Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi ngọn dứa (ananas comosus)

An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 84 NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME BROMELAIN THÔ TỪ CHỒI NGỌN DỨA (ANANAS COMOSUS) Nguyễn Phú Thọ1 1Trường Đại học An Giang Thông tin chung: Ngày nhận bài: 31/08/2017 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 07/06/2018 Ngày chấp nhận đăng: 08/2018 Title: A study of the extraction of crude bromelain from the pineapple bud (Ananas comosus) Keywords: Acetone precipitation, bromelain, drying precipitation, pineapple bud (Ananas comosus) Từ khóa: Chồi dứa (Ananas comosus), bromelain, kết tủa acetone, sấy khô kết tủa ABSTRACT This paper presents the study of the extraction of crude bromelain from the pineapple bud. The project objectives were the establishment of the simple bromelain production procedure which based on studies of (a) Appropriate extraction conditions of bromelain from pineapple bud; (b) The effects of precipitants on bromelain activity; (c) Appropriate temperature of drying; (d) Applying extracted bromelain to hydrolysis of Tra fish by-product. The results showed that the appropriate ratio between pineapple bud and distilled water was 1:3. The best precipitant was acetone with the ratio between pineapple bud and acetone = 1:1. The optimum drying temperature was 45 oC within 4 hours. This bromelain product had the hydrolysis property higher than the commercial one (Sigma - Aldrich). TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu quy trình sản xuất bột bromelain đơn giản và rẻ tiền dựa trên các nghiên cứu: (a) Điều kiện trích ly bromelain từ chồi ngọn dứa; (b) Ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến bromelain; (c) Nhiệt độ sấy khô kết tủa bromelain; (d) Thử khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra giữa bromelain sản phẩm và bromelain thương mại. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nước là dung môi thích hợp để trích ly bromelain từ chồi ngọn dứa với tỷ lệ chồi ngọn:nước là 1:3. Acetone cho hiệu quả tủa bromelain chồi ngọn tốt nhất. Tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone là 1:1. Nhiệt độ sấy khô kết tủa tối ưu là 45 oC, thời gian sấy 4 giờ. Bromelain sản phẩm thu được có khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra. Khả năng thủy phân của bromelain sản phẩm thí nghiệm cao hơn bromelain thương mại (Sigma - Aldrich). 1. GIỚI THIỆU Bromelain là một loại enzyme thủy phân đạm (proteinase) được tìm thấy trong toàn bộ cây dứa cũng như trong các phế phụ phẩm của dứa (Ananas comosus), đây là một enzyme được ứng dụng rộng rãi trong y học và chế biến thực phẩm. Trong ngành công nghệ chế biến dứa sẽ có các phế phẩm như lõi, chồi, vỏ và lá. Phần phế phẩm này chiếm một tỷ lệ lớn của lượng dứa nguyên liệu đưa vào chế biến, khoảng 70% An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 85 (Nguyễn Bá Mùi, 2005). Tuy nhiên ở Việt Nam, một nước nhiệt đới có sản lượng dứa lớn, việc tách bromelain từ phế phụ phẩm tạo chế phẩm thương mại ứng dụng trong công nghiệp chưa nhiều. Ở các nông trường trồng dứa, cây và lá dứa bị bỏ khô trên đất hoặc được vùi làm phân bón. Ở các nhà máy chế biến rau quả, phần lớn phụ phẩm dứa được đưa ra bãi rác gây ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ tình hình thực tế trên đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa (Ananas comosus)” được thực hiện nhằm bước đầu xây dựng quy trình thu nhận bromelain thô từ chồi dứa góp phần đáp ứng được nhu cầu sử dụng enzyme; làm tăng giá trị kinh tế của cây dứa. Mặt khác, đề tài còn góp phần giải quyết được một phần nguồn phụ phẩm từ công nghiệp chế biến dứa. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu nghiên cứu Nguyên liệu: Phụ phẩm chồi dứa được chọn là chồi ngọn thu tại các chợ trên địa bàn thành phố Long Xuyên. Hóa chất: Coomasie Brillant Blue G250 (Merck), L-Cystein (Merck), Casein (Trung Quốc), Tyrosin (Merck), Tricloroacetic acid (Trung Quốc), EDTA, NaH2PO4 và Na2HPO4 (Trung Quốc) để pha dung dịch đệm phosphat có pH = 7, H3PO4, 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Trích ly bromelain từ chồi ngọn dứa Chồi ngọn dứa sau khi loại hết lá, rửa sạch, nghiền nhuyễn và được ly trích bằng hai loại dung dịch: nước cất; đệm phostphat 50 mM, pH=7. Nước cất hoặc đệm được cho lần lượt vào các cốc chứa 10 g chồi ngọn đã nghiền nhuyễn với thể tích khác nhau 20 ml, 30 ml, 40 ml và 50 ml. Khuấy đều trên máy khuấy từ trong 15 phút. Sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC. Bỏ cặn, lấy dịch enzyme trong bên trên để xác định hoạt tính bromelain. 2.2.2 Ảnh hưởng của tác nhân tủa lên hoạt tính bromelain Bromelain được trích ly từ chồi ngọn bằng nước cất với tỷ lệ chồi ngọn:nước thích hợp. Sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC. Lấy dịch trích enzyme ở phía trên đem tủa với các tác nhân: acetone (với tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone lần lượt là 1/1, 1/2, 1/3 và 1/4); ethanol 960 (với tỷ lệ dịch trong:ethanol lần lượt là 1/4, 1/5, 1/6 và 1/7); (NH4)2SO4 (30%, 40%, 50% và 60%). Kết thúc quá trình tủa tiến hành ly tâm ở 13.000 vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC. Thực hiện đo hoạt tính trước và sau khi tủa. 2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính bromelain trong quá trình sấy Bromelain được trích ly từ chồi ngọn bằng nước cất với tỷ lệ chồi ngọn:nước là 10 g:30 ml. Dịch trích enzyme được tủa bằng acetone với tỷ lệ dịch trích enzyme:acetone là 1:1. Kết thúc quá trình tủa ly tâm ở 13.000 vòng/phút, trong 10 phút, 4 oC để thu lấy tủa. Trải kết tủa thật mỏng trên khai nhựa, sấy đối lưu tự nhiên bằng tủ sấy Memmert UNB500 ở nhiệt độ 45 oC, 55 oC, 65 oC và để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 30 oC. Cứ sau 2 giờ lấy mẫu một lần ở mỗi nhiệt độ sấy tương ứng để xác định hoạt tính. 2.2.4 So sánh khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra giữa sản phẩm bromelain thí nghiệm và bromelain thương mại Phụ phẩm cá tra gồm đầu, xương, bụng được nghiền nhuyễn và tách béo. Bổ sung enzyme bromelain trong nghiên cứu và bromelain thương mại với nồng độ 0,1%. Tiến hành thủy phân trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 37 oC. Mẫu đối chứng không bổ sung enzyme. Khối lượng cho mỗi mẫu thủy phân là 1 kg phụ phẩm. Khi thủy phân xong, chiết lấy dịch thủy phân và nâng nhiệt độ lên 100 °C trong 15 phút để vô hoạt enzyme. Sau đó dịch thủy phân được lọc và phân tích hàm lượng đạm amin. 2.3 Phương pháp phân tích 2.3.1 Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradfrod (1996). Nồng độ protein được xác định sau khi cho tác dụng với Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250. Chất này kết hợp An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 86 với protein trong điều kiện axít tạo nên phức màu xanh tím hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein trong dung dịch. Dựng đường chuẩn hàm lượng protein, dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ protein trong mẫu. Protein thu hồi bằng protein sau khi tủa chia cho protein trước khi tủa nhân với 100. 