Luận văn Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học

Luận văn Nghiên cứu tối ưu hĩa quá trình sản xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hĩa học i LỜI CẢM ƠN Qua 2 tháng nỗ lực phấn cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ và bạn bè em đã hồn tất đề tài này. Qua đây em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ: Nguyễn Duy Nhứt và cơ giáo: Phan Thị Thương người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình thự tập và trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hồn thành tốt đề tài. Em xin bày tỏ lịng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cơ trong khoa cơng nghệ hố phân tích đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến các thầy, cơ phụ trách phịng thí nghiệm hố phân tích, cùng thầy cơ bộ mơn cơng nghệ hố, bộ mơn hố phân tích và cơng nghệ thực phẩm, các anh chị và cơ chú ở Viện nghiên cứư và ứng dụng cơng nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập. Chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp CĐH 29, cùng các bạn sinh viên thực tập tại phịng thí nghiệm ở Viện đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em. Cuối cùng con xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu. Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Sinh viên Trần Thị Mỹ Châu ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................iv a.Khử lần 1: Dùng acid benzoic .............................................................................39 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tơm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)......................23 Bảng 2. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain (Trần Thị Luyến, 2003)...........................................................................27 Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret...34 Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret............34 Bảng 5. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase...............................................36 Bảng 6. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.......................................................................................36 Bảng 7. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử protein bằng NaOH................................................................38 Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH........................................................................................................38 Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH.....................................................39 Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH.............................................................................................40 Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử khống bằng HCl....................................................................41 Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng HCl............................................................................................................41 Bảng 13. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ chân trắng (%).................46 Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein cịn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase.......................................................................................47 Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.......................................................................................47 Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất............................................................................................................48 Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH...49 iv Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH........................................................................................................50 Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất............................................................................................................50 Bảng 20. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ Chân Trắng sau khi khử lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu....52 Bảng 21. Kết quả hàm lượng khống cịn lại trong phế liệu tơm ở các chế độ khử khống bằng C6H5COOH..............................................................53 Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH.............................................................................................53 Bảng 23. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ Chân Trắng sau khi khử protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối ưu...............................................................................................................55 Bảng 24. Kết quả hàm lượng khống cịn lại trong phế liệu tơm ở các chế độ khử khống bằng HCl.............................................................................55 Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng HCl55 Bảng 26. Kết quả đo OD330nm...............................................................................1 Bảng 27. Kết quả đo OD570nm...............................................................................1 Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm.............................................................................2 Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án.............................................................2 Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.........................................................................................3 Bảng 31.Các số liệu dùng để tính tốn....................................................................4 Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn thủy phân khử protein bằng enzyme ..............................................................................................6 Bảng 33.Các thơng số tối ưu....................................................................................6 Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm..............................................................................7 Bảng 35.Các thí nghiệm ở tâm phương án.............................................................7 Bảng 36.Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH..........................................................................................................8 Bảng 37. Các số liệu dùng để tính tốn...................................................................9 Bảng 38.Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn khử protein bằng NaOH10 v Bảng 39.Các thơng số tối ưu..................................................................................10 Bảng 40. Bảng bố trí thí nghiệm............................................................................11 Bảng 41. Các thí nghiệm ở tâm phương án..........................................................11 Bảng 42. Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH.............................................................................................11 Bảng 43.Các số liệu dùng để tính tốn..................................................................12 Bảng 44. Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH ............................................................................................14 Bảng 45. Các thơng số tối ưu.................................................................................14 Bảng 46. Bảng bố trí thí nghiệm............................................................................15 Bảng 47. Các thí nghiệm ở tâm phương án..........................................................15 Bảng 48. Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH .......................................................................................................15 Bảng 49. Các số liệu dùng để tính tốn.................................................................16 Bảng 50. Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn khử khống bằng HCl...17 Bảng 51. Các thơng số tối ưu.................................................................................18 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.Cấu tạo của Chitin.......................................................................................4 Hình 2. Cấu tạo của Chitosan..................................................................................5 Hình 3.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Cơng Nghệ Châu Á.................15 Hình 4.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tơm hùm của Hackman...................17 Hình 5.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)...................17 Hình 6.Quy trình sản xuất của Pháp....................................................................18 Hình 7.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản....................20 Hình 8. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam...................................................................................21 Hình 9. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tơm Sú bằng phương pháp hĩa học với một cơng đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003)........................22 Hình 10. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản........................24 Hình 11. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006)......................25 Hình 12. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan....................26 Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất.....................................................................32 Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin khơng dùng acid benzoic.(đối chứng)........33 Hình 15.Cơng thức của phức Biuret.....................................................................42 Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret...............45 Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret.........................46 Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ thủy phân bằng enzyme theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..................................49 Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..........................................................52 Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm C6H5COOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..................................54 Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm HCl theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson..........................................................57 Hình 22.Thiết bị ổn nhiệt Memmert.....................................................................18 Hình 23. Thiết bị đo Uvmini-1240.........................................................................19 Hình 24.Máy li tâm.................................................................................................19 vii Hình 25.Thiết bị Vortex..........................................................................................19 Hình 26.Sự bắt màu của dung dịch BSA sau khi cho thuốc thử Biuret............20 Hình 27. Cơng thức cấu tạo của Sodium citrate..................................................20 Hình 28. Mono Sodium Citrate Anhydrous.........................................................20 Hình 29. Dung dịch protein và thuốc thử Biuret.................................................21 Hình 30. Thủy phân đầu tơm.................................................................................21 Hình 31. Đầu tơm đã được vơ hoạt enzyme sau khi thủy phân(dùng nhiệt).....21 Hình 32. Phế liệu tơm sau khi thủy phân..............................................................22 Hình 33. Phế liệu tơm sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và