Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro và in vivo của cao chiết thạch hộc nuôi cấy mô và thạch hộc tự nhiên (Dendrobium Nobile Lindl. Orchidaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 17 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO VÀ IN VIVO CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NUÔI CẤY MÔ VÀ THẠCH HỘC TỰ NHIÊN (DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE) Lâm Cẩm Tiên*, Trần Công Luận** TÓM TẮT Tình hình chung và mục tiêu nghiên cứu: Thạch hộc tự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) là thực vật quý hiếm đã được chứng minh có hiệu quả chống oxy hóa mạnh trên thực nghiệm và xu hướng hiện nay là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao. Để góp phần làm rõ hơn tác dụng dược lý của Thạch hộc nuôi cấy mô so với Thạch hộc trồng tự nhiên, chúng tôi khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của Thạch hộc nuôi cấy mô in vitro, in vivo trên thực nghiệm. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid màng tế bào não chuột bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA). Nghiên cứu in vivo: Các cao thử ở các liều khác nhau được cho uống liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamide ở liều 150 mg/kg thể trọng chuột. Kết quả đánh giá dựa trên định lượng MDA và GSH trong gan. Kết quả: Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (μg/ml) tương đương với thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (μg/ml) và mạnh hơn cao Thạch hộc nuôi cấy mô có IC50 = 86,20 (μg/ml). Tác dụng chống oxy hóa in vivo: cả 2 mẫu cao đều có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, đều làm giảm hàm lượng MDA và tăng hàm lượng GSH trong gan chuột. Kết luận: Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (μg/ml) yếu hơn so với thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (μg/ml) và mạnh hơn cao Thạch hộc nuôi cấy mô có IC50 = 86,20 (μg/ml). Tác dụng chống oxy hóa in vivo: cả 2 mẫu cao đều có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, đều làm giảm hàm lượng MDA và tăng hàm lượng GSH trong gan chuột. Từ khóa: Thạch hộc tự nhiên, Thạch hộc nuôi cấy mô, chống oxy hóa, MDA, GSH. ABSTRACT IN VITRO AND IN VIVO STUDY ON ANTIOXIDANT EFFECTS OF EXTRACTS FROM WILD DENDROBIUM AND TISSUE CULTURE DENDROBIUM (DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE) Lam Cam Tien, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 17 – 24. Background and aims: Wild dendrobium (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) is a rare plant that has been proven to have potent antioxidant efficacy in the experiment and the current trend is to apply plant biotechnology to produce medicinal sources with a large scale and high quality. In order to clarify the pharmacological effect of tissue culture dendrobium in comparison with wild dendrobium, we investigated the in vitro and in vivo antioxidant effect in trend of hepatoprotective effect. Methods: For in vitro study, the anti-lipid peroxidation effect of test extracts on malonyl dialdehyde (MDA) test were examined. For in vivo study, acoholic extract from tissue culture dendrobium and wild dendrobium were given orally in 8 days after single dose of cyclophosphamide (intraperitoneal injection at 150 mg/kg body weight). * Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược TP. HCM ** Đại học Công nghệ Miền Đông Tác giả liên lạc: ThS. BS. Lâm Cẩm Tiên ĐT: 01699940841 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 18 Evaluation were checked with a quantification of hepatic MDA and GSH. Results: Based on IC50, wild dendrobium with IC50 34.86 (μg/ml) was shown equivalent in vitro antioxidant activity activity to Trolox (28.32 μg/ml) and better than tissue culture dendrobium (86.20 μg/ml). For in vivo study, the results indicated that both extracts