Luận văn Sử dụng kỹ thuật rflp xác định sự đa dạng di truyền của nấm metarrhizium anisopliae và nấm beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CƠN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CƠN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHĨA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cơ đã truyền đạt kiến thức cho chúng tơi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tơi trong suốt quá trình thực tập và giúp tơi hồn thành khĩa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hĩa – Sinh trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phịng thí nghiệm Hĩa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hĩa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lịng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tơi trong suốt thời gian làm khĩa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phịng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tơi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Cơng Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tơi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập. TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. Nấm này cĩ tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của cơn trùng dẫn đến cơn trùng bị chết khơ Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dịng nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc đúng những dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana cĩ tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian trên một số cơn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana.. 3. Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi các dịng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA: Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên mơi trƣờng PGA(Potato-Glucose- Agar),kết quả chúng tơi đã thu đƣợc một số dịng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuơi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dịng nấm Metarrhizium và Beauveria trong mơi trƣờng lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất rồi phơi khơ , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tơi đƣợc nấm ở dạng khơ và chúng tơi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích đƣợc DNA của 12 dịng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đĩ là tinh sạch DNA của các dịng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dịng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dịng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6 dịng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dịng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các dịng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là hồn tồn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dịng nấm Beauveria . MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tĩm tắt ........................................................................................................................... iv Mụclục ............................................................................................................................ vi Danh sách chữ viết tắt .................................................................................................... ix Danh sách các bảng ......................................................................................................... x Danh sách các hình ........................................................................................................ xi 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài ................................................................................... 1 1.2.1.Mục đích ...................................................................................................... 1 1.2.2.Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.3.Yêu cầu nghiên cứu ............................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1.Vai trị của biện pháp phịng trừ sinh học.............................................................. 3 2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh ...................................................................................... 4 2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae .............................................. 5 2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille............................................. 6 2.3.Hiệu quả phịng trừ bằng chế phẩm nấm ............................................................... 8 2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm ...................................................................... 9 2.5.Hoạt tính sinh học ................................................................................................ 11 2.6.Một số nghiên cứu trong và ngồi nƣớc ............................................................. 11 2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................. 11 2.6.2.Nghiên cứu ngồi nƣớc ............................................................................ 12 2.7.Vai trị của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ........................................ 14 2.8.Phản ứng PCR ..................................................................................................... 14 2.8.1.Giới thiệu chung về PCR .......................................................................... 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR ................................................... 15 2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR ...................................................... 16 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR ................................................... 16 2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động .................................................................. 17 2.10.Phân tích RFLP ................................................................................................. 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 19 3.1.Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 19 3.1.1.Thời gian .................................................................................................. 19 3.1.2.Địa điểm .................................................................................................. 19 3.2. Vật liệu và hĩa chất .......................................................................................... 19 3.2.1.Vật liệu ..................................................................................................... 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm............................................................................. 19 3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm ............................................... 19 3.2.2.Hĩa chất và mơi trƣờng ........................................................................... 19 3.2.2.1.Các hĩa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm ................... 19 3.2.2.2. Các hĩa chất dùng trong điện di .................................................. 20 3.2.2.3. Các hĩa chất dùng trong phản ứng PCR ..................................... 20 3.2.2.4.Mơi trƣờng ................................................................................... 20 3.2.3.Các thiết bị chính ...................................................................................... 21 3.3.Nơi dung nghiên cứu ......................................................................................... 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 21 3.4.1.Phục hồi các chủng nấm ........................................................................... 21 3.4.2.Chủân bị mơi trƣờng lỏng ....................................................................... 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA ....................................................................... 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA .................................................................... 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR ......................................................................... 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae ..................................................... 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille ................................................... 25 3.4.6.Điện di và đọc kết quả ............................................................................. 26 3.4.6.1.Điện di trên gel agarose .............................................................. 26 3.4.6.2.Đọc kết quả điện di .................................................................... 