Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ NHÃ VY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH HOẠT CHẤT ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CÂY TRỒNG CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG ĐÀ LẠT TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 LỜI CÁM ƠN Lời tri ân sâu sắc nhất xin gửi đến tới TS. Trần Thị Thanh – Người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. Xin chân thành cám ơn TS. Trần Thanh Thủy cùng toàn thể Thầy, Cô khoa Sinh trường Đại Học Sư Phạm Tp. HCM đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Lê Thị Châu cùng các cán bộ nghiên cứu tại phòng vi sinh Viện Sinh Học Tây Nguyên; ThS. Nguyễn Khoa Trưởng cùng toàn thể các Thầy, Cô khoa Sinh trường Đại Học Đà Lạt đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt thời gian làm đề tài. Cuối cùng, tôi xin được cám ơn những người thân, bạn bè, các chị cùng khóa, các em sinh viên trường Đại Học Đà Lạt đã sát cánh cùng tôi hoàn thành luận văn này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 08 năm 2009 Nguyễn Thị Nhã Vy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả của quá trình tự tìm tòi nghiên cứu của chính tôi, không sao chép bất cứ thành quả của công trình nghiên cứu nào và tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước các nội dung đã trình bày trong luận văn. MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa. Lời cám ơn. Lời cam đoan. Mục lục. Danh mục các chữ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục cách hình vẻ, đồ thị. MỞ ĐẦU Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi...............................................................................................................5 1.1.1 Đặc điểm cơ bản của nấm sợi ................................................................. .5 1.1.2 Phân loại nấm sợi.................................................................................. 14 1.1.3 Vai trò của nấm sợi ............................................................................... 17 1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi ................................................................................18 1.2.1 Lịch sử tìm ra chất kháng sinh ........................................................... 19 1.2.2 Ứng dụng của chất kháng sinh từ nấm sợi.......................................... 22 1.3 Thuốc trừ sâu Sinh học – giải pháp cho một ngành Nông nghiệp xanh, sạch, an toàn.................................................................................................................28 1.3.1 Đặc tính VSV kí sinh gây bệnh cho cây trồng................................... 28 1.3.2 Tình hình phá hoại cây trồng của sâu, bệnh. ..................................... 31 1.3.3 Một số nấm gây bệnh cho cây trồng................................................... 33 1.3.4 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu, bệnh hiện nay ................................ 37 1.3.5 Những chế phẩm VSV trong phòng trừ sâu, bệnh ............................. 39 1.3.6 Tình hình sản xuất rau, hoa tại Đà Lạt ............................................... 42 1.3.7 Tình hình bệnh hại cây Địa Lan (Cymbidium) ................................... 44 1.4 Vài nét giới thiệu về Đà Lạt. ..............................................................................52 1.4.1 Vị trí địa lý .......................................................................................... 52 1.4.2 Địa hình............................................................................................... 52 1.4.3 Tài nguyên rừng.................................................................................. 54 1.4.4 Khí hậu ............................................................................................... 56 Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu ............................................................................................................59 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 59 2.1.2 Hoá chất .............................................................................................. 60 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 60 2.1.4 Các môi trường đã sử dụng khi nghiên cứu........................................ 61 2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................63 2.2.1 Phương pháp VSV .............................................................................. 63 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi ............................................ 65 2.2.3 Các phương pháp hoá sinh ................................................................. 66 2.2.4 Thử hoạt tính đối kháng với các chủng nấm bệnh cho cây trồng....... 70 2.2.5 Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của hoạt chất đối kháng. ............ 