2.3.2 Xác định họat tính papain Hoạt tính enzyme papain được xác định dựa theo phương pháp Kunitz (1917) cải tiến, sử dụng casein làm cơ chất thủy phân và đã được điều chỉnh để có thể thực hiện trong ống eppendorf. Cho vào các ống eppendorf 600 µl 1% (w/v) casein + 40 µl Cystein 20 mM + 140 µl đệm phosphat (pH = 7,5) + 20 µl enzyme. Ống đối chứng bất hoạt enzyme bằng TCA 15%. Ủ lắc 10 phút, 37 oC. Ly tâm 13.000 rpm, 10 phút. Dung dịch được đo độ hấp thụ ánh sáng ở 275 nm. Một đơn vị hoạt tính của papain (Tyrosin Unit (TU) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein cho ra 1 µg tyrosine trong 1 phút ở 37 oC, pH =7,5. Hoạt tính đặc hiệu là số đơn vị hoạt tính của enzyme trên 1 mg protein (U/mg). Hoạt tính thu hồi bằng hoạt tính bromelain sau khi tủa chia cho hoạt tính bromelain trước khi tủa nhân với 100. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ 10 kg chồi ngọn sau khi làm sạch lá gai thu được 2 kg chồi. Rửa sạch, nghiền và trích ly được 4 L dịch chiết enzyme bromelain. Hàm lượng protein và hoạt tính của dịch trích thô đã được xác định ở Bảng 1. Bảng 1. Thành phần protein và hoạt tính bromelain trong chồi dứa Chồi ngọn chưa xử lý (kg) Chồi ngọn sau khi xử lý (kg) Thể tích (lít) Protein (mg/ml) Hoạt tính (U/ml) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) 10 2 4 1,06 4,62 4,36 Kết quả này giống với Lại Thị Ngọc Hà (2009), hoạt lực protease trong chồi ngọn và vỏ quả là cao nhất. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Thị Xuân Sâm (2005) khẳng định, bromelain thu nhận chủ yếu từ chồi và vỏ dứa. Đinh Thị Tình (2007) đã khảo sát hoạt lực protease trong các phần của quả dứa cũng cho kết quả tương tự. Như vậy, chồi ngọn là phần phụ phẩm có thể dùng để tách protease. 3.1 Ảnh hưởng của dung dịch trích và tỷ lệ trích ly đến bromelain chồi dứa Kết quả ảnh hưởng của loại dung dịch trích ly và tỷ lệ trích ly bromelain chồi ngọn dứa đến hàm lượng protein tổng và hoạt tính đặc hiệu của bromelain được trình bày ở Bảng 2. Kết quả Bảng 2 cho thấy, hàm lượng protein khác biệt không có ý nghĩa ở các nghiệm thức khác nhau. Hàm lượng protein thu được cao nhất là 1,82 mg/ml khi ly trích bằng nước với tỷ lệ 1/5 nhưng hoạt tính đặc hiệu thu được là thấp nhất (2,04 U/mg). Tương tự, hoạt tính đặc hiệu cũng khá thấp (2,27 U/mg) khi ly trích bằng đệm ở tỷ lệ 1/5. Điều này cho thấy ở hàm lượng nước cao enzyme dễ dàng bị mất hoạt tính. An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 87 Bảng 2. Ảnh hưởng của dung dịch trích ly và tỷ lệ trích ly đến lượng protein và hoạt tính đặc hiệu của bromelain Dung dịch trích ly Tỷ lệ Chồi:dung môi Protein tổng (mg) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Đệm 1/2 1,33ab 3,21a 1/3 1,25ab 3,43a 1/4 1,61ab 2,84abc 1/5 1,52ab 2,27bc Nước 1/2 1,18ab 2,06bc 1/3 1,15b 3,54a 1/4 1,70ab 2,89ab 1/5 1,82a 2,04c Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Hoạt tính đặc hiệu của bromelain (Bảng 2) khi ly trích ở tỷ lệ 1/3 bằng đệm là 3,43 U/mg và bằng nước là 3,54 U/mg cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Như vậy cho thấy, tỷ lệ 1/3 thích hợp cho việc trích ly bromelain từ chồi ngọn dứa. Tóm lại, tỷ lệ ly trích bromelain từ chồi dứa thích hợp là 1/3. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Phú Thọ và Dương Thị Hương Giang (2011) thì tỷ lệ trích ly papain (enzyme cùng nhóm với bromelain) từ nhựa đu đủ thích hợp nhất là nhựa:nước: 0,1:2 g/ml. Như vậy so sánh kết thí nghiệm với kết quả nghiên cứu này ta thấy nước là dung môi rẻ tiền có thể sử dụng để trích ly enzyme nhóm thiol protease. 3.2 Kết quả ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính bromelain Độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử enzyme với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Hình 1. Dịch trích chồi dứa trước và sau khi tủa An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 88 Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. Mỗi loại dung môi khác nhau sẽ có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính enzyme trong quá trình kết tủa. Tương tự, trong cùng một loại dung môi (hay tác nhân tủa) thì nồng độ dung môi khác nhau cũng có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt lực của enzyme. Theo Mariela, Bruno, Pardo, Caffini và López (2002), khi tủa bromelain quả với acetone, protein thu hồi đạt 90%, hoạt tính thu hồi là 94%. Ngược lại, khi tủa với ethanol protein thu hồi giảm còn 75% và hoạt tính thu hồi là 88%. Điều này cho thấy, tác nhân tủa khác nhau sẽ có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính của enzyme sau tủa. Đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của ba loại tác nhân tủa là ethanol, acetone và ammonium sulfate ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính và protein thu hồi của enzyme bromelain chồi Tỷ lệ tủa Protein thu hồi (%) Hoạt tính thu hồi (%) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Enzyme:ethanol:1:4 32,58b 36,96de 5,61e Enzyme:ethanol:1:5 38,48a 55,32ab 7,04de Enzyme:ethanol:1:6 38,98a 66,62a 8,38d Enzyme:ethanol:1:7 36,52a 43,08cde 5,78e Enzyme:acetone:1:1 12,40f 50,14bc 19,66a Enzyme:acetone:1:2 15,85ef 33,19e 11,00c Enzyme:acetone:1:3 19,29cde 48,73bcd 12,28bc Enzyme:acetone:1:4 15,85ef 43,55bcde 13,55b Ammonium sulfate (30%) 17,25de 6,97f 1,97f Ammonium sulfate (40%) 19,71cd 10,03f 2,49f Ammonium sulfate (50%) 21,61c 14,36f 3,26f Ammonium sulfate (60%) 19,78cd 12,48f 3,09f Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì không khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Đối với tác nhân tủa là ethanol, kết quả ở Bảng 3 cho thấy, protein thu hồi thấp nhất ở tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/4 (32,58%). Phần trăm protein thu hồi cao nhất là 38,48% và 38,98% tương ứng với tỷ lệ dịch trích enzyme:ethanol là 1/5 và 1/6. Tuy nhiên, với tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/7 thì phần trăm thu hồi protein lại giảm (36,52%) nhưng khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với tỷ lệ 1/5 và 1/6. Trong chiết xuất enzyme, phần trăm hoạt tính thu hồi thường dùng để đánh giá sự hiệu quả của phương pháp. Ở điều kiện tinh sạch tối ưu phần trăm hoạt tính thu hồi có thể đạt xấp xỉ 90% (Lopes và cs., 2009). Đối với hoạt tính thu hồi, ở tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/4 thì hoạt tính thu hồi thấp nhất (36,96%). Phần trăm hoạt tính thu hồi tăng lên 55,32% ở tỷ lệ 1/5. Khi tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/6, hoạt tính thu hồi tăng lên 66,62%. Tuy nhiên không có sự khác biệt ý nghĩa 5% về hoạt tính thu hồi giữa 2 tỷ lệ 1/5 và 1/6. Hoạt tính thu hồi lại giảm còn 43,08% ở tỷ lệ 