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự .......................................................... 27 3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................ 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự ............................................ 27 3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự .............................................................. 28 3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả ..................................................................... 29 3.4.10. Phân tích RFLP ..................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 30 4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm .......................................................... 30 4.2. Kết quả ly trích DNA ....................................................................................... 30 4.3. Kết quả tinh sạch DNA .................................................................................... 32 4.4. Kết quả PCR ..................................................................................................... 33 4.5. Kết quả phân tích RFLP ................................................................................... 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 36 5.1.Kết luận............................................................................................................... 36 5.2.Đề nghị .............................................................................................................. 36 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 37 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium ...................... 9 Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong .......................... 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium ...................................................... 30 Hình 4.2 Kết quả ly trích ................................................................................... 31 Hình 4.3 Kết quả tinh sạch ................................................................................ 32 Hình 4.4:Kết quả PCR ....................................................................................... 34 Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP ..................................................................... 35 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dịng 3.1 BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3 PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu rĩm BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6 PM : pico mol Ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature PCR : Polymerase Chains Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1:Thành phần phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium ................................ 24 Bảng 3.2:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium .............................. 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 25 Bảng 3.4:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 26 Bảng 3.5:Thành phần phản ứng đọc trình tự ....................................................... 28 Bảng 3.6:Quy trình chung phản ứng cắt .............................................................. 29 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và cơng nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thơng qua đĩ đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực tế cho thấy việc áp dụng thành cơng trong khoa học – cơng nghệ vào sản xuất nơng nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã đƣợc ứng dụng từ nhiều năm nay và đã đem lại nhiều kết quả đáng kể nhƣ: tạo giống bƣởi khơng hạt, bƣởi da xanh cĩ chất lƣợng tốt, mùi vị ngon, ngọt và khơng xử lý hĩa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam); hay tạo giống lúa ngắn ngày cĩ khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trƣớc đĩ bằng việc xử lý yếu tố di truyền trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nĩi chung và của Cơng nghệ Sinh học nĩi riêng . Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Cơng Nghệ Sinh Hoc) trong Nơng Nghiệp và đời sống, nên chúng tơi đã thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên cơn trùng gây hại”. Từ việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký sinh trên cơn trùng gây hại cho hoa màu, ta cĩ thể chủ động hơn trong quá trình tác động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do cơn trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an tồn và thân thiện với mơi trƣờng. 1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài 1.2.1. Mục đích Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học cĩ hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong cơng tác bảo vệ thực vật hiện nay. 2 1.2.2. Mục tiêu Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đĩ tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dịng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dịng nấm Beauveria bassiana. 1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu Phục hồi các dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ nhiều cây trồng khác nhau. Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR. Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dịng nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dịng nấm Beauveria bassiana. Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2 trên hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Một số lồi thuộc hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho cơn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vai trị của biện pháp phịng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nơng nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến mơi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử dụng biện pháp sinh học một cách cĩ hệ thống. Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nơng lâm nghiệp theo định hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm cĩ nguồn gốc thảo mộc là một hƣớng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, gĩp phần xây dựng một nền nơng nghiệp bền vững, bảo vệ mơi trƣờng và cân bằng sinh thái. Cĩ nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm: Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thƣờng là ký sinh. Sử dụng ký sinh thiên địch khơng chuyên tính, thƣờng là các lồi ăn thịt sâu hại. Biện pháp dịng hố đực làm cho sâu hại khơng thể sinh sản đƣợc. Sử dụng vi sinh vật cĩ ích. Biện pháp dẫn dụ giới tính để phịng trừ sâu hại. Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhƣợc điểm của các biện pháp hố học thƣờng dùng trƣớc đây. Ƣu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm: Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại. Giảm bớt hoặc giảm hồn tồn sử dụng thuốc hố học, giữ đƣợc quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch. Bảo vệ đƣợc cơn trùng cĩ ích và các vi sinh vật cĩ ích khác, hạn chế sâu bệnh thứ cấp trở thành sâu bệnh chính. Bảo vệ đƣợc sức khỏe con ngƣời và tránh ơ nhiễm mơi trƣờng. (Trần Văn Mão, 2004). 2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên cơn trùng Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với cơn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh hoặc hoại sinh, nhƣng cĩ nhiều lồi nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và dẫn đến sự chết của cơn trùng. Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng, 4 1981) nấm ký sinh cơn trùng trong tự nhiên cĩ thể gây chết thƣờng xuyên với tỷ lệ cao cho nhiều lồi cơn trùng gây hại và là những tác nhân điều hồ quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả. Cơn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ tồn bộ bề mặt ngồi của cơ thể cơn trùng. Cơ thể cơn trùng chết do nấm khơng bị tan rã, mà thƣờng giữ nguyên hình dạng ban đầu, tồn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981).Nấm gây bệnh cho cơn trùng thuộc nhiều nhĩm nấm khác nhau: từ nhĩm nấm nguyên thủy sống dƣới nƣớc đến nhĩm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho cơn trùng cĩ mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất tồn Deurteromycetes. - Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các lồi ký sinh trên cơn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt cĩ những họ nấm gồm tất cả các lồi đều là ký sinh trên cơn trùng nhƣ Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. - Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi cĩ bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh cơn trùng cĩ chuyên tính cao, cịn các lồi nấm túi khác đều là nội ký sinh của cơn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho cơn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales). - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống cĩ các lồi gây bệnh trên cơn trùng, đĩ là giống Septobasidium và Uredinella. - Lớp cơn trùng đều thuộc bộ Moniliades. Những giống Beauveria, Spicana, Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các lồi nấm khi xâm nhiễm vào cơn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định. 2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. Metschinikov đã phát hiện nấm này đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì,Chúng gây bệnh cho cơn trùng sống trong đất. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể cơn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngồi cơ thể cơn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đĩ tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể cơn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào lồi và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì cơn trùng chết 5 - Nấm Metarrhizium anisopliae cĩ 2 dạng: M. anisopliae var. major cĩ bào tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae cĩ bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9.0(thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh (nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000). - Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 lồi cơn trùng thuộc các bộ: Orthoptera (11 lồi), Dermaptera (1 lồi), Hemiptera (21 lồi), Lepidoptera (27 lồi), Diptera (4 lồi), Hymenoptera (6 lồi) và Coloptera (134 lồi). Nấm xanh cĩ thể nuơi cấy trên mơi trƣờng thức ăn nhân tạo. - Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho cơn trùng thuộc bộ Coleoptera. Hơn 204 lồi cơn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Ngồi ra Metarrhizium anisopliae cịn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, cơn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, lồi mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân bố rộng trong tự nhiên. - M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đơi khi màu tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên mơi trƣờng PGA sau 10 ngày nuơi cấy ở 20oC cĩ đƣờng kính 2 cm. Đã cĩ nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xơ (cũ). Ở những nơi khơng cĩ cơn trùng cũng phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngồi đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi cĩ thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ơ nhiễm), trầm tích cửa sơng, đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số lồi chim và rễ của dâu tây cũng đều phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae. * Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa của nấm Metarrhizium anisopliae: Khơng thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất khơng cĩ chitin. 6 Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng cĩ thể sống sĩt tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đĩ cĩ chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử khơng thể xảy ra. Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. Metarrhizium anisopliae cĩ khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lơng và da cơn trùng). (Trần Văn Mão, 2004). 2.2.2 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille - Nấm Beauveria bassiana cũng nhƣ Metarrhizium anisopliae là nấm thiên địch ký sinh trên cơn trùng gây hại, bào tử nấm thƣờng cĩ kích thƣớc thƣờng dài hơn 3µmdạng bào tử túi.Nấm Beauveria bassiana thuộc lớp: Deuteromycetes, họ Moniliacea, bộ Moniliales, Giống: Beauveria. Giống Beauveria thƣờng đƣợc chia thành 3 lồi: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đĩ 2 lồi đầu là tác nhân gây bệnh cơn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997)là nấm trắng thƣờng gây bệnh cho:rầy nâu, sâu cuốn lá, sâu dục thân,bọ xích hại lúa, bọ xích đen,….Nĩ hủy hoại các mơ mềm và dịch cơ thể ký chủ, chúng phát triển bên ngồi rồi mọc đầy trên cơ thể ký chủ, hút hết dƣỡng chất cho đến khi ký chủ chết, khi ký chủ chết nĩ hình thành bào tử và phát tán bào tử trong khơng khí nhờ nƣớc và giĩ.Tuy nhiên để phát tán nĩ địi hỏi cần phải cĩ ẩm độ kéo dài để bào tử cĩ thể lan đi nhờ giĩ và nƣớc. - Bào tử trần hình cầu (đƣờng kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m). Sợi nấm cĩ chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên mơi trƣờng, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng, Nấm khi mọc trên cơn trùng thƣờng cĩ màu trắng hoặc vàng nhạt, đơi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và cĩ nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bĩ sợi( Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Nhiệt độ tối ƣu cho nấm phát triển là khỏang trên dƣới 250C tốt nhất từ 250C- 30 0 C trong trƣờng PDA (Potato-Dextrose-Agar), trong khỏang 3-6 ngày nuơi cấy 7 nấm phát trịển mạnh lúc này nấm cĩ màu vàng nhạt hoặc màu trắng, đƣờng viền đơi khi cĩ màu kem hoặc hơi đỏ. Bào tử thƣờng cĩ hình cầu, hình trứng, cĩ khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Cĩ khỏang 9 lịai Beauveria bassiana đƣợc phân lập, sử dụng trong nghiên cứu trong kỹ thuật rRNA Sequencing. Theo Veliska (1967), giá trị pH mơi trƣờng từ 3 - 9 khơng ảnh hƣởng tới sự phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral(1970) nấm Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật cĩ khả năng điều chỉnh pH mơi trƣờng, pH thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngồi ra, cĩ nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,4 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống nhƣ hầu hết các loại nấm diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đĩ, chúng đều cĩ khả năng trở thành thành viên trong sinh quần nơi đĩ và tự sinh sơi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh chuyên hĩa rộng nên nấm này cĩ khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành cơng của nấm với cơn trùng là khá lớn vì chúng cĩ nhiều cách xâm nhiễm khác nhau: qua lớp cutin, qua đƣờng tiêu hĩa, qua đƣờng hơ hấp và qua lỗ của thân. Ngồi ra, nấm Beauveria bassiana cịn cĩ khả năng tồn tại trong điều kiện mơi trƣờng khơng thuận lợi dƣới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dƣỡng kết lại thành một thể rắn chắc).Cĩ thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nơng nghiệp vì: chúng cĩ thể phát triển trên mơi trƣờng dinh dƣỡng, cĩ thể đƣợc chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lƣợng khơng nhiều các cơn trùng cĩ ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Chất diệt cơn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm. Tên thơng thƣờng của độc tố là beauverixin, cơng thức hĩa học C45H57O9N3 - ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)3 . Đĩ là một loại depxipeptit vịng cĩ điểm sơi 93 - 94oC (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Vì tính chất quan trọng của nấm trong vai trị điều khiển cân bằng sinh học trong tự nhiên nĩi chung và trong bảo vệ thực vật nĩi riêng nên hiện nay nhiều nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong 8 nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng Isozymes (St Legent et al ., 1992;Poprawski et al .,1998), rRNA Sequences (Rakotonirainy et al .,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al .,1997). Trong đĩ vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả . 2.3. Hiệu quả phịng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nơng nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phịng thí nghịêm và ở nhà lƣới. Chế phẩm cĩ tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các lồi rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các lồi rầy hại lúa trong vụ. Dùng nấm B. bassiana vuille để quản lý các lồi rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana khơng gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng khơng gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae cĩ khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng khơng đều (Trần Văn Mão, 2004). Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nơng Nghiệp Hội Đồng Khoa Học Cơng nghệ Việt Nam cho kết quả nhƣ sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên sâu rĩm hại thơng cĩ khả năng trừ sâu là đến 93.6%. Cịn tác dụng khi sử dụng kết hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index .asp……) Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc cơng ty PROBIOMA đã sản xuất thành cơng nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều lồi nấm thiên dịch khác, trong đĩ cĩ hai lồi nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên thị trƣờng là: ProbioBass, ProbioMet 9 iPROBIOMET CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM METARRHIZIUM ANISOPLIAE DIỆT CƠN TRÙNG GÂY HẠI PROBIOBASS CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM BEAUVERIA BASSIANA VUILLE DIỆT CƠN TRÙNG GÂY HẠI Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium (Nguồn : www.probioma.org.bo) 2.4. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên cơn trùng - Hầu hết những lồi nấm gây bệnh cho cơn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp vỏ cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể cơn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chiti mầm, qua lỗ thủng dĩ bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể cơn trùng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể cơn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm cĩ thể ký sinh đƣợc cơn trùng chích hút và cả những pha phát triểncủa cơn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác khơng ký sinh đƣợc. - Nấm cũng cĩ thể xâm nhập vào bên trong cơ thể cơn trùng qua đƣờng miệng.Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các lồi nấm sống ở nƣớc. Dƣới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra cĩ thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Bào tử nấm cịn cĩ thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể cơn trùng nhƣng rất ít. Sự phát triển của nấm tới khi cơn trùng chết Sau khi xâm nhập vào cơ thể cơn trùng thì chúng bắt đầu sinh sơi nảy nở bên 10 trong cơ thể cơn trùng và cơn trùng chết trong khoảng 3 tuần. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi cơn trùng vật chủ chết - Sau khi cơn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ tồn bộ bề mặt ngồi của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu cĩ màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục. - Các nấm gây bệnh cho cơn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hồn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấmgây bệnh cơn trùng cĩ tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh cĩ tính chuyên hĩa thức ăn rộng, cĩ thể ký sinh nhiều lồi cơn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau. - Để cĩ thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đĩng một vai trị quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện khơng thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đĩ là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nĩ. Điều đĩ tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể cơn trùng. Sự phát tán cĩ hiệu quả cao hay khơng ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào. 2.5. Hoạt tính sinh học - Các nấm diệt sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme, toxin và các chất hoạt tính sinh học khác. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine(ví dụ: nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana ,nấm Muscardine xanh: Metarrhizium anosopliae )cĩ khả năng tổng hợp một lƣợng lớn enzyme, trong đĩ cĩ ý nghĩa lớn nhất cĩ khả năng gây bệnh cho cơn trùng cĩ chứa. chitinase,Proteinase,lipase và amylase. 2.6. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngồi nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana vuille cũng nhƣ một số nấm ký sinh cơn trùng khác trong ứng dụng để phịng trừ sâu hại 2.6.1. Nghiên cứu trong nƣớc - Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarrhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarrhizium sau khi đã thử nghiệm trong phịng, trong nhà lƣới và ngồi đồng cĩ hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Hiện tại ở Việt Nam đã thu thập và lƣu giữ một số chủng nấm Beauveria và Metarrhizium, 11 gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium. Chúng đƣợc phân lập từ các loại cơn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc, rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngơ, sâu xanh hại bơng, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000). - Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc mơi trƣờng nhân giống cho các chủng Metarrhizium anisopliae là mơi trƣờng Saubouraund cĩ bổ sung vỏ trấu.Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria bassiana dạng bột để phịng trừ sâu rĩm hại cây thơng và cho biết sâu chết 80% sau một năm xử lý. - Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm, sản xuất và ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phịng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Ngồi ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các lồi sâu hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Cơn (2001), các vi nấm cĩ khả năng gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các lồi sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các lồi sâu hại thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng - Hemiptera - Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nƣớc ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phƣơng pháp này là 10 ngày, chế phẩm đƣợc làm khơ ở nhiệt độ 45oC trong 8 giờ và cĩ thể đƣợc bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phƣơng pháp lên men chìm cĩ sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa mơi trƣờng cĩ pepton, cao nấm men và muối khống thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 109 bào tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 108 bào tử/ml. Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm. - Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nịi nấm cĩ hiệu lực diệt sâu cao cĩ thể mất dần tính độc trong quá trình nuơi cấy. Sử dụng phƣơng pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn đƣợc các chủng nấm diệt sâu cĩ độc tính cao. Từ các mẫu sâu chết ngồi đồng ruộng đã phân lập đƣợc 9 chủng nấm Beauveria bassiana từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hĩc Mơn và Indonesia. Thử nghiệm trong phịng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều cĩ hiệu lực diệt trùng ấu 12 trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trƣởng thành và sâu xanh da láng nhƣng ở các mức độ khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng khoai lang ở Thủ Đức Thị Hƣơng Giang, 1997). - Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế bassiana và Entomopthorales) của Cơng ty Hợp danh Sinh Thành trong phịng trừ bọ cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent cĩ hiệu lực phịng trừ cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa . 2.6.2. Nghiên cứu ngồi nƣớc - Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại cĩ lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Theo Juntin L.Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawski và Ray M. Miller (1999), các nghiên cứu về nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng từ năm1995-1998, và cho biết trong 8 lịai nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết chết rầy mềm, gồm cĩ 6 lịai thuộc Entomophthorale Pandora neoaphidis, Connidiobolus thromdoides, C.corcnatus, Entomophthora planhoniana và Neozygites fresenii) và hai lịai thuộc Hyphomycetes (Beauveria bassiana, verticillium lecanii) . Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm gây bệnh cơn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm , 3mm, 4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại mơi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong mơi trƣờng PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên mơi trƣờng YPDA và độ sâu của mơi trƣờng thì khơng đáng kể. Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể 13 . Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana ký sinh trên ong (nguồn: wescaco.ars.usda.gov) Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập từ New Zealand bằng hai phƣơng pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập đƣợc thành 4 nhĩm cĩ kiểu di truyền khác nhau: nhĩm nhân khơng đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhĩm B. bassiana, nhĩm B. brongniartii và một nhĩm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy cĩ sự khác biệt về di truyền giữa giống B. bassiana và nhĩm nhân khơng đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii. 2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng ITS1 -5.8S – ITS2: Cĩ nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) cĩ những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi lồi hoặc địi hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu cĩ thể phân tích đƣợc trong thời gian thích hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mơ tả đặc điểm những giống Metarrhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng khơng ổn định, chỉ cĩ thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuơi cấy ở ký chủ. Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên cơn trùng. Đĩ là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hĩa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2 đƣợc tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các sản phẩm PCR hai vùng này 14 2.8. Phản ứng PCR 2.8.1. Giới thiệu sơ lƣợc về PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuơn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuơn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đốn bệnh, biện pháp cắt mầm bệnh trên ngƣời, vật nuơi và thực phẩm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đơi tách ra thành dạng mạch đơn, thƣờng là 94oC – 95oC trong vịng 30 giây – 4 phút. Bƣớc 2 (bƣớc lai, anealation): trong bƣớc này, ở nhiệt độ hơn Tm (nhiệt độ nĩng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thƣớc sản phẩm khuếch đại. Bƣớc 3 (bƣớc kéo dài, elongation): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleoid lần lƣợt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuơn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mồi đƣợc nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72oC. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bƣớc trên sẽ đƣợc lập lại nhiều lần, làm gia tăng số lƣợng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính tốn sau 30 đến 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bởi Ethidium Bromide và cĩ thể quan sát thấy thơng qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sĩng 312nm). 2.8.2. Yêu cầu cần thiết trong phản ứng PCR - DNA khuơn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch. - Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Tag polymerase tách chiết từ vi - khuẩn suối nƣớc nĩng Thermus aquaticus, cĩ khả năng chịu nhiệt cao. - Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:Trình tự của 15 - primer đƣợc chọn sao cho khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuơi” và primer “ngƣợc”. - “Nhiệt độ nĩng chảy” (Tm) của primer xuơi và primer ngƣợc khơng đƣợc cách biệt quá xa - Các pimer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại. - Trình tự nằm giữa hai primer xuơi và ngƣợc khơng quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.8.3. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng trong việc lập bản đồ gen, dịng hố gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen, các khảo sát trong pháp y, trong điều tra hoạt tính di truyền, trong khảo cổ học thì giúp khuếch đại những đọan DNA ủa những sinh vật đã tuyệt chủng nhƣ: khủng long, voi mamut…và những hĩa thạch khác.Và gần đây là đĩng gĩp vào việc giải mã bộ gen ngƣời, đƣợc xem là thành tựu mang tính lịch sử. Do vậy, ƣu điểm của cơng cụ PCR là khả năng khuếch đại chính xác một trình tự DNA mong muốn với một lƣợng lớn. Hiện nay, phƣơng pháp PCR cịn đƣợc sử dụng trong phát hiện các virus, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và động vật cũng nhƣ việc kiểm nghiệm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, trong nƣớc. Ở các nƣớc phát triển, PCR đã đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ cơng cụ chuẩn đốn trong y học để phát hiện những bệnh di truyền, đƣợc sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những ngƣời bị tình nghi ở cấp độ phân tử, đƣợc sử dụng trong xác địnhquan hệ quyết thống và là một cơng cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen ngƣời. 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR - Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR khơng hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dƣới 1,5 kb cho kết quả tốt. - Ỵếu tố ngoại nhiễm lớn nhất thƣờng là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trƣớc. - Các cơng đoạn thao tác khác nhau nhƣ thiết lặp phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải đƣợc tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau. 16 - Micropipette khơng sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải cĩ lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử cịn lại từ các lần khuếch đại trƣớc. - Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotid (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998)). 2.9.Kỹ thuật RFLP(Restriction Fragment length polymorphism) * Kỹ thuật RFLP(sự đa hình về chiều dài các đọan DNA cắt bởi các enzyme giới hạn). Đây là phƣơng pháp tạo nên các đọan cắt khác nhau trên band agarose và đƣợc ghi nhận trên gel bởi máy điện di, từng lịai cĩ kích thƣớc riêng và đặc trƣng cho từng lồi.Khi xử lý cùng một enzyme cắt cho các mẫu DNA khác nhau, những lịai khác nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau trên gel tạo nên sự đa hình trong lồi đĩ . Cịn những lồi khác nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau. * Quy trình phƣơng pháp RFLP thơng thƣờng: 1. Ly trích và tinh sạch DNA. 2. Thực hiện phản ứng cắt các mẫu DNA khác nhau trên cùng enzyme cắt. 3. Điện di và tiến hành phản ứng lai Southern blot. Trong thực tế, DNA của genome là rất lớn, nên khi cắt bởi enzyme và điện di Southern blot. Đây là mơt kỹ thuật rất tốn kém và phức tạp. Do đĩ khi sự khác nhau trong trình tự của các lồi lân cận chỉ xảy ra ở một vùng nào đĩ trong genome thì áp dụng kỹ thuật RFLP dựa trên PCR cĩ thể đƣợc sử dụng phân biệt các sản phẩm PCR. Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số,tinh sạchDNA. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt. Ƣu điểm của phƣơng pháp RFLP-PCR so với phƣơng pháp RFLP thơng thƣờng: - Đơn giản, dễ thực hiện . - Cần lƣợng nguyên liệu DNA ít. - Cĩ thể đọc đƣợc kết quả trực tiếp bằng mắt thơng qua điện di trên gel. 17 - Khơng cần phải sử dụng các đầu dị phức tạp và tốn kém. - Khi đọc kết quả dùng ánh sáng huỳnh quang thay cho chất phĩng xạ. 2.10.Giải trình tự bằng máy đọc tự động Ở đây, chúng tơi tiến hành giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR bằng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 của cơng ty AB (Applied Bioscience). Máy hoạt động dựa trên nguyên tắc của Sanger nhƣng cĩ một số cải biên. Trong kỹ thuật này ngƣời ta khơng đánh dấu bằng các đồng vị phĩng xạ mà bằng hố chất – các fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome cĩ màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ cĩ cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrlamide, kết quả sẽ đƣợc đọc qua một hệ thống vi tính. 18 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian đề tài được tiến hành là từ 20/2/2006 đến 15/8/2006 - Địa điểm :phòng thực tập bệnh cây Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nơng Học và trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh . 3.2. Vật liệu và hố chất 3.2.1. Vật liệu 3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm Đối tƣợng khảo sát là gen gây độc protease (Pr1) hiện diện ở nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 hiện diện trên nấm Beauveria bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại cây trồng. Các mẫu phân lập nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc thu thập trên một số cơn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nƣớc. 3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự Các primer đƣợc dùng để khuếch đại gen, giải trình tự đều đƣợc thiết kế bằng phần mềm Amplify v1.4. Các primer đƣợc tổng hợp bởi cơng ty IDT (Mỹ) do cơng ty Bio-Rad cung cấp. 3.2.2. Hố chất và mơi trƣờng Các hố chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Cơng ty Sigma, Merk, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.2.2.1. Các hố chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm Phenol bảo hồ trong TE pH 8,0. Chloroform. Isoamyl. Isopropanol. Ethanol 100%. Ethanol 70%. RNAse 1mg/ml. 19 Nitơ lỏng. Dung dịch chiết xuất (lyssis buffer): 50mM Tris HCl, 50mM EDTA, 3%SDS, 1% - mercaptoethanol. Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1). 3M sodium acetate (pH5,2). Dung dịch TE 1X vơ trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0. 3.2.2.2. Các hố chất dùng trong điện di Gel agarose, thƣờng sử dụng gel cĩ nồng độ 1% agarose. Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần nhƣ sau: Tris HCl 4,48 g Na2EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml Glacial acetic acid 1,14 ml Nƣớc cất vừa đủ 1 lít Dung dịch nhuộm gel là Ethidium bromide 1%. Ladder 1.5kb, 1kb. 3.2.2.3. Hố chất cho phản ứng PCR (do cơng ty Bio - Rad cung cấp) Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl. Dung dịch đệm 10X: đi kèm với Taq. dNTP 10 mM. MgCl2 50 mM. Primer 1 (METPR1). Primer 2 (METPR4). Primer 3 (METPR2). Primer 4 (METPR5). 3.2.2.4. Mơi trƣờng Mơi trƣờng PGA. Mơi trƣờng Agar. Mơi trƣờng lỏng CZA. 20 3.2.3. Các thiết bị chính Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho một phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Máy đo pH. Máy lắc. Máy ly tâm lạnh. Máy khuấy từ. Bộ điện di ngang HorizonR 558 (Life Technologies). Máy PCR (PTC – 100 Programable Thermal Controller, MJ Raearch). Máy vortex . Máy chụp hình gel Bio –Rad. Máy đọc trình tự ABI PRISM 3100. 