effectively reduced the levels of MDA and significantly increased the levels of GSH in mouse liver. Conclusion: In vitro antioxidant activity: alcoholic extractions of wild dendrobium has IC50 = 34.86 μg/ml, lower than Trolox with IC50 = 28.32 (μg/ml) and higher than alcoholic extractions of tissue culture dendrobium with IC50 = 86.20 (μg/ml). In vivo antioxidant activity: Both samples were equally effective in antioxidant activity, which reduced MDA and increased GSH levels in mices. Keywords: Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae., wild dendrobium, tissue culture dendrobium, antioxidant effect, MDA, GSH. ĐẶT VẤN ĐỀ Đã từ rất lâu, Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) là một trong những dược liệu quý, đã được Trung Quốc sử dụng như thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dạ dày, để cải thiện cảm giác ngon miệng, kích thích tiết nước bọt, điều trị các bệnh khác nhau, như viêm dạ dày, đái tháo đường, lão hóa da, và bệnh tim mạch, mà phần lớn được cho là liên quan chặt chẽ với sự trao đổi chất, chống lại sự rối loạn trong việc tạo ra gốc tự do(1). Một số nghiên cứu nước ngoài đã chứng minh Thạch hộc có tác dụng kháng viêm, chống tế bào ung thư, chống đột biến gen điều hòa miễn dịch,gần đây còn cho thấy tác dụng chống oxy hóa trên in vitro(2). Hiện nay Thạch hộc là thực vật quý hiếm, được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn(6), nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao. Để so sánh và làm rõ tác dụng chống oxy hóa của Thạch hộc nuôi cấy mô so với Thạch hộc trồng tự nhiên, chúng tôi tiếp tục khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên in vitro, in vivo trên thực nghiệm. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU Đối tượng nghiên cứu Thạch hộc nuôi cấy mô được Công ty cổ phần khoa học công nghệ Anh Đào, số 1031, Nguyễn Hữu Thọ, ấp 2, xã Long Thới, huyện Nhà bè, TP. HCM cung cấp. Mẫu được cấy từ thân Thạch hộc, nuôi trong ống nghiệm trong 5 tháng với môi trường sử dụng là MS bổ sung 30g/l đường, 8g/l agar, 50g/l khoai tây, 200ml/l nước dừa, 1g/l than hoạt tính, mẫu được nuôi cấy trong điều kiện pH 5,7 - 5,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, và độ ẩm trung bình 50 - 60%. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50oC và được bảo quản trong hộp kín. Thạch hộc tự nhiên được vườn lan tại xã Qui Đức, huyện Bình Chánh, TP. HCM cung cấp. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45-50oC và được định danh tại Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP. HCM. Phương tiện Hóa chất: Cyclophosphamid momohydrat (CY-Endoxan® 500 mg), Acid tricloacetic (TCA), Acid thiobarbituric (TBA), Silymarin của Sigma Co.Ltd, USA; Đệm Phosphat (PBS), Dung dịch dimethyl sulfosid (DMSO), Kali clorid 1,15% (KCl), Natri clorid 0,9% (NaCl), Đệm Tris-HCl của Merck Co. Germany, Trolox (Calbiochem Ltd. Co.). Thuốc đối chiếu: Silymarin của Sigma Co. Ltd, USA. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đồng đều cả hai giới (chủng Swiss albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2g), được cung cấp bởi Viện Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 19 Vắcxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Trong suốt quá trình thử nghiệm chuột được nuôi với thức ăn viên và điều kiện môi trường ổn định. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA)(5) Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm. Pha thuốc thử TBA 0,8%. Mỗi mẫu thử cao cồn nuôi cấy mô và tự nhiên được tiến hành nghiên cứu ở các nồng độ: 2000µg/ml, 1000µg/ml, 500µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO). Chiết 5g bột dược liệu trong bình tam giác bằng diethyl ether trong bể siêu âm khoảng 20 phút (4 lần × 30ml). Chiết đến khi dịch ether sau khi bốc hơi không để lại vết mờ trên mặt kính đồng hồ. Gộp dịch chiết lại, lọc, cô đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết. Bã dược liệu sau khi chiết ether được chiết bằng cồn cao độ (96%) trên bếp cách thuỷ (3 lần × 30ml). Gộp dịch chiết lại, lọc, cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết. Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 5 mM theo tỉ lệ 1: 10 (não: dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5oC. Lấy 0,5ml dịch đồng thể, thêm vào 0,1ml các nồng độ mẫu thử và 1,4ml đệm phosphat, ủ ở 37oC trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng 1ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2ml dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo màu ở λ = 532nm. Các mẫu được đo 2 lần và lấy kết quả trung bình của hai lần đo. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu. Tính toán kết quả Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100. ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO). ODT: Mật độ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo khác nhau. Cách tính giá trị IC50 Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do hay khả năng ức chế peroxy hóa lipid theo nồng độ khảo sát của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do hay ức chế peroxy hóa lipid IC50 bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 vào để suy ra IC50. Gây mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamide(3) Đã xác định được Dmax của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên: Đối với Thạch hộc nuôi cấy là 25g/kg chuột (tương đương 126,45g dược liệu khô). Đối với Thạch hộc tự nhiên là 28,6g/kg chuột (tương đương 348,78g dược liệu khô). Theo “Phương pháp xác định độc tính cấp” của Đỗ Trung Đàm. Từ Dmax chúng tôi quyết định chọn liều cho các thử nghiệm tiếp theo là 1/10, 1/20 Dmax đối với Thạch hộc nuôi cấy và 1/20, 1/40 Dmax đối với Thạch hộc tự nhiên. Cao chiết Thạch hộc nuôi cấy: liều 2,5g/kg (1/10 Dmax), liều 1,25g/kg (1/20 Dmax). Cao chiết Thạch hộc tự nhiên: liều 1,43g/kg (1/20 Dmax), liều 0,715g/kg (1/40 Dmax). Chuột được tiêm phúc mạc một lần duy nhất cyclophosphamide (CY) liều 150mg/kg, chia các lô theo bảng sau: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 20 Bảng 1. Mô hình nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá in vivo của các cao chiết Thạch hộc Nhóm Lô (n= 8) Tiêm phúc mạc CY Mẫu thử uống (10 ml/kg thể trọng chuột) CY (-) Chứng (-) nước cất Thử cao nuôi cấy (-) 2,5 g/kg chuột (tương đương 12,65 g dược liệu khô) Thử cao tự nhiên (-) 1,43 g/kg chuột (tương đương 17,44 g dược liệu khô) Đối chiếu (-) silymarin 0,1 g/kg chuột CY (+) Chứng 150 mg/kg nước cất Thử cao nuôi cấy 150 mg/kg 1,25 g/kg chuột (tương đương 6,32 g dược liệu khô) Thử cao nuôi cấy 150 mg/kg 2,5 g/kg chuột (tương đương 12,65 g dược liệu khô) Thử cao tự nhiên 150 mg/kg 0,715 g/kg chuột (tương đương 8,72 g dược liệu khô) Thử cao tự nhiên 150 mg/kg 1,43 g/kg chuột (tương đương 17,44 g dược liệu khô) Đối chiếu 150 mg/kg silymarin 0,1 g/kg thể trọng chuột Các cao thử nghiệm được cho uống một lần trong ngày vào buổi sáng (8 - 9 h) và liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ tách gan chuột đem định lượng MDA và GSH. Phương pháp xác định hàm lượng malondialdehyd (MDA) và glutathion (GSH) trong gan chuột (4) Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15%. Lấy 1 - 2ml dịch đồng thể, thêm dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vđ 3 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. MDA: Sau khi ly tâm lấy 2ml dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo quang ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. GSH: Sau khi ly tâm lấy 1ml dịch trong, cho phản ứng với 0,2ml thuốc thử Ellman và thêm đệm EDTA phosphat vđ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g protid) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Các dữ liệu được trình bày dưới dạng Mean ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn của trị số trung bình). Việc xử lý thống kê trong đề tài này dùng phần mềm phần mềm SigmaStat 3.5. Các số liệu được khảo sát trên các nhóm súc vật thí nghiệm độc lập (nhóm chứng và nhóm dùng thuốc) và các mẫu đều bé (< 30). Do đó phương pháp thống kê được sử dụng là phép kiểm Student cho 2 dãy số liệu độc lập. So sánh sự khác nhau giữa các nhóm có tác dụng gây ngủ bằng phép kiểm One – Way ANOVA và t – test (phần mềm SigmaStat 3.5). Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị P < 0,05 so với lô chứng. KẾT QUẢ Hoạt tính chống oxy hóa in vitro Trong thử nghiệm MDA, các mẫu thử cao cồn Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên làm giảm màu phức hợp của MDA và acid thiobarbituric, chứng tỏ trong mẫu thử này có các nhóm chất có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên đã làm giảm hàm lượng MDA trong dịch não chuột, dẫn đến hiện tượng giảm màu của của phức hợp này. Dựa vào IC50 trong thử nghiệm MDA, sơ bộ kết luận hoạt tính chống oxy hóa in vitro của Thạch hộc tự nhiên mạnh hơn Thạch hộc nuôi cấy mô. Bảng 2. Kết quả thuốc đối chiếu Trolox Nồng độ ban đầu (mM) Nồng độ ban đầu (µg/ml) Nồng độ phản ứng (µg/ml) OD HTCO% 10 2500 125,00 0,124 77,70 5 1250 62,50 0,203 63,49 1 250 12,50 0,376 32,37 0,5 125 6,25 0,445 19,96 0,1 25 1,25 0,529 4,86 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 21 Từ bảng 2 xây dựng được phương trình logarit y = 16,26ln(x) – 4.391; R2 = 0,974; suy ra IC50 = 28,32 (µg/ml). Từ bảng 3, đối với Thạch hộc nuôi cấy mô, xây dựng được phương trình logarit y = 9,215ln(x) + 8,931; R2=0,971; suy ra IC50 = 86,20 (µg/ml). Đối với Thạch hộc tự nhiên, xây dựng được phương trình logarit y = 12,95ln(x) + 3,998; R2=0,966; suy ra IC50= 34,86 (µg/ml). Bảng 3. Kết quả thử trên test MDA của mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên Nồng độ Ban đầu (µg/ml) Nồng độ phản ứng (µg/ml) Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên OD HTCO% OD HTCO% L1 L2 TB L1 L2 TB 2000 100 0,161 0,192 0,177 53,86 0,121 0,124 0,123 67,97 1000 50 0,216 0,206 0,211 44,84 0,174 0,182 0,178 53,46 500 25 0,251 0,25 0,251 34,51 0,255 0,229 0,242 40,00 100 5 0,29 0,286 0,288 24,71 0,295 0,272 0,284 25,88 50 2,5 0,32 0,306 0,313 18,17 0,317 0,315 0,316 17,39 Nghiên cứu in vivo Kết quả khảo sát hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan sau khi gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide Bảng 4. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA trong gan ở lô cho uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lô (n= 8) Liều uống (g/kg) Hàm lượng MDA (nM/g protein) CY (-) Chứng bình thường 35,061 ± 3,638 Thạch hộc nuôi cấy 2,5 41,843 ± 2,628 Thạch hộc tự nhiên 1,43 46,259 ± 2,922 # Silymarin 0,1 31,725 ± 1,79 CY (+) Chứng bệnh lý 62,181 ± 3,119 # Thạch hộc nuôi cấy 1,25 45,513 ± 2,729 * Thạch hộc nuôi cấy 2,5 50,177 ± 4,482* , $ Thạch hộc tự nhiên 0,715 47,921 ± 5,718 * Thạch hộc tự nhiên 1,43 42,014 ± 3,929 * Silymarin 0,1 36,184 ± 2,801* (#): P < 0,05 so với lô chứng CY (-) (*): P < 0,05 so với lô chứng CY (+) tương ứng. ($): P < 0,05 so với lô đối chiếu silymarin CY (+). Từ bảng 4, cho thấy: Nhóm bình thường CY (-) Lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô ở liều 2,5g/kg cũng như lô đối chiếu silymarin 0,1g/kg có hàm lượng MDA trong gan khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao Thạch hộc nuôi cấy mô không có tác dụng trên cơ thể chuột bình thường. Lô uống cao Thạch hộc tự nhiên ở liều 1,43g/kg có hàm lượng MDA trong gan tăng so với lô chứng và lô đối chiếu silymarin 0,1g/kg đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05), điều này cho thấy cao Thạch hộc tự nhiên không có tác dụng chống oxy hóa trên cơ thể chuột bình thường, do vẫn chưa có các nghiên cứu so sánh tác dụng chống