1/7. Theo Lại Thị Ngọc Hà (2009), hàm lượng protein và hoạt tính thu hồi cũng tăng lên khi nồng độ ethanol trong thể tích hỗn hợp tăng An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 89 và sau đó lại giảm khi nồng độ ethanol tăng vượt quá. Hoạt tính đặc hiệu thể hiện độ tinh sạch của enzyme, hoạt tính đặc hiệu càng cao enzyme càng tinh sạch. Kết quả Bảng 3 cho thấy, khi nồng độ ethanol tăng thì hoạt tính đặc hiệu thu được sau tủa cũng tăng, nhưng khi nồng độ ethanol vượt quá cao thì hoạt tính lại giảm. Hoạt tính đặc hiệu thấp nhất ở tỷ lệ enzyme:ethanol là 1/4 (5,61 U/mg) và cao nhất ở tỷ lệ 1/6 (8,38 U/mg). Khi nồng độ ethanol tăng lên (tỷ lệ 1/7) thì hoạt tính đặc hiệu lại giảm (5,78 U/mg). Khi nồng độ ethanol quá cao thì lực tương tác tĩnh điện tăng lên, kết quả làm cho các phân tử enzyme bị vặn uốn gây ảnh hưởng đến hoạt tính. So sánh giữa các nghiệm thức khảo sát có thể thấy tỉ lệ tủa enzyme:ethanol 1:6 là tối ưu nhất. Tỷ lệ 1/6 tương đương với nồng độ ethanol khoảng 82%. Kết quả này trùng khớp với Lại Ngọc Hà (2009) kết tủa bromelain chồi bằng cồn ở nồng độ 80% là tốt nhất. Đối với tác nhân tủa là acetone, kết quả thí nghiệm cho thấy, phần trăm protein thu hồi thấp nhất là 12,40% tương ứng với tỷ lệ enzyme:acetone là 1:1. Ở tỷ lệ enzyme:acetone là 1/2 phần trăm protein thu hồi là 15,85% và tăng lên 19,29% ở tỷ lệ 1/3. Tuy nhiên, phần trăm thu hồi protein lại giảm xuống còn 15,85% với tỷ lệ enzyme:acetone là 1/4. Ở nồng độ acetone quá cao, protein bị biến tính không thuận nghịch và không thể hòa tan trở lại trong nước hay dung dịch đệm sau khi kết tủa. Ở tỷ lệ enzyme:acetone là 1/1 kết tủa thu được có hoạt tính đặc hiệu cao và khác biệt so với các mẫu còn lại. Tuy hiệu suất thu hồi protein thấp nhưng hoạt tính thu hồi và hoạt tính đặc hiệu cao chứng tỏ enzyme khá sạch. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc (2010), tỷ lệ enzyme:acetone là 1/1 cũng cho hiệu quả tủa tốt nhất ở bromelain thân dứa. Đối với tác nhân tủa là ammonium sulfate, kết quả thí nghiệm cho thấy, khi lượng ammonium sulfate tăng từ 30% đến 50% thì phần trăm thu hồi protein cũng tăng. Ở 30%, lượng protein thu hồi đạt 17,25% và ở 50% ammonium sulfate bão hòa tăng đến 21,61%, sau đó giảm ở các nồng độ ammonium sulfate bão hòa cao hơn thể hiện qua lượng protein còn (19,78% thu hồi). Theo Bảng 3 thì ở nồng độ 50% ammonium sulfate bão hòa có phần trăm hoạt tính thu hồi đạt cao nhất 14,36% nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Khi nồng độ ammonium sulfate bão hòa tăng lên 60% thì hoạt tính đặc hiệu và hoạt tính thu hồi có xu hướng giảm. Như vậy có thể thấy với nồng độ ammonium sulfate 50% bão hòa thì các protein trong dung dịch đều được kết tủa với hàm lượng và hoạt tính thu hồi enzyme cao nhất. Kết quả này không khớp với nghiên cứu của Nguyễn Văn Thành và cs. (2013) khi nồng độ ammonium sulfate 70% thì hoạt tính thu hồi bromelain trong thân dứa là cao nhất. Ở nồng độ muối cao hơn 70% bão hòa, lực điện tích tăng lên, số lượng ion kết hợp với protein nhiều, lực tĩnh điện được tạo thành sẽ làm cho phân tử protein bị xoáy, vặn và dẫn đến sự biến tính (Nguyễn Đình Huyên, Hà Ái Quốc, Lâm Thị Kim Châu, Lê Thị Thanh Mai, 1994). Theo kết quả của Nguyễn Đình Huyên và cs. (1994), khi kết tủa bromelain trái bằng ammonium sulfate ở các nồng độ từ 30% đến 100% cũng đã kết luận nồng độ 70% ammonium sulfate cho hiệu suất thu hồi hoạt tính cao nhất. Dương Thị Hương Giang