3.3. Nội dung nghiên cứu 1. Phục hồi 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana trên một số sâu hại cây trồng. 2. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc của 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1) và Beauveria bassiana, vùng ITS1 -5.8S – ITS2 3. Xác định tính đa dạng di truyền của gen Pr1 và gen ITS1 - 5.8S - ITS2 trên nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille bằng phƣơng pháp RFLP và phƣơng pháp giải trình tự (Sequencing). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu: 3.4.1 Phục hồi các nguồn nấm trên mơi trƣờng PGA: Nấm đƣợc thu thập từ nhiều địa phƣơng khác nhau nhƣ : Bến tre.Tiền Giang, long An, Đồng Tháp, Quận 9, Quận 2 TP Hồ Chí Minh,…trên một số cơn trùng gây hại nhƣ: Rầy Nâu, Bọ Dừa, Bọ Xích Đen,…đƣợc bảo quản trong ống nghiệm dể phục hồi sức sống cho nấm chúng tơi tiến hành cấy chuyền nấm sang mơi trƣờng PGA(potato –glucose – agar). - Thành phần mơi trƣờng phục hồi: (PGA)cho 1lít + Glucose: 20g. + Khoai tây: 200g. 21 + Agar: 18-20g. + Nƣớc cất1lần: 1lít. - Cách nấu: nấu khoai tây với 1lít nƣớc khỏang 1h cho mềm, vớt bỏ xác lấy nƣớc đong lại cho đủ 1lít (nếu thiếu cho thêm nƣớc cất)sau đĩ cho agar và glucose vào nấu cho tan, đem hấp mơi trƣờng bằng Autoclay 1210C 15phút, để nguội bớt đỗ lên dĩa dã tịêt trùng (sấy ở 2000C trong 1h), khỏang 15ml để chuẩn bị cấy chuyền. - Cách cấy:dùng que cấy đã khử trùng bằng đèn cồn cấy lên 4 điểm, cấm sâu vào bề mặt thạch, sau 5-7 ngày nấm phát triển mạnh lúc này cĩ thể sử dụng nấm để nhân sinh khối. 3.4.2 Chuẩn bị mơi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm Các mẫu phục hồi đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng lỏng CZA (Czapek- Dox) (Tuite, 1969): - Glucose 10g. - Dịch chiết nấm men (Yeast extract) 1.5g. - KH2PO4 0.025g. - K2HPO4 0,25g. - MgSO4.7H2O 0.25g. - Một lƣợng nhỏ vài mg NACL. . - Nƣớc cất : 500ml. Tất cả cho vào cốc 500 ml nƣớc cất vơ trùng và đặt vào máy khuấy từ nấu khoảng 20 phút. Sau đĩ đổ vào 10 bình tam giác, mỗi bình 50 ml đem hấp khử trùng 20 phút. Sợi nấm đƣợc băm nhỏ trực tiếp từ bề mặt của mơi trƣờng PGA cho vào bình chứa mơi trƣờng lỏng, để vào máy lắc điều chỉnh ở mức 170 vịng khoảng từ 3-5ngày, sau đĩ ta thu đƣợc khối sợi nấm là những hạt trịn nhỏ li ti. Lọc lấy khối sợi nấm này qua giấy lọc (đã đƣợc khử trùng) và làm khơ. Đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80 o C. 3.4.3 Phƣơng pháp ly trích DNA Quy trình tách chiết đƣợc cải tiến theo hƣớng đơn giản nhƣng vẫn đạt đƣợc hiệu quả tốt trong sử dụng làm khuơn mẫu cho phản ứng PCR (Leal, 1994) nhƣ sau: - Đặt 1g sợi nấm đƣợc làm khơ kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch nitơ lỏng. Sau khi nghiền xong chuyển dung dịch này sang một eppendorf thể tích 1,5 ml. Lƣu ý trong cơng đoạn này cố gắng giữ cho bột nấm đƣợc nghiền khơng tan . 22 - Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65oC.ở giai đọan này để đạt hiệu quả tốt cĩ thể ủ thời gian kéo dài hơn làm quá trình phá vỡ màng DNA tốt hơn. - Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nƣớc ấm. Thêm vào khoảng 300 l Phenol:Chloroform: Isoamyl: alcohol (25:24:1)lắc nhẹ nhiều lần, dung dịch lúc này cĩ màu trắng đục nhƣ sữa. - Ly tâm 20 phút 13500 vịng ở nhiệt độ phịng 280C. - Thu dung dịch (phần trên ống nghiệm ) sang một ống nghiệm khác, chất kết tủa DNA bởi sự thêm vào với thể tích tƣơng ứng 0.03 mol của 3M Sodium acetate và 0.5 mol của Isopropanol (tƣơng ứng khỏang 15ml Sodium acetate : 250ml Isopropanol), trộn nhẹ nhàng nhiều lần. Lúc này DNA kết tủa thành những sợi cĩ màu trắng đục. - Ly tâm 13500 vịng trong 1 phút ở nhiệt độ phịng 280C. - DNA kết tủa nằm dƣới đáy eppendorf, nhẹ nhàng dổ bỏ dịch nổi phía trên, dùng ethanol 70% rửa DNA khoảng 3 lần, mỗi lần khoảng 300 l. - Làm khơ DNA ờ nhiệt độ phịng khỏang 2h, hồ tan DNA trong khỏang 80µl dung dịch TE 1X, đánh tan DNA và tồn trữ mẫu ở . +4 oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng. - Điện di kiểm tra kết quả bằng bộ điện di ngang trên gel agarose, nồng độ gel 0.8%. *LƢU Ý: cần phơi DNA khơ trƣớc khi cho TE 1X vào để bảo quản mẫu, vì Ethanol dễ phá hủy DNA nếu trữ mẫu lâu 3.4.4 Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau: Cho hỗn hợp DNA pha lỗng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp lắc nhẹ nhàng. Ủ ở 370C khoảng 30 phút. Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ nhàng nhiều lần . Ly tâm lấy phần dịch nổi phía trên sang ống khác. 23 Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khơ DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phịng và cho vào TE.1X làm hịa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA đƣợc khuếch đại theo phƣơng pháp PCR với cặp primer cĩ trình tự cụ thể nhƣ sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl - MgCl2 1.5mM 0.75µl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl - METPR1 50ng 1.5µl - METPR4 50ng 1.5µl - Tag DNA polymerase 0.04UI 0.5µl - DNA khuơn 125ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vơ trùng vừa đủ 25 l 24 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt khuếch đại gen Pr1 trên nấm Metarrhizium Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 5 phút - Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 570C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút - Kéo dài 720C 6 phút - Ủ 40C 6 phút 3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille Đọan DNA đƣợc khuếch đại cĩ trình tự primer cụ thể nhƣ sau : Primer Trình tự (5’-3’) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Bảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria Thành phần Nồng độ cuối Thực hút (µl) - PCR buffer 1X 2.5µl - MgCl2 1.5mM 0.75µl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5µl - ITS 4 50ng 1µl - ITS 5 50ng 1µl - Tag DNA polymerase 1UI 0.25µl - DNA khuơn 100ng 1µl - Nƣớc cất 2 lần vơ trùng vừa đủ 25 l 25 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 trên nấm Beauveria Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 3 phút - Số chu kỳ lặp lại (30 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 560C 30giây - Kéo dài 720C 4 phút - Kéo dài 720C 7 phút - Ủ 40C 10 phút 3.4.6 Điện di và đọc kết quả trên gel Agarose 3.4.6.1 Điện di trên gel Agarose - Cho 0.125 gram agarose vào 12.5ml dung dịch 0.5X TAE. - Đun sơi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lị viba. - Để nguội ở nhiệt độ phịng. - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí trên gel. - Để nguội ở nhiệt độ phịng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel, cho dung dịch 0.5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel. - Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin. Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm cĩ giếng than chuẩn, giếng đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định kiểu gen, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA.. 3.4.6.2 Đọc kết quả điện di - Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. 26 - Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). - Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ xuất hiện những băng sáng trên gel. - Xác định kết quả dự kiến: đối với cặp primer METPR1/METPR4 thì trên màn hình xuất hiện băng cĩ kích thƣớc 1,5kb. 3.4.7 Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 trên nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8s – ITS2 trên nấm Beaveria Bassiana vuille Sau khi chạy PCR chúng tơi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đĩ so sánh với ngân hàng gen thế giới. Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao. 3.4.7.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch).Cho vào GFX 500µl capture buffer. 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX. 3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần. 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vịng trong 30 giây ở 40C. 5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đĩ đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc. 6.Thêm 500µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vịng khoảng 30 giây ở 40C. 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 8.Thêm 50µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX. 9.Giữ ở nhiệt độ phịng khoảng 1 phút. 10.Ly tâm 10000 vịng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C 27 3.4.7.2 Thành phần của phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X Bảng 3.5 Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) - BDT mix 2,5 X 4µl - Buffer 5 X 2µl - Primer 3.2 pmol 1µl - DNA khuơn 10-40 ng 1µl - Nƣớc cho đến 10 µl * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự * Nấm Metarrhizium anisopliae 1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đến thể tích chính xác. 2. Biến tính hồn tồn: 960C trong 1 phút. 3. Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây. 50 0C trong 5 giây. 60 0 C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. * Nấm Beaveria Bassiana vuille 1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thơng số. 2. Biến tính hồn tồn: 950C trong 5 phút. 3 .lặp lại 25 chu kỳ: 950C trong 30 giây. 50 0C trong 10 giây. 60 0C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. 3.4.8 Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp EDTA . - Cho 5µl EDTA vào mỗi eppendorf. - Thêm vào 60µl ethanol 100% mỗi eppendorf. 28 - Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần. - Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phịng khoảng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12000 vịng trong 30 phút. - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 vịng trong 15 phút ở 40C. - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khơ ở nhiệt độ phịng. - Làm tan DNA bằng cách cho vào 2µl hidiformamide, biến tính 950C trong 3 phút. 3.4.9 chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100 sản phẩm sau tinh sạch, tiến hành điện di và đọc kết quả trên máy Sequencer. 3.4.10 Phân tích RFLP *Quy trình chung phản ứng cắt - Ủ khoảng 1 g DNA đã đƣợc khuếch đại với 1U enzyme cắt dƣới những điều kiện nhà sản xuất (Roche) hƣớng dẫn. Thành phần của phản ứng xem bảng 3.6. - Những đoạn DNA đã cắt đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đĩ gel đƣợc nhuộm ethidium brommide. Đọc kết quả và chụp hình dƣới tia UV. Bảng 3.6 Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Thể tích SuRE/cut Buffer DNA Restriction enzyme Nƣớc cất vơ trùng 10X 100 – 150 ng 10 UI 2,5 l 6 – 10 l 0,1 l Vừa đủ thể tích 25 l 29 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.kết quả phục hồi và nhân sinh khối các dịng nấm đã thu thập đƣợc từ các tỉnh thành trong nƣớc *Kết quả phục hồi các nguồn nấm trên mơi trƣờng PGA chúng tơi đã phục hồi đƣợc một số dịng nấm dùng trong thí nghiệm sau thời gian khỏang 7-10 ngày nuơi cấy, nấm phát triển tốt, quan sát bào tử nấm trên kính hiển vi, xác định chính xác đây là hai nguồn nấm thu thập ban đầu Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana , khơng bị tạp nhiễm vi khuẩn hay các lọai nấm khác. Bao gồm các dịng sau: BDQ96, BDTN4, SCLLLA1, RNBT1.7, BXĐTG6, DỊNG3-1, RMTĐ3, BHBD6, NNPT7, SR, BRVT6, PULQ2 . * Kết quả nhân sinh khối sợi nấm trên mơi trƣờng CZA. Thu đƣợc sinh khối của 12 dịng nấm gồm: 6 dịng nấm Metarrhizium anisopliae và 6 dịng nấm Beauveria bassiana. Hình 4.1 Nấm Metarrhizium anisopliae(A) Nấm Beauveria bassiana (B) A B B A 30 4.2 Kết quả ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana Sau thu sinh khối chúng tơi tiến hành ly trích các dịng nấm, đây là một quá trình đơn giản nhƣng cĩ ý nghĩa quyết định đến chất lƣợng sản phẩm DNA thu đƣợc trong những bƣớc tiếp theo, phải thao tác nhẹ nhàng và chính xác theo qui trình chung nhằm tránh sự đứt gãy DNA, nhiễm tạp….Qua điện di cho thấy mẫu ly trích cĩ lƣợng DNA thu đƣợc chƣa nhiều, cịn lẫn tạp và gãy DNA do quá trình thao tác chƣa tốt . Sản phẩm DNA ly trích đƣợc điện di trên gel thƣờng cĩ nồng độ gel1 %, hiệu điện thế 50 v, 250 mA, trong khỏang thời gian 50 phút Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm Metarrhizium và Beauveria Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Qua hình 4.6 ta thấy rằng: lƣợng DNA thu đƣợc trong quá trình ly trích chƣa đồng đều, ở các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 3.NNPT7, 4.SR, 5.PULQ2, 6.BRVT67.SCLLLA1, 8.DONG 3-1, 9.BDQ96 thu đƣợc lƣợng DNA nhiều , thể hiện qua ảnh kích thƣớt band đậm và rõ so với 3 mẫu cịn lại là 10.BDTN4,11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7. Phần cuối giếng cịn nhiều tạp nên phát sáng nhiều, điều đĩ gây khĩ khăn nhiều cho quá trình tinh sạch ở bƣớc tiếp theo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm 31 4.3. Kết quả tinh sạch DNA tổng số của hai dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana. Tiến hành tinh sạch sản phẩm DNA vừa ly trích bằng RNAse, nhằm lọai bỏ tạp nhiễm và giúp sản phẩm sau khuếch đại đƣợc tốt hơn. Quan sát hình 4.3 ta thấy sau khi tinh sạch tuy lƣợng DNA cĩ giảm so với lúc chƣa tinh sạch nhƣng nhìn chung các mẫu tƣơng đối sạch, ít tạp và hầu nhƣ khơng cịn sản phẩm đứt gãy. Điều này giúp cho quá trình khuếch đại sản phẩm DNA bằng kỹ thuật PCR diễn ra thuận lợi hơn Kiểm tra sản phẩm tinh sạch thƣờng sử dụng gel cĩ nồng độ 1 %, hiệu địên thế ở 50 v, 250 mA, thời gian điện di 50 phút . Hình 4.3 Hình ảnh DNA tổng số của nấm Beauveria và Metarrhizium sau khi xử lý RNAse Ghi chú:1.RMTĐ3 7.SCLLLA1 2.BHBD6 8.DONG 3-1 3.NNRT7 9.BDQ96 4.SR 10.BDTN4 5.PULQ2 11.BXĐTG6 6.BRVT6 12.RNBT1.7 Sau tinh sạch ta thấy rằng các mẫu 1.RMTĐ3, 2.BHBD6, 4.SR, 5.PULQ2, 9.BDQ9 lƣợng DNA cịn nhiều, khi tiến hành phản ứng PCR với những mẫu này cần phải pha lõang nồng độ DNA trong nƣớc cất 2 lần khỏang từ 7-10 lần. Riêng những mẫu cịn lại gồm 3.NNPT7, 6.BRVT6, 7.SCLLLA1, 8.DONG3-1, 10.BDTN4 11.BXĐTG6, 12.RNBT1.7 do nồng độ DNA trong mẫu cịn ít hơn nên cĩ thể pha lõang từ 1-3 lần hoặc khơng pha lõang. Vd:đối với mẫu 6.BRVT6. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA tổng số Tạp nhiễm 32 4.4. Kết quả phản ứng PCR Thực hiện PCR trên 12 dịng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana, tuy nhiên kết quả khuếch đại sản phẩm DNA chỉ thu đƣợc 6 dịng nấm Beauveria bassiana khi sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5. qua hình 4.4 chúng tơi đã khuếch đại đƣợc vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 gây độc cao, mặc dù đƣợc phân lập từ nhiều ký chủ và địa phƣơng khác nhau nhƣng vẫn cho kích thƣớt các band trên gel nhƣ nhau. Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng PCR. Phản ứng PCR xảy ra tốt trong điều kiện DNA ly trích phải đúng, phải đảm bảo DNA cĩ nồng độ và độ tinh sạch nhất định. Đối với nấm Beauveria bassiana nồng độ DNA phù hợp là 100ng Nồng độ DNA cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha lỗng DNA trong dung dịch đệm (TE 1X) hay nƣớc vơ trùng Riêng 6 dịng nấm Metarrhizium anisopliae khi sử dụng cặp mồi METPR1 và METPR4 khơng thực hiện đƣợc phản ứng PCR do một số yếu tố chủ quan nhƣ đã nêu trên. PCR là một phản ứng cĩ độ nhạy cao, nếu quá trình thao tác khơng đảm bảo điệu kiện vơ trùng tƣơng đối thì khĩ tránh tạp nhiễm dẫn đến kết quả sai lệch hoặc cĩ khi khơng thu đƣợc kết quả mong muốn. Ngồi ra cịn cĩ thể do quy trình chƣa phù hợp, nhiệt độ bắt cặp chƣa tƣơng thích, cĩ sự sai khác đáng kể vùng liên kết trên gen, dẫn đến primer khơng bắt cặp, nên khơng khuếch đại đƣợc. Một khả năng nữa khơng thể thiếu là chính những dịng nấm Metarrhizium đĩ cĩ độc tính yếu hoặc khơng cĩ sự hiện diện của gen Pr1 do bị mất đi một đoạn chromosome (Wang C., Skrobek A. and Butt T.M., 2003)…Vì thế phản ứng khuếch đại DNA trên các dịng nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chƣa cĩ thể thực hiện đƣợc. Ở hình 4.4 ta thấy rằng, 2 mẫu đầu gồm: 1.RMTĐ3 và 2.BHBD6 tạo band phát sáng đậm là do nồng độ DNA cĩ trong 2 mẫu trên cao hơn so với 4 mẫu cịn lại, nên khi khuếch đại sẽ tạo sản phẩm cĩ kích thƣớc band dày. Sản phẩm khuếch đại đƣợc điện di trong 60 phút , 250 mA, 50 V, nồng độ gel là 1 %. 33 Hình 4.4 sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0.5 pmol/µl Ghi chú :1. RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5.PULQ2 6.NNPT7 7.LADDER 4.5. Kết quả phân tích RFLP trên các dịng nấm Beauveria bassiana vuille Khi thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn cho 6 dịng nấm Beauveria Bassiana. kết quả cho thấy chƣa thấy rõ sự đa dạng về di truyền giữa các dịng nấm, nguyên nhân là do khơng cĩ khả năng khảo sát trên nhiều enzyme cắt khác nhau, mà chỉ thực hiện đƣợc phản ứng cắt trên 2 enzyme đặc trƣng Hae III và Alu I. Vì thế nên chƣa thấy rõ đƣợc sự đa hình trên các band địên di, chỉ cho 2 band cĩ kích thƣớc nhƣ nhau trên cả 6 dịng phân tích. Tuy nhiên tổng kích thƣớc band trên mỗi mẫu đều tƣơng đƣơng với kích thƣớc của ladder 580 bp Với enzyme HaeIII khi cắt trên 6 dịng nấm Beauveria bassiana gồm 1.RMTĐ3, 2.SR, 3.BHBD6, 4.BRVT6, 5.PULQ2, 6.NNPT7, qua hình 4.5 cho thấy enzyme cắt đƣợc hết sản phẩm PCR trên cả 6 mẫu nấm, tạo thành 2 band cĩ kích thƣớc tƣơng đƣơng trên ladder 1.5 kb là 200 bp và 380 bp. Nồng độ DNA là 100ng (sử dụng 6µl). 1 2 3 4 5 6 7 1 kb 580 bp 34 với enzyme Alu I cũng thực hiện phản ứng cắt trên 6 dịng Beauveria bassiana nhƣ với enzyme Hae III. Qua hình 4.9 cho thấy enzyme Alu I cũngcắt đƣợc hết lƣợng sản phẩm PCR của các mẫu nấm ban đầu, và tạo thành 2 band cĩ kích thƣớc tƣơng ứng trên ladder là 250 bp và 330 bp. Do quá trình bơm mẫu vào giếng và giai đọan trộn mẫu thao tác chuẩn nên kích thƣớc các band chƣa đề. Tuy nhiên với kích thƣớc band tạo ra tƣơng ứng 580 bp trên mỗi enzyme cho thấy mẫu cắt chính là nấm Beauveria bassiana, và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 Chính là vùng mà enzyme Hae III và Alu I đã cắt đƣợc. Hình 4.5 Sản phẩm cắt trên 2 enzyme Hae III và Alu I Ghi chú: 1.RMTĐ3 2.SR 3.BHBD6 4.BRVT6 5. PULQ2 6. NNPT7 7. LADDER 8. RMTĐ3 9. SR 10. BHBD6 11. BRVT6 12. PULQ2 13. NNPT7 Mẫu enzyme cắt đƣợc điện di ở 50 V, 250 mA, trong thời gian 60 phút. ladder 1.5 kb Alu I Hae III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 35 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Đã phục hồi đƣợc 12 nguồn nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana trên các cơn trùng khác nhau: bọ xít đen, bọ dừa, sâu cuốn lá lúa, rầy nâu ở các tỉnh Tiền Giang, Tây Ninh, Long An, Bến Tre, Quận 9 – Thành phố Hồ Chí Minh, Quận 2 – thành phố Hồ Chí Minh. - Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ở nấm Beauveria với cặp mồi ITS4 và ITS5, các thành phần hĩa chất và chu kỳ nhiệt cụ thể đã đƣợc hồn thiện. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục thu thập, phục hồi và phân tích sự đa dạng di truyền của các dịng nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae với số lƣợng mẫu lớn hơn từ nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc nhằm làm phong phú thêm bộ giống các chủng nấm ký sinh cơn trùng phân lập từ tự nhiên ở Việt Nam. Tạo điều kiện phục vụ dắc lực cho Nơng nghiệp nĩi chung và cơng tác bảo vệ thực vật nĩi riêng . - Trong phân tích RFLP, sản phẩm cắt chƣa cho thấy rõ sự đa hình giữa các dịng nấm với nhau. Nếu cĩ điều kiện cần tiếp tục hồn thiện và đọc trình tự trên nhiều đối tƣợng khác nhau , từ đĩ so sánh với ngân hàng gen trên thế giới để biết sự khác biệt và cĩ hƣớng nghiên cứu phù hợp . 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231. 2. Tạ Kim Chỉnh, 1996. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt cơn gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng. Luận án PTS. Viện Cơng Nghệ Sinh Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Cơng Nghệ Quốc Gia, Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, 1981. Sử dụng vi sinh vật để phịng trừ sâu hại cây trồng. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 5. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong cơng nghệ sinh học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 140 – 145. 6. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản nơng nghiệp. Trang 150 – 155. 7. Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trang 7 –30. 8. Võ Thị Thƣơng Lan. Sinh học phân tử. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Trang 159 – 161. 9. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 10. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật cĩ ích tập II. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. Trang 49 – 90. 11. Tống Kim Thuần, 2001. Vi sinh vật diệt sâu hại đậu tương và triển vọng sử dụng chúng ở Đồng Bằng Sơng Hồng. Tạp chí sinh học 9/2001, 23(3): 22 – 28. 12. Phạm Thị Thùy, Ngƣyễn Văn Thiêm, Võ Hiền, 2000. Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae để phịng trừ bọ hại dừa. 37 13. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Trang 19 – 44. 14. Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết, 2000. Sản suất chế biến và sử thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học. Viện Bảo Vệ Thực Vật. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. 15. Nguyễn Ngọc Tú-Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. TP.Hồ Chí Minh. 158 trang. TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI 16. Bidochka M.J., McDonald M.A., St Leger R.J., and Roberts D.W., 1994. Differentiation of species and strain of entomopathogenic fungi by Random Amplifiction of Polymorphic DNA (RAPD). Current Genetics 25: 107 – 113. 17. Charnley A.K., Xia Y., Gao M., and Clarkson J.M.,2002. Molecular cloning, characterisation, and expression of a neutral trehalase frpm the insect pathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Journal of invertebrate pathology 80: 127 –137. 18. Charnley A.K., and El – Sayed, 1989. A technique for accelerating and synchronising germination of conidia of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Archives of Microbiology 142: 204 – 206. 19. Destéfano R.H.R., Destéfano S.A.L., and Messias C.L., 2004. Detection of Metarrhizium anisopliae var anisopliae within infected sugarcane borer Diatraea saccharalis (Lepidoptera, Pyralidae) using specific primers. Genetics and Molecular Biology, 27, 2: 245 – 252. 20. Fegan M., Manners J.M., Maclean D.J., Irwin J.A., Samuels K.D., and Holdom D.P., 1993. Random amplified polymorphic DNA markers reveal a high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisoliae var anisopliae. Gene Microbiol 139 (Pt9): 2075 – 2081. 21. Hegedus D.D., and Khachatourians G.G., 1993. Construction of cloned DNA probes for the specific detection of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in grasshoppers. Journal of Invertebrate Pathology 62: 233 –240. 22. Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997. Isolation of a cDNA encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the 38 enthomopathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae using differential display RT-PCR. Gene 197: 1 – 8. 23. Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1994. Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR. Mycological Research 98: 1077 – 1081. 24. Leger R.S.T., Roberts D.W., and Staples R.C., 1999. Molecular cloning of a comlimentary DNA sequence encoding a cuticle degrading protease produced by entomopathogenic fungi. Boyce Thompson Institute for Plant Research, Inc, Ithaca, NY. 25. Maria C.V., and Peberdy J.F., 1997. Location of chitinolytic enzymes in protoplasts and whole cells of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae. Mycological Research 101 (11): 1393 – 1396. 26. Nam Jin – Sik, Lee D.H., Lee K.H., Park H.M., and Bae K.S., 1998. Cloning and phylogenetic analysis of chitin synthase genes from the insect pathogenic fungus, Metarrhizium anisopliae var anisopliae. FEMS Microbiology letters 159: 77 – 84. 27. Raymond J., St Leger R.J., Lokesh Joshi, Michael J., and Bidochka, 1995. Protein synthesis in Metarrhizium anisopliae growing on host cuticle. Mycological Research 99: 1034 – 1040. 28. Soraya C.M.L., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1997. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Pr1 gene for the detection and characterization of Metarrhizium strains. Mycological research 101 (3): 257 – 265. 29. St Leger R.J., May B., Allee L.L., Frank D.C., Staples R.C., and Roberts D.W., 1992. Genetic differences in allozymes and information of infection structures among isolates of the entomopathogenic fugus Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertabrate Pathology 60: 98 – 101. 30. Wang C., Skoroberk A., and Butt T.M., 2003. Concurrence of losing a chromosome and the ability to produce destruxin in a mutant of Metarrhizium anisopliae. FEMS Microbiology lettres 226: 373 – 378. 31. Bidochka, M .J.&Khachatorians, G. G (1993). Regulation of extracellular N-acetyl-D-glucosidase production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana vuille . Canadian Journal of Microbiology 39,6-12 32. Riba, G, Bouvier-Fuorcade, I.,and caudal, A. (1986) Isoenzyme polymorphisms in Metarrhizium anisopliae (Deute-romycotina, Hyphomycetes) entomogenous fungi . Mycopa-thologia 96,161-169 39 33. File://D:\Beauveria- thang7\Selection%20of%20Beauveria%20bassiana%20and%20Metarh... 8/17/2004 34. Kosir, J . M., MacPherson, J.M. &Khachatuorians, G. G.(1991). Genomic analysis of c Virulent and a less virulent strain of the enthomopathogenic fungus Beauveria bassiana , using restriction fragment length polymorphism . Canadian Journal of Microbiology 37,534-541 35. Mugnai, L,. Bridge . P.D & Evans, H.C. (1989). A chemotaxonomic evaluation of genus Beauveria . Mycological Research 92,199-209 36. poprawski, T. J., Riba, G., Jones, W. A. & Aioun , A. (1988) . Variation in isoesterase profiles of geographic population of Beauveria bassiana (Dueteromycotina: Hypomycetes ) isolates from Sitona weevils (Coleoptera:curculiondae). Environmental Entomology 17 , 275-279