Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ rễ cây mướp gai (lasia spinosa l.)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 436 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM, KHÁNG OXY HÓA CỦA HỢP CHẤT POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ RỄ CÂY MƯỚP GAI (LASIA SPINOSA L.) Nguyễn Minh Cẩm Tiên*, Phạm Ngọc Khôi** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các nghiên cứu lâm sàng trong và ngoài nước đã chứng minh khả năng sử dụng của các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật trong việc phòng và điều trị các bệnh truyền nhiễm, bệnh ký sinh trùng, bệnh nội khoa và bệnh ngoại khoa để thay thế dần việc sử dụng kháng sinh như hiện nay, đặc biệt là các hợp chất polyphenol có trong thực vật. Cây mướp gai (Lasia spinosa L.) được xem là cây dược liệu quý hiếm đang được nhiều nước trên thế giới khai thác và hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về loại cây này tại Việt Nam. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa của cây mướp gai tại Đồng Nai. Mục tiêu: Khảo sát quy trình tách chiết tốt nhất để thu được hàm lượng polyphenol cao nhất từ rễ cây mướp gai (Lasia spinosa L.) nhằm sử dụng trong việc kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa. Đối tượng và phương pháp: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai. Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu, hoạt tính chống oxy hóa được xác định dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH. Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp đặt đĩa kháng sinh đối với các chủng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi; kháng nấm của cao chiết đối với chủng Candida ablican. Kết quả: Dung môi ethanol 90%, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (1/6), thời gian 150 phút, nhiệt độ 60oC cho hiệu suất chiết tách polyphenol từ rễ cây mướp gai là cao nhất. Trong nghiên cứu này, cao chiết polyphenol (60 mg/mL) có khả năng ức chế lên sự biểu hiện của E.coli, P.aeruginosa, S. aureus và C. ablicans, tuy nhiên cao chiết này không kháng được B. subtilis và S. typhi. Nghiên cứu này còn đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của cao chiết polyphenol thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH với giá trị IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 52,50 mg/mL. Két luận: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm ra được điều kiện chiết tách polyphenol từ rễ cây mướp gai. Đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của cao chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH. Cao chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai thể hiện hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn vitamin C. Cao polyphenol từ rễ cây mướp gai ở nồng độ 60 mg/mL cao kháng được nhiều loại vi khuẩn và nấm bệnh trên người như E. coli, P. aeruginosa, S. aureus và C. ablicans. Từ khóa: Cây mướp gai, polyphenol, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, bệnh nhiễm khuẩn ABSTRACT ANTIBACTERIAL, ANTIFUNGAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF LASIA SPINOSA L. EXTRACTS CONTAINING PHENOLIC COMPOUNDS Nguyen Minh Cam Tien, Pham Ngoc Khoi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 2 - 2016: 436 - 446 * Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM ** Bộ môn Mô Phôi - Di truyền Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 437 Background: Clinical studies domestic and abroad have demonstrated the possibility of using the biological compounds derived from plants in the prevention and treatment of infectious diseases, parasitic diseases, medical conditions and surgical conditions to gradually replace the use of antibiotics as today, especially the polyphenol compound in plants. Lasia spinosa L. are considered rare medical plants are many mining countries in the world and there are not many studies on this plant in Vietnam. This study was carried out to optimize extracting condition of polyphenol from Lasia spinosa L. roots, and antibacterial, antifungal, antioxidant of Lasia spinosa L. in Dong Nai province. Aims: Surveying the best extraction process to obtain the highest polyphenol content