phôi: Hiệu suất họat hóa (tế bào phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi) đạt 88,4% trên môi tr−ờng nuôi cấy MS + CW (10%) + NAA (0,1 mg/l) + BA (0,1 mg/l) sau 30 ngày nuôi cấy. Trải và tái sinh tế bào phôi soma trên môi tr−ờng agar: Dịch huyền phù tế bào phôi hóa đ−ợc trải nuôi cấy 5 ml/60 ml trên môi tr−ờng nuôi cấy bán rắn MS + CW (10%) có bổ sung tổ hợp NAA (0,1 mg/l) + BA (0,2 mg/l). Sau 45 ngày nuôi cấy: cho phát sinh mô sẹo đi đôi với tái sinh tới 24 chồi đỉnh/5ml dịch huyền phù tế bào phôi. Lời cảm ơn: Chân thành cám ơn Văn phòng Các ch−ơng trình trọng điểm cấp nhà n−ớc và Ch−ơng trình Công nghệ sinh học KC04 đV cấp kinh phí thực hiện đề tài KC04.15/06-10 “ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào, công nghệ phôi soma và bioreactor trong nhân nhanh các cây trồng kinh tế”. TàI LIệU THAM KHảO 1. Arditti J., 2008: Micropropagation of orchids. Blackwell Publishing, 1523 pages. 2. Chandler S. F., Lu C. Y., 2005: Biotechnology in ornamental horticulture. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41: 591-601. 3. Chung H. H., Chen J. T., Chang W. C., 2005: Cytokinin induce direct somatic embryogenesis of Dendrobium Chiengmai Pink and subsequent plant regeneration. In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant, 41: 765-769. 78 4. Gamborg O. L., 2002: Plant tissue culture: biotechnology and milestones. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 38: 84-92. 5. Jaime A., Teixeira da Silva, Singh N., Tanaka M., 2006: Priming biotic factorsfor optomal PLB and callus induction in hybrid Cymbidium, and assessment of cytogenetic stability in regenerated plants. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 84: 135-144. 6. Murashige T., Skoog R., 1962: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 431-497. 7. Paek K. Y., Chakrabarty D., Hahn E. J., 2005: Application of bioreactor systems for large scale production of horticultural and medicinal plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 81: 287-300. 8. Park S. Y., Yeung E. C., Chakrabarty D., 2002: An efficient direct induction of PLB from leaf subepidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin-section culture. Plant Cell Report, 21: 46-51. 9. Roy J., Naha S., Majumdar M., Banerjee N., 2007: Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot- tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl. (Orchidaceae). Plant Cell Tiss Organ Cult, 90: 31-39. 10. Zhao, P 10.1007/s11627-007-9101-2 - aff1, Wu F 627-007-9101-2 - aff1, Feng FS 27-007-9101-2 - aff1, Wan-Jun Wang WJ (2008). Protocorm-like body (PLB) formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrobium candidum Wall ex Lindl. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 44(3): 178-185. MICROPROPAGATION OF DENDROBIUM SP. VIA SOMATIC EMBRYOGENESIS CULTURE Nguyen Thi Ngoc Tu, Bui Thi Tuong Thu, Tran Van Minh SUMMARY Protocorm like bodies were used as planting materials. PLBs were cut into slices and placed on the medium for callus initiated. Callus was initiated on the medium MS + CW (30%) + 2.4D (0.5 mg/l). Callus proliferates on the medium MS + CW (10%) supplemented with NAA (0.5 mg/l) + 2.4D (0.1 mg/l). Callus was regenerated on the medium MS + (10%) supplemented with + NAA (0.1 mg/l) + BA (0.1 mg/l). Somatic cell suspension was initiated on MS + 2.4D (0.5 mg/l) and proliferated on the medium MS + CW (10%) supplemented was NAA (0.5 mg/l) + 2.4D (0.1 mg/l). Somatic cell suspension was differentiated to embryogenic cell suspension on the medium MS + CW (10%) supplemented with NAA (0.1 mg/l) + BA (0.1 mg/l). Embryogenic cell suspension was plating and regeneration on the medium MS + CW (10%) + NAA (0.1 mg/l) + BA (0.1 mg/l). Ngày nhận bài: 2-8-2010