Nghiên cứu thành phần hóa học cao ethyl acetat từ lá cây hoa mua (melastoma affine d. don)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 95 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETAT TỪ LÁ CÂY HOA MUA (MELASTOMA AFFINE D. DON) Huỳnh Thị Ngọc Trúc*, Võ Văn Lẹo** TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục tiêu: Cây Hoa mua là một trong những loài thuộc họ Melastomaceae được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh như tiêu chảy, nhiễm trùng sau sinh, kiết lỵ, leucorrhoea, làm lành vết thương và bệnh trĩ. Các nghiên cứu hóa học cho thấy cây có chứa flavonoid, acid hữu cơ và tanin. Tuy nhiên các nghiên cứu trong nước về Hoa mua vẫn còn khá ít, do vậy đề tài này được thực hiện nhằm mục đích phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có trong cao ethyl acetat chiết từ lá cây Hoa mua nhằm bổ sung vào dữ liệu hóa học của cây này và làm tiền đề cho các thử nghiệm sinh học và tiêu chuẩn hóa dược liệu sau này. Đối tượng-Phương pháp nghiên cứu: Lá cây Hoa mua thu thập tại tỉnh Tiền Giang vào tháng 3 năm 2017. Dược liệu được chiết với cồn 80%, cô đến dạng cao lỏng, thêm nước rồi lắc phân bố lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các kỹ thuật sắc kí (sắc kí cột nhanh, sắc kí cột cổ điển, sắc kí cột Sephadex LH-20) được sử dụng cho mục đích phân tách và phân lập hợp chất tinh khiết. Các chất phân lập được xác định cấu trúc bằng kỹ thuật phổ MS, NMR. Kết quả: Dược liệu được chiết với cồn 80%, cao toàn phần được lắc phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat và nước, cô loại dung môi thu được 4 cao phân đoạn. Từ cao ethyl acetat, bằng các kỹ thuật sắc ký đã phân lập và xác định được 3 flavonoid: quercetin, quercitrin và isoquercitrin. Kết luận: Từ phân đoạn cao ethyl acetat chiết từ lá Melastoma affine, đã phân lập được quercetin, quercitrin và isoquercitrin. Các hợp chất phân lập sẽ là tiền đề cho các thử nghiệm về sinh học và tiêu chuẩn hóa dược liệu sau này. Từ khóa: Melastoma affine, quercetin, quercitrin, isoquercitrin. ABSTRACT STUDY ON CHEMICAL CONSTITUENTS OF ETHYL ACETATE EXTRACT FROM THE LEAVES OF MELASTOMA AFFINE D. DON Huynh Thi Ngoc Truc, Vo Van Leo * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 95 – 100 Background - Objectives: Melastoma affine is one of the species in the Melastomataceae family. It has been used in traditional medicine for the treatment of many ailments, such as diarrhea, puerperal infection, dysentery, leucorrhoea, wound healing and haemorrhoids. However, there are few researches on chemical constituents of the leaves of Melastoma affine in Vietnam. So this study was carried out to isolate some chemical constituents from the ethyl acetate extract as a first step for further pharmacological studies such as biological activity tests and the standardization of this herb. Materials and Methods: Melastoma affine was collected in Tien Giang, in March, 2017. Plant material was percolated with 80% ethanol. The crude extract was diluted and separated by liquid – liquid *Cao đẳng Y tế Tiền Giang **Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Võ Văn Lẹo ĐT: 0907060790 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 96 distribution. The isolation of pure compounds was carried out by different means of column chromatography (vacuum liquid chromatography, Sephadex chromatography,). The structures of isolated compounds were elucidated by MS, NMR spectroscopy methods. Results: Plant material (10 kg) was percolated with 80% ethanol. The ethanol extract was evaporated to a concentrated residue under reduced pressure, then was diluted with water and partitioned with n- hexan, cloroform, ethyl acetate, and water to yield 4 fraction extracts, respectively. The ethyl acetate extract was subjected to a vacuum liquid chromatography to give 3 compounds: quercetin, quercitrin and isoquercitrin. Conclusion: Three flavonoids (quercetin, quercitrin and isoquercitrin) were isolated from the ethyl acetate extract of the leaves of Melastoma affine. These isolated compounds can be used for further pharmacological studies. Key words: Melastoma affine, quercetin, quercitrin, isoquercitrin. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Hoa mua là một trong những loài thuộc họ Melastomaceae được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh như tiêu chảy, nhiễm trùng sau sinh, kiết lỵ, huyết trắng, làm lành vết thương và bệnh trĩ. Các nghiên cứu hóa học cho thấy cây có chứa flavonoid, acid hữu cơ và tanin. Tuy nhiên các nghiên cứu trong nước về Hoa mua hãy còn khá ít, do vậy đề tài này được tiến hành nhằm mục đích phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có trong cao ethyl acetat chiết từ lá cây Hoa mua nhằm bổ sung vào dữ liệu hóa học của cây này và làm tiền đề cho các thử nghiệm sinh học và tiêu chuẩn hóa dược liệu sau này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Lá cây Hoa mua thu thập tại tỉnh Tiền Giang, tháng 3 năm 2017. Mẫu được định danh bằng cách so với các dữ liệu trong các tài liệu phân loại thực vật. Lá cây Hoa mua thu hái là lá bánh tẻ, phơi khô và xay thành bột thô, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Hóa chất Ethanol 80%, n-hexan, cloroform, ethyl acetat, acid acetic (SCI Co.Ltd, Trung quốc), methanol (Fisher, Hàn Quốc). Chiết xuất – tách phân đoạn Dược liệu xay nhỏ (10 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn 80% (70 L). Dịch chiết được cô thu hồi dung môi cho cao toàn phần. Cao toàn phần được pha loãng với nước và chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n- hexan, cloroform, ethyl acetat để phân tách các chất theo độ phân cực khác nhau. Phương pháp sắc ký Sắc ký lớp mỏng Thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck). Sau khi triển khai hệ dung môi thích hợp, phát hiện dưới đèn UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS, thuốc thử FeCl3. Sắc kí cột chân không (VCL): Chất hấp phụ là silica gel có kích thước hạt 40-63 µm. Tiến hành nạp mẫu khô, khai triển bằng hệ dung môi ethyl acetat bão hòa nước. Sắc kí cột rây phân tử Sephadex Chất hấp phụ là 50g Sephadex LH-20 trong MeOH. Tiến hành nạp mẫu ướt, khai triển bằng MeOH. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các chất Kết hợp phương pháp đo phổ MS và phổ cộng hưởng từ NMR Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 97 KẾT QUẢ Chiết xuất và tách phân đoạn Bột lá Hoa mua (10 kg) được chiết xuất với 70 lít cồn 80%, cô thu hồi thu được 4 lít cao toàn phần. Cao toàn phần (4 L) được lắc phân bố lần lượt với n-hexan, cloroform và ethyl acetat, thu được cao n-hexan (83,58 g), cao cloroform (117,34 g), cao ethyl acetat (233,31 g) và 331,35g tủa từ phân đoạn ethyl acetat. 30g tủa từ phân đoạn ethyl acetat được tiến hành phân tích bằng sắc kí cột nhanh với dung môi ethyl acetat bão hòa nước thu được 8 phân đoạn (T1-8). Tủa từ phân đoạn T1 và T2 được lọc, rửa nhiều lần bằng MeOH lạnh thu được hợp chất MA1 (2,98 g). Tủa từ phân đoạn T4 và T5 được lọc, rửa nhiều lần bằng MeOH lạnh thu được hợp chất MA2 (1,8 g). Tủa từ phân đoạn T6 được lọc, rửa nhiều lần bằng MeOH lạnh thu được hợp chất MA4 (0,1 g). BÀN LUẬN Xác định cấu trúc các chất phân lập Chất MA1 MA1 ở dạng bột vô định hình màu vàng. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 301,0368; ứng với khối lượng phân tử 302; công thức phân tử C15H10O7. Phổ 13C-NMR cho 15 tín hiệu tương ứng với 15 carbon, δCmax 175,79 < 180, định hướng hợp chất 1 là một flavonol. Phổ 1H- NMR có 1 đỉnh singlet có δH 12,48 đặc trưng cho proton 5-OH; hai tín hiệu proton doublet ghép cặp meta δH 6,40 (H, d, J=2,0 Hz) và δH 6,18 (1H, d, J=2,0 Hz) điển hình cho proton ở vị trí C8, C6 của vòng A và bộ ba tín hiệu δH 7,54 (1H, dd, J=8,5; 2,5 Hz); 7,67 (1H, d, J=2,5 Hz); 6,88 (1H, d, J=8,5 Hz) điển hình cho proton ở 3 vị trí C6’, C2’ và C5’ của vòng B. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất MA1 được xác định là quercetin. Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất MA1 được so sánh với dữ liệu phổ của quercetin(4) được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA1 và quercetin. C CHn Hợp chất MA1 (DMSO-d6, 125/500 MHz) Quercetin (DMSO-d6, 125/500 MHz)(4) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) HMBC c ppm H ppm, mult., (J, Hz) 2 >C= 146,8 - - 147,3 - 3 >C= 135,7 - - 136,2 - 4 >C=O 175,8 - - 176,3 - 5 >C= 160,7 - - 161,2 - 6 =CH- 98,1 6,18 d (2,0) 7,5, 8, 10 98,6 6,19 d (2) 7 >C= 163,8 - - 164,3  8 =CH- 93,3 6,40 d (2,0) 6, 7, 9, 10 93,8 6,40 d (2) 9 >C= 156,1 - - 156,6  10 >C= 103,0 - - 103,5  1’ >C= 121,9 - - 122,4  2’ =CH- 115,0 7,67 d (2,5) 3’, 4’, 6’ 115,5 7,68 d (2,2) 3’ >C= 145,0 - - 145,5  4’ >C= 147,7 - - 148,2  5’ =CH- 115,6 6,88 d (8,5) 3’, 4’, 1’ 116,1 6,88 d (8,3) 6’ =CH- 119,9 7,54 dd (8,5; 2,5) 4’, 2’ 120,4 7,53 dd (8,6; 2,2) 5-OH 12,48 s 12,48 s Dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA1 phù hợp với quercetin đã công bố trong tài liệu. Từ những dữ liệu trên, hợp chất MA1 được xác định là quercetin. Hợp chất MA2 Bột vô định hình màu vàng. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 447,0957; ứng với khối lượng phân tử Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 98 448; công thức phân tử C21H20O11. Phổ 13C-NMR cho 21 tín hiệu tương ứng với 21 carbon, δCmax 177,69 < 180, định hướng hợp chất 2 là một flavonol. Phổ 1H-NMR có 1 đỉnh singlet có δH 12,65 đặc trưng cho proton 5-OH; hai tín hiệu proton doublet ghép cặp meta δH 6,39 (H, d, J=2,0 Hz) và δH 6,20 (1H, d, J=2,0 Hz) điển hình cho proton ở vị trí C8, C6 của vòng A và bộ ba tín hiệu δH 7,30 (1H, d, J=2,0 Hz); 6,86 (1H, d, J=8,5 Hz); 7,25 (1H, dd, J=8,0; 2,0 Hz) điển hình cho proton ở 3 vị trí C2’, C5’ và C6’ của vòng B. Trong vùng 60-80 ppm có 4 tín hiệu carbon, 1 tín hiệu carbon δC 17,4 ppm đặc trưng cho CH3- và 1 tín hiệu carbon δC 101,8 ppm đặc trưng cho 1 C- anomer của đường. Kết hợp các dữ liệu và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất MA2 được xác định là quercitrin. Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất MA2 được so sánh với dữ liệu phổ của quercitrin(3) được trình bày ở bảng 2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA2 phù hợp với quercitrin đã công bố trong tài liệu. Từ những dữ liệu trên, hợp chất MA2 được xác định là quercitrin. Bảng 2: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA2 và quercitrin. C CHn Hợp chất MA2 (DMSO-d6, 125/500 MHz) Quercitrin (DMSO-d6, 125/500 MHz)(3) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) HMBC c ppm H ppm, mult., (J, Hz) 2 >C= 157,2 - - 158,0 - 3 >C= 134,2 - - 134,9 - 4 >C=O 177,7 - - 178,2 - 5 >C= 161,3 - - 162,0 - 6 =CH- 98,6 6,20 d (2,5) 5, 7, 8, 10 99,4 6,40 d (1,5) 7 >C= 164,2 - - 165,0 - 8 =CH- 93,6 6,39 d (2,0) 6, 7, 9, 10 94,2 6,49, J = 2,1 Hz 9 >C= 156,4 - - 157,2 - 10 >C= 104,0 - - 104,8 - 1’ >C= 121,1 - - 121,5 - 2’ =CH- 115,6 7,30 d (2,0) 3’, 4’, 6’ 116,2 7,31 d (1,5) 3’ >C= 145,1 - - 145,9 - 4’ >C= 148,4 - - 149,2 - 5’ =CH- 115,4 6,86 d (8,5) 1’, 3’, 4’ 116,4 6,90 d (8,5) 6’ =CH- 120.1 7,25 dd (8,5, 2,0) 4’, 2’ 121,8 7,30 dd (8,5; 1,5) 1” =CH- 100,8 5,25 d (1,5) 3 102,6 5,21 br 2” =CH- 70,0 3,51 dd (9,0, 3,0) - 70,3 - 3” =CH- 70,5 3,29 m - 71,1 - 4” =CH- 71,1 3,15 t (9,5) - 71,9 - 