xử lý NaOH ...................................................................................................................22 Hình 34. Phế liệu tơm đã khử protein và khư khống lần 1 bằng C6H5COOH ...................................................................................................................22 Hình 35. Phế liệu tơm(PLT) đã khử protein bằng enzyme(trái), PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH...............................................................23 Hình 36. PLT đã khử protein bằng enzyme và NaOH(trái), PLT đã khử protein và khử khống bằng C6H5COOH............................................23 viii LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hố học cĩ sử dụng các loại hố chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây ảnh hưởng tới chất lượng chitin-chitosan và các chế phẩm khác được sản xuất từ phế liệu giáp xác. Vì vậy, việc nghiên cứu một quy trình kết hợp phương pháp hố học với phương pháp sinh học đồng thời giảm tối đa lượng hố chất sử dụng là rất cần thiết gĩp phần giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm. Ngồi ra, cịn cĩ rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu giáp xác sản xuất các mặt hàng cĩ giá trị khác như: Astaxanthin, thức ăn chăn nuơi, chiết rút chất mùi nhưng cơng nghệ gây ơ nhiễm nên khơng cho phép tận dụng các chất cĩ hoạt tính khác. Do đĩ việc sử dụng nguồn phế liệu từ vỏ tơm đã được triển khai tại rất nhiều các khu vực trong nước. Việc tận dụng phế liệu vỏ tơm tập trung chủ yếu vào sản xuất thức ăn cho gia súc, các sản phẩm Chitin-Chitosan, glucosamine, oligosaccharide Tuy nhiên theo điều tra ban đầu thì trong cơng nghệ sản xuất Chitin-Chitosan trong nước hiện nay đều thực hiện chủ yếu theo phương pháp hĩa học dẫn đến chất lượng chưa cao, hầu hết các cơ sở sản xuất Chitin-Chitosan chưa cĩ một hệ thống xử lý nước thải đạt tiêu chuẩn. Nguyên nhân chủ yếu là do hàm lượng chất lơ lửng, trong đĩ chủ yếu là các chất cĩ nguồn gốc từ protein. Chúng cĩ tính chất là rất khĩ lắng trong quá trình xử lí. Như vậy, nếu chúng ta cĩ thể thu hồi protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase thì sẽ tận dụng được nguồn chất dinh dưỡng trong phế liệu đầu vỏ tơm để làm bột dinh dưỡng cho người, thức ăn cho gia súc, gia cầm, từ đĩ nâng cao nâng cao được giá trị của nguyên liệu, giảm tải cho quá trình xử lí nước thải, hạn chế sự ơ nhiễm mơi trường. Đồng thời việc sử dụng thủy phân bằng enzyme sẽ hạn chế việc sử dụng hĩa chất, gây ơ nhiễm mơi trường. Trong thực tế hiện nay tại các cơ sở sản xuất phải thu nhân nguyên liệu từ các khu vực xa, khơng tập trung và khối lượng khơng lớn gây khĩ khăn về chi phí vận chuyển. Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chế độ thủy phân bằng enzyme gĩp 1 phần kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu, giảm chi phí do phơi hoặc sấy khơ nguyên liệu, giảm sự ơ nhiễm mơi trường do khơng vận chuyển tạm thời, đồng thời loại bỏ một phần các chất khống, protein. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ mơn Cơng nghệ Chế biến- Khoa Chế biến-Trường Đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cơ Thạc sĩ Ngơ Thị Hồi Dương, em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tối ưu hĩa quá trình sản xuất Chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hĩa học.” 2.Mục đích của đề tài: Xác định các điều kiện tối ưu để khử protein từ phế liệu tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase và NaOH, đồng thời xác định các điều kiện tối ưu để khử khống bằng acid benzoic kết hợp HCl nhằm giảm thiểu hĩa chất sử dụng, giảm ơ nhiễm mơi trường, nâng cao chất lượng Chitin. 3. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài: Thành cơng của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất chitin với mục đích tận dụng nguồn protein từ đầu tơm, hạn chế sử dụng hĩa chất nhằm giảm ơ nhiễm mơi trường và sản xuất ra chitin-chitosan cĩ chất lượng cao và ứng dụng vào các lĩnh vực đặc biệt như ứng dụng trong y học, mỹ phẩm. Đề tài cũng là nguồn tài liệu hữu ích phục vụ cho cơng tác nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này. 4. Nội dung của đề tài: - Tổng quan về cơng nghệ sản xuất chitin-chitosan - Nghiên cứu sản xuất Chitin bằng phương pháp sinh học Tối ưu hĩa quá trình khử protein bằng enzyme kết hợp với NaOH Tối ưu hĩa quá trình khử khống cĩ sử dụng acid benzoic - Đề xuất quy trình. PHẦN 1. 2 TỔNG QUAN VỀ CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITIN-CHITOSAN. 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN-CHITOSAN 1.1.1. Sự tồn tại của Chitin-Chitosan trong tự nhiên Chitin và dẫn xuất của nĩ là Chitosan là những polysaccharide mạch thẳng, chúng phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Ở động vật thủy sản, Chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là ở vỏ tơm, cua, ghẹ, Vì vậy, chúng là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất Chitin-Chitosan. Trong động vật: Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao của một số động vật khơng xương sống như cơn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun trịn, Chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật khơng xương sống. Trong thực vật: Chitin cĩ trong vách tế bào của nấm và một số lồi tảo chlorophyceae. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Nĩ cĩ cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi ít nhiều cĩ tổ chức. Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của Chitin, nĩ liên kết dưới dạng phức hợp Chitin-protein,Chitin với các hợp chất hữu cơ, khi tồn tại như thế Chitin cĩ sự đề kháng đối với các chất thủy phân, hĩa học và enzyme. Do đĩ nĩ gây khĩ khăn cho việc tách chiết và tinh chế. Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một lồi, người ta cĩ thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của Chitin. Trong tự nhiên, Chitosan rất hiếm gặp, chỉ cĩ trong vách ở một số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor,) và ở vài loại cơn trùng như ở thành bụng của mối chúa. Sự deacetyl bằng kiềm, Chitin tạo thành Chitosan và tan được trong dung dịch acid acetic lỗng. 1.1.2. Cấu trúc và tính chất của Chitin-Chitosan 1.1.2.1 Cấu trúc của Chitin-chitosan Chitin-Chitosan là một polysaccharide nên cĩ cấu trúc dạng chuỗi. Trong đĩ : Chitin : R : -NH-COCH3 Chitosan : R : -NH2 3 CHITIN: Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nĩ cĩ cấu trúc tuyến tính gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside. Cơng thức phân tử: (C8H13O5N)n Phân tử lượng : M = (203,19)n Trong đĩ n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu: Đối với tơm hùm : n = 700÷800 Đối với cua : n = 500÷600 Đối với tơm thẻ: n = 400÷500 Cơng thức cấu tạo: Hình 1.Cấu tạo của Chitin. CHITOSAN: Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, gồm các phân tử D- 1,4glucosamine. Khi xử lý kiềm đặc từ Chitin ta thu được Chitosan. Cơng thức phân tử : (C6H11O4N)n Phân tử lượng: M= (161,07)n Cơng thức cấu tạo : 4 Hình 2. Cấu tạo của Chitosan. 1.1.2.2. Tính chất của Chitin-Chitosan CHITIN: Chitin cĩ màu trắng, khơng tan trong nước, trong kiềm, trong acid lỗng và các dung mơi hữu cơ khác như ete, rượu. Chitin hịa tan được trong dung dịch đậm đặc, nĩng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo. Chitin ổn định với chất oxy hĩa như KMnO4, nước javen, NaClO, người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin. Chitin cĩ khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sĩng 884÷890 cm. Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, cĩ hoạt tính sinh học cao, cĩ tính hịa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin bị men lysozyme, một loại men chỉ cĩ ở cơ thể người, phân giải thành monome N-acetyl-D-glucosamine. Chitin kết tinh ở dạng vơ định hình, khĩ hịa tan trong dung dịch amoniac (NH3), khơng hịa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia. Điều này cĩ thể là do sự thay đổi nhĩm hydroxy (-OH) tại vị trí C2 bằng nhĩm acetamic (NHCOCH3) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết. Khi nung nĩng Chitin trong dung dịch NaOH đặc thì Chitin sẽ bị khử mất gốc acetyl tạo thành Chitosan. Khi đun nĩng Chitin trong acid HCl đặc thì Chitin sẽ bị thủy phân tạo thành Glucosamine 85,5%, acid acetic 14,5%. 5 CHITOSAN: Đặc tính cơ bản của Chitosan: Chitisan cĩ nguồn gốc thiên nhiên, khơng độc, dùng an tồn cho người trong thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, cĩ tính hịa hợp sinh học cao với cơ thể, cĩ khả năng tự phân hủy sinh học, cĩ nhiều tác dụng sinh học đa dạng: cĩ khả năng hút nước, giữ ẩm, kháng nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích tăng sinh tế bào ở người, động vật, thực vật, cĩ khả năng nuơi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Tính chất hĩa học : Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, khơng mùi, khơng vị, hịa tan dễ dàng trong dung dịch acid lỗng. Loại Chitosan cĩ khối lượng trung bình thấp từ 100000÷400000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và trong thực phẩm. Tính chất sinh học: Chitosan cĩ nhiều tác dụng sinh học đa dạng như : tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, cĩ khả năng nuơi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u. Ngồi ra, Chitosan cịn cĩ tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptid- insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên Chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều cơng trình đã cơng bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khơi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư, HIV/AISD, chống tia tử ngoại, chống ngứa, của Chitosan. 1.1.3. Ứng dụng của Chitin-Chitosan:[2][5][10] 1.1.3.1. Trong y học và mỹ phẩm Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược chính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứnglàm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng chậm kéo dài, làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vơ trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ lipid và cholesterol 6 máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, lỗng xương, chống đơng tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, cĩ khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư và chống HIV. Dùng làm vật liệu y sinh: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mơ cấy ghép Trong mỹ phẩm chitosan được bổ sung vào kem chống khơ da, kem lột mặt để tăng độ bám dính, tăng độ hịa hợp sinh học với da, chống tia cực tím 1.1.3.2. Trong cơng nghiệp thực phẩm[3] Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử axit của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên. Tạo màng để bao gĩi thực phẩm, hoa quả, rau tươi. Là một polyme dùng an tồn cho người, lại cĩ hoạt tính sinh học đa dạng, chitosan được coi là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm, bánh kẹo, nước giải khát, thức ăn vật nuơi và thủy sản. Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đơng thực phẩm. 1.1.3.3. Ứng dụng trong nơng nghiệp[2][5] Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho mơi trường xung quanh. Ngồi ra, chitosan cịn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ơn, khơ vằn cho lúa. 1.1.3.4. Ứng dụng trong sinh học Làm giá thể hoạt hĩa cho cơng nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp polymer sinh học. 1.1.3.5. Ứng dụng trong các ngành cơng nghiệp khác. Trong cơng nghiệp dệt: Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm cĩ thể thay thế được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ xát, bề mặt đẹp, bền trong kiềm. 7 Làm vải chịu nước, khơng bắt lửa: Hịa tan chitosan trong dung dịch acid acetic lỗng cùng với axetat nhơm và axit stearic thu được hỗn hợp. Hỗn hợp này đem sơn lên vải, khi khơ tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và khơng bắt lửa. Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động. Làm sợi Chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na2SO4 bão hịa rồi đem kéo sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai. Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi Chitin-cellulose. Khả năng bắt màu thuốc nhuộm càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin. Trong cơng nghiệp giấy: Chitosan cĩ tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đơi độ bền của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét khi in. Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy. Trong ngành phim ảnh: Phim chitosan cĩ độ nhớt rất cao, khơng tan trong nước, acid. Độ cứng được cải thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý phim bằng dung dịch acid. Ứng dụng trong mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng trong sản xuất kem chống khơ da, do bản chất chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhĩm NH4+ thường được các nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím. Vì vậy chitosan là gạch nối giữa hoạt chất của kem và da. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PHẾ LIỆU TƠM VÀ CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN-CHITOSAN. 1.2.1. Giới thiệu về phế liệu tơm Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tơm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính là đánh bắt tự nhiên và nuơi trồng. Đặc biệt, nuơi tơm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuơi tơm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đĩ xuất khẩu tơm đơng lạnh chiếm 47%, đứng thứ 2 sau xuất khẩu dầu khí. Năm 2004, xuất khẩu 8 thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đĩ tơm đơng lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản. Năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2005, trong đĩ mặt hàng tơm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu. Năm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006 Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giá trị 4 - 4,5 tỷ USD. Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuơi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề cá. Tơm được dự kiến đạt khoảng 483 nghìn tấn nguyên liệu để phục vụ cho xuất khẩu khoảng 390.000 tấn năm 2010. Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học Thuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm. Trần Thị Luyến (2004) cho biết trong vỏ tơm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng, trong vỏ tơm khơ khoảng 20-40% khối lượng. Như vậy hàng năm cĩ thể sản xuất gần 5000 tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành Thuỷ sản . Phế liệu tơm (PLT) là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tơm bao gồm đầu, vỏ và đuơi tơm. Ngồi ra, cịn cĩ tơm gãy thân, tơm lột vỏ sai quy cách hoặc tơm bị biến màu. Tuỳ thuộc vào lồi và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu cĩ thể vượt quá 60% khối lượng sản phẩm. Cĩ thể lấy tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii làm ví dụ, đầu tơm chiếm tới 60% trọng lượng tơm. Đầu tơm sú Penaeus monodon cũng chiếm tới 40% trọng lượng tơm. Với sản phẩm tơm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng đuơi và vỏ đuơi của tơm chiếm khoảng 25% trọng lượng tơm. Đối với tơm thẻ, lượng phế liệu đầu tơm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tơm thẻ là 37%. Lượng phế liệu này cĩ thể giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và cơng nghệ chế biến tốt hơn. Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng 9 chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản. Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tơm từ 30-70% (Watkin và cộng sự, 1982 ; Evers và Carroll [19], trung bình khoảng 50% so với khối lượng tơm chưa chế biến. Halanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tơm cĩ thể chiếm 50-70% so với nguyên liệu [20]. Phần lớn tơm được đưa vào chế biến dưới dạng bĩc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuơi và chân chiếm 10-15% trọng lượng của tơm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỉ lệ này tuỳ thuộc vào giống lồi và giai đoạn sinh trưởng của chúng [5] [6]. Cấu tạo và thành phần sinh hĩa của vỏ tơm[5] Lớp ngồi cùng của vỏ tơm cĩ cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường bị hĩa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất khơng hịa tan. Vỏ chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì Lớp màu. Lớp canxi. Lớp khơng bị canxi hĩa. - Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hĩa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp màu, lớp canxi hĩa, lớp khơng bị canxi hĩa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì khơng - Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khí hoặc những khơng bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng cĩ phân nhánh, là con đường cho caxi thẩm thấu vào. - Lớp biểu bì: những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chĩng bị biến đỏ bởi Fucxin, cĩ điểm pH =5,1 khơng chứa chitin. Nĩ khác với các lớp vỏ cịn lại, bắt màu xanh với anilin xanh. Lớp biểu bì cĩ lipid vì vậy nĩ cản trở tác động của acid ở nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt. 10 - Lớp canxi hĩa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường cĩ màu xanh trải đều khắp. - Lớp khơng bị canxi hĩa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững khơng cĩ canxi và puinone. Thành phần sinh hố của vỏ tơm Protein: Thành phần protein trong phế liệu tơm thường tồn tại ở hai dạng Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tơm từ một số tơm bị biến đổi được vứt lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt cịn sĩt lại trong đầu và nội tạng của đầu tơm. Nếu cơng nhân vặt đầu khơng đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khĩ xử lý hơn. Dạng phức tạp: Ở dạng này protein khơng hịa tan và thường liên kết với chitin, Canxi Carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tơm. Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hĩa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin-protein; liên kết với các hợp chất khống và các hợp chất hữu cơ khác gây khĩ khăn cho việc tách và chiết chúng. Canxi: Trong vỏ, đầu tơm, vỏ ghẹ cĩ chứa một lượng lớn muối vơ cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù khơng nhiều nhưng trong quá trình khử khống dễ hình thành hợp chất CaHPO4 khơng tan trong HCl gây khĩ khăn cho quá trình khử khống. Sắc tố: Trong vỏ tơm thường cĩ nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là Astaxanthin. Enzyme: Theo tạp chí Thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme protease của đầu tơm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi. Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tơm và của vi sinh vật thường trú trên tơm nguyên liệu. Ngồi thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tơm cịn cĩ các thành phần khác như: nước, lipid, phospho, 1.2.2. Cơng nghệ sản xuất Chitin-Chitosan 11 Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nĩ khơng được tìm thấy ở dạng tinh khiết. Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi . Vì vậy, nĩ cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kỳ mục đích thương mại nào. Phương pháp dùng để phân tách và tinh sạch chitin phải đảm bảo lấy đi khống và tận dụng được các hợp chất cĩ giá trị khác. Do đĩ, nhiều phương pháp đã được áp dụng cho việc thu hồi chitin. Hơn nữa, tính hữu ích của các nguồn chitin khác nhau phụ thuộc vào sự sẵn cĩ của nguyên liệu, phương pháp đơn giản, hàm lượng chitin, và sự phù hợp để tận thu các sản phẩm cĩ giá trị khác. Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính: - Khử khống: Loại bỏ khống bằng acid hoặc là một tác nhân tạo phức. - Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease. Hai bước này cĩ thể đổi vị trí cho nhau phụ thuộc vào phương pháp thu hồi protein, carotenoid và hơn nữa là ứng dụng chitin. Chitin sử dụng như một chất hấp thụ hay hỗ trợ enzyme nên khử khống trước, bởi vì bước này lấy đi muối khống và bảo vệ cấu trúc chitin đảm bảo sự deacetyl polysaccharid khi xử lý kiềm nhẹ để khử protein. Tăng cường mức deacetyl gia tăng các nhĩm amino tự do tham gia vào quá trình hấp phụ và gắn kết protein. Tuy nhiên, để thu hồi protein thì nên thực hiện bước khử protein trước. Khi đĩ, sản lượng protein và chất lượng là lớn nhất . Sau quá trình khử khống và khử protein, sản phẩm được tẩy màu bằng acetone hoặc hydrogen peroxide. Bước này là khơng cần thiết và phụ thuộc vào yêu cầu của sản phẩm cuối cùng. Cĩ hai phương pháp chính để sản xuất chitin: phương pháp hĩa học và phương pháp sinh học. -Phương pháp hĩa học: Quá trình khử khống được thực hiện bằng việc sử dụng HCl hoặc acid hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phịng với cơ chế như sau: CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là: 12 a. Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ khơng khử được hết khống dẫn đến sản phẩm cịn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất lượng sản phẩm. b. Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ khơng khử hết khống, nếu quá lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí. c. Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ rất khĩ xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm sau này. Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khống sẽ khơng bị loại triệt để. Thơng thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu cĩ điều kiện ta cĩ thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn. -Phương pháp sinh học: Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại cơng đoạn khử protein và deacetyl khơng sử dụng hố chất mà cĩ thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Việc deacetyl được thực hiện bởi enzyme deacetylase. Sản phẩm chitosan thu được cĩ chất lượng cao do khơng bị ảnh hưởng nhiều bởi hố chất [6] Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khĩ khăn như giá thành sản phẩm cĩ thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hồn tồn protein cĩ thể đạt được bằng phương pháp hố học nhưng khơng thể đạt được bằng phương pháp sinh học . Vì vậy, người ta cĩ thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khĩ khăn trong phương pháp hố học để sản xuất chitin là thể tích chất thải cĩ chứa các chất ăn mịn, các chất lơ lửng khĩ xử lý quá lớn. Những chất này là do trong cơng đoạn khử khống và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải cĩ các biện pháp xử lý trước khi thải ra mơi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hố học cĩ thể gây nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) và gây ơ nhiễm mơi trường 13 (Allan và cộng sự, 1978) [20]. Điều này là do khơng xác định được bản chất hoạt động của hố chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu. Ngược lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất khơng lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme cĩ thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý mơi trường. Vì vậy, muốn sản phẩm chitin cĩ được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hố thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme. Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzyme protease và vi khuẩn cĩ khả năng tạo protease để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hố học. Quá trình này giúp tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng đến mơi trường. Hall & De Silva (1994) đã đề xuất một phương pháp khử khống đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu. Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tơm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN-CHITOSAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hĩa ứng dụng của Chitosan đã được cơng bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành cơng trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đĩ là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Cho đến nay trên thế giới đã cĩ nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tơm, cua, ghẹ như:[5] 1.3.1. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hĩa học - Quy trình của Stevens 14 Hình 3.Quy trình của Stevens (2002) Học Viện Cơng Nghệ Châu Á Cao hơn 1% Cao hơn 1% Phế liệu tơm tươi Khử protein (NaOH 4%, t = 24 giờ, to=30oC) Kiểm tra hàm lượng protein Khử khống (HCl 4%, t=24 giờ, to=30oC) Kiểm tra hàm lượng khống Chitin 15 - Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tơm hùm của Hackman: HCl 2M to phịng t = 48h w/v = 1/2.5 Vỏ tơm hùm Ngâm HCl Rửa trung tính,sấy khơ, nghiền mịn Ngâm HCl Li tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH Li tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH Li tâm Rửa trung tính Rửa sạch bằng li tâm Làm khơ Chitin dạng bột màu kem NaOH 1M to = 100oC t= 42h w/v = 1/2,5 NaOH 1M To = 100oC T= 12h w/v = 1/2,5 HCl 2M to phịng t = 5h w/v= 1/10 16 Hình 4.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tơm hùm của Hackman Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều cơng đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65 giờ nên chỉ cĩ ý nghĩa trong cơng tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hĩa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất. - Quy trình thủy nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản): Hình 5.Quy trình nhiệt của Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) Nhận xét: Quy trình đã đơn giản hĩa cơng đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hĩa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được cĩ độ tinh khiết cao. Tuy nhiên sản phẩm chitosan thu được cĩ độ nhớt thấp do nhiệt độ xử lý ở các cơng đoạn khá cao. 1.3.2. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hĩa học cải tiến: Vỏ cua khơ Khử chất vơ cơ Rửa trung tính Sấy khơ Khử protein và chitin Rửa trung tính HCl 2M to=120oC t= 1h NaOH 15M to= 150oC t = 1h Sấy khơ Chitosan 17 Quy trình sản xuất của Pháp: Hình 6.Quy trình sản xuất của Pháp Hấp chín, phơi khơ Xay nhỏ Tách protein Rửa trung tính NaOH 3,5% to = 65oC t = 2h w/v = 1/10 Ngâm HCl Ngâm aceton Ngâm NaOCl Rửa trung tính Deacetyl chitin Rửa trung tính Chitosan Vỏ tơm HCl 1N to phịng t = 2h w/v = 1/10 NaOCl 0,135% to phịng t = 6 phút w/v = 1/10 NaOH 40% to = 85oC t = 4h w/v = 1/4 To phịng T = 30 phút w/v = 1/5 18 Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm thu được rất sạch cĩ màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để. Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hĩa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt. Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Chưa kể đến các yếu tố an tồn sản xuất cơng nghệ này khĩ áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay. Việc nghiên cứu sản xuất Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Năm 1978 trường Đại học Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết Chitin-Chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện. - Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại học Thủy sản: Nhận xét: Sản xuất chitosan theo quy trình này sản phẩm tạo thành cĩ chất lượng khá tốt, chitin cĩ màu sắc đẹp. Song thời gian cịn dài, sử dụng nhiều chất oxy hĩa do đĩ dễ làm ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm. Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành cơng nghiệp và cĩ giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: trường Đại học Thủy sản, Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội, Trung tâm Cơng nghệ và sinh học Thủy sản – Viện nghiên cứu mơi trường Thủy sản 2, đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng cơng nghệ này. Trong đĩ, các kết quả cơng bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hĩa chất trong xử lý, ứng dụng cơng nghệ enzyme. Những kết quả đĩ đã gĩp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu của tơm đơng lạnh và trước những yêu cầu khắc khe hơn về chất lượng của chitin, chitosan trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay. 19 Hình 7.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản. Nhận xét : Chitin thu được cĩ độ trắng cao mặc dù khơng cĩ cơng đoạn tẩy màu. Tuy nhiên, lại cĩ nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân cơng, nồng độ hĩa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian sử lý dài (cơng đoạn khử khống) làm cắt mạch polymer trong mơi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm. Vỏ tơm khơ Ngâm HCl Rửa trung tính Ngâm NaOH Rửa trung tính HCl 6N to phịng t = 48h w/v = 1/2,5 NaOH 8% to = 100oC t = 2h w/v = 1/2,5 Tẩy màu Chitin Nấu trong NaOH Rửa trung tính Chitosan NaOH 40% to = 80oC t = 24h w/v = 1/1 20 - Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam. Hình 8. Quy trình sản xuất Chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện khoa học Việt Nam Nhận xét: Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này cĩ màu sắc khơng đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện lại kéo dài, nhiều cơng đoạn. Ngâm HCl Rửa trung tính Nấu trong NaOH Rửa trung tính Ngâm HCl HCl 4% to phịng t = 24h NaOH 3% to = 90÷95oC t = 3h HCl 4% to phịng t = 24h Rửa trung tính Nấu trong NaOH Rửa trung tính Nấu trong NaOH đặc Chitosan Nguyên liệu NaOH 3% to = 90÷95oC t = 3h NaOH 40% to = 90÷95oC t = 3h 21 - Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tơm Sú bằng phương pháp hĩa học với một cơng đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến) Hình 9. Quy trình sản xuất Chitosan từ vỏ tơm Sú bằng phương pháp hĩa học với một cơng đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003) Nhận xét: phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan cĩ chất lượng khơng thua kém so với quy trình thơng thường với hai giai đoạn xử lý kiềm. tổng thời gian cần thiết giảm rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thị đây là phương pháp tốt hơn hẳn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn cịn nhược điểm là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl cĩ màu sẫm gây khĩ khăn cho việc tái sử dụng. Theo quy trình cơng nghệ này sản phẩm chitosan dạt được cĩ các chỉ tiêu chất lượng như bảng 1 Vỏ tơm khơ Vỏ tơm tươi Ngâm HCl Ngâm HCl Rửa trung tính Khử protein, lipid HCl 10% to phịng t =5h w/v = 1/10 HCl 10% to phịng t= 5h w/v = 1/5 NaOH 40% to = 80±2oC t = 5h w/v = 1/10 Rửa trung tính Chitosan 22 Bảng 1. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tơm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003) Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng đẹp Độ Deacetyl 76,25% Trạng thái Mềm mại Tổng thời gian thực hiện 9,5 giờ Độ ẩm 10% Nts 8,07% Hàm lượng tro 0,023% Hiệu suất 40,25 Hàm lượng các chất khơng tan 1,6% Độ tan 98,32% Độ nhớt 14,48oE Phản ứng biure Âm tính -Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản. Quy trình của trung tâm chế biến cĩ ưu điểm là đơn giản, khơng địi hỏi máy mĩc thiết bị phức tạp. Do đĩ rất dễ dàng để sản xuất lớn. Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hĩa chất sử dụng cịn khá cao, vẫn chưa cĩ hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất. 23 Hình 10. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản Phế liệu tơm Rửa sơ bộ Khử khống Ngâm rửa trung tính Khử protein HCL 7% v/w=5/1 To phịng T=24h NaOH 40% v/w10/1 To=80oC T=6,5h Rửa trung tính Deacetyl hĩa Ngâm rửa trung tính Phơi, sấy Chitosan NaOH 6% v/w=5/1 To phịng T=24h 24 1.3.3. Sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp sử dụng enzyme: -Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto[27] Hình 11. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm Chitin thu được cĩ chất lượng khá tốt, màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố trong cơng đoạn chiết astaxanthin. Ngồi ra cịn tận thu được protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đáng kể lượng hĩa chất sử dụng. Phế liệu tơm Khử protein bằng enzyme Alcalase Ly tâm (4oC, 15 phút) Phần bã Phần dịch nổi phía trên pH = 8,5 to = 55oC tỷ lệ E/NL 3% w/v = 1/1 Sấy lạnhChiết Astaxanthin bằng dầu nành và hỗn hợp dung mơi Khử khống HCl 2,5%, 2h, to phịng Bột protein Rửa trung tính Sấy khơ (60oC, 16h) Chitin 25 Nhược điểm: Enzyme đắt tiền dẫn đến chi phí giá thành sản phẩm cao. - Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003)[6] Hình 12. Quy trình sử dụng Enzyme papain để sản xuất chitosan (Trần Thị Luyến, 2003) Vỏ tơm khơ Vỏ tơm tươi Ngâm HCl Ngâm HCl Rửa trung tính Khử protein HCl 10% To phịng T = 5h w/v = 1/10 HCl 10% To phịng T = 5h w/v = 1/5 Rửa sạch Deacetyl Rửa trung tính Làm khơ Chitosan Chitin Rửa trung tính 26 Bảng 2. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain (Trần Thị Luyến, 2003) Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng, trong Độ nhớt 15,25oE Trạng thái Mềm mại Độ Deacetyl 78,25% Độ ẩm 10,10% Nts 8,25% Hàm lượng tro 0,68% Hiệu suất 41,25% Hàm lượng các chất khơng tan 0,92% Độ tan 98,37% Nhận xét : Quy trình papain cho sản phẩm cĩ độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất của quy trình cĩ ưu thế hơn hẳn. Nhưng để nâng cao chất lượng của chitosan cĩ thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tơm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, điều đĩ chắc chắn mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên, cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này. Cần tiếp tục nghiên cứu và sản xuất enzyme deacetylase để thay thế hồn tồn cho NaOH đặc trong cơng đoạn deacetyl. Gần đây Đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Chitin từ đầu-vỏ tơm bằng các phương pháp sinh học (Sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) do tác giả Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú thực hiện nhằm thu nhận chitin từ phế liệu đầu vỏ tơm bằng phương pháp cơng nghệ enzyme.[12][13] Nguyên liệu để phục vụ thí nghiệm bao gồm: phụ phẩm đầu và vỏ tơm khơ (Nam Định), phụ phẩm sau khi mua về được sấy lại cho khơ giịn ở nhiệt độ 40oC rồi nghiền nhỏ thành bột để thu nhận chitin. Vỏ dứa được thu mua ở chợ. Nghiên cứu thử nghiệm tách chiết chitin bằng phương pháp hĩa học. Kết quả cho thấy, lượng chitin trung bình thu được từ 100g nguyên liệu bột đầu – vỏ tơm khơ là 7,4-7,5 g. Kết quả này thấp hơn nhiều so với các số liệu cơng bố trong các tài liệu khác. Nguyên nhân là do nhĩm nghiên cứu đã sử dụng đầu vỏ tơm chứa nhiều thịt. Hiệu suất thu hồi chitin phụ thuộc vào mẫu nguyên liệu đĩ chứa nhiều hay ít protein. Tiếp tục tách chiết chitin nhờ sử dụng enzyme bromelanin, tác giả cho rằng, việc xử lý bột vỏ tơm với dịch ép bã dứa khơng chỉ loại được phần lớn lượng 27 protein của vỏ tơm mà cịn loại được hết các chất khống trong vỏ tơm. Dịch ép bã dứa cĩ nhiều axit hữu cơ cĩ phản ứng với các chất khống trong vỏ tơm. Phương pháp này tỏ ra cĩ nhiều ưu điểm như: khơng cần axit để loại khống, tiêu tốn ít xút cho loại protein, hiệu quả thu hồi chitin cao hơn, chất lượng phế phẩm chitin nhận tốt hơn và ít gây ơ nhiễm mơi trường hơn. Nhược điểm duy nhất của phương pháp là mất nhiều thời gian thực hiện quy trình. 28 PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu đầu tơm Đầu tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu. Đầu tơm được lấy từ nguyên liệu tơm Thẻ chân trắng chế biến tại Cơng ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hịa. Nguyên liệu sau khi lấy được vận chuyển ngay bằng thùng xốp cách nhiệt cĩ nhiệt độ < 5oC về phịng thí nghiệm. Nguyên liệu trước khi sử dụng được rửa sạch, để ráo trong thời gian 5 phút. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch → bao gĩi → bảo quản đơng ở điều kiện nhiệt độ -20oC tại phịng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ sinh học và Mơi trường. 2.1.2. Enzyme Protease[15] Đề tài sử dụng enzyme Alcalase được mua tại cơng ty Novozyme, Tp. Hồ Chí Minh. Enzyme Alcalase 2.4 FG thu được từ Bacillus licheniformis. Đây là enzyme được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi sinh vật. Sử dụng enzyme Alcalase cho phép điều chỉnh dễ dàng độ thủy phân, tính tốn được lượng base yêu cầu để duy trì pH khơng đổi trong suốt quá trình thủy phân. Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nĩ cho khả năng khơng hút nước của các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân khơng cĩ vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm cĩ sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000). Hoạt tính 2,4 AU-A/g. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷10oC. Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8 Nhiệt độ: 50 ÷ 60 oC (122 ÷ 1400F) DH (%) tối đa 15 ÷ 25. Để kiểm sốt đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản ứng enzyme gần với DH % xác định. Tất cả protease cĩ thể bị bất hoạt bằng cách 29 xử lý nhiệt ở 850C, thời gian 10 phút hoặc protease Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút. Phản ứng cĩ thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic, acetic . Tăng nhiệt độ tức thời khĩ đạt được dưới các điều kiện cơng nghiệp và nĩ cĩ thể khĩ để kiểm sốt DH % do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt. 2.1.3. Acid benzoic (C6H5COOH) Axit benzoic, C7H6O2 (or C6H5COOH), là một chất rắn tinh thể khơng màu và là dạng carboxylic acid aromatic đơn giản nhất. Tên của nĩ được lấy theo gum benzoin, là một nguồn để điều chế axid benzoic. Acid yếu này và các muối của nĩ được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm. Đây là một chất ban đầu quan trọng để tổng hợp nhiều chất hữu cơ khác. Acid benzoic đã được phát hiện vào thế kỷ 16. Việc chưng cất khơ gum benzoin đã được mơ tả lần đầu tiên bởi Nostradamus (1556), và sau đĩ là bởi Alexius Pedemontanus (1560) và Blaise de Vigenère (1596). Justus von Liebig và Friedrich Wưhler đã xác định cấu trúc của acid benzoic vào năm 1832. Họ cũng đã nghiên cứu quan hệ giữa acid hippuric và acid benzoic. Năm 1875, Salkowski đã phát hiện ra khả năng kháng nấm của acid benzoic, do đĩ nĩ đã được sử dụng bảo quản một số loại trái cây ... CTPT: C6H5COOH Phân tử gam : 122,12 g/mol Bề ngồi : Chất tinh thể rắn, khơng màu Tỷ trọng : 1,32g/cm2, solid Điểm nĩng chảy: 122,4oC (395oK) Độ sơi : 249oC (522oK) Độ hịa tan trong nước: Tan được ( nước nĩng )(3,4g/l ở 25oC) Độ hịa tan trong methalnol, diethylether : tan được Độ acid (pKa): 4,21 2.1.4. Nguyên liệu khác NaOH tinh thể dạng phân tích. HCl dạng phân tích 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu Nguyên liệu đầu tơm được thu tại phân xưởng chế biến, Cơng ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu NL phải tươi, khơng cĩ mùi lạ, khơng bị biến đỏ, khơng lẫn tạp chất. NL sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt cĩ chứa nước đá và vận chuyển ngay về phịng thí nghiệm. NL được rửa sạch và xay nhuyễn (trong đĩ cĩ 100% là đầu tơm , tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0,8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polyme ( mỗi túi 1 kg), bảo quản đơng ở điều kiện nhiệt độ -20oC. 2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thơng số kỹ thuật Phương pháp bố trí thí nghiệm: dùng phương pháp qui hoạch thực nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Mơ tả quy trình Nguyên liệu vỏ đầu tơm được xay nhỏ và khử protein bằng enzyme protease (Alcalase) trong mơi trường cĩ pH và tỷ lệ E/S theo tỷ lệ nghiên cứu. Tiến hành thuỷ phân protein để chọn ra thời gian, tỷ lệ E/S, nhiệt độ thích hợp. Sau khi tìm được chế độ tối ưu ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã. Phần dịch tận dụng thu protein và asthaxanthin dùng để sản xuất thức ăn chăn nuơi. Phần bã được rửa sạch, phơi khơ, tiếp tục khử protein bằng NaOH, khử khống bằng C6H5COOH và HCl, ở mỗi cơng đoạn cũng tiến hành thực hiện để chọn được chế độ tối ưu (nồng độ, thời gian xử lý) sau đĩ rửa sạch và thu được Chitin. Quy trình dự kiến sản xuất chitin từ phế liệu tơm: 31 Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất. Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Dịch protein Tỉ lệ E/NL:[0,1-0,5%] Nhiệt độ: [40-60oC] Thời gian:[4-10h] Khử protein bằng NaOH C M = 0,012÷0,018M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độ phịng Rửa Rửa Rửa Chitin Khử khống bằng acid benzoic Khử khống bằng HCl Đầu tơm C M = 1÷3% Thời gian: 8÷10h Nhiệt độ phịng CM=0,6÷0,8M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độ phịng 32 Sau khi tìm được các thơng số tối ưu của các cơng đoạn, ta tiến hành sản xuất Chitin theo các thơng số tối ưu của cơng đoạn khử protein bằng enzyme và NaOH, cịn ở cơng đoạn khử khống ta chỉ dùng HCl, khơng dùng C6H5COOH. Theo Nguyễn Văn Tồn và cộng sự đã nghiên cứu [22], cơng đoạn khử khống chỉ dùng HCl 1,1M; ngâm trong 12 giờ ở 30oC được áp dụng đối với phế liệu đầu vỏ tơm, kết quả hàm lượng khống cịn lại trong Chitin là 1,11±0,01%. Ở đây đối tượng nguyên liệu được nghiên cứu là phế liệu đầu tơm, đầu tơm thường thì hàm lượng khống cao hơn cho nên em đã dự kiến quy trình đối chứng với nồng độ HCl là 1,2M; và ngâm trong 16 giờ ở nhiệt độ phịng. Quy trình dự kiến sản xuất đối chứng như sau: Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin khơng dùng acid benzoic.(đối chứng) Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Bã đã tách protein Dịch protein Tỉ lệ E/NL:0,42% Nhiệt độ: 56oC Thời gian:8,8 giờ Khử protein bằng NaOH Nồng độ:2,4% Thời gian:12,2 giờ. Nhiệt độ phịng Khử khống bằng HCl Chitin Nồng độ:1,2M Thời gian:16 giờ Nhiệt độ phịng Đầu tơm 33 2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret ● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret: Hịa tan 0.1 gam huyết thanh bị (BSA) trong NaOH 3% tạo thành các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ protein trong dịch thuộc khoảng từ 0.05-0.5g/l. Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 1 đến 7, sau đĩ cho các dung dịch hĩa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau: Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret Ống nghiệm Nồng độ Số ml dịch BSA(ml) Số ml NaOH 3%(ml) 1 0 0 4 2 0,05 0,2 3,8 3 0,1 0,4 3,6 4 0,2 0,8 3,2 5 0,3 1,2 2,8 6 0,4 1,6 2,4 7 0,5 2 2 Sau đĩ lấy mỗi mẫu 4ml, thêm vào đĩ 200μl thuốc thử Microbiuret,vortex cho đều và ủ sau 15 phút mang đi đo ở bước sĩng 330nm. (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank). ● Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret: Pha dung dịch chuẩn BSA: Hịa tan 0,5 gam BSA vào trong 50ml nước cất, khuấy dần dần khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng nước cất (Hàm lượng BSA: 10mg/ml). Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau đĩ cho các dung dịch hĩa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự như sau: Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret 34 Dung dịch hĩa chất Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10 Sau khi đã cho đầy đủ các hĩa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phịng trong thời gian 30 phút. Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sĩng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank) 2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hĩa học của phế liệu đầu tơm thẻ chân trắng –Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret. –Xác định hàm lượng khống bằng phương pháp nung ở 600oC 2.2.2.3. Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưu a. Khử lần 1: dùng enzyme alcalase Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm [8][9] Mục đích của quá trình tối ưu là chọn một chế độ cơng nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ đầu tơm bằng enzyme Alcalase sao cho hàm lượng protein khử được là tốt nhất. Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân, qua các thí nghiệm thăm dị và kế thừa kết quả nghiên cứu trước đây, đề tài chọn các yếu tố cố định như sau: - pH = 8 - Tỷ lệ nguyên liệu / nước là 1:1 - Cịn lại 3 thơng số: tỷ lệ enzyme bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất khử protein. Đề tài nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm phân tích hồi 35 quy 3 yếu tố, sau đĩ tối ưu hĩa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm giá trị tối ưu. Các thơng số cần tối ưu là: - Nồng độ enzyme trong khoảng: [0,1%-0,5%] - Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [40oC-60oC] - Thời gian thủy phân trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein cịn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khơ) → Min. Bảng 5. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase. N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%) 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 8 0,5 60 10 1 1 1 1 Bảng 6. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase STT U1 U2 U3 Y(%) 9 0,3 50 7 10 0,3 50 7 11 0,3 50 7 U1: nồng độ enzyme (%) U2: nhiệt độ thủy phân (oC) U3: thời gian thủy phân (giờ) 36 b. Khử lần 2 dùng NaOH: Các thí nghiệm của mẫu khử protein bằng NaOH theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Khử protein bằng xút lỗng là phương pháp sử dụng xút ở nồng độ thấp để thủy phân các liên kết peptit của protein khơng hịa tan tạo thành các dạng peptit, pepton, acid amin hịa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Như trên đã nĩi protein trong phế liệu tơm tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do thường là phần thịt trong đầu, chân, đuơi tơm và phần protein liên kết với chitin và các thành phần khác vì vậy muốn loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu phải sử dụng các tác nhân hĩa học hoặc sinh học để thủy phân protein. Tuy nhiên, phương pháp sinh học khơng thể loại bỏ protein một cách triệt để được, do đĩ ta phải kết hợp cả 2 phương pháp sinh học và hĩa học để đảm bảo hàm lượng protein cịn lại trong Chitin là < 1%. Phương trình phản ứng biểu diễn quá trình khử protein như sau: H2N-CH-CO-NH-CH-CO- H2N-CH-CO-NH-CH- + H2N-CH-COOH R1 R2 R1 R2 R3 Polypeptid Peptid Acid amin Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid cĩ thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phịng theo phương trình phản ứng sau: CH2OCOR1 CH2OH CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa CH2OCOR3 CH2OH Triaxylglycerol Glycerol Xà phịng NaOH to cao 37 Thơng thường hàm lượng của lipid trong nguyên liệu khơng cao do vậy khơng cần nghiên cứu loại bỏ lipid trong cơng nghệ sản xuất chitin-chitosan vì phần nhỏ lipid đã bị thủy phân theo phản ứng trên. Các yếu tố cố định: - Nhiệt độ : 40oC - Tỷ lệ mẫu đem đi xử lý NaOH/dung dịch NaOH là: 1/10(w/v) Các thơng số cần tối ưu là: - Nồng độ NaOH trong khoảng: [0,1%-0,3%] - Thời gian xử lí NaOH trong khoảng: [8h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein cịn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khơ) → Min. Bảng 7. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử protein bằng NaOH N U1(Nồng độ NaOH(%)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,1 8 1 -1 -1 2 0,3 8 1 1 -1 3 0,1 10 1 -1 1 4 0,3 10 1 1 1 Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH. STT U1 U2 Y(%) 5 0,2 11 6 0,2 11 7 0,2 11 U1 : Nồng độ NaOH(%) U2: Thời gian xử lí NaOH(giờ) 2.3.4.3. Thí nghiệm xác định chế độ khử khống 38 a. Khử lần 1: Dùng acid benzoic Các thí nghiệm của mẫu khử khống bằng acid benzoic theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Mục đích của cơng đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khống của axít benzoic trên nguyên liệu là đầu tơm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH ở điều kiện tối ưu. Cơng đoạn khử khống được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tơm trong dung dịch acid benzoic. Các thơng số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính tốn được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử khống như sau: Các yếu tố cố định: - Nhiệt độ : nhiệt độ phịng - Tỷ lệ mẫu đem đi khử khống/dung dịch acid benzoic =1/15(w/v) Các thơng số cần tối ưu là: - Nồng độ C6H5COOH trong khoảng: [0,012M- 0,018M] - Thời gian xử lí C6H5COOH trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khống cịn lại trong mẫu sau khi khử khống (Y) (% theo vật chất khơ) → Min. Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH N U1 (nồng độ C6H5COOH (M)) U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,012 4 1 -1 -1 2 0,018 4 1 1 -1 3 0,012 10 1 -1 1 4 0,018 10 1 1 1 39 Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH STT U1 U2 Y(%) 5 0,015 7 6 0,015 7 7 0,015 7 U1 : Nồng độ C6H5COOH(M) U2: Thời gian xử lí ngâm C6H5COOH (giờ) b. Khử lần 2: Dùng acid chlohydric Các thí nghiệm của mẫu khử khống bằng HCl theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm: Sau khi khử protein bằng enzyme và NaOH thì % hàm lượng khống cịn lại rất lớn, dùng acid benzoic khơng thể loại bỏ khống một cách triệt để được, do đĩ ta phải kết hợp sử dụng cả acid hữ cơ kết hợp acid vơ cơ để đảm bảo hàm lượng khống cịn lại trong Chitin là < 1%. Mục đích của cơng đoạn này là nghiên cứu khả năng khử khống của axít chlohydric trên nguyên liệu là đầu tơm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH và đã khử khống một phần bằng acid benzoic ở điều kiện tối ưu. Cơng đoạn khử khống được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tơm trong dung dịch HCl. Các thơng số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính tốn được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử khống như sau: Các yếu tố cố định: - Nhiệt độ : nhiệt độ phịng - Tỷ lệ mẫu đem đi khử khống/dung dịch HCl =1/10(w/v) Các thơng số cần tối ưu là: - Nồng độ HCl trong khoảng: [0,6M- 0,8M] 40 - Thời gian xử lí HCl trong khoảng: [4h-10h] Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khống cịn lại trong mẫu sau khi khử khống (Y) (% theo vật chất khơ) → Min. Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của cơng đoạn khử khống bằng HCl. N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 2 0,8 4 1 1 -1 3 0,6 10 1 -1 1 4 0,8 10 1 1 1 Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng HCl STT U1 U2 Y(%) 5 0,7 7 6 0,7 7 7 0,7 7 U1 : Nồng độ HCl (M) U2: Thời gian xử lí ngâm HCl (giờ) 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HĨA HỌC:[1] 2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theo TCVN 3700-1990. 2.3.2. Xác định hàm lượng khống bằng phương pháp nung ở 600oC. 2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret: Nguyên lý: Trong mơi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret). Màu sắc của phức chất tỷ lệ với số liệu peptid (-CO-NH) của protein và gần như khơng phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. 41 Hình 15.Cơng thức của phức Biuret. 2.3.3.1. Dụng cụ -Dụng cụ thủy tinh(ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette), vật liệu thơng thường của phịng thí nghiệm - Micropipet (100-1000μl) -Thiết bị đo UV-Vis mini1240 2.3.3.2. Hĩa chất - NaOH - Na2CO3 (Sodium Cabonate) - CuSO4.5H2O - Na3C6H5O7.2H2O (Sodium citrate) 2.3.3.3. Tiến hành ● Pha dung dịch thuốc thử Microbiuret: Lấy 173g Sodium citrate và 100g Sodium carbonate, đem hịa tan trong nước nĩng nhưng khơng để nước sơi. Lấy 17,3g CuSO4 hịa tan trong 100ml nước cất và thêm vào hỗn hợp trên. Sau đĩ thêm nước cất vào cho đủ 1 lít. ● Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nĩi ở phần bố trí thí nghiệm ● Xử lý mẫu: 42 Lấy 1g mẫu + 20ml NaOH 3% →ủ ở 80oC,trong 6 giờ. Sau đĩ, hỗn hợp này được làm lạnh ở nhiệt độ phịng, rồi sau đĩ mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 10-15ml NaOH 3% để rửa bã. Sau đĩ đem dịch đi li tâm ở 5000 vịng/15 phút → Lấy dịch → Pha lỗng sao cho hàm lương protein nằm trong dãi bước sĩng. Lấy 4ml + 200μl Microbiuret → đo ở bước sĩng 330nm. Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein cĩ trong 1 ml dịch. Từ đĩ tính ra được phần trăm protein cĩ trong mẫu theo cơng thức tính sau: 100/)100.(1000. 100..% Mcm CVprotein − = V: Thể tích mẫu sau khi pha lỗng(ml) C: Hàm lượng protein trong 1 ml(mg/ml) m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%) 2.3.4. Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Biuret: 2.3.4.1. Dụng cụ: giống như phương pháp Microbiuret. 2.3.4.2. Hĩa chất: NaOH CuSO4.5H2O C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat) BSA (Bovine serum albumin) 2.3.4.3. Tiến hành: Pha thuốc thử Biuret: Hịa tan 2,35375 gam CuSO4.5H2O và 8,0571 gam C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất . Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nĩi ở phần bố trí thí nghiệm. Xử lí mẫu: Cách 1: Ngâm 3-5gam nguyên liệu khơ hoặc 3-10 gam nguyên liệu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v. Sau đĩ đem ủ ở 95oC trong 6 giờ. 43 Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng khơng ủ ở 95oC trong 6 giờ mà ủ ở nhiệt độ phịng 12 giờ, sau đĩ nâng nhiệt lên 95oC trong 1 giờ. Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu khơng đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân khơng bằng giấy lọc Whatman Filter paper. Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lượng protein bằng thiết bị đo UV- Vis mini1240. 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý theo phần mềm Excel 2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm. PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Kết quả đường chuẩn xây dựng được theo phương pháp Microbiuret và phương pháp Biuret: 3.1.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret : Kết quả đo được (ở phụ lục) Phương trình đường chuẩn. Đồ thị đường chuẩn BSA y = 1.4689x + 0.0027 R2 = 0.9998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Hàm lượng protein(mg/ml) OD 33 0n m Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret 3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Biuret: Kết quả đo mật độ quang học của các mẫu đường chuẩn (ở phụ lục) 45 Đồ thị đường chuẩn BSA y = 0.0509x - 0.001 R2 = 0.9999 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 2 4 6 8 10 12 Hàm lượng protein(mg/ml) OD 57 0n m Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret. 3.2. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ: Kết quả phân tích thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ chân trắng được trình bày tại bảng 3.1. Bảng 13. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ chân trắng (%) Chỉ tiêu Protein Lipid Tro Chitin Thành phần hĩa học (%) 49 4,7 25,2 18,3 (Tính theo vật chất khơ) Kết quả phân tích cho thấy tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cĩ hàm lượng protein trong phế liệu tơm khá cao. Kết quả này cho thấy cần sử dụng phương pháp sinh học để thủy phân protein để tận dụng lượng protein cĩ chất lượng vào việc chế biến thức ăn gia súc, đồng thời nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chitin vừa cĩ hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa mơi trường.Hàm lượng khống trong đầu tơm cũng khá cao, hàm lượng lipid và hàm lượng Chitin được tham khảo.[13] 46 3.3. Kết quả nghiên cứu cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase: Cơng đoạn khử protein này được thực hiện bằng cách bổ sung enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tơm. Các thơng số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính tốn được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử protein như sau: Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein cịn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%) lượng protein cịn lại 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975 8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423 Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase N0 U1 U2 U3 Y(%) 9 0,3 50 7 12,67 10 0,3 50 7 12,7970 11 0,3 50 7 13,8167 Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau: Y= 12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1) 47 Thảo luận: Phương trình (1) tương thích với thực nghiệm :qúa trình thủy phân để khử protein của phế liệu tơm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian Qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ thủy phân (X2) và thời gian khử protein (X3) thì hàm lượng protein cịn lại trong phế liệu tơm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều hơn so với nhiệt độ thủy phân. Từ phương trình (1) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ enzyme, thời gian khử protein và nhiệt độ thủy phân; song việc tăng cao nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và kéo dài thời gian khử protein như thế nào cho hợp lí để tiết kiệm được thời gian và chi phí sản xuất mà vẫn đảm bảo được lượng protein cịn lại trong phế liệu tơm là ít nhất. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 16 Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hĩa Tên U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,3 50 7 Bước làm trịn 0,04 2 0,6 Thí nghiệm 12 0,34 52 7,6 9,451 Thí nghiệm 13 0,38 54 8,2 9,2528 Thí nghiệm 14 0,42 56 8,8 8,0102 Thí nghiệm 15 0,46 58 9,4 8,655 Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 14 hàm lượng protein cịn lại trong phế liệu tơm là thấp nhất. 48 9.451 9.2528 8.0102 8.655 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 12 13 14 15 Thí nghiệm H àm lư ợ ng p ro te in c ịn lạ i(% ) Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ thủy phân bằng enzyme theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét và thảo luận: Bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm tốn học cho phép dần tới điểm tối ưu nhất. Kết quả nghiên cứu cĩ ý nghĩa tốn học cao với độ tin cậy là 95%. Điểm tối ưu đạt được ở thí nghiệm thứ 14 với nồng độ enzyme là 0,42%, ở nhiệt độ 56oC và ứng với thời gian tương ứng là 8,8 giờ. 3.4. Kết quả nghiên cứu cơng đoạn khử protein bằng NaOH: Cơng đoạn khử protein được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tơm trong dung dịch acid NaOH lỗng. Các thơng số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính tốn được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử protein như sau. Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH N U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) X0 X1 X2 Y (%) lượng protein cịn lại 1 1 8 1 -1 -1 1,78 2 3 8 1 1 -1 1,04 3 1 14 1 -1 1 1,34 4 3 14 1 1 1 0,82 49 Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH N0 U1 U2 Y(%) 9 2 11 1,1214 10 2 11 1,0764 11 2 11 1,1319 Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau : Y= 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2) Thảo luận: Phương trình (2) tương thích với thực nghiệm và qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ dung dịch NaOH (X1) và thời gian khử protein (X2) thì hàm lượng protein trong phế liệu tơm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ NaOH ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều hơn. Từ phương trình (2) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ NaOH và thời gian khử protein; song việc tăng cao nồng độ NaOH và kéo dài thời gian khử protein sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đĩ làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở bảng 19 Bảng 19. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất Tên U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,2 11 Bước chuyển động 4 4 Bước làm trịn 0,2 0,6 Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08 Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96 Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91 Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86 50 Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấy ở thí nghiệm thứ 10 hàm lượng protein trong chitin tương đối thấp tương ứng với nồng độ NaOH là 2,4%, ở 12,2 giờ. Nếu nâng cao nồng độ protein và thời gian xử lý khử protein thì hàm lượng giảm khơng đáng kể. Mặt khác, tăng nồng độ NaOH làm tăng chi phí sản xuất và giảm độ nhớt chitosan. Hàm lượng protein trong chitin ảnh hưởng lớn đến chất lượng chitin vì protein làm giảm độ tan của chitin trong acid HCl đặc và ảnh hưởng tới chất lượng của các chế phẩm được sản xuất từ chitin như: Glucosamin, chitosan Khi hàm lượng protein trong chitin cao thì trong cơng đoạn deacetyl ta phải tăng hàm lượng NaOH và kéo dài thời gian deacetyl để khử hết protein và làm tăng độ deacetyl. Nhưng nồng độ NaOH càng cao và thời gian xử lý khử protein càng dài thì dễ gây cắt mạch glucoside từ đĩ làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Vì vậy em quyết định chọn các thơng số tối ưu cho cơng đoạn xử lý khử protein như trên. Từ các thí nhiệm ở phần tối ưu hố cơng đoạn khử protein theo quy hoạch thực nghiệm ta vẽ được đồ thị sau: 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 8 11 11.6 12.2 12.8 13.4 14 Thời gian ngâm NaOH(giờ) H àm lư ợn g pr ot ei n cị n lạ i(% ) 1.0% 3.0% 2.0% 2.2% 2.4% 2.6% 2.8% 51 Hình 19. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm NaOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson Nhận xét: Qua đồ thị trên ta thấy khi nồng độ NaOH thấp thì dù thời gian cĩ kéo dài thì hàm lượng protein trong chitin cũng rất cao (1,34%). Khi nồng độ NaOH tăng dần và thời gian khử protein tăng dần thì hàm lượng protein giảm dần. Ở nồng độ NaOH 2,4% protein trong mẫu <1% là hàm lượng protein đạt tiêu chuẩn của chitin- chitosan hiện nay. Ở nồng độ NaOH 2,4% cho hàm lượng protein tương đối thấp (0,96%), ở nồng độ NaOH 2,6% và 2,8% hàm lượng protein cịn lại trong phế liệu tơm thấp hơn 0,96% nhưng nồng độ NaOH cao cĩ ảnh hưởng đến chất lượng của Chitin-Chitosan sau này, mặc khác cịn tốn thêm chi phí. Vì vậy cĩ thể chọn nồng độ NaOH=2,4% trong thời gian 12,2 giờ làm thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử protein. Vậy thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử protein là: Nồng độ NaOH=2,4%, thời gian xử lý 12,2 giờ, tỷ lệ w/v=1/10, nhiệt độ (40±1 oC). 3.5. Kết quả nghiên cứu cơng đoạn khử khống bằng acid benzoic: Phế liệu tơm đã qua khâu xử lý enzyme và NaOH cĩ thành phần hố học được trình bày ở bảng 20. Bảng 20. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ Chân Trắng sau khi khử lý khử protein bằng enzyme Alcalase và NaOH ở điều kiên tối ưu STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tơm 1 Protein 0,96 2 Khống 62,4 3 Độ ẩm 13,86 Từ bảng 20 ta thấy sau khi xử lý protein bằng enzyme Alcalase và NaOH hàm lượng protein giảm đáng kể (hiệu quả khử protein 98%). Nhưng hàm lượng khống cịn rất nhiều vì mơi trường khử protein bằng enzyme là mơi trường kiềm (pH=7,2). Một phần khống được tách ra do phần protein liên kết với khống được tách ra. Nhưng thành phần phần trăn theo khơi lượng của hàm lượng khống tăng do hàm lượng protein trong phế liệu giảm 52 Cơng đoạn khử khống được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tơm trong dung dịch acid benzoic. Các thơng số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính tốn được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thơng số tối ưu cho cơng đoạn khử khống như sau. Bảng 21. Kết quả hàm lượng khống cịn lại trong phế liệu tơm ở các chế độ khử khống bằng C6H5COOH N U1 (nồng độ C6H5COOH (M)) U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,012 4 1 -1 -1 35,21 2 0,018 4 1 1 -1 34,38 3 0,012 10 1 -1 1 25,09 4 0,018 10 1 1 1 18,57 Bảng 22. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH N0 U1 U2 Y(%) 9 0,015 7 26,05 10 0,015 7 25,14 11 0,015 7 26,23 Phương trình hồi quy của hàm lượng khống xác định được như sau: Y= 26.3125 - 1.8375*X1 - 6.4825*X2 (3) Quy luật biến đổi của hàm lượng khống là khi tăng nồng độ dung dịch acid benzoic (X1), tăng thời gian khử khống (X2) thì hàm lượng khống trong phế liệu tơm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian ngâm acid benzoic ảnh hưởng tới hàm lượng khống nhiều hơn . Từ phương trình (3) nếu muốn khử khống một cách triệt để ta phải tăng nồng độ acid benzoic, thời gian khử khống; song việc tăng cao nồng độ acid benzoic, kéo dài thời gian khử khống sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của 53 chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đĩ làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất. Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hĩa Tên U1(nồng độ M) U2(thời gian) Y(%) Mức cơ sở 0,015 7 Hệ số bj -1,8375 -6,4825 Bước chuyển động 3 3 Bước làm trịn 0,0006 0,6 Thí nghiệm 9 0,0156 7,60 25,01 Thí nghiệm 10 0,0162 8,20 22,29 Thí nghiệm 11 0,0168 8,80 20,83 Thí nghiệm 12 0,0174 9,4 19,02 Hình 20. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm C6H5COOH theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ acid benzoic, thời gian khử khống thì hàm lượng khống giảm dần, khi nồng độ C6H5COOH 0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ thì hàm lượng khống cịn lại là 20,83%. Khi tiếp tục tăng nồng độ benzoic và thời gian khử khống thì hàm lượng khống giảm khơng đáng kể. Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khống 54 thấp và độ nhớt cao thì ta cĩ thể chọn các thơng số tối ưu cho quá trình khử khống để giảm được nồng độ C6H5COOH và thời gian xử lý C6H5COOH sau này nhằm đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một cách tốt nhất. Ta cĩ thể chọn các thơng số tối ưu cho quá trình khử khống như sau: nồng độ C6H5COOH là 0,0168M, thời gian ngâm 8,8 giờ. 3.6. Kết quả nghiên cứu cơng đoạn khử khống bằng HCl: Phế liệu tơm đã qua khâu xử lý acid benzoic cĩ thành phần hố học được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 23. Thành phần hĩa học của phế liệu tơm thẻ Chân Trắng sau khi khử protein bằng enzyme Alcalase, NaOH và C6H5COOH ở điều kiên tối ưu. STT Thành phần Hàm lượng (%) trong phế liệu tơm 1 Protein 0,96 2 Khống 20,83 3 Độ ẩm 12,23 Bảng 24. Kết quả hàm lượng khống cịn lại trong phế liệu tơm ở các chế độ khử khống bằng HCl N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 4,98 2 0,8 4 1 1 -1 2,24 3 0,6 10 1 -1 1 2,86 4 0,8 10 1 1 1 0,73 Bảng 25. Thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng HCl N0 U1 U2 Y(%) 9 0,7 7 1,94 10 0,7 7 1,81 55 11 0,7 7 1,79 Phương trình hồi quy của hàm lượng khống xác định được như sau: Y= 2.7025 - 1.2425 * X1 - 0.9325 * X2 (4) Quy luật biến đổi của hàm lượng khống là khi tăng nồng độ dung dịch acid chlohydric (X1), tăng thời gian khử khống (X2) thì hàm lượng khống trong phế liệu tơm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ HCl ảnh hưởng tới hàm lượng khống nhiều hơn . Từ phương trình (4) nếu muốn khử khống một cách triệt để ta phải tăng nồng độ HCl, thời gian khử khống; song việc tăng cao nồng độ HCl, kéo dài thời gian khử khống sẽ gây ảnh hưởng lên cấu trúc của chitin-chitosan làm cắt mạch polymer từ đĩ làm giảm độ nhớt dung dịch chitosan. Như vậy xuất phát từ mức cơ sở em tiến hành các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất. Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hĩa Tên U1(nồng độ %) U2(thời gian) Y Mức cơ sở 0.7 7 Hệ số bj -1.2425 -0.9325 Khoảng biến thiên 0.1 3 bj*khoảng biến thiên -0.12425 -2.7975 Bước chuyển động 4 4 Bước làm trịn 0.02 0.6 Thí nghiệm 9 0.72 7.6 1.53 Thí nghiệm 10 0.74 8.2 0.98 Thí nghiệm 11 0.76 8.8 0.83 Thí nghiệm 12 0.78 9.4 0.77 56 01 2 3 4 5 6 4 7 7.6 8.2 8.8 9.4 10 Thời gian xử lí HCl (giờ) H àm lư ợn g kh ố ng c ịn lạ i(% ) 0.60% 0.80% 0.70% 0.72% 0.74% 0.76% 0.78% Hình 21. Kết quả nghiên cứu tối ưu hĩa chế độ ngâm HCl theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson. Nhận xét: Từ các thí nghiệm và nhìn vào đồ thị, nhận thấy khi tăng nồng độ acid chlohydric và thời gian khử khống thì hàm lượng khống giảm dần, khi nồng độ HCl 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ thì hàm lượng khống cịn lại là 0,98%. Khi tiếp tục tăng nồng độ HCl và thời gian khử khống thì hàm lượng khống giảm khơng đáng kể, mặt khác, hàm lượng khống cịn lại cũng đã < 1%. Do vậy nếu chitin-chitosan yêu cầu hàm lượng khống thấp và độ nhớt cao thì ta cĩ thể chọn các thơng số tối ưu cho quá trình khử khống để giảm được nồng độ HCl và thời gian xử lý HCl sau này nhằm đảm bảo được chất lượng của Chitin-Chitosan một cách tốt nhất. Ta cĩ thể chọn các thơng số tối ưu cho quá trình khử khống như sau: nồng độ HCl là 0,74M, thời gian ngâm 8,2 giờ. Thảo luận: Từ qui trình đối chứng khử khống bằng HCl nồng độ 1,4M và thời gian ngâm là 16 giờ ở nhiệt độ phịng, khơng dùng C6H5COOH, ta thu được Chitin, trong đĩ hàm lượng khống cịn lại là 0.78%, cịn quy trình dự kiến sản xuất thì hàm lượng khống cịn lại 0,98%. Ta thấy, Chitin thu được từ 2 qui trình trên đều cĩ hàm lượng khống cịn lại là <1%, nhưng ở qui trình khử khống cĩ sử dụng 57 kết hợp với C6H5COOH thì chất lượng Chitin sẽ tốt hơn vì thời gian xử lí HCl ngắn hơn do đĩ giảm tác động khơng cĩ lợi đến mạch polysaccharid của Chitin, acid hữu cơ cĩ khả năng bảo tồn mạch Chitin. Mặc khác, khi xử lý acid benzoic nĩ cịn làm yếu liên kết giữa protein-chitin-khống, do đĩ khi xử lý HCl sẽ dễ dàng tách khống ra khỏi phế liệu tơm ở nồng độ thấp (0,74M) và thời gian ngắn hơn (8,2 giờ). Khi chỉ dùng HCl thơi thì phải dùng ở nồng độ cao hơn (1,2M), thời gian xử lý dài hơn (16 giờ), vì ở nồng độ và thời gian dài như vậy sẽ làm ảnh hưởng xâu đến mạch polysaccharid của Chitin. Do đĩ, việc kết hợp khử khống bằng acid hữu cơ và vơ cơ là vấn đề quan trọng cần được nghiên cứu thêm. 58 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận: 1. Đã nghiên cứu được điều kiện khử protein bằng enzyme và NaOH thích hợp để sản xuất chitin như sau: - Điều kiện khử protein bằng enzyme Alcalase: Nồng độ enzyme 0,42%, nhiệt độ 56oC,thời gian là 8.8 giờ,tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1:1. - Điều kiện khử protein bằng NaOH: Nồng độ NaOH 0,24%, nhiệt độ 40oC,thời gian là 12,2 giờ, tỷ lệ 1w/5v. Khử protein từ phế liệu tơm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase đã giảm thiểu hĩa chất sử dụng, giảm ơ nhiễm mơi trường, đồng thời đã tận dụng nguồn protein từ đầu tơm làm thúc ăn chăn nuơi. 2. Đã nghiên cứu được điều kiện khử khống bằng acic benzoic thích hợp: nồng độ acid benzoic là 0,0168M, thời gian xử lý là 8,8 giờ, ở nhiệt độ phịng. Tiếp tục khử khống bằng acid chlohydric thích hợp là: 0,74M,thời gian ngâm là 8,2 giờ, ở nhiệt độ phịng. 4.2. Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu: - Cần tiếp tục nghiên cứu cơng đoạn deacetyl để hồn thiện qui trình sản xuất Chitin-Chitosan theo phương pháp sinh học - Cần phân tích chất lượng Chitosan từ chitin sản xuất theo qui trình đề xuất để đánh giá mức độ ảnh hưởng của các thơng số cơng nghệ. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt 1. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ Ngọc Bội – Phân tích thực phẩm kiểm nghiệm thủy sản – Nhà xuất bản Nơng nghiệp, 2006. 2. Nguyễn Hữu Tào, Lê Văn Liễn, Bùi Văn Chính,Vũ Chí Cương – Viện chăn nuơi – Kỹ thuật chế biến, bảo quản, và sử dụng nguồn phụ phẩm nơng nghiệp và hải sản làm thức ăn chăn nuơi. 3. Nguyễn Thị Ngọc Tú , 2003,76tr. Nghiên cứu dùng vật liệu Chitosan làm phụ gia thực phẩm đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm. [Tên tạp chí] 4. Trần Thị Luyến, 2004, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp bộ sản xuất chitin, Chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản, Mã số B2002-33-01-DA,8-15 5. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, 03/2005, Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu Thủy sản- NXB Nơng nghiệp. 6. Trần Thị Luyến và cộng sự (2003), Nghiên cứu sản xuất Chitosan từ vỏ tơm sú bằng phương pháp hĩa học với một cơng đoạn xử lý kiềm, Tạp chí KHCN Thủy sản, Đại học Thủy Sản, số 5, 18-20 7. Trần Thị Luyến, (2006), Các phản ứng cơ bản và biến đổi của thực phẩm trong quá trình cơng nghệ - NXB Nơng nghiệp, 2-17 8. Nguyễn Cảnh (1993), Quy hoạch thực nghiệm, Trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh, 10-15 9. Phan Hiếu Hiền (2001), Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu – NXB Nơng nghiệp,22-24. 10. M.T.DenSiKov, Nguyễn Văn Đạt, Bùi Huy Thanh (1997), Tận dụng phế liệu của cơng nghiệp thực phẩm, NXB Khoa hoc và Kỹ thuật, Hà Nội, 60-64 60 11. Roelof Schoemaker, Chuyên gia tư vấn (2005), Tận dụng phế liệu tơm, Dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu Thủy sản (Seaquip), NXB Nơng nghiệp, 10-15. 