Nghiên cứu quy trình tách chiết asiaticoside từ cây ngũ gia bì chân chim

Lê Thị Nga và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 13 - 17 13 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ASIATICOSIDE TỪ CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM Lê Thị Nga*, Nguyễn Văn Tùng, Vũ Thị Hằng, Cao Thị Duyên, Lê Thị Phượng, Lưu Hồng Sơn, Tạ Thị Lượng, Trần Văn Chí Trường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố nhiệt độ sấy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi ethanol, ảnh hưởng tới quá trình tách chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim cho kết quả tương ứng: 80oC ; 15/1 (v/w); 80%. Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết tách, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ sấy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ dung môi là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình chiết tách. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken đã tìm được điều kiện tối ưu quá trình tách vỏ cây ngũ gia bì chân chim ở nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 17,51/1 (v/w), ethanol 79,42%, hàm lượng asiaticoside là 0,0545%. Kết quả thực nghiệm cho kết quả có độ tương thích cao với mô hình. Từ khóa: ngũ gia bì chân chim, asiaticoside, tách chiết, tối ưu, Box- Behnken MỞ ĐẦU* Chân chim (Schefflera heptaphylla) là chi lớn nhất, có thành phần loài rất đặc sắc, đa dạng; hiện đã thống kê được khoảng 56 loài (chiếm 39,7% tổng số loài của cả họ) và 4 thứ, trong số đó có tới 40 loài (chiếm 71,2% số loài trong chi, hay 28,4% tổng số loài của cả họ) là đặc hữu. Đây thực sự là nguồn tài nguyên chứa các hợp chất tự nhiên rất phong phú và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam [3], ngũ gia bì chân chim mọc hoang ở nhiều tỉnh miền bắc nước ta [2]. Chân chim có một số tác dụng dược lý: Tăng lực, chống lạnh, hạ đường huyết, kiểu oestrogen, ảnh hưởng đối với thuốc gây ngủ. Ngoài ra, chân chim còn được kết hợp với dược liệu khác để chữa: Phong thấp đau xương, bệnh cước khí, chân sưng đau, chân tê buốt sưng đau, da lở ngứa do thấp nhiệt [4]. Cây ngũ gia bì chân chim là một loại cây dễ kiếm trong tự nhiên và được sử dụng với nhiều công dụng khác nhau. Trong vỏ thân của cây ngũ gia bì chân chim có chứa asiaticoside [1]. Asiaticoside và scheffoleoside B được phân lập từ vỏ thân cây Schefflera heptaphylla [5]. Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose được tìm thấy trong tự nhiên. Asiaticoside có * Tel: 01685141798 khả năng kháng khuẩn và hoạt tính diệt nấm chống lại được mầm bệnh và nấm, asiaticoside còn có khả năng đuổi muỗi hiệu quả [4]. Vì vậy asiaticoside được sử dụng nhiều trong lĩnh vực dược phẩm. Việc tách chiết asiaticoside chịu ảnh hưởng bởi dung môi, điều kiện chiết. Vì vậy mục đích của nghiên cứu là nhằm tối ưu hóa quá trình tách chiết asiaticoside tổng số từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim tại trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Vỏ cây ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla) được thu hái tự nhiên tại trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên, xã Quyết Thắng, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên. Nguyên liệu được rửa sạch, sau đó đem đi sấy ở nhiệt độ 80oC đến độ ẩm dưới 10%, tiến hành bảo quản trong túi PE đặt trong hộ nhựa kín, lưu trữ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng và ẩm. Dung môi: Dùng dung môi ethanol (dạng tinh khiết – Việt Nam). Bố trí thí nghiệm Asiaticoside được chiết từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim bằng dung môi ethanol 50, 60, 70, Lê Thị Nga và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 13 - 17 14 80, 90% (v/v). Nhiệt độ sấy là 60, 70, 75, 80, 85 o C trong các khoảng thời gian 3 h, 4 h, 5 h, 6 h với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu lần lượt là 10:1; 15:1; 20:1 (v/w). Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng asiaticoside tổng số trong vỏ cây ngũ gia bì chân chim, để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box – Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ. Xác định hàm lượng asiaicoside tổng số Cân 3 g bột vỏ cây ngũ gia bì chân chim cho vào giấy lọc buộc kĩ để tránh bột rau chảy ra ngoài. Sau đó cho gói bột vào phần thân của bình soxhlet, còn dung môi cho khoảng 250 ml vào bình cầu bên dưới rồi tiến hành tách chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi. Sau khi chiết xong phần dịch chiết sẽ được cho vào bình tam giác, rồi tiến hành lọc thô, lọc tinh. Cuối cùng dịch chiết được chứa trong eppendorf đem đi phân tích sắc kí. Đánh dấu mức dịch chiết ở bình tam giác và xác định thể tích dịch chiết. Hàm lượng asiaticoside (X) của mẫu sẽ được tính dựa vào nồng độ của asiaticosdie chuẩn thông qua diện tích peak chuẩn và diện tích peak ghi nhận được của mẫu công thức sau: [1] Trong đó: Sas: Diện tích peak của Asiaticoside chuẩn Sm: Diện tích peak của Asiaticosdie mẫu A: Nồng độ mẫu Asiaticoside chuẩn (mg/ml) K: Thể tích của dịch chiết Asiaicoside (ml). Phương pháp xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm xử lý số liệu SPSS 18. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nồng độ ethanol Từ kết quả bảng 1 cho thấy khi chiết ở nồng độ khác nhau thì sẽ cho hàm lượng asiaticoside khác nhau và hàm lượng asiaticoside bắt đầu tăng lên khi chiết ở nồng độ từ 50% đến 70%. Hàm lượng asiaticoside đạt cao nhất tại nồng độ ethanol 80% tương ứng với hàm lượng asiaticoside 0,037%. Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 90% thì hàm lượng asiaticoside không tăng. Do vậy, nồng độ ethanol 80% là thích hợp nhất để thực hiện quá trình tách chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim. Bảng 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng asiaticoside của vỏ cây ngũ gia bì chân chim CT Nồng độ (%) Hàm lượng asiaticoside (mg/100 g) CT1 50 0,027 b ± 0,002 CT2 60 0,028 b ± 0,002 CT3 70 0,030 b ± 0,002 CT4 80 0,037 a ± 0,001 CT5 90 0,036 a ± 0,001 Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05 Ảnh hưởng của thời gian chiết Từ bảng 2 ta thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách asiaticoside từ nguyên liệu vỏ cây ngũ gia bì chân chim. Ta có thể nhận thấy hàm lượng asiaticoside tăng khi tăng thời gian chiết từ 3 h đến 4 h. Tuy nhiên khi tăng thời gian chiết lên 5 h thì có hàm lượng bị giảm từ 0,040% xuống 0,036%. Tiếp tục tăng thời gian chiết lên 6 h thì hàm lượng asiaticoside tiếp tục giảm từ 0,040% xuống 0,035%. Khi chiết ở thời gian là 4 h thì cho hàm lượng asiaticoside là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 h. Bảng 2. Ảnh hưởng của thời gian chiết CT Thời gian chiết (giờ) Hàm lượng asiaticoside (%) CT1 3 h 0,036 b ± 0,001 CT2 4 h 0,040 a ± 0,002 CT3 5 h 0,036 b ± 0,002 CT4 6 h 0,035 b ± 0,002 Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy Từ kết quả bảng 3 cho thấy nhiệt độ sấy là yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng asiaticoside KA Sas Sm X * Lê Thị Nga và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 13 - 17 15 tổng thu được sau quá trình chiết. Từ bảng 3 ta có thể thấy hàm lượng asiaticoside tăng đều khi tiến hành tăng nhiệt độ từ 60oC đến 80oC. Hàm lượng tăng cao từ 0,037% lên 0,048%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 85oC thì hàm lượng asiaticoside có xu hướng giảm. Hàm lượng asiaticoside thu được cao nhất khi chiết ở 80oC. Vì vậy nhiệt độ sấy thích hợp là 80 o C. Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy CT Nhiệt độ (°C) Hàm lượng asiaticoside (%) CT1 60 0,037 c ± 0,001 CT2 70 0,040 b ± 0,002 CT3 75 0,041 b ± 0,002 CT4 80 0,048 a ± 0,002 CT5 85 0,042 b ± 0,001 Ghi chú: Trên cùng 1 cột các giá trị mang cùng chữ số mũ thì khác nhau không có ý nghĩa ở mức α=0,05 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu Từ bảng 4 cho thấy tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng asiaticoside được chiết từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim. Hàm lượng asiaticoside trong dịch chiết tăng lên khi tỷ lệ: dung môi/ nguyên liệu tăng. Từ tỷ lệ 10/1 đến 15/1, hàm lượng asiaticoside tăng nhanh nhưng từ tỷ lệ 15/1 đến 20/1 thì hàm lượng asiaticoside lại tăng chậm. Đạt hàm lượng asiaticoside cao nhất 0,055% ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1. Tuy nhiên hàm lượng asiaticoside ở công thức tỷ lệ 15/1 và 20/1 sự sai khác không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu thích hợp là 15/1 để tiết kiệm dung môi. Bảng 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu CT Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g) Hàm lượng asiaticoside (%) CT1 10/1 0,048 b ± 0,002 CT2 15/1 0,054 a ± 0,002 CT3 20/1 0,055 a ± 0,002 Tối ưu hóa quá trình tách chiết Chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu thu được từ dịch chiết vỏ cây ngũ gia bì chân chim được xử lý trên phần mềm Design- Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá kết quả thu được. Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lượng asiaticoside là cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng asiaticoside: Y= +0,054 – 1,375*10-3*A + 8,75*10-4 *B – 1,25*10 -3 *C – 7,5*10-4*A*B + 9,5 *10- 3 *A*C - 5*10 -4 *B*C – 0,012 A2 – 9,75*10-4 *B 2 – 0,021*C2 Trong đó Y là hàm lượng asiaticoside trong dịch chiết dự báo thu được. Bảng 5. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim TN Biến thực Hàm lượng asiaticoside (%) A (nhiệt độ sấy) B (dung môi/ nguyên liệu) C (nồng độ ethanol) 1 75 10/10 80 0,040 2 85 10/10 80 0,041 3 75 20/1 80 0,043 4 85 20/1 80 0,041 5 75 15/1 70 0,035 6 85 15/1 70 0,011 7 75 15/1 90 0,013 8 85 15/1 90 0,027 9 80 10/1 70 0,032 10 80 20/1 70 0,035 11 80 10/1 90 0,031 12 80 20/1 90 0,032 13 80 15/1 80 0,054 14 80 15/1 80 0,053 15 80 15/1 80 0,055 16 80 15/1 80 0,055 17 80 15/1 80 0,054 Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau: Lê Thị Nga và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 13 - 17 16 Bảng 6. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết asiaticoside từ vỏ cây ngũ gia bì chân chim Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p Model 60,47 9 6,72 105,14 < 0,0001 A 2,07 1 2,07 32,40 0,0267 B 0,25 1 0,25 3,89 0,0485 C 1,04 1 1,04 16,22 0,0386 AB 0,093 1 0,093 1,46 0,0671 AC 1,39 1 1,39 21,79 <0,0001 BC 0,032 1 0,032 0,51 0,0956 A 2 3,21 1 3,21 50,30 <0,0001 B 2 4,16 1 4,16 65,07 0,0364 C 2 44,64 1 44,64 698,63 < 0,0001 Residual 0,45 7 0,064 Lack of Fit 0,32 3 0,11 3,52 0,0743 Sai số (pure error) 0,12 4 0,031 SS tổng Số 60,91 16 SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; Chuẩn F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích của mô hình với thực nghiệm. Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value = 0,0001<0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí nghiệm, Lack of fit test = 0,0743 (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình. (a) (b) (c) Hình 1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng asiaticoside a. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và nhiệt độ b. Mô hình tương tác giữa nồng độ và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu c. Mô hình tương tác giữa nồng độ và nhiệt độ Phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 17,51/1 (v/w), nồng độ ethanol 79,42% khi đó hàm lượng asiaticoside đạt 0,0545%. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho kết quả tương ứng Hình 2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng asiaticoside Lê Thị Nga và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 13 - 17 17 KẾT LUẬN Điều kiện tách chiết thích hợp để thu được hàm lượng asiaticoside được xác định như sau: Nhiệt độ sấy 80oC, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 15/1 (v/w), nồng độ ethanol 80%. Chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ cho phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ sấy 79,52°C, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 17,51/1 (v/w), nồng độ ethanol 79,42% khi đó hàm lượng asiaticoside đạt 0,0545%. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm có độ tương thích cao. Kết quả của chúng tôi chỉ ra tiềm năng sử dụng vỏ cây ngũ gia bì chân chim trong dược phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Thị Vân Anh (2012), Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticoside từ rau má và ứng dụng sản xuất trà chức năng từ rau má, Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật công nghệ thực phẩm và đồ uống, Đại học Đà Nẵng. 2. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học. 3. Lã Đình Mõi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung và cs (2013), “Họ nhân sâm (araliaceae Juss.) nguồn hoạt chất sinh học đa dạng ở Việt Nam”. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Hà Nội ngày 18/10/2013, Nxb Nông nghiệp, tr. 1153- 1157. 4. Nguyễn Tấn Phát (2016), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá Schefflera Sessiliflora De P. V. Thuộc họ ngũ gia bì (Araliaceae), Luận án tiến sĩ hóa học, Học viện khoa học và công nghệ. 5. Chun Wu, Ying-Hiu Duan, Man Meo Li (2013), “Triterpenoid Saponins from the stem barks of Scheffera Heptaphylla”, Phytochemistry, pp. 1348- 1352. SUMMARY THE STUDY OF THE EXTRACTION PROCESS OF ASIATICOSIDE FROM THE BARK OF SCHEFFERA HEPTAPHYLLA Le Thi Nga * , Nguyen Van Tung, Vu Thi Hang, Cao Thi Duyen, Le Thi Phuong, Luu Hong Son, Ta Thi Luong, Tran Van Chi TNU - University of Agriculture and Forestry The purpose of this sudy was to investigate the single-element drying temperature, the solvent/ material ratio, ethanol solubility, which affected the extraction process of asiaticoside from the bark of Schefflera heptaphylla, resulting in 80 o C; 15/1(v/w); 80%. On the basis of the factors affecting the extraction conditions, we found that the drying temperature, the solvent/ material ratio and the solvent concentration were the factors influencing the extraction process. Application of Box-Behnken design found the optimum condition for the extraction process of Schefflera heptaphylla with drying temperature of 79.52 o C, ethanol 79.42% and the material/solvent ratio extraction of 1/17.51 (w/v), asiaticoside content is 0.0545%. Experimental results showed high compatibility with the model. Keywords: Schefflera heptaphylla, asiaticoside, extraction, optimize, Box-Behnken Ngày nhận bài: 13/7/2018; Ngày phản biện: 07/8/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018 * Tel: 01685141798