5” =CH- 70,3 3,98 d (1) - 70,8 - 6” CH3- 17,4 0,82 d (6,5) - 18,2 0,80 d (6) 5-OH 12,65 s - 12,65 s Hợp chất MA4 Bột vô định hình màu vàng. Phổ ESI-MS m/z [M-H]- = 463,0912; ứng với khối lượng phân tử 464; công thức phân tử C21H20O12. Phổ 13C-NMR cho 21 tín hiệu tương ứng với 21 carbon, δCmax 177,69 < 180, định hướng hợp chất 2 là một flavonol. Phổ 1H-NMR có 1 đỉnh singlet có δH 12,64 đặc trưng cho proton 5-OH; hai tín hiệu proton doublet ghép cặp meta δH 6,40 (H, d, J=2,0 Hz) và δH 6,20 (1H, d, J=2,0 Hz) điển hình cho proton ở vị trí C8, C6 của vòng A và bộ ba tín hiệu δH 7,58; 6,84 (1H, d, J=9 Hz); 7,58 điển hình cho proton ở 3 vị trí C2’, C5’ và C6’ của vòng B. Trong vùng 60-80 ppm có 5 tín hiệu carbon, và 1 tín hiệu carbon δC 101,8 ppm đặc trưng cho 1 C- anomer của đường. Kết hợp các dữ liệu và so Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 99 sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất MA4 được xác định là isoquercitrin. Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất MA4 được so sánh với dữ liệu phổ của isoquercitrin(2) được trình bày ở bảng 3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA4 phù hợp với isoquercetin đã công bố trong tài liệu. Từ những dữ liệu trên, hợp chất MA4 được xác định là isoquercitrin. Bảng 3: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất MA4 và isoquercitrin. C CHn Hợp chất MA4 (DMSO-d6, 125/500 MHz) Isoquercitrin (DMSO-d6, 75/300 MHz)(2) c ppm H ppm, mult., (J, Hz) HMBC c ppm H ppm, mult., (J, Hz) 2 >C= 156,1   156,0  3 >C= 133,3   133,2  4 >C=O 177,3   177,2  5 >C= 161,2   161,0  6 =CH- 98,7 6,20 d (1,5 Hz) 5, 7, 8, 10 98,6 6,18 d (1,8) 7 >C= 164,4   164,0  8 =CH- 93,5 6,40 d (2 Hz) 6, 7, 9, 10 93,5 6,39 d (1,8) 9 >C= 156,3   156,1  10 >C= 103,8   103,9  1’ >C= 121,1   121,0  2’ =CH- 116,1 7,58 2, 3’, 4’, 6’ 116,1 7,56 br 3’ >C= 144,8   144,6  4’ >C= 148,4   148,3  5’ =CH- 115,1 6,84 d (9 Hz) 1’, 3’, 4’ 115,1 6,83 d (9) 6’ =CH- 121,5 7,58 2, 2’, 4’ 121,5 7,58 d (9,0) 1” =CH- 100,9 5,46 d (7,5 Hz) 3 100,8 5,45 d (6,9) 2” =CH- 74,1 3,23 – 3,27 m  74,1  3” =CH- 76,5 3,23 – 3,27 m  76,5  4” =CH- 69,9 3,09 s  70,0  5” =CH- 77,5 3,09 s  77,5  6” CH3- 60,9 3,56 – 3,60 m  61,0  5-OH 12,65 s 12,65 s MA1 (Quercetin) MA2 (Quercitrin) MA4 (Isoquercitrin) Hình 1: Công thức của hợp chất MA1, MA2, MA4 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 100 KẾT LUẬN Từ cao ethyl acetat của lá Melastoma affine đã phân lập được 3 hợp chất tinh khiết gồm quercetin (2,98 g), quercitrin (1,8 g) và isoquecitrin (0,1 g). Isoquecitrin một hợp chất chưa được công bố ở loài Melastoma affine(1). Các hợp chất phân lập này có thể được dùng trong tiêu chuẩn hóa dược liệu và phục vụ cho các thử nghiệm sinh học sau này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Joffry S, Rofiee NJY, MeorMohd. AMS, Suhaili ZMMR, Othman F, Akim AMd, Desa MNM, and Zakaria ZA (2012)."Melastoma malabathricum (L.) Smith Ethnomedicinal Uses, Chemical Constituents and Pharmacological Properties: A Review ". Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. pp. 8-27. 2. Khanittha DKK, Masataka M Thitima P, and Rutt S (2009)."Flavonoid glycosides from the leaves of Uvaria rufa with advanced glycation end-products inhibitory activity". The Thai Journal of Pharmaceutical Sciences. 33: pp. 84-90. 3. Sang WC, Kim KH, Lee IK, Choi SU, Ryu SY, and Lee KR, (2009)."Phytochemical Constituents of Bistorta manshuriensis". Natural Product Sciences. 15(4): pp. 234-240. 4. Saraswathi SV, Santhakumar DSK (25 April 2017)."Isolation of quercetin from the methanolic extract of Lagerstroemia speciosa by HPLC technique, its cytotoxicity against MCF-7 cells and photocatalytic activity". Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019