oxy hóa của Thạch hộc tự nhiên và Thạch hộc nuôi cấy mô đã thực hiện trong và ngoài nước trước đây, do đó cần tiến hành thêm các thử nghiệm khác với số chuột thử nghiệm cao hơn để đưa ra được kết luận về tính chống oxy hóa của Thạch hộc tự nhiên cũng như nuôi cấy mô. Nhóm bệnh lý CY (+) Lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống nước cất trong 8 ngày làm tăng hàm lượng MDA so với lô chứng bình thường đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Hàm lượng MDA trong gan của lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25g/kg và 2,5g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05) cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy mô có tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamid. Hàm lượng MDA trong gan của lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg và 1,43g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05) cho thấy cao Thạch hộc tự nhiên có tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamid. Lô đối chiếu silymarin (0,1g/kg) cũng thể Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 22 hiện tác động làm giảm sự gia tăng hàm lượng MDA gây bởi cyclophosphamid so với lô chứng đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05), và tác dụng làm giảm hàm lượng MDA lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25g/kg không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin (0,1g/kg); lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg và 1,43g/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin 0,1g/kg. Lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25g/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA (giảm 26,8% so với lô chứng bệnh) không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715g/kg (giảm 22,9% so với lô chứng bệnh) và 1,43g/kg (giảm 32,4% so với lô chứng bệnh). Kết quả khảo sát hàm lượng glutathion (GSH) trong gan sau khi gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide Bảng 5. Kết quả khảo sát hàm lượng GSH trong gan ở lô cho uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên Nhóm Lô (n= 8) Liều uống (g/kg) Hàm lượng GSH (nM/g protein) CY (-) Chứng bình thường 8627,679 ± 539,418 Thạch hộc nuôi cấy mô 2,5 8098,171 ± 797,613 Thạch hộc tự nhiên 1,43 6031,090 ± 484,076 # Silymarin 0,1 9693,044 ± 525,897 CY (+) Chứng bệnh lý 5557,294 ± 388,485 # Thạch hộc nuôi cấy mô 1,25 7170,738 ± 586,503 * Thạch hộc nuôi cấy mô 2,5 7515,966 ± 824,415 * Thạch hộc tự nhiên 0,715 5884,622 ± 301,588 $ Thạch hộc tự nhiên 1,43 6869,425 ± 337,289 * , $ Silymarin 0,1 8442,570 ± 437,238 * (#): P < 0,05 so với lô chứng CY (-) (*): P < 0,05 so với lô chứng CY (+) tương ứng. ($): P < 0,05 so với lô đối chiếu silymarin CY (+). Từ bảng 5, cho thấy: Nhóm bình thường CY(-) Lô cao Thạch hộc nuôi cấy mô ở liều 2,5g/kg cũng như lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg có GSH trong gan không thay đổi so với lô chứng, chứng tỏ cao Thạch hộc nuôi cấy mô không có tác dụng trên cơ thể chuột bình thường. Lô uống cao Thạch hộc tự nhiên ở liều 1,43 g/kg có hàm lượng GSH trong gan giảm so với lô chứng và lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05), chứng tỏ cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg không có tác dụng chống oxy hóa trên cơ thể chuột bình thường, kết quả này cũng phù hợp với kết quả định lượng MDA giảm ở lô dùng Thạch hộc tự nhiên ở Bảng 3, do đó cần tiến hành thêm các thử nghiệm khác với số chuột thử nghiệm cao hơn để đưa ra được kết luận về tính chống oxy hóa của Thạch hộc tự nhiên cũng như nuôi cấy mô. Nhóm bệnh lý CY(+) Lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống nước cất trong 8 ngày có hàm lượng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường (p < 0,05). Hàm lượng GSH trong gan của lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg và 2,5 