và cs. (2002) đã nghiên cứu đánh giá các phương pháp trích ly bromelain từ nước khóm thô bằng acetone và ammonium sulfate đã kết luận rằng, phương pháp trích ly bromelain bằng ammonium sulfate theo tỷ lệ 70% bão hòa thu nhận bromelain thô cho hiệu suất thu hồi khá cao 92% so với hoạt tính ban đầu. Như vậy cho thấy có sự khác biệt trong cấu trúc giữa bromelain trong thân, nước khóm và chồi ngọn. Tóm lại, khi so sánh giữa các tác nhân tủa thì hoạt tính đặc hiệu của các mẫu tủa bằng An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 90 ammonium sulfate là thấp hơn so với các tác nhân tủa khác. Điều này cho thấy, ammonium sulfate không cho hiệu quả tủa bromelain chồi tốt vì kết tủa chứa nhiều protein tạp. Đối với phương pháp tủa bằng acetone tỷ lệ 1/1 hoạt tính đặc hiệu của bromelain thu được cao nhất là 19,66 U/mg gấp 2 lần so với mẫu tủa bằng ethanol tỷ lệ 1/6 (8,38 U/mg) và gấp 6 lần so với mẫu tủa bằng ammonium sulfate 50% (3,26 U/mg). Với ethanol tỉ lệ 1:6, tăng thu hồi protein 3 lần, tăng hoạt tính thu hồi phần trăm cao hơn so với aceton nhưng hoạt tính đặc hiệu thấp hơn chứng tỏ trong thành phần kết tủa ngoài bromelain còn có nhiều protein tạp. Như vậy, acetone là dung môi thích hợp để tinh sạch sơ bộ bromelain chồi, mặc dù protein thu hồi tương đối thấp (khoảng 12,4%), nhưng hoạt tính đặc hiệu rất cao cho thấy về mức độ tinh sạch cũng tốt hơn nhiều so với hai tác nhân tủa còn lại. 3.3 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bromelain trong quá trình sấy khô kết tủa Nhiệt độ sấy và thời gian sấy là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm enzyme. Sấy ở nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme do protein bị biến tính. Tuy nhiên, khi sấy ở nhiệt độ thấp thì thời gian sấy kéo dài và trong thời gian này với sự hiện diện của ẩm độ cao thì sự tự phân của các protease sẽ diễn ra làm enzyme bị mất hoạt tính. Bảng 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính đặc hiệu của enzyme bromelain qua quá trình sấy Nhiệt độ (oC) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Trung bình Thời gian (giờ) 2 4 6 Phòng (30 oC) 14,48a x 14,15c x 8,08 b y 12,24 45 15,47a x 13,71bc x 10,18b y 13,12 55 15,64a x 11,98b y 8,36b z 12,00 65 14,34a x 3,13a y 0,00a z 5,82 Trung bình 14,99 10,74 6,65 Ghi chú: Các kí tự từ a – b so sánh các trung bình trong cùng một cột, các kí tự từ x – z so sánh các trung bình trong cùng một hàng. Các kí tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hoạt tính của bromelain trong quá trình sấy kết tủa được thể hiện trong Bảng 4. Kết quả Bảng 4 cho thấy, thời gian sấy càng kéo dài thì hoạt tính bromelain càng giảm. Ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ kết quả thực nghiệm cho thấy, độ ẩm của chế phẩm bromelain vẫn cao hơn 10%. Mức ẩm độ này chưa đủ để bảo quản chế phẩm được lâu vì độ ẩm càng cao thì enzyme dễ dàng bị mất hoạt tính. Đồng thời theo kết quả thí nghiệm (Bảng 4) thì ở nhiệt độ này hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời gian đặc biệt là sau 6 giờ sấy, do đó không thể làm khô tủa bromelain chồi ở nhiệt độ phòng. Ở nhiệt độ 45 °C, hoạt tính bromelain ở 2 giờ sấy là 15,47 U/mg và giảm còn 13,71 U/mg sau 4 giờ sấy. Tuy nhiên khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Sau 6 giờ sấy hoạt tính bromelain là 10,18 U/mg giảm đáng kể so với thời gian 2 giờ và 4 giờ. Như vậy, thời gian sấy thích hợp cho bromelain chồi ngọn ở 45 oC là 4 