71 2.2.6 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng......................................................................................... 72 2.2.7 Phương pháp xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản. ................... 72 2.2.8 Phương pháp định danh vi nấm bằng phương pháp giải trình tự ở công ty Nam Khoa. ............................................................................. 72 Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt ......... 76 3.2 Khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được ........................................................................................................... 77 3.3 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có họat tính đối kháng cao ................. 81 3.4 Khảo sát phổ đối kháng với VSV gây bệnh ............................................. 83 3.5 Các đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn............................................................................................................ 90 3.5.1 Đặc điểm hình thái, phân loại. .......................................................90 3.5.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm sợi nghiên cứu ........................................................................................................95 3.6 Bước đầu ứng dụng các chủng nấm sợi được tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymbidium) ....................................................... 110 3.6.1 Ứng dụng chủng Trichoderma atroviride trong phòng bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium)......................................................................110 3.6.2 Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ ở cây Địa Lan (Cymdibium)....................................................................................116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BTT : Bào tử trần CKS : Chất kháng sinh DNC : Dịch nuôi cấy ĐKKL : Đường kính khuẩn lạc KL : Khuẩn lạc KS : Kháng sinh HS : Hệ sợi MT : Môi trường NC : Nghiên cứu VK Gr+ : Vi khuẩn Gram dương VK Gr- : Vi khuẩn Gram âm VSV : Vi sinh vật VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định. TBT: Trung bình tháng TBN: Trung bình năm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20oC trong 7 ngày). Bảng 1.2: Diện tích gieo trồng rau và hoa cắt cành từ năm 1996-2005. Bảng 3.1 : Kết quả khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng ở các vị trí lấy mẫu. Bảng 3.2 : Kết quả thống kê hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. Bảng 3.3 : Những chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao. Bảng 3.4: Khảo sát khả năng đối kháng với VSV gây bệnh ở cây trồng của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.5: Đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi ĐTN3.8. Bảng 3.6: : Hoạt tính enzyme của các chủng sợi được tuyển chọn. Bảng 3.7: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Bảng 3.11: Độ bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô trong dịch lên men DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc sợi nấm Hình 1.2: Sự phát triển của hệ sợi nấm Hình 1.3: Nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh cho cây trồng. Hình 1.4: Cuống bào tử và bào tử của Pyricularia oryzae (Sharma, 1998). Hình 1.5: Cuống bào tử và bào tử của Curvularia lunata (Sharma, 1998). Hình 1.6 : Vùng rau hoa Vạn Thành, Cam Ly. Hình 1.7: Vườn Hoa Địa Lan Phường 7, Đà Lạt. Hình 1.8: Hình thái cây Địa Lan (Cymbidium) Hình 1.9 : Cảnh quan nơi lấy mẫu nghiên cứu Hình 2.1: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Đà Lạt – Lâm Đồng Hình 2.2: Phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). Hình 3.1: Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của chủng ĐTN4.19. Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của các chủng ĐTN3.7, ĐTN3.8, ĐTN3.9. Hình 3.3: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng hoạt chất đối kháng. Hình 3.4: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng cách cạnh tranh. Hình 3.5: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN3.8 Hình 3.6: Khuẩn lạc ĐTN4.19 sau 3 ngày nuôi cấy trên Czapek Dox. Hình 3.7: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN4.19 Hình 3.8: Hoạt tính enzyme cellulaza của chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8 Hình 3.9: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau Hình 3.10: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nghiên cứu. Hình 3.12: Đốt Trấu và Dớn làm giá thể trồng Địa Lan và bổ sung Trichoderma atroviride. Hình 3.13: Cây Địa Lan được trồng trên các loại giá thể khác nhau Hình 3.14: Rễ cây Địa Lan sau 3 tháng trồng trên các loại giá thể khác nhau. Hình 3.15: Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ cho cây Địa Lan DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau của hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng độ pH ban đầu lên hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.6: Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài. Ngành Nông nghiệp đang đối mặt với một đề cực kỳ nghiêm trọng là sự xuất hiện ngày càng nhiều loại sâu, bệnh nguy hiểm gây hại cho cây trồng. Chúng đã gây tổn thất lớn đến năng suất và sản lượng cây trồng. Để đối phó với sâu bệnh, nông dân sử dụng rộng rãi cũng như quá lạm dụng nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học và đây cũng chính là mối lo ngại lớn của con người. Bên cạnh đó, có rất nhiều chủng VSV gây bệnh lại lờn thuốc kháng sinh. Một trong những biện pháp hữu hiệu khắc phục tình trạng lờn thuốc của cái các VSV gây bệnh là tìm thêm các kháng sinh mới từ VSV trong thiên nhiên. Trong các nhóm VSV sinh kháng sinh, người ta quan tâm tìm hiểu nhiều nhất là các nhóm nấm sợi và xạ khuẩn. Hiện nay, Khí hậu Đà Lạt đang biến đổi một cách bất thường nhất trong lịch sử hình thành. Trước đây, nhiệt độ trung bình năm ở Đà Lạt là 18-20°C. Nhưng hiện nay, sự khắc nghiệt gia tăng với biên độ nhiệt dãn cách đột biến chưa từng thấy: chênh nhau giữa nhiệt độ cao nhất và thấp nhất bình quân từ 8-10 độ những năm trước lên 12-15 độ. Đà Lạt đã nóng lên 3-4°C so với trước kia; còn sương mù, bây giờ một năm, thỉnh thoảng mới có lại vài lần. Có thể nói sự thu hẹp nhanh hơn rừng nội ô ở thành phố Đà Lạt, việc xây dựng công trình ồ ạt, cộng với hiện tượng El Nino đang diễn ra là nguyên nhân dẫn đến bức tranh khí hậu tồi tệ ở Đà Lạt. Trước tình hình đó, các nhà chuyên môn đã đưa cảnh báo: sự biến đổi khí hậu theo chiều hướng tiêu cực trên chắc chắn sẽ làm sâu, bệnh phát sinh gay gắt trên cây trồng, vật nuôi ở vùng sản xuất rau, hoa cao cấp lớn nhất nước này. Theo quy luật đấu tranh sinh tồn: khi sâu, bệnh gia tăng thì sẽ xuất hiện các chủng sinh vật sinh các hoạt chất đối kháng chống lại các sâu, bệnh đó. Trên con đường tìm kiếm những giống VSV có khả năng kháng sâu, kháng bệnh mới có hoạt tính cao. Chúng tôi nhắm đến nấm sợi và tiến hành nghiên cứu những khả năng tuyệt vời của nó trong phòng trừ sâu, bệnh. Hi vọng trên vùng đất Đà Lạt – Lâm Đồng với đặc điểm khác 2 biệt về địa hình, thời tiết – khí hậu, chúng ta có thể tìm ra những chủng nấm sợi có những đặc tính ưu việt mới trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Theo thông tin mà chúng tôi thu thập được, hiện nay có rất ít các công trình nghiên cứu về khu hệ nấm sợi ở rừng Đà Lạt. Tài liệu duy nhất mà chúng tôi thu thập được đó là đề tài: Nghiên cứu khu hệ vi nấm gây bệnh và có lợi cho cây thông vùng Đà Lạt – Lâm Đồng năm 2004 do Viện Khoa học và công nghệ Miền Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới, Phân viện Sinh học tại Đà Lạt (Nay là Viện Sinh Học Tây Nguyên) thực hiện. Còn các đề tài về tìm hiểu khả năng sinh hoạt chất đối kháng của hệ nấm sợi rừng Đà Lạt chưa thấy có tài liệu nào được công bố. Xuất phát từ thực tế trên, việc tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối kháng VSV gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt” là việc làm rất cần thiết. 2. Mục đích đề tài Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối kháng có thể ức chế, tiêu diệt các VSV gây bệnh cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu đề tài: - Phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt. - Xác định khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được và tuyển chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao. - Thử khả năng ức chế các VSV gây bệnh ở cây trồng để tiến tới chọn ra những chủng nấm sợi tiêu biểu. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm sợi tiêu biểu đã được tuyển chọn và tiến tới định danh những chủng này. - Bước đầu ứng dụng những chủng nấm sợi được tuyển chọn vào mục đích phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymbidium) ở Đà Lạt. 3 4. Phạm vi nghiên cứu : - Vị trí lấy mẫu là Suối Vàng, Thái Phiên, Tà Nung (Rừng Tà Nung là rừng hổn giao rừng cây lá rộng thường xanh và rừng cây lá kim nên xem như là hai vị trí), Lang Biang. - Lấy mẫu 4 lần: mùa nắng, thời điểm giao mùa mưa nắng và mùa mưa. 5. Các phương pháp nghiên cứu: - Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi bằng phương pháp vi sinh. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản, phân loại các chủng nấm sợi bằng phương pháp hóa sinh, kỷ thuật di truyền. - Xử lý số liệu thu thập bằng phương pháp sử dụng toán học thống kê. 6. Đối tượng nghiên cứu: - Các chủng nấm sợi được phân lập từ các khu rừng tại Đà Lạt : Suối vàng, Thái phiên, Tà nung, Lang Biang . - VSV kiểm định : Escherichia coli Gram (-) và Bacillus subtilis Gram (+), Saccharosemyces cerevisier, nấm Aspergillus niger; Vi khuẩn Pseudomonas gladioli, Erwnia sp. nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Đà Lạt và các nấm gây bệnh ở cây trồng nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh Đại học Sư Phạm Tp. HCM. 7. Cấu trúc của luận văn Gồm: Mở đầu Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết Luận và Kiến nghị 4 8. Nơi thực hiện đề tài - Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Sư Phạm Tp. HCM. - Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Đà Lạt. - Phòng thí nghiệm Vi Sinh – Viện Sinh học Tây Nguyên. - Vườn Địa Lan 45 Bạch Đằng Phường 7 Đà Lạt. 5 Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm cơ bản của nấm sợi. Nấm học (Mycology) được khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm sợi lại là Elias Fries (1794-1874). Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm sợi có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả. Tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất. [45] 1.1.1.1 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm sợi 1.1.1.1.1 Hình dạng và kích thước Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast=nấm men), đa số có hình sợi (filamentous fungi=nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm (hypha) thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình 6 thái, kích thước, màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc… có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm. [45] Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extensionzone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [46]. Hình 1.1: Cấu trúc sợi nấm Hình 1.2: Sự phát triển của hệ sợi nấm 7 Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay mà sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn có các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường có màu nên khuẩn lạc thường có màu. [46] 1.1.1.1.2 Cấu tạo của nấm sợi Tế bào nấm sợi có thành phần cấu tạo cơ bản như các loài nấm lớn và ở các nhóm sinh vật có nhân thực khác, nghĩa là gồm thành tế bào, chất nguyên sinh, nhân tế bào, không bào và các thể ẩn nhập. Thành tế bào dày khoảng 0,2µm, nhưng có tính phản quang mạnh nên có thể phân biệt được rõ ràng ở kính hiển vi quang học. [4] Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose. Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitin syntase. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lổ thủng, trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân. Nhân của nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02µm, bên trong màng nhân chứa ARN và DNA. Trong tế bào nấm chứa mạng nội chất (endoplasmic reticulum), thể ribosomes (ribosome), không bào (vacuoles), bào nang (vesicle), thể Golgi (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitôxôm đường kính 40-70nm (chitosome)…ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid). Đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra trong tế bào chất 8 còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemnasome). [46] Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và ctv. (1978) đầu tiên ly trích được và gọi là neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi. Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. [45] 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hoá năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh. Chúng có khả năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng cacbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng cacbon dị dưỡng. Chúng có khả năng phân giải các xác hữu cơ hoặc sử dụng các hợp chất hữu cơ bên ngoài các cơ thể sống để làm chất dinh dưỡng. Cũng có những loài thuộc loại ký sinh, chúng sống trên cơ thể của sinh vật khác (người, động vật, thực vật…) và đem lại những ảnh hưởng xấu đối với các cơ thể này. Có những loài lại ký sinh trên cơ thể những loài nấm khác và được gọi là nấm ký sinh trên nấm. [4] Nấm sợi có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau. Để thực hiện các quá trình sinh lí khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon. Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hoá. Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất. Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hoá trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường… Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều loại sinh vật khác (hợp chất n-alcan, alkaloid, phenol, sterin, nhiều chất kháng sinh, nhiều độc tố). [4], [13] 9 Các loài nấm sợi thường không có những đòi hỏi nghiêm khắc đối với một loại thức ăn cacbon nào. Chúng thường có khả năng sử dụng nhiều loại cacbon khác nhau, tuy nhiên có thể là loại hợp chất cacbon này được đồng hoá tốt hơn loại hợp chất khác. Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn Cacbon khác nhau chúng sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Có thể lấy nghiên cứu của Horr ở bảng 1.1 làm ví dụ: Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20oC trong 7 ngày). Loại đường Nồng độ (g/l) Trọng lượng khô của hệ sợi nấm Galactose Glucose Galactose + Glucose 10 18 20 2 10 18+2 10+10 45,1 42,4 44,3 145,6 411,0 577,0 1151,6 Khi phát triển trên các môi trường có nguồn thức ăn cacbon thích hợp người ta nhận thấy thời kỳ tiền phát (lag phase) thường rút lại rất ngắn và hệ sợi nấm rất nhanh chóng được tích lũy trong môi trường nuôi cấy. Các loài nấm sợi khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn thức ăn nitơ. Nấm sợi thường có khả năng sử dụng cả nguồn Nitơ hữu cơ lần các nguồn Nitơ vô cơ. Nhiều loài nấm sợi có khả năng đồng hoá cả muốn amon lẫn nitrat. Có những loài thích hợp sử dụng muốn amon hơn nitrat nhưng ngược lại cũng có những loài thích hợp sử dụng nitrat hơn muốn amon. Đôi khi có những loài vi nấm không phát triển trên các môi trường chứa nguồn Nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Ngược lại với muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý, sau khi nấm sợi đồng hoá gốc NO3- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation Na+, K+… và do đó làm tăng độ pH của môi trường. 10 Nhiều tác giả nhận thấy khả năng đồng hoá amon sunfat của nấm sợi sẽ được tăng cường rõ rệt khi bổ sung thêm vào môi trường một số ít acid hữu cơ như acid lactic, acid malic. Ngoài các nguồn Nitơ vô cơ, nấm sợi còn có thể sử dụng tốt nhiều nguồn Nitơ hữu cơ như protein, pepton, peptide, acid amin…[4] Một số loài như Aspergillus flavus, Tricoderma lignorum, Myrothecium verrucaria… có khả năng đồng đó trực tiếp Nitơ phân tử [13] Bằng các phương pháp phân tích quang phổ người ta đã xác định được tất cả các chất khoáng có chứa trong tế bào vi nấm. Một số các nguyên tố khoáng có những chức năng sinh lý và chức năng cấu trúc đã được biết rõ, nhưng nhiều nguyên tố khoáng khác cho đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ về vai trò sinh lý của chúng. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium... sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào. [45] Các nguyên tố đa lượng có thể kể đến như S, P, K, Ca, Mg. Chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô của sợi nấm. Các nguyên tố vi lượng mà vi nấm cần có thể kể đến là Mn, Mo, Zn, Cu,Co, Ni, B…Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi. Các loại nấm sợi có quan hệ rất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm sợi có thể thay đổi tuỳ theo điều kiện nuôi cấy, tuỳ theo tuổi giống. Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hoá của tế bào. Liên quan đến 11 lượng nước còn có độ ẩm. Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60%). Khả năng hấp thụ hay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ môi trường, khoảng 15-30oC, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25-30oC, tuỳ loài. Hầu hết các loài nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950). Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, tối hảo từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC. Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH=6 nhưng pH tối hảo là 5-6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967). Môi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu. [13][45]. Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm sợi vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm sợi có thể phát triển liên tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng. Nấm sợi không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định. [45] 1.1.1.3 Sinh sản của nấm sợi Nói chung, nấm sợi sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính. Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. 12 1.1.1.3.1 Sinh sản vô tính The Alexopoulos và Mims (1979), nấm sợi sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau: a. Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): các bào tử động (zoospores) có ở nấm Saprolegnia và bào tử túi (sporangiopores) ở nấm Mucor, Rhizopus chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và túi bào tử (sporangium) được mang bởi cuống túi bào tử (sporangiophores). b. Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Penicillium,... Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm. Cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thẻ phân nhánh như ở Penicillium. Bào tử đính hình thành từ những cụm (cluster) trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma. Ở giống Microsporum và Fusarium, có hai loại bào tử đính: loại nhỏ, đồng nhất gọi là tiểu bào tử đính (microconidia), loại lớn, đa dạng gọi là đại bào tử đính (macroconidia). c. Bào tử tản (Thallospores): trong nhiều loài nấm men và nấm sợi có hình thức sinh sản đặc biệt gọi là bào tử tản. Bào tử tản có thể có những loại sau: - Chồi hình thành từ tế bào nấm men: Cryptococcus và Candida là những loại bào tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi (blastospores) 13 - Giống Ustilago có những sợi nấm có xuất hiện tế bào có vách dầy gọi là bào tử vách dầy còn gọi là bào tử áo (chlamydospores). Vị trí của bào tử vách dầy ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài. - Giống Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chử nhật và tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores). 