Lasia spinosa L. roots to use in antibacterial, antifungal, antioxidants. Methods: Survey of factors affecting performance polyphenol extracted from Lasia spinosa L. roots. Polyphenol content was determined by a colorimetric method, antioxidant activity is based on the ability to eliminate free radicals DPPH. Indenting antibacterial extracts of method antibiotic disks set for the strain of Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudononas aeruginosa and Salmonella typhi, antifungal extract of strains of Candida ablicans. Results: Ethanol 90%, the ratio of material/solvent (1/6), 150 minutes, 60oC for polyphenol extraction efficiency is the highest Lasia spinosa L. roots. In this study, polyphenol extracts capable of inhibiting the expression of E. coli, P. aeruginosa, S. aureus and C. ablicans. However this is not resistant B. subtillis and S. typhi. This study also evaluated the ability to capture free radicals DPPH IC50 value of the ability to capture free radicals DPPH (52.50 mg/mL). Conclusions: In this study, for the first time, we were carried out to optimize extracting conditions of polyphenol from Lasia spinosa L. roots. Evaluated the ability of antioxidants of polyphenol extracted though the ability to capture free radicals DPPH. Polyphenol extracts shown antioxidant activity of vitamin C lower. Polyphenol extracts are decent variety of bacterial and fungal diseases in humans, such as E. coli, P. aeruginosa, S. aureus and C. ablicans. Keywords: Lasia spinosa L., polyphenol, antibacterial, antifungal, antioxidant, infection. ĐẶT VẤN ĐỀ Các công trình nghiên cứu về lĩnh vực đông y, y dược cổ truyền đã và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam. Các nhà khoa học trong nước đã chú ý đến việc sử dụng dược liệu thực vật trong phòng và điều trị bệnh truyền nhiễm, bệnh ký sinh trùng, bệnh nội khoa và bệnh ngoại khoa... Hiện nay, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa đã và đang trở nên khá phổ biến. Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với một số bệnh nhiễm khuẩn. Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn như các carotenoid, flavonoid, vitamin C, vitamin E, Các hợp chất phenolics là những chất chống oxy hóa tự nhiên, được phát hiện phổ biến trong các loại thực vật. Chúng đã được báo cáo là có nhiều chức năng sinh học quý bởi vì chúng có khả năng trì hoãn hiệu quả quá trình oxy hóa chất béo và do đó góp phần cải thiện chất lượng và dinh dưỡng của thực phẩm(3, 5). Polyphenol là những hợp chất thơm có nhóm hydroxyl đính trực tiếp với nhân benzene(4). Polyphenol có nhiều trong thực vật như rau, quả, hoa và một số bộ phận của thực vật. Polyphenol đóng vai trò hết sức quan trọng đối với đời sống thực vật như tạo màu sắc đặc trưng, bảo vệ thực vật khỏi những tác nhân xâm hại của côn trùng, sự oxy Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 438 hóa và tác dụng của tia cực tím. Về y học, polyphenol là một trong những hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng như chống oxy hóa mạnh, kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng, chống lão hóa và một số bệnh tật liên quan đến ung thư(3). Cây mướp gai (Lasia spinosa L.) là loài thực vật có hoa trong họ Ráy (Araceae). Lá non cây mướp gai được dùng làm rau ăn ở nhiều nước Đông Nam Á và dùng làm bài thuốc trị bệnh, đặc biệt là bệnh gan. Ngoài ra mướp gai còn được sử dụng làm thuốc chữa lở ngứa ngoài da, trị tê thấp, lưng, gối cẳng chân tê buốt, thanh nhiệt, giải độc. Hiện nay, trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về cây này. Các nhà khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bước đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó. Những nghiên cứu trước đây về hàm lượng flavonoid trong loài Araceae cho thấy rằng loài Araceae có chứa những hợp chất đơn giản như flavone C- glycosides, flavonols, flavones và proanthocyanidins là các chất chính(8). Các nghiên cứu về hoạt chất hóa học có nguồn gốc thực vật trên lá cây đã được báo cáo về sự phân lập triglochinin, trong khi β-sitosterol acetate, stigmasterol và acetate của nó được phân lập từ thân rễ của cây(2). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa của rễ cây mướp gai tại vùng Đồng Nai. Từ đó đề ra điều kiện tách chiết thích hợp. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp dữ liệu khoa học về điều kiện tách chiết rễ cây mướp gai để thu được hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa cao nhất. ĐỐI TƯỢNG - ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Rễ cây mướp gai được thu từ ven các con suối huyện Cẩm Mỹ, tỉnh Đồng Nai. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm là chủng Bacillussubtilis, Staphylococcus aureus đại diện cho nhóm vi khuẩn gram dương và Escherichiacoli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi đại diện cho nhóm vi khuẩn gram âm. Chủng nấm bệnh thử nghiệm là các chủng Candida albicans. Các chủng này được do phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM cung cấp. Xử lý mẫu Mẫu sau khi được thu hoạch, xác định các thông số về sinh trưởng như: chiều cao, mức độ trưởng thành và tuổi thu hoạch. Mẫu tươi được phơi khô tự nhiên. Mẫu rễ tươi được phơi khô tự nhiên, sau đó đem xác định độ ẩm của nguyên liệu và định tính sơ bộ thành phần hóa học của cây mướp gai. Công thức thí nghiệm Để nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết, sử dụng 5 loại dung môi có độ phân cực khác nhau, bao gồm: acetone 99,5%, ethanol 99,5%, methanol 99,5%, ethyl acetate 99,5% và nước. Các thông số về thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết được giữ cố định với giá trị tương ứng là: 180 phút, 30oC và 1/6 (g/mL). Loại dung môi chiết thích hợp được chọn dựa vào hàm lượng polyphenol và hàm lượng flavonoid cao nhất. Sau đó sử dụng dung môi này để nghiên cứu các thông số khác. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol và hàm lượng flavonoid của rễ cây mướp gai được thực hiện ở nồng độ dung môi là 50, 60, 70, 80, 90, 96 và 99,9%. Các thông số khác cố định bao gồm: dung môi chiết, nhiệt độ chiết và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết là 1/6 (g/mL). Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết được nghiên cứu ở các mức 1/4, 1/6, 1/8, 1/10 (g/mL). Các thông số cố định gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian chiết 180 phút và nhiệt độ chiết 30oC. Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cũng được lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol và hàm lương flavonoid, cố định thông số này để nghiên cứu các thông số còn lại. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 439 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol và hàm lượng flavonoid của rễ cây mướp gai được thực hiện ở 30, 40, 50, 60, 70 và 80oC. Các thông số cố định gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian chiết 180 phút và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết. Nhiệt độ chiết thích hợp được lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol và hàm lượng flavonoid, cố định thông số này để nghiên cứu các thông số còn lại. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol và hàm lượng flavonoid của rễ cây mướp gai được nghiên cứu ở các mốc thời gian 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 và 300 phút. Các thông số khác cố định bao gồm: dung môi chiết, nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết. Thời gian chiết thích hợp cũng được lựa chọn dựa vào hàm lượng polyphenol và hàm lương flavonoid cao nhất. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ, cụ thể như sau: dịch chiết được hòa loãng ở nồng độ thích hợp, sau đó 0,1 mL dịch chiết đã pha loãng trộn với 0,9 mL nước cất trước khi thêm 1 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu. Hỗn hợp được trộn đều trước khi thêm 2,5 mL Na2CO3 7,5%. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được giữ ở 30oC trong 30 phút trước khi đi đo ở bước sóng 760 nm sử dụng máy quang phổ kế (Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi miligam acid gallic tương đương (mg GAE)/g chất khô. Xác định hàm lượng flavonoid tổng số Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3. Phản ứng này dùng để xác định hàm lượng flavonoid tổng. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Hút 0,5 mL dịch chiết bổ sung 1,5 mL ethanol 95% + 0,1 mL AlCl3 + 0,1 mL CH3COOK và 2,8 mL nước cất. Sau đó, hỗn hợp được lắc đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, rồi tiến hành đo trên máy UV-Vis ở bước sóng 415 nm, mẫu trắng sử dụng là nước cất. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cụ thể như sau: khoảng 20 - 140 µL dịch chiết đã pha loãng đến nồng độ thích hợp được trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 mL. Sau đó thêm 1 mL dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Carry 50, Varian, Australia). Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT-ASP)/ACT (trong đó: ACT là độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết, ASP là độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết). Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp đặt đĩa giấy để khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai. 1: Mẫu đối chứng (DMSO) 2: Dịch chiết nồng độ 20 mg/mL 3: Dịch chiết nồng độ 40 mg/mL 4: Dịch chiết nồng độ 60 mg/mL Số nghiệm thức/đĩa petri: 4 nghiệm thức Tổng số đĩa petri cho 1 loại vi sinh vật: 3 đĩa Tổng số đĩa petri cho 5 loại khuẩn và 1 loại nấm: 18 đĩa Thể tích môi trường/đĩa petri: 20 mL Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 440 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA. Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng SAS 8.0. Kiểm định Tukey được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý nghĩa P<0,05. KẾT QUẢ Kết quả định tính một số nhóm chất tự nhiên Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong cây mướp gai Hợp chất Thuốc thử Hiện tượng Kết luận 1 Steroid Salkowsky Vòng ngăn cách ++ Libermann- Burchard Màu đỏ ++ 2 Flavonoid (CH3COO)2Pb bão hòa Kết tủa trắng + Dung dịch FeCl3 1% Kết tủa xanh lục đen + 3 Alcaloid Bouchardat Kết tủa màu nâu +++ 4 Saponin Tạo bọt CSB > 100 + 5 Tannin (CH3COO)2Pb Kết tủa vàng nhạt ++ FeCl3 1% Dung dịch màu xanh đen ++ 6 Glycosyd Fehling Kết tủa đỏ ++ Tollens Kết tủa Ag ++ 7 Coumarin Phản ứng mở vòng lacton Ống có kiềm trong, acid hóa thì đục ++ Phản ứng diazo hóa Dung dịch đỏ thẫm ++ Chú thích: + dương tính, ++ dương tính rõ, +++ dương tính rất rõ Kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol trong rễ cây mướp gai Dung môi tách chiết là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến hiệu quả chiết. Hiệu quả chiết polyphenol từ nguyên liệu thực vật phụ thuộc vào loại dung môi sử dụng đặc biệt là độ phân cực của dung môi. Ảnh hưởng của các loại dung môi chiết lên hàm lượng polyphenol của dịch chiết được thể hiện trong hình 1. Kết quả cho thấy dung môi chiết ethanol 99,5%; methanol 99,5% cho hàm lượng polyphenol cao hơn đáng kể so với dung môi chiết acetone 99,5%; ethyl acetate 99,5% và nước. Trong các dung môi khảo sát, ethanol cho hiệu quả trích ly polyphenol (TPC và TFC) hiệu quả nhất cho TPC đạt 138,40 mgGAE/g db và TFC đạt 220,57 µgQE/g, nước cho hiệu quả chiết thấp nhất với TPC là 46,16 mgGAE/g db và TFC là 114,08 µgQE/g. Từ kết quả thu được, hiệu suất chiết polyphenol bằng dung môi được sắp xếp theo thứ tự giảm dần, có nghĩa là ethanol > methanol > acetone > ethyl acetat > nước. Sự khác nhau về hiệu quả chiết của dung môi có thể được giải thích như sau: hiệu quả chiết của dung môi phụ thuộc vào khả năng khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu. Cả năm loại dung môi được nghiên cứu đều có khả năng chiết được polyphenol, nhưng mỗi loại dung môi lại có những ưu nhược điểm riêng. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phenol trình bày ở phần trên cho thấy các hợp chất này đều có chứa một hoặc nhiều nhân benzen, mạch nhánh ankane ngắn, mang các nhóm chức hydroxyl (-OH), metoxyl (-OCH3), carboxyl (-COOH) nên nói chung các hợp chất phenol có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, tùy theo hợp chất có mang ít hay nhiều nhóm chức hydroxyl, carboxyl Vì vậy, muốn chiết tách hợp chất này ra khỏi cây cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần. Hình 1: Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng polyphenol và flavonoid chiết từ rễ cây mướp gai Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 441 Các kết quả có được hoàn toàn phù hợp về độ phân cực của dung môi dùng để chiết tách và tính tan của các hợp chất polyphenol trong nguyên liệu. Chỉ số phân cực của ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol là 4,4; 5,1; 5,1; 5,2(3). Ethanol và methanol là dung môi vạn năng để chiết kiệt các hợp chất có trong bột cây và giá thành rẻ. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn dung môi ethanol để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenol Các kết quả có được hoàn toàn phù hợp về độ phân cực của dung môi dùng để chiết tách và tính tan của các hợp chất polyphenol trong nguyên liệu. Chỉ số phân cực của ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol là 4,4; 5,1; 5,1; 5,2(3). Ethanol và methanol là dung môi vạn năng để chiết kiệt các hợp chất có trong bột cây và giá thành rẻ. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn dung môi ethanol để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nồng độ ethanol có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng trích ly của cả TPC và TFC từ rễ cây mướp gai. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenol được trình bày trên hình 2. Kết quả cho thấy khi tăng nồng độ dung môi chiết ethanol thì TPC và TFC trong dịch tăng dần. Ở nồng độ 50% TPC là 53,68 mgGAE/g db, TFC là 95,64 µgQE/g. Khi tăng nồng độ ethanol lên 60%, 70%, 80%, 90% thì TPC tăng dần tương ứng là 79,39; 111,19; 116,30; 136,68 mgGAE/g db và TFC cũng tăng dần. Trong các nồng độ dung môi trên thì ở mẫu chiết ở 90% cho giá trị TPC (136,68 mgGAE/g db) và TFC (193,65 µgQE/g) là cao nhất. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ ethanol lên 96% và 99,5% thì TPC và TFC trong các mẫu này lại giảm, chỉ còn 93,69 mgGAE/g db, 172,83 µgQE/g ở 90% và 40,08 mgGAE/g db, 100,39 µgQE/g ở 99,5%. Nồng độ ethanol càng tăng thì khả năng trích ly các chất càng nhiều do sự thẩm thấu và khả năng khuếch tán hợp chất càng cao. Chính vì vậy tổng polyphenol trong dịch chiết tăng dần. Tuy nhiên khi tăng nồng độ ethanol 96% thì hàm lượng polyphenol giảm. Hiện tượng này là do khi nồng độ ethanol quá cao sẽ gây biến tính tế bào cũng như thành tế bào bị mất nước cục bộ dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khô và co lại, ngăn chặn quá trình trích ly các hợp chất polyphenol vào trong dung môi. Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn nồng độ ethanol là 90% để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenol và flavonoid Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi đến hiệu quả trích ly polyphenol Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi đến hiệu quả trích ly được trình bày trên hình 3. Có thể quan sát thấy rằng tỷ lệ mẫu trong dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến cả TPC và TFC. Khi tăng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/4 lên 1/6 thì TPC tăng đáng kể 135,3 mgGAE/g db, tăng 1,472 lần và TFC là 179,97 µgQE/g, tăng 1,149 lần. Tỷ lệ mẫu trong dung môi là 1/6 (g/mL) cho hàm lượng cao nhất của cả TPC và TFC. Gia tăng hơn nữa tỷ lệ mẫu trong dung môi (tức từ 1/6 - 1/10) giảm hàm lượng của cả TPC và TFC. Theo Tân và cộng sự (2011), một tỷ lệ dung môi Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 442 cao có thể được tìm thấy và cho là thuận lợi trong việc trích ly các hợp chất polyphenol. Các kết quả này phù hợp với nguyên tắc truyền khối mà động lực cho khối lượng truyền khối được coi là gradient nồng độ giữa chất rắn và dung môi. Tỷ lệ dung môi cao có thể thúc đẩy một gradient nồng độ càng tăng, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán cho phép quá trình trích ly chất rắn bằng dung môi được tốt hơn(1). Ngoài ra, cơ hội của các thành phần hoạt tính sinh học tiếp xúc với dung môi trích ly được mở rộng với sự gia tăng lượng dung môi, dẫn đến tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, sản lượng thành phần hoạt tính sinh học sẽ không tiếp tục tăng khi đã đạt được sự cân bằng. Hình 3: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi đến hàm lượng TPC và TFC Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả trích ly polyphenol Hình 0: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến TPC và TFC Ứng với các nhiệt độ chiết khác nhau cho giá trị TPC và TFC thu được cũng có sự khác biệt rõ rệt. Điều đó cho thấy nhiệt độ là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu quả trích ly polyphenol được trình bày trên hình 4. Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly tăng lên khi ta tăng nhiệt độ từ 30oC - 60oC từ 43,23 đến 115,67 mgGAE/g db, TFC tăng từ 107,98 đến 139,51 µgQE/g và giảm khi ở 70oC và 80oC. Nhiệt độ cao có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt của dung dịch, giúp các phân tử cần chiết dễ dàng khuếch tán trong lòng các phân tử của dung môi do đó làm tăng tốc độ khuếch tán dẫn đến hiệu quả thu hồi dịch chiết mang cấu tử cần chiết tốt hơn. Mặt khác, nhiệt độ giúp làm biến tính màng tế bào và phá hủy màng tế bào nhờ các bọt khí tạo thành làm cho quá trình chiết tách dễ dàng hơn. Theo Shi và cộng sự (2003), nhiệt độ sẽ làm suy yếu sự liên kết giữa phenol và lipoprotein cũng như polyphenol tương tác với polysaccharide trong nguyên liệu thực vật từ đó tốc độ khuếch Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 443 tán của polyphenol từ bên trong nguyên liệu ra ngoài dung môi mạnh hơn. Mặc dù nhiệt độ tác động tích cực trong việc trích ly polyphenol, nhưng không có nghĩa là có thể tăng nhiệt độ vô thời hạn. Khi nâng nhiệt độ lên đến một mức độ nào đó có thể làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi mãnh liệt đồng thời quá trình oxy hóa polyphenol tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly. Điều này được giải thích trong nghiên cứu của Abad-Garcia và cộng sự (2007), nhiệt độ cao sẽ gây biến tính màng tế bào cũng như sự phân hủy các polyphenol do phản ứng thủy phân, phản ứng oxy hóa, phản ứng trùng hợp sẽ làm giảm hàm lượng, hoạt tính sinh học của các hợp chất. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly polyphenol Thời gian chiết cũng là một trong những yếu tố quan trọng, ảnh hưởng tới hiệu suất, chất lượng của dịch chiết polyphenol cũng như tính kinh tế của quá trình. Nếu thời gian quá ngắn, không đủ để dung môi xâm nhập vào trong tế bào, hòa tan polyphenol và khuếch tán ra ngoài dung môi ít thì hàm lượng polyphenol thấp, ngược lại khi thời gian chiết quá dài làm giảm hiệu suất và polyphenol có thể bị oxy hóa. Tiến hành chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai ở các mức thời gian khác nhau ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly được trình bày trong hình 5. Quan sát kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian chiết ở 150, 180, 240 và 300 phút cho TPC cao hơn đáng kể so với thời gian chiết ở 30, 60, 90 và 120 phút. Khi tăng thời gian chiết từ 30 phút lên 150 phút, hàm lượng polyphenol chiết được tăng tương ứng là 60,74 lên 133,12 mgGAE/mg db. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian chiết lên 180, 240 và 300 phút, hàm lượng polyphenol tăng lên không đáng kể và không có sự khác biệt so với thời gian chiết 150 phút. Kết quả cũng được ghi nhận tương tự đối với TFC.Điều đó cho thấy đối với rễ cây mướp gai thời gian 150 phút đủ để chiết polyphenol trong những điều kiện đã xác định, đồng thời tiết kiệm năng lượng và rút ngắn quá trình chiết. Hình 5: Ảnh hưởng của thời gian đến TPC và TFC Kết quả này có thể được giải thích bằng định luật thứ hai của Fick về sự khuếch tán khi dự đoán trạng thái cân bằng cuối cùng giữa nồng độ chất tan trong ma trận chất rắn trong dung môi có thể đạt được sau một thời gian nhất định (Silva và cộng sự, 2007). Khi thời gian trích ly tăng thì lượng polyphenol khuếch tán từ tế bào ra ngoài càng nhiều. Do lúc đầu lượng polyphenol ở mẫu lớn nên sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào cao vì vậy mà hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly tăng mạnh. Tuy nhiên, theo thời gian hàm lượng polyphenol bên trong và bên ngoài tế bào gần đạt đến trạng thái cân bằng nên làm cho lượng polyphenol thu được tăng không đáng kể. Hiệu suất của quá trình trích ly polyphenol Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu suất trích ly polyphenol được trình bày trên hình 6. Kết quả cho thấy khi số lần trích ly tăng thì lượng polyphenol khuếch tán từ tế bào ra ngoài càng nhiều. Lúc đầu lượng polyphenol có trong mẫu lớn làm cho sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào cao nên hàm lượng polyphenol thu