giờ. Ở 55 oC và 65 °C, khi kéo dài thời gian sấy thì hoạt tính bromelain giảm nhanh theo thời gian An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 91 và có sự khác biệt ý nghĩa giữa mốc thời gian 2 giờ và 4 giờ sấy. Không chỉ có nhiệt độ mà thời gian cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain trong quá trình sấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi thời gian sấy càng kéo dài thì hoạt tính đặc hiệu của bromelain càng giảm do càng có nhiều phân tử enzyme bị biến tính. Ở thời gian 2 giờ, hoạt tính đặc hiệu của bromelain khác biệt không có ý nghĩa khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau. Tóm lại, chế phẩm bromelain có thể sấy ở nhiệt độ 45 °C trong 4 giờ là thích hợp nhất với hoạt tính đặc hiệu là 13,71 U/mg. So với hoạt tính đặc hiệu ban đầu (18,71 U/mg) thì phần trăm hoạt tính còn lại sau khi sấy là 73,28%. So với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thành và cs. (2013) thì hoạt tính còn lại của bromelain thân dứa là 87,55% khi thực hiện sấy đông khô. Lại Thị Ngọc Hà (2009) so sánh hiệu quả của phương pháp sấy phun và sấy đông khô bromelain cho kết quả hoạt tính được giữ lại sau hai quá trình này là 96% và 73%, tương ứng. 3.4 So sánh khả năng thủy phân phụ phẩm cá tra giữa sản phẩm bromelain thí nghiệm với sản phẩm bromelain thương mại Hình 2. Bột bromelain chồi dứa sau khi sấy Sau khi sấy khô kết tủa thì thu được chế phẩm bromelain dạng bột màu trắng ngà. Tiến hành đo hoạt tính để so sánh với sản phẩm bromelain thương mại (Sigma-Aldrich). Kết quả Bảng 5 cho thấy, hoạt tính đặc hiệu của bromelain trong sản phẩm thí nghiệm cao hơn so với chế phẩm thương mại. Số đơn vị hoạt tính trên một miligam bột sản phẩm bromelain thí nghiệm là 1,12 U/mg cao hơn so với bromelain thương mại 0,91 U/mg. Như vậy, nếu sử dụng cùng một lượng bột enzyme thì sản phẩm bromelain An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 92 thí nghiệm có thể cho hiệu quả thủy phân cao hơn. Bảng 5. So sánh hoạt tính của sản phẩm bromelain thí nghiệm và bromelain thương mại Enzyme bromelain Protein (mg/mg bột) Hoạt tính (U/mg bột) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Bromelain sản phẩm 0,09a 1,12a 13,13a Bromelain thương mại (Sigma - Aldrich) 0,10b 0,91b 9,48b Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Xét về hàm lượng protein thì chế phẩm bromelain thương mại có hàm lượng protein cao hơn nhưng hoạt tính đặc hiệu thấp hơn sản phẩm thí nghiệm. Như vậy cho thấy, sản phẩm thí nghiệm có độ tinh sạch cao hơn so với sản phẩm thương mại. Bảng 6. Hàm lượng đạm amin trong dịch thủy phân phụ phẩm cá tra khi thủy phân bằng hai chế phẩm bromelain Loại bột bromelain Đạm amin (g/l)* Bromelain sản phẩm 2,24a Bromelain thương mại (Sigma-Aldrich) 2,01b Không bổ sung enzyme 0,64c Ghi chú: Các giá trị trung bình được theo sau cùng một ký tự trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Từ Bảng 6 nhận thấy với cùng loại cơ chất là phụ phẩm cá tra, cùng một nồng độ enzyme thì khả năng thủy phân của sản phẩm bromelain thí nghiệm cao hơn so với sản phẩm bromelain thương mại. Hàm lượng đạm amin sinh ra khi thủy phân bằng sản phẩm bromelain thí nghiệm là 2,24 g/l so với bromelain thương mại là 2,01 g/l. So với mẫu không sử dụng enzyme thì hàm lượng đạm amin cao hơn 3,5 lần khi dùng bromelain thí nghiệm và cao hơn 3,1 lần khi dùng chế phẩm thương mại. 