g/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng (p < 0,05). Lô đối chiếu silymarin (0,1 g/kg) cũng thể hiện tác động làm tăng hàm lượng GSH so với lô chứng tương ứng đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05); lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg và 2,5 g/kg có tác dụng làm tăng hàm lượng GSH không khác biệt so với lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg. Hàm lượng GSH trong gan của lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 0,715 g/kg tăng nhưng không đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý và có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu silymarin (0,1 g/kg) (p < 0,05). Hàm lượng GSH trong gan của lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý và không có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô đối chiếu silymarin 0,1 g/kg. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 23 Lô uống cao Thạch hộc nuôi cấy có tác dụng làm tăng hàm lượng GSH ở liều 1,25 g/kg (tăng 29% so với lô chứng bệnh) và 2,5 g/kg (tăng 35,2% so với lô chứng bệnh) không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg (tăng 23,6% so với lô chứng bệnh). BÀN LUẬN Hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua thử nghiệm MDA MDA là chất được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo ra phức hợp có màu hồng. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm lượng MDA có trong mẫu. Kết quả thử nghiệm cho thấy các mẫu thử cao Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên làm giảm màu phức hợp MDA và acid thiobarbituric, chứng tỏ trong mẫu thử này có các chất có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên đã làm giảm hàm lượng MDA trong dịch não chuột, dẫn đến hiện tượng giảm màu của của phức hợp này. Vậy các mẫu thử có tác dụng bắt giữ gốc tự do, ở nồng độ mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô IC50 = 86,20 (µg/ml) (bảng 2) và nồng độ mẫu Thạch hộc tự nhiên IC50 = 34,86 (µg/ml) (bảng 3). Dựa trên bảng 1, 2 và 3 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của cao Thạch hộc nuôi cấy mô và cao Thạch hộc tự nhiên tăng theo nồng độ khảo sát (từ 50 µg/ml đến 2000 µg/ml). Ở nồng độ 2000 µg/ml cao Thạch hộc tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa tương đương với chất đối chiếu Trolox ở nồng độ 5 mM và cao gấp 1,3 lần so với cao Thạch hộc nuôi cấy. Dựa vào IC50 trong thử nghiệm MDA cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của Thạch hộc tự nhiên với IC50 = 34,86 (µg/ml) yếu hơn so với thuốc đối chiếu IC50 = 28,32 (µg/ml) và mạnh hơn Thạch hộc nuôi cấy mô IC50 = 86,20 (µg/ml). Theo nghiên cứu của Trung Quốc cao chiết cồn Thạch hộc có nobilin D và E (alkaloid) ly trích từ cây có khả năng chống oxy hóa khá mạnh khi thử nghiệm dùng phương pháp 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) với IC50 = 32 (µg/ml) tương đương với thuốc đối chiếu Trolox(7). Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vivo Khảo sát hàm lượng MDA trong gan MDA gan là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan, hàm lượng MDA trong gan càng cao chứng tỏ gan bị tổn thương oxy hóa càng nặng. Kết quả ở bảng 3 ghi nhận lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống nước cất trong 8 ngày có hàm lượng MDA trong gan tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ cyclophosphamid gây tổn thương peroxy hóa tế bào gan dẫn đến việc làm tăng hàm lượng MDA trong gan. Hàm lượng MDA trong gan lô tiêm cyclophosphamid và uống thuốc đối chiếu silymarin liều 0,1 g/kg; cao Thạch hộc nuôi cấy mô với 2 liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg và cao Thạch hộc tự nhiên với 2 liều 0,715 g/kg; 1,43 g/kg thể trọng chuột trong 8 ngày làm hàm lượng MDA giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý, cho thấy silymarin, cao Thạch hộc nuôi cấy mô ở liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg và cao Thạch hộc tự nhiên ở liều 0,715 g/kg; 1,43 g/kg có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA trong gan gây bởi cyclophosphamid. So sánh về tác dụng làm giảm hàm lượng lượng MDA lô thử cao Thạch hộc tự nhiên và Thạch hộc nuôi cấy mô cho thấy Thạch hộc nuôi cấy mô liều 1,25 g/kg so với lô uống liều 0,715 g/kg và 1,43 g/kg của cao Thạch hộc tự nhiên sự khác biệt không ý nghĩa thống kê cũng như với với lô uống silymarin liều 0,1 g/kg. Chứng tỏ về tác dụng làm giảm hàm lượng MDA trong gan của mẫu cao Thạch hộc tự nhiên và cao Thạch hộc nuôi cấy là tương đồng với nhau. Khảo sát hàm lượng GSH trong gan Kết quả bảng 4 cũng ghi nhận là có sự giảm hàm lượng GSH ở lô chứng tiêm cyclophosphamid so với lô chứng sinh lý CY (-). Điều này cho thấy GSH và những nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein và N-acetylcystein) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 24 với chức năng giải độc đã thông qua hệ thống cytocrom P - 450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của cyclophosphamid trong cơ thể. Độc tính của cyclophosphamid tăng kéo theo sự suy giảm GSH nội sinh trong gan, do đó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến hàm lượng MDA tăng. Kết quả thu được lô tiêm cyclophosphamid và thuốc đối chiếu silymarin liều 0,1 g/kg; uống cao Thạch hộc nuôi cấy với liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg và lô uống cao Thạch hộc tự nhiên liều 1.43 g/kg trong 8 ngày làm hàm lượng GSH tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25 g/kg; 2,5 g/kg và cao Thạch hộc tự nhiên liều 1,43 g/kg có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan thông qua việc phục hồi hàm lượng GSH bị suy giảm do cyclophosphamid. So sánh về tác dụng làm tăng hàm lượng lượng GSH của cao Thạch hộc tự nhiên và Thạch hộc nuôi cấy cho thấy Thạch hộc nuôi cấy liều 1,25 g/kg và 2,5 g/kg so với lô uống liều 1,43 g/kg của cao Thạch hộc tự nhiên khác biệt là không ý nghĩa thống kê và so với lô uống silymarin liều 0,1 g/kg. Chứng tỏ về tác dụng làm tăng hàm lượng GSH trong gan của mẫu cao Thạch hộc tự nhiên và cao Thạch hộc nuôi cấy là tương đồng với nhau. KẾT LUẬN Tác dụng chống oxy hóa in vitro: cao Thạch hộc tự nhiên có IC50 = 34,86 (µg/ml) yếu hơn thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32 (µg/ml) và mạnh hơn cao Thạch hộc nuôi cấy mô có IC50 = 86,20 (µg/ml). Tác dụng chống oxy hóa in vivo: cả 2 mẫu cao đều có tác dụng chống oxy hóa tương đương nhau, đều làm giảm hàm lượng MDA và tăng hàm lượng GSH trong gan chuột. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. China’s Pharmarcopoiea, Part One (1977). The People’s Health Sciences Publication. Beijing (Peking), China, pp. 145. 2. Lee YH, Park JD, Baek NI, Kim SI, Ahn BZ (1995). "In Vitro and In Vivo Antitumoral Phenanthrenes from the Aerial Parts of Dendrobium nobile". Planta Medica; 61(2): 178-180. 3. Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008). “Tác dụng của Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm. F. Nees Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide”. Y học TP. Hồ Chí Minh; 12(4): 142-147. 4. Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010). “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)”. Tạp chí Y học TP.HCM; 14(2): 129 – 134. 5. Viện Dược liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo. NXB Khoa học và Kỹ thuật; tr. 28-35, 279-292, 367. 6. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007). Sách Đỏ Việt Nam. NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ; tr. 57-60. 7. Zhang X, Xu JK, Wang J, Wang NL, Kurihara H, Kitanaka S, Yao XS (2007), "Bioactive Bibenzyl Derivatives and Fluorenones from Dendrobium nobile". J. Nat. Prod.; 70: 24-28. Ngày nhận bài báo: 25/04/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018