được ở lần trích ly đầu cao. Nhưng ở lần trích ly sau thì nồng độ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 444 polyphenol trong dịch chiết gần đạt đến trạng thái bão hòa làm cho hàm lượng polyphenol trong dịch chiết không cao. Giả sử sau 3 lần trích ly thì hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu còn lại là không đáng kể, do đó tổng lượng polyphenol trích ly được trong mẫu là 248,06 mg GAE/g db. Hình 6: Hiệu suất trích ly polyphenol và flavonoid Hiệu suất trích ly lần 1 = = 53,53% Hiệu suất trích ly lần 2= = 33,53% Hiệu suất trích ly lần 3= = 12,94% Nếu trích ly 1 lần thì polyphenol còn trong bã nhiều (83,18 mgGAE/g db). Nếu trích ly 2 lần thì polyphenol còn trong bã rất thấp (32,10 mgGAE/g db).Số lần trích ly càng nhiều thì hàm lượng polyphenol tăng nhưng việc tăng số lần trích ly lại tiêu tốn về mặt năng lượng và dung môi. Do đó, số lần trích ly polyphenol thích hợp nên chọn là 3 lần. Như vậy sau 3 lần trích ly thì hàm lượng polyphenol thu được trong dịch rễ cây mướp gai là 248,06 mgGAE/g db. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ rễ cây mướp gai Các nồng độ vitamin C và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường thẳng với phương trình y = 1,0707x + 0,9512, với hệ số tương quan R2 = 0,9944. Thay y = 50 vào phương trình tìm được IC50 = 45,81 (mg/mL) Đồ thị 1: Tỉ lệ ức chế gốc tự do của vitamin C Đồ thị 2: Khả năng bắt gốc tự do của cao chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai Các nồng độ của cao chiết từ rễ cây mướp gai và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường thẳng với phương trình y = 1,5024x – 28,878, với hệ số tương quan R2 = 0,9912. Thay y = 50 vào phương trình tìm được IC50 = 52,50 (mg/mL). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 445 DPPH là phương pháp kiểm tra khả năng làm sạch gốc tự do hoặc nhóm cho hydro, sử dụng để định lượng chất kháng oxy hóa trong các hệ thống sinh học phức tạp. DPPH là hợp chất có màu tím được hấp thu ở bước sóng 517 nm. Khi các điện tử lẻ của các gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất kháng oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH – H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH(7). Do đó, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị giảm và ngược lại. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của rễ cây mướp gai được trình bày trong đồ thị 2. Từ kết quả ở đồ thị cho thấy, hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH tăng phụ thuộc vào nồng độ cao chiết. Khi nồng độ cao chiết tăng thì hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH tăng và ngược lại. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của rễ cây mướp gai được so sánh dựa vào khả năng loại bỏ 50% lượng gốc tự do. Giá trị IC50 của cao polyphenol chiết từ rễ cây mướp gai và vitamin C lần lượt là 52,50 mg/mL và 42,81 mg/mL, so sánh 2 giá trị IC50 trên cho thấy cao polyphenol thu được có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn vitamin C. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ rễ cây mướp gai Bảng 2: Đường kính vòng kháng khuẩn của cao polyphenol từ rễ cây mướp gai Loại vi sinh vật Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ cao chiết (mg/mL) Mẫu đối chứng 20 40 60 DMSO S. aureus 6,67 c 8,50 b 12,00 a 0,00 B. subtilis 0,00 0,00 0,00 0,00 E. coli 0,00 c 14,70 b 19,63 a 0,00 P.aeruginosa 12,77 c 15,63 b 18,67 a 0,00 S. typhi 0,00 0,00 0,00 0,00 C. ablicans 0,00 a 7,73 b 11,70 a 0,00 Các mẫu tự khác nhau (a,b,c,) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P= 0,05 Bảng 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao polyphenol từ rễ cây mướp gai Loại vi sinh vật Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Nồng độ cao chiết (mg/mL) 20 40 60 S. aureus + + ++ B. subtilis - - - E. coli - ++ +++ P. aeruginosa + +++ +++ S. typhi - - - C. ablicans - + ++ Kháng cao: +++; kháng trung bình: ++; kháng thấp:+; không kháng: - Từ bảng 2 thấy: Đối với P. aeruginosa và S. aureus: đường kính vòng kháng khuẩn ở mẫu cao chiết từ rễ cây mướp gai có nồng độ 20 mg/mL nhỏ nhất, tăng lên ở cao chiết từ rễ cây mướp gai có nồng độ 40 mg/mL và cao nhất ở nồng độ 60 mg/mL. Cả 