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Đề tài bước đầu đã xây dựng được quy trình thu nhận bột enzyme bromelain thô từ chồi ngọn dứa. Enzyme bromelain thô có thể được trích ly từ chồi ngọn dứa đơn giản chỉ bằng nước cất với tỉ lệ 30 ml nước trên 10 g chồi ngọn. Acetone là dung môi thích hợp cho quá trình tủa bromelain chồi. Tủa bromelain chồi có thể sấy ở điều kiện không khí đối lưu ở nhiệt độ 45 oC - 55 oC khoảng 4 giờ. Chế phẩm bromelain chồi có khả năng thủy phân protein trong phụ phẩm cá tra. Trong tương lai cần nghiên cứu thêm việc ứng dụng sản phẩm này trong các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm chức năng (trợ tiêu hóa cho người già và trẻ con), mỹ phẩm (kem tẩy tế bào chết), lên men bia (chống cặn lắng), chế biến thịt và thủy hải sản (làm mềm thịt), hay lên men nước mắm ngắn ngày TÀI LIỆU THAM KHẢO Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method quantification of protein utilizing the principle of protein dye biding. Anal. Biochem 72, 248 - 254. Dương Thị Hương Giang, Lê Thanh Hùng, Võ Văn Song Toàn, Sonia Beeckmans, Edilbert Van Driessche & Trần Phước Đường. (2002). Đánh giá các phương pháp trích ly An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 21 (3), 84 – 93 93 bromelin từ nước khóm thô. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Dương Thị Hương Giang. (2005). Tinh sạch bromelain quả từ phụ phẩm dứa bằng phương pháp sắc ký gel mở rộng. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Đại học Cần Thơ. Đinh Thị Tình. (2007). Xác định hoạt lực và tách sơ bộ enzyme bromelain từ phụ phẩm dứa. Khóa luận tốt nghiệp Đại học. Trường Đại học Nông nghiệp, Hà Nội. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy & Nguyễn Thị Xuân Sâm. (2005). Công nghệ enzyme. NXB Khoa học Kỹ thuật. Kunitz M. (1974). Determination of proteolytic activity by the casein digestion method. Journal of General Physiology, 30, 291. Lại Thị Ngọc Hà. (2009). Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm dứa. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2, 203 – 211. Lopes, F.L.G., J.B.S. Júnior , R.R. de Souza, D.D. Ehrhardt, J.C.C Santana & E.B. Tambourgi. (2009). Concentration by membrane separation processes of a medicinal product obtained from pineapple pulp. An international journal, 52, 457 - 464. Melissa. (2005). Nghiên cứu quy trình tinh sạch enzyme bromelain trích ly từ thân và quả ở phạm vi pilot. Mariela A. Bruno, M.F. Pardo, N.O. Caffini & L.M.I. López. (2002). Purification of a New Endopeptidase Isolated from Fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae). Acta Farm. Bonaerense, 21, 51 - 56. Nguyễn Bá Mùi. (2005). Nghiên cứu phụ phẩm dứa ủ chua làm thức ăn gia súc. (Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp không xuất bản). Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam. Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Lê Hà Ny & Lê Trung Hiếu. (2013). Trích ly enzyme bromelain từ phụ phẩm dứa Cầu Đúc (Hậu Giang). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 28, 21 - 27. Nguyễn Phú Thọ & Dương Thị Hương Giang. (2011). Nghiên cứu qui trình điều chế bột enzyme papain thô từ nhựa đu đủ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 17b, 158 - 166. Nguyễn Thị Thanh Trúc. (2010). Tinh sạch và khảo sát các nhân tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme bromelain trích ly từ thân khóm. Đề tài Nghiên cứu Khoa học cấp Trường. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Đại học Cần Thơ.