Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Lê Tấn Đức

Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Lê Tấn Đức: TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 205 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2 (1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com (2)Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và nồng độ acetosyringone trong quá trình xâ...

pdf7 trang | Chia sẻ: quangot475 | Ngày: 19/01/2021 | Lượt xem: 360 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryiab vào cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Lê Tấn Đức, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 205 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2 (1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com (2)Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500 mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của công ty Envirologix (Mỹ). Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA, PCR. MỞ ĐẦU Cà chua là một loại rau ăn quả được trồng rất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quả được ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến. Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi ngày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây cà chua như một trong những loại cây trồng chính. Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quả kinh tế khá cao. Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khích phát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởi sâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera và Spodoptera litura). Một số loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạn khác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồng chống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chất hóa học của các loại thuốc này có thể tác hại đến người tiêu dùng. Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyển gen trên cây cà chua như các tác giả Cortina et al. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker et al. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lá mầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu cho việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện của gen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làm giảm tác hại của sâu hại cà chua. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386, TN148 của Công ty Trang Nông và giống Hồng Châu của Công ty Sygenta. Phương pháp Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy Môi trường gieo hạt là 1/2MS [10] không chất điều hòa sinh trưởng. Môi trường tiền tái sinh là MS với vitamin B5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/l NAA, 1 mg/l BA. Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi 206 vitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA. Môi trường chọn lọc như môi trường tái sinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/l cefotaxime. Môi trường ra rễ là MS. Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC. Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiện nuôi cấy Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen nptII (kháng kanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/l kanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm trong môi trường AB [3] cũng có nồng độ kanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệt độ nuôi cấy ở 28oC. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các nồng độ khác nhau đến khả năng chuyển gen Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600 nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển gen với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen thông qua biểu hiện của gen gusA. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng chuyển gen Để nâng cao tần số chuyển gen acetosyringone được sử dụng với các nồng độ 50, 100 và 150 µM trong quá trình chuyển gen với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển gen các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen. Quy trình chuyển gen Các mẫu lá mầm 10 ngày tuổi từ cây in vitro được sử dụng làm vật liệu chuyển gen. Các bước chuyển gen: 1. Nuôi cấy lá mầm trên môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA trong thời gian 2 ngày; 2. Gây nhiễm các mẫu lá mầm với vi khuẩn trong thời gian 20 phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc; 3. Nuôi chung mẫu lá mầm với vi khuẩn trong 2 ngày; sử dụng môi trường như trên nhưng có 100 µM acetosyringone; 4. Rửa thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc nhẹ); 5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mẫu lá mầm trên môi trường tái sinh có chọn lọc. Thời gian nuôi 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; 6. Khi xuất hiện chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm) cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh trưởng đến khi vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi khoảng 1 tháng. Kiểm tra cây chuyển gen Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme β- glucoronidase trong mô tế bào thực vật chuyển gen. Lá mầm sau khi chuyển gen 4 ngày và chồi con tái sinh được ngâm trong dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) ở nhiệt độ 37oC trong 20 giờ thì loại bỏ dung dịch và thay bằng cồn 70% cho đến khi các điểm xanh xuất hiện rõ ràng. Phân tích bằng phương pháp sinh học phân tử PCR: Cây con sau khi tái sinh chọn lọc được tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ lá theo phương pháp của Dellaporta et al. (1983) [4]. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu. Gen nptII: Mồi 1 (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC - 3’, Mồi 2 (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 58C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp. Gen cryIA(b) : Mồi 1 (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC - 3’, Mồi 2 (R): 5’ - GCC AGA ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương trình nhiệt: 94C: 4 phút; 35 chu kỳ (94C: 30 giây, 54C: 60 giây, 72C: 1 phút 30 giây); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb: Kit của Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) được sử dụng để phát hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển gen. Lá tươi của cây cà chua được nghiền trong TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 207 tube 1,5 ml đến khi lá bị vỡ nát cho thêm dung dịch tách chiết protein được cung cấp bởi công ty. Tiếp tục nghiền. Que thử được nhúng vào trong tube khoảng 5 phút sẽ cho kết quả nếu có mặt của độc tố tạo bởi gen cryIAb sẽ xuất hiện hai vạch (dương tính) trên que thử nếu chỉ có môt vạch là âm tính. Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Phần mềm MSTAT-C được dùng để phân tích kết quả thí nghiệm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Giống cà chua TN 386 được dùng trong thí nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen. Theo tác giả Abida Yasmeen et al. (2009) [1] nếu trước khi chuyển gen đặt lá mầm vào môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BA trong thời gian 2 ngày sẽ giúp tăng khả năng tái sinh và tần số chuyển gen nên trước khi cho xử lí chuyển gen chúng tôi đặt lá mầm 10 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu và nuôi cấy trong môi trường này. Lá mầm đã được cắt ở phần đầu lá và phần cuống lá để tạo vết thương giúp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm. Khoảng 80% lá mầm có phát triển bằng cách phình to ra sau 2 ngày, các lá mầm này được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen. Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng chuyển gen Sau khi lá mầm giống cà chua TN 386 được tạo vết thương và xâm nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmidCAMBIA2301cryIAb và plasmid này có mang gen gusA (gen chỉ thị) nên chúng tôi sử dụng biểu hiện của gen này để đánh giá kết quả chuyển gen của thí nghiệm. Kết quả sau khi chuyển gen 4 ngày chúng tôi nhuộm các lá mần để xem biểu hiện của gen GusA cho thấy mức độ chuyển gen thông qua biểu hiện của gen gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ của dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước đây của tác giả Fillatti et al (1987) [5]. Biểu hiện tạm thời cao nhất của gen gusA (hình 1) khi OD600nm là 1,0 với tần suất là 40,55%, khi OD600nm là 0,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng giảm và khi OD600nm tăng là 1,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng không tăng theo chỉ số OD (bảng 1). Hình 1. Biểu hiện của gen gusA trên lá mầm Bảng 1. Ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA OD600nm Số lượng lá mầm xử lí chuyển gen Số lượng lá mầm biểu hiện gen gusA % lá mầm biểu hiện gen gusA 0,5 30 6 19,17  6,29b* 1,0 30 12 40,56  10,05a 1,5 30 8 26,67  2,89ab Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi 208 * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,05. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng chuyển gen Sự có mặt của acetosyringone làm tăng khả năng chuyển gen trên nhiều loại cây trồng trong đó có cà chua. Vì vậy, acetosyringone đã được cho vào trong giai đoạn xử lý ngâm dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với lá mầm của giống cà chua TN386 ở các nồng độ 50, 100 và 150 µM. Kết quả cho thấy khi nồng độ acetosyringone 100 µM sẽ cho tần số chuyển gen cao nhất và khi tăng lên 150 µM sẽ làm giảm tần số chuyển gen (bảng 2). Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA Nồng độ Acetosyringone Số lượng lá mầm xử lí chuyển gen Số lượng lá mầm biểu hiện gen gusA % lá mầm biểu hiện gen gusA 50 25 6 24,07  1,61b* 100 25 9 36,11  2,41a 150 25 4 15,74  5,61b * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01. Hình 2. Biểu hiện của gen gusA trên chồi cà chua Hình 3. Tái sinh chồi cà chua trên môi trường chọn lọc Nghiên cứu chuyển gen Lá mầm của các giống cà chua TN 386, 148 và Hồng Châu sau khi xử lí chuyển gen được đặt vào môi trường tái sinh chồi có bổ sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết quả sau hai tuần một số lá mầm có mô sẹo phát triển và tái sinh chồi sau 4-6 tuần trong khi các lá mầm đối chứng (không xử lí chuyển gen) hoàn toàn không phát triển mô sẹo và chồi sau 4 tuần trong môi trường chọn lọc. Các chồi đã tái sinh trên môi trường chọn lọc được chọn ngẫu nhiên để kiểm tra biểu hiện của gen gusA đồng thời quan sát trên chồi không chuyển gen. Kết quả cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định chuyển gen được kiểm tra gen gusA có những đốm xanh chàm ở những mức độ đậm nhạt khác nhau cho thấy, việc biểu hiện của gen gusA (hình 2) không đồng nhất trong các chồi chuyển gen, trong khi đó, các mẫu không chuyển gen thì không có vệt xanh nào. Đồng thời, tần số chuyển gen dựa trên khả năng tái sinh trong môi trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy rất phụ thuộc vào giống, các giống TN 386 và TN148 khả năng tái sinh chồi tạo dòng kháng kanamycin (hình 3) là 5,22% và 4,11% theo thứ tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh khá thấp 2,45% (bảng 3). Các chồi kháng kanamycin và TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 209 có biểu hiện gen gusA được cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành cây và ra rễ. Bảng 3. Tần số chuyển gen của lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số giống cà chua Giống cà chua Số lượng lá mầm xử lí chuyển gen Số lượng chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc Phần trăm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc (%) TN 386 350 18 5,22  0,69a* TN148 350 14 4,11  0,84ab Hồng Châu 250 6 2,45  0,43b * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01. Phân tích PCR các gen nptII