1.1.1.3.2 Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: - Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử. - Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid). - Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội). Theo Machlis (1966) tất cả các giai đoạn trên kể cả giai đoạn tạo cơ quan sinh dục được điều khiển bởi một số kích thích tố sinh dục (sexual hormones). Cơ quan sinh dục của nấm sợi có tên là túi giao tử (gametangia) có 2 loại: cơ quan sinh dục đực gọi là túi đực (antheridium) chứa các giao tử đực (antherozoids), còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn (oogonium) chứa giao tử cái hay noãn, khi có sự kết hợp giữa giao tử đực và noãn sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là bào tử động (zoospores). Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes. 14 Bào tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang (ascus) và túi này chứa những bào tử gọi là bào tử nang (ascospores). Nang và bào tử nang là đặc trưng của nhóm Ascomycetes. Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng của cấu trúc thể quả gọi là đãm (basidium) và bào tử được gọi là bào tử đãm (basidiospores) Nhóm Nấm bất toàn (Deuteromycetes=Deuteromycotina)) gồm những nấm cho đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng. [45] 1.1.2 Phân loại nấm sợi Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá và phương thức sinh sản. Tuy nhiên, ngày nay, phương pháp định danh bằng sinh học phân tử đang phát triển nhanh chóng, cung cấp nhiều thông tin cho định danh và định typ VSV, chính xác và hiệu quả. 1.1.2.1 Phương pháp sinh hóa Nhà nấm học Italia P.A. Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G.C. Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2, 3, 4A, 4B. New Yord and London: Academic Press, 1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn từ điển về nấm (Dictionary of the Fungi) của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum): - Ngành Chytridiomycota - Ngành Zygomycota - Ngành Ascomycota - Ngành Basidiomycota 15 Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn – Fungi imperfecti. Theo hệ thống phân loại của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp - Lớp Deuteromycetes. Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên loài và xếp sang một lớp khác. Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành loài Gibberella fujikuroi. Các nấm bất toàn hiện được xếp trong các nhóm conidial Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes. Nấm bất toàn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J. Carlile at al, 2001). Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm. [46 ] Khoá phân loại đến lớp (Robert A.Samson,1984):[48] NẤM TÚI (ASCOMYCETES) Bào tử sinh ra trong túi bào tử NẤM TIẾP HỢP (ZYGOMYCETES) Bào tử hoặc bào tử trần không sinh ra trong túi bào tử. Hệ sợi không có hoặc có rất ít vách ngăn, thường rộng, bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử kín NẤM BẤT TOÀN (DEUTEROMYCETES) Sợi nấm thường có vách ngăn, bào tử trần không sinh ra trong các nang bào tử kín. - Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: - Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). - Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. - Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. 16 1.1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử được gọi là phương pháp giải trình tự dựa trên phương pháp PCR (Polymerase Chain Reation – phản ứng tổng hợp di chuyền nhờ polymerase). Ngày nay, Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng. Phương pháp này có tính chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ VSV. Phương pháp giải trình tự DNA là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Phương pháp giải trình tự DNA theo nguyên tắc tạo ra các mảnh DNA để đánh dấu tại đầu 5’ hoặt 3’. Các mảnh có các base đánh dấu được tách ra trên gel polyacrylamid. Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh DNA sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp : Phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzyme kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzyme được dùng phổ biến hơn cả. Phương pháp enzyme kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger : Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân DNA từ sợi khuôn khi có đoạn DNA mồi với xúc tác của Klenow hay T7-DNA polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của DNA được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi DNA đơn tạo ra bằng cách tách dòng DNA vào vectơ 17 thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi DNA đã được Chen, Walliam (1986) mô tả khi tách dòng DNA vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự DNA cho nghiên cứu phân loại và xác định typ VSV thay cho phương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chổ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chổ các đoạn DNA cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự DNA. Tuy nhiên