12. 13. 702260902082.pdf. 14. Một số đồ án tốt nghiệp trên thư viện. B. Tài liệu tiếng Anh 15. Adler – Niesen. J.,(1986), Enzyme Hydrosis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers, New York. 16. Asbjorn Gildberg, Even Stenberg., (2000), A new process for advanced utilisention of shrimp waste, pp.2-7. 17. Birch. G.G., Blakerough. N., and Parker. K.J., (1981), Enzymes and Food Processing Applied, Science Publishers Ltd, London. 18. Bustos. R.O.,and Michael. H., (1994), Microbial deproteinisation of waste prawn shell, Institution of Chemical Engineers Symposium Series, Institution of Chemical Engineers, Rugby, England, pp. 13-15. 19. Dalev. P. G., Simeonova. L.S., (1992), An enzyme biotechnology for thetotal utilization of leather wastes, Biotechnol Lett Vol. 14, pp.531- 534. 20. Gagne. N. and Simpson. B.K.,(1993), Use of proteolytic enzymes to facilitate recovery from shrimp wastes, Food Biotechnol,pp. 253-263. 21. Holanda, H. D. D, Netto, F. M., 2006. Recovery of components from shirmp (Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic hydrolysis. Journal of Food Science, 71, 298-303. 22. Nguyen Van Toan, Chuen-How Ng, Kyaw Nyein Aye, Trung Si Trang and Willem F.Stevens, Production of high-quality chitin and chitosan from preconditioned shrimp shells, F. Chem Technol Biotechnol 81:1113-1118(1006) 61 ảng 62 PHỤ LỤC Bảng 26. Kết quả đo OD330nm Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 OD330nm 0,075 0,148 0,296 0,448 0,594 0,732 Bảng 27. Kết quả đo OD570nm Ống nghiệm Hàm lượng BSA(mg/ml) OD570 1 2 0,101 2 4 0,201 3 6 0,305 4 8 0,409 5 10 0,506 1) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hĩa cho cơng đoạn khử protein từ phế liệu tơm bằng enzyme Alcalase Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh giá vai trị của từng yếu tố là: N = nk Trong đĩ: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n = 3 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k = 3 vậy N = 23 = 8 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: 8 . 1 ∑ = = N i iij YX bj 1 Ở đây: j = 0, 1,2, k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=8 Bảng 28. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%)lượng protein cịn lại 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975 8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 12,5298 ; b1 = -1,0145; b2 = - 0,8808 ; b3= -2,1623 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: =Y 12,5298 – 1,0145 * X1 – 0,8808 * X2 – 2,1623 * X3(1) Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song thủy phân phế liệu tơm bằng enzyme Alcalase theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 29.Các thí nghiệm ở tâm phương án N U1 U2 U3 Y 1 03 50 7 12,67 2 2 0,3 50 7 12,797 3 0,3 50 7 13,8167 Bảng 30. Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase. N0 01uY 01Y 0 1 0 1 YY u − ( )20101 YY u − A 1 12,67 13,0618 3 3 1 0 1 = ∑ −u uY - 0,3912 0,1531 ( ) 3081,123 1 0 1 0 1 =−∑ −u u YY 2 12,797 - 0,2642 0,0698 3 13,8167 0,6555 0,4296 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: ( ) 3263,0 11 00 3 1 20 1 0 1 2 = − = − − = ∑ − N A N YY S u u th 30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: 0: 0: ≠ = ja iO H H β β == bj j j S b t với 2019,0 2 == N SS thbj Trong đĩ bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính tốn ta cĩ: to= 62,0449 t1= 5,0237 t2 = 4,3616 t3 = 10,7075 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2 Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t Như vậy các hệ số 321 ;; ttt đều cĩ ý nghĩa. Khi đĩ phương trình hồi quy cĩ dạng: 1Y =12,5298 – 1,0145*X1 – 0,8808*X2 – 2,1623*X3 (1) 3 Kiểm định sự tương thích của mơ hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính tốn phương sai dư ( 2thS ) được cho ở bảng sau: Bảng 31.Các số liệu dùng để tính tốn STT iY iYˆ ii YY ˆ− 2)iˆi YY − 47,29)ˆ( 2 1 =−∑ = i N i i YY1 19,6183 15,7066 3,9117 15,3013 2 11,8941 13,6776 -1,7835 3,1808 3 13,023 15,7066 -2,6836 7,2018 4 14,233 13,6776 0,5554 0,3085 5 11,5383 11,3819 0,1564 0,0244 6 10,5916 9,3529 1,2387 1,5344 7 9,9975 11,3819 -1,3844 1,9167 8 9,3423 9,3529 0,0106 0,0001 Phương sai dư ( ) 8936,5 38 47,29 1 ˆ 1 2 2 = − = − − = ∑ = N YY S N i ii d Trong đĩ: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số cĩ nghĩa Tiêu chuẩn Fisher: 064,18 6540,0 5307,12 2 2 === th d S S F Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với: α =0,05 f1=N-L=3: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta cĩ: F0,05(3,2) = 19,3 Vì F = 18,0641 < F0,05(3,2) = 19,3; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (1), ta cĩ nhận xét: 4 Cả 3 yếu tố nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân và tỷ lệ E/S đều cĩ ảnh hưởng đến mức độ thủy phân nhưng thời gian cĩ ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2, b3 đều cùng dấu âm, cĩ nghĩa là Y(hàm lượng protein cịn lại) đồng biến với X1 (tỷ lệ E/S), X2 (nhiệt độ thủy phân), X3 (thời gian thủy phân) Từ phương trình (1) ta tiến hành tối ưu hĩa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nhiệt độ thủy phân X1 là 2oC. Các bước chuyển động của yếu tố X2, X3 được tính theo cơng thức dưới đây: 58,0 036,0 33 11 13 22 11 21 = ∆ ∆ = = ∆ ∆ = b b b b δδ δδ Chọn bước nhảy thích hợp với X1 là 0,04. 5 Bảng 32. Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn thủy phân khử protein bằng enzyme . Tên X1 X2 X3 Y Mức cơ sở 0.3 50 7 Hệ số bj -1.0145 -0.8808 -2.1623 Khoảng biến thiên 0.2 10 3 bj j∆ -0.2029 -8.808 -6.4869 Bước jδ 0.036 2 0.58 Bước làm trịn 0.04 2 0.6 Thí nghiệm 9 0.34 52 7.6 9.451 Thí nghiệm 10 0.38 54 8.2 9.2528 Thí nghiệm 11 0.42 56 8.8 8.0102 Thí nghiệm 12 0.46 58 9.4 8.655 Bảng 33.Các thơng số tối ưu. Các thơng số tối ưu Hàm lượng protein (%) Nồng độ enzyme Alcalase:4,2 % Thời gian: 8,8 giờ Nhiệt độ: 56oC 8,0102 2) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hĩa cho cơng đoạn khử protein từ phế liệu tơm bằng NaOH: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánh giá vai trị của từng yếu tố là: N=nk Trong đĩ: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n=2 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2 vậy N= 22 =4 thí nghiệm. Tính các hệ số của phương trình hồi quy: 6 4 . 1 ∑ = = N i iij YX bj Ở đây: j = 0, 1,2, k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4 Bảng 34. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ %) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng protein cịn lại 1 0,1 8 1 -1 -1 1,78 2 0,3 8 1 1 -1 1,04 3 0,1 14 1 -1 1 1,34 4 0,3 14 1 1 1 0,82 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 1,245 ; b1= -0,315; b2= -0,165 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: =Y 1.245 - 0.315*X1 - 0.165*X2 Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song khử protein trong phế liệu tơm bằng NaOH theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 35.Các thí nghiệm ở tâm phương án N0 U1 U2 Y(%) 9 0,2 11 1,1214 10 0,2 11 1,0764 11 0,2 11 1,1319 7 Bảng 36.Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử protein bằng NaOH N0 01uY 01Y 0 1 0 1 YY u − ( )20101 YY u − A 1 1,1214 = ∑ − 3 3 1 0 1 u uY 1,1099 0,0115 0,0001 = −∑ − 23 1 0 1 0 1 u u YY 0,001 7 2 1,0764 - 0,0335 0,0011 3 1,1319 0,0220 0,0005 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: ( ) 0009,0 11 00 3 1 20 1 0 1 2 = − = − − = ∑ − N A N YY S u u th 30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: 0: 0: ≠ = ja iO H H β β == bj j j S b t với 0147,0 2 == N SS thbj Trong đĩ bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính tốn ta cĩ: to= 84,4553 t1= 21,3682 t2 = 11,1929 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2 Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t Như vậy các hệ số t1,12 đều cĩ ý nghĩa. Khi đĩ phương trình hồi quy cĩ dạng: 1Y = 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2) Kiểm định sự tương thích của mơ hình thực nghiệm được thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher. Các số liệu dùng để tính tốn phương sai dư ( 2thS ) được cho ở bảng sau: 8 Bảng 37. Các số liệu dùng để tính tốn STT iY iYˆ ii YY ˆ− 2)iˆi YY − 001,0)ˆ( 2 1 =−∑ = i N i i YY1 1,78 1,7250 0,0550 0,003 2 1,04 1,0950 -0,0550 0,003 3 1,34 1,3950 -0,0550 0,003 4 0,82 0,7650 0,0550 0,003 Phương sai dư ( ) 0061,0 1 ˆ 1 2 2 = − − = ∑ = N YY S N i ii d Trong đĩ: N: Số thí nghiệm 1: Số hệ số cĩ nghĩa Tiêu chuẩn Fisher: 96,6 0009.0 0061.0 2 2 === th d S S F Tra bảng phân vị phân bố Fisher Fα (f1,f2) với: α =0,05 f1=N-L=2: Bậc tự do của tử. f2=N0-1=2 : Bậc tự do của mẫu. Tra bảng ta cĩ: F0,05(2,2) =18,5 Vì F =6,96 < F0,05(2,2) =18,5; nên phương trình tương thích với thực nghiệm. Nhìn vào phương trình hồi quy (2), ta cĩ nhận xét: Cả 2 yếu tố nồng độ NaOH, thời gian ngâm đều cĩ ảnh hưởng đến mức độ khử protein nhưng nồng độ cĩ ảnh hưởng mạnh nhất. Các hệ số b1, b2 đều cùng dấu âm, cĩ nghĩa là Y(hàm lượng protein cịn lại) đồng biến với X1 (nồng độ NaOH), X2 (thời gian ngâm). Từ phương trình (2) ta tiến hành tối ưu hĩa theo phương pháp đường dốc nhất. Chọn bước chuyển động của nồng độ NaOH là 0,2%. Các bước chuyển động của yếu tố X2, X3 được tính theo cơng thức sau hay được chọn theo kinh nghiệm. 607,0 22 11 12 =∆ ∆ = b bδδ 9 Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn thủy phân khử protein bằng NaOH được ghi trong bảng : Bảng 38.Kết quả thực nghiệm tối ưu hĩa cơng đoạn khử protein bằng NaOH Tên X1 X2 Y Mức cơ sở 0,2 11 Hệ số bj -2,3238 -2,6763 Khoảng biến thiên 0,1 3 bj j∆ -0,3238 -8,0289 Bước jδ 0,2 0,607 Bước làm trịn 0,2 0,6 Thí nghiệm 9 2,2 11,6 1,08 Thí nghiệm 10 2,4 12,2 0,96 Thí nghiệm 11 2,6 12,8 0,91 Thí nghiệm 12 2,8 13,4 0,86 Bảng 39.Các thơng số tối ưu Các thơng số tối ưu Hàm lượng protein (%) Nồng độ NaOH:2,4 % Thời gian: 12,2 giờ Tỷ lệ w/v: 1/15 0,96 3) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hĩa cho cơng đoạn khử khống từ phế liệu tơm bằng C6H5COOH: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thì số thí nghiệm cần tiến hành để đánhgiá vai trị của từng yếu tố là: N=nk Trong đĩ: N : Số thí nghiệm; n: Số mức, ở đây n=2 k: Số yếu tố ảnh hưởng; k=2 vậy N = 22 = 4 thí nghiệm. 10 Tính các hệ số của phương trình hồi quy: 4 . 1 ∑ = = N i iij YX bj Ở đây: j = 0, 1,2, k với k là số yếu tố độc lập. N là số thí nghiệm trong ma trận quy hoạch thực nghiệm N=4 Bảng 40. Bảng bố trí thí nghiệm N U1(nồng độ M) U2(thời gian) X0 X1 X2 Y(%)lượng khống cịn lại 1 0,012 4 1 -1 -1 35,21 2 0,018 4 1 1 -1 34,38 3 0,012 10 1 -1 1 25,09 4 0,018 10 1 1 1 18,57 Thay số ta tính được các hệ số: b0 = 26,3125 ; b1= -1,8375; b2= -6,4825 Phương trình hồi quy tuyến tính dạng rút gọn là: =Y 26,3125 – 1,8375*X1 – 6,4825*X2 (3) Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Bố trí 3 thí nghiệm song song khử khống trong phế liệu tơm bằng C6H5COOH theo các điều kiện ở tâm phương án. Các thí nghiệm được bố trí như sau: Bảng 41. Các thí nghiệm ở tâm phương án N0 U1 U2 Y(%) 9 0,015 7 26,05 10 0,015 7 25,14 11 0,015 7 26,23 Bảng 42. Các thí nghiệm ở tâm phương án của cơng đoạn khử khống bằng C6H5COOH N0 01uY 01Y 0 1 0 1 YY u − ( )20101 YY u − A 1 26,05 0,2433 0,0592 11 8067,25 3 3 1 0 1 = ∑ −u uY ( ) 6829,023 1 0 1 0 1 =−∑ −u u YY 2 25,14 - 0,6667 0,4444 3 26,23 0,4233 0,1792 Ta sẽ được phương sai tái hiện là: ( ) 3414.0 11 00 3 1 20 1 0 1 2 = − = − − = ∑ − N A N YY S u u th 30 =N : số thí nghiệm ở tâm phương án Kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy: Cấu trúc: 0: 0: ≠ = ja iO H H β β == bj j j S b t với 2922,0 2 == N S S thbj Trong đĩ bjs là độ lệch quân phương của hệ số thứ j Tính tốn ta cĩ: to= 96,907 t1= 6,2893 t2 =22,1881 Tra bảng phân vị phân bố Student với p= 0,05; f = 0N - 1 = 2 Suy ra : ( ) 3,4205.0 =t Như vậy các hệ số t1,12 đều cĩ ý nghĩa. Khi đĩ phương trình hồi quy cĩ dạng: 1Y = 26,3125 – 1,