và cryIAb Các dòng chồi tái sinh và phát triển tốt trên môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin được tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR. Kết quả PCR các gen cryIAb và nptII với các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng DNA được khuếch đại tương ứng là 559 bp (hình 4) và 600 bp (hình 5) trong các dòng cà chua giả định chuyển gen. Hình 4. PCR gen cryIAb dương tính với băng DNA 559 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. ĐC dương (plasmid); 3. NC âm (cây không chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5. Cây chuyển gen. Hình 5. PCR gen nptII dương tính với băng DNA 600 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. Đối chứng dương (plasmid); 3. NC âm (cây không chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb Chọn một ít dòng cây cà chua giả định chuyển gen phát triển tốt trên môi trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb thông qua bộ Kit của Công ty Envirologix Quickstix (Mỹ) bằng cách phát hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển gen. Lá của cây giả định chuyển gen và đối chứng được nghiền trong dung dịch tách chiết protein, que thử được nhúng vào trong tube khoảng 5 phút cho kết quả sự có mặt của độc tố Bt (Bacillus thuringiensis) đã được khẳng định bằng sự xuất hiện hai vạch (dương tính) trên que thử cây cà chua chuyển gen trong khi mẫu đối chứng chỉ Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi 210 có một vạch (âm tính) (hình 6). Hình 6. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb bằng que thử của Envirologix Quickstix KẾT LUẬN Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các giống cà chua, chúng tôi nhận thấy, nồng độ thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong quá trình xử lí chuyển gen là OD600nm bằng 1 và nồng độ acetosyringone cho hiệu quả chuyển gen cao là 100 µM. Đã nhận được nhiều dòng cây cà chua mang gen nptII và cryIAb và sự có mặt của gen chuyển trong cây đã được kiểm tra dương tính bằng phân tích PCR. Đồng thời biểu hiện của độc tố Bt đã được kiểm tra bằng que thử của công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abida Yasmeen, 2009. An improved protocol for the regeneration and transformation of tomato (cv Rio Grand), Acta. Physiol. Plant, 31: 1271-1277. 2. Cortina C., Culiánez-Macià F. A., 2004. Tomato transformation and transgenic plant production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 76: 269-275. 3. Chilton M. D., Currier T. C., Farrand S. K., Bendich A. J., Gordon M. P., Nester E. W., 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and P58 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumours. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 3672-3676. 4. Dellaporta S., Wood J., Hicks J. B., 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1(4): 19-21. 5. Fillatti, JoAnne J., Kiser John, Rose Ronald, Comai Luca, 1987. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector. Nature Biotechnology, 5(7): 726-730. 6. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan B. W., 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO, 6: 3901-3907. 7. Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968. Nutrient requirement suspensions cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, 50(1): 151-158. 8. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 15: 473-497. 9. Park S. H., Morris J. L., Park J. E., Hirschi K. D., Smith R. H., 2003. Efficient and genotype-independent Agrobacterium- mediated tomato transformation. J. Plant Physiol., 160: 1253-1257. 10. Sarker R. H., Islam K., Hoque M. I., 2009. In vitro regeneration and Agrobacterium- mediated genetic transformation of tomato. Plant Tissue Cult., 19(1): 101-111. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211 211 A STUDY ON GENETIC TRANSFORMATION OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) WITH AN INSECT RESISTANCE GENE CRY1AB BY Agrobacterium tumefaciens Le Tan Duc1, Pham Duc Tri1, Nguyen Huu Ho1, Ha Tran Minh Dung1, Duong Thi Ngoc Thi2 (1)Institute of Tropical Biology, VAST (2)Research and Development Center for Hi-tech Agriculture SUMMARY Damage caused by insects to crops is a major problem for the agricultural economy in the tropics. The main objective of this study was to transfer the gene cryIAb into tomato by using an Agrobacterium-mediated transformation method. Kanamycin was used as the transformant selectable agent. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, containing plasmidCAMBIA2301cryIAb that consists of kanamycin resistance gene, gusA gene and cry1Ab gene encoding for delta endotoxin of Bacillus thuringiensis, was used. Conditions such as bacterial concentration and concentration of acetosyringone were studied. For genetic transformation, the cotylendons were infected and co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens. After the 2 day co- cultivation, the cotylendons were washed by the cefotaxime solution and transferred to the MS medium containing IAA (0.5 mg/l), BA (2 mg/l) and kanamycin (100 mg/l) for selection. After a few weeks, putative transformed explants, able to grow on the kanamycin-containing medium, were transferred to MS medium for root development. Expression of GusA was detected by the X-glu substrate in the GUS assay. The presence of nptII and cry1Ab in the putative transformed tomatoes was confirmed by polymerase chain reaction analysis. Transgenic tomatoes were able to produce Bt endotoxin in the leaf tissue, revealed by the Envirologix Quickstix strip test. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis, Lycopersicon essculentum, genetic transformation. Ngày nhận bài: 21-6-2012

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf1771_5657_1_pb_8488_2180537.pdf
Tài liệu liên quan