3 nồng độ của cao chiết này đều có đường kính vòng kháng khuẩn cao hơn so với mẫu DMSO, chứng tỏ cao chiết từ rễ cây mướp gai có khả năng kháng P. aeruginosa và S. aureus, khả năng kháng tương đối cao. Đối với E.coli: không có vòng kháng khuẩn ở mẫu cao chiết từ rễ cây mướp gai có nồng độ 20 mg/mL, nồng độ 40 mg/mL có đường kính vòng kháng khuẩn (14,70 mm) và cao nhất ở nồng độ 60 mg/mL (19,63 mm). Chứng tỏ cao chiết từ rễ cây mướp gai có khả năng kháng E. coli. Đối với B. subtilis và S. typhi: ở tất cả các nồng độ cao chiết, không có vòng kháng khuẩn giống như mẫu đối chứng DMSO, chứng tỏ cao chiết từ rễ cây mướp gai không có khả năng kháng hai loại vi khuẩn là B. subtilis và S. typhi. Đối với nấm men C. ablicans: không có vòng kháng khuẩn ở mẫu cao chiết từ rễ cây mướp gai có nồng độ 20 mg/mL, nồng độ 40 mg/mL có đường kính vòng kháng khuẩn (7,73 mm) và cao nhất ở nồng độ 60 mg/mL (11,70 mm). Chứng tỏ cao chiết từ rễ cây mướp gai có khả năng kháng C. ablicans. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 446 Với nồng độ cao chiết từ rễ cây mướp gai là 60 mg/mL, tạo vòng vô khuẩn có đường kính lớn nhất với P. aeruginosa tiếp theo là E. coli, S. aureus, C. ablicans và cuối cùng là B. subtilis với sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhìn chung, cao polyphenol chiết từ rễ cây mướp gai có khả năng kháng khá đa dạng loài vi khuẩn. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm ra được điều kiện chiết tách polyphenol từ rễ cây mướp gai cho hiệu suất cao nhất là dung môi ethanol, nồng độ ethanol 90%, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/6 (g/mL), thời gian 150 phút, nhiệt độ 60oC với 3 lần chiết là thích hợp. Đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của cao chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH. Cao chiết polyphenol từ rễ cây mướp gai thể hiện hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn vitamin C với giá trị IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 52,50 mg/mL. Khảo sát được tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao polyphenol từ rễ cây mướp gai, ở nồng độ 60 mg/mL cao kháng được E. coli, P. aeruginosa, S. aureus và C. ablicans nhưng không kháng được B. subtilis và S. typhi. Tuy nhiên, cũng cần có thêm nhiều nghiên cứu mới để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh sạch cao polyphenol, thành phần hóa học cũng như khảo sát khả năng kháng một số chủng vi khuẩn, nấm gây bệnh khác của cao polyphenol từ rễ cây mướp gai, hay triển khai thử nghiệm in vivo trên chuột viêm gan hay xơ gan để làm sáng tỏ hơn về các cơ chế kháng bệnh của cao chiết polyphenol này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmad J, Wizarat D, Shamsuddin KM, Zaman A, Connolly JD 1984. Phytochemistry. DINDA. B. et al. 2004. Chemical constituents of Lasia spinosa, Mussaenda incana and Wendlandia tinctoria. Journal of The Indian Chemical Society. 81:73-76. 2. Jin D and Russell JM. 2010. Plant phenolic: extraction, analysis and antioxydant and anticancer properties. Molecules. 15: 7313-7352. 3. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn Và Lê Doãn Diên. 2002. Hóa sinh công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Marja PK, Anu IH, Heikki JV, Jussi-Pekka R, Kalevi P, Tytti SK, Marina H 1999. Antioxydant activity of plant extracts containing phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 47: 3954-3961. 5. Nguyễn Kim Phi Phụng. 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Prakash A, Rigelhof F and Miller et al. 2000. Antioxidant activity. Analytical progress Medallion Laboratories.1-4. 7. Suthikrai W, Jintana R, Sophon S, Hengtakulsin R, Usawang V. et al. 2007. Effects of Lasia spinosa Thw. on growth rate and reproductive hormone of weaned Swamp buffalo and Murrah X Swamp buffalo calves. Italian Journal of Animal Science. 6: 532-535. 8. Zheng X. et al. 2013. Extraction characteristics andoptimal parameters of anthocyanin from blueberry powder under microwave-assisted extraction conditions. Sep. Purif. Technol. 104:17-25. Ngày nhận bài báo: 13/03/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 28/03/2016 Ngày bài báo được đăng: 15/04/2016