cho đến nay người ta cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Có hai phương pháp : Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). [81] 1.1.3 Vai trò của nấm sợi Một số loài nấm sợi rất hữu ích trong sản xuất và đời sống (Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin...), nấm Aspergillus niger tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua đó có thể dùng làm thiên địch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút được nhiều hơn lượng phân vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng. Nấm còn là đối tượng nghiên cứu về di truyền học như nấm Neurospora crassa, nấm Physarum polycephalum dùng để tổng hợp DNA và những nghiên cứu khác. 18 Bên cạnh đó, Nấm sợi có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trong chế biến, bảo quản. Nấm sợi còn gây hư hại vật dụng, quần áo... hay gây bệnh cho người, động vật khác và cây trồng. Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người, Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... đặc biệt nấm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi sinh ra độc tố aflatoxin. Ngoài ra, các qui trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của VSV trong đó có nấm sợi. Nấm sợi cũng giúp tổng hợp acid hữu cơ (acid oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược ... đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, nấm sợi còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ màu mỡ cho đất trồng. Đặc biệt, Nấm sợi có khả năng tổng hợp rất nhiều loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin…) [45]. 1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi Kháng sinh (antibiotics, chemotherapeutics) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu, bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh học ở tầm phân tử (nồng độ thấp: nồng độ sử dụng để điều trị nhỏ hơn nhiều lần so với liều độc đối với cơ thể người; đặc hiệu: mỗi kháng sinh chỉ có tác dụng trên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn). Kháng sinh, thoạt đầu là do các tế bào tiết ra nên chúng được coi là yếu tố sinh học ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Đến nay kháng sinh còn là những dẫn xuất thu được sau những biến đổi hoá học (gọi là kháng sinh bán tổng hợp) hay bằng đường sinh tổng hợp trong phòng thí nghiệm (ví dụ sulfamid). Vì vậy, định 19 nghĩa về chất kháng sinh đã được mở rộng, không phải duy nhất chỉ do VSV sinh ra. [2] 1.2.1 Lịch sử tìm ra chất kháng sinh Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với loài người và các sinh vật khác. Do vậy, việc tìm kiếm chữa bệnh cho con người, vật nuôi, cây trồng từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nói riêng và của cả nhân loại nói chung. Từ đó đã có nhiều chất kháng sinh phát hiện từ nấm sợi như : Penicillin: Năm 1928, ở bệnh viện Saint Marie, chất kháng sinh được phát hiện tình cờ. Trong khi làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiếm nấm sợi Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ông cấy nấm sợi trên thử nghiệm lại trên một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra. Từ đó, ông kết luận là nấm sợi đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929). Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trong đó có các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên. Mãi đến 1945, ông mới nhận được giải Nobel. [2], [27] Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium vào sản xuất thử. Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng penicillin đủ để thử nghiệm trên chuột thí nghiệm và kết quả điều trị đã thành công mỹ mãn ngày 25/05/1940 và mở ra kỷ nguyên dùng kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm trùng. [2] [27] 20 Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của penicillin. Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng sinh kháng tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó. Năm 1946-1950, hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillium, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin sử dụng trong chữa bệnh. [20] Tiếp theo Penicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện. Streptomicin : Năm 1944, Waksman và Schatz phân lập được chủng Streptomyces grieus (sau này đổi tên là Streptomyces streptomixin) có khả năng sinh tổng hợp Streptomicin và cho đến nay nó mang nhiều tên khác nhau như: Streptomicin, Strepocvin, Strizolin. Loại kháng sinh nay có thể tiêu diệt nhiều VSV khác nhau (cả Gr+ và Gr-) [20] Tetraxyclin : Đây là nhóm kháng sinh có chung một phân nhóm –N(CH3)2, nhóm CONH2, nhóm phenohydroxyl và hai hệ thống nối đôi liên hợp chứ etol và enol. Nhóm tetraxyclin có nhiều loại. Các loại tetraxyclin được ứng dụng nhiều trong chữa bệnh cho người và gia súc bao gồm: Tetraxyclin, Clotetraxyclin, Oxytetraxyclin, Demetyltetraxyclin. Sản phẩm Tetraxyclin hiện nay có bán trên thị trường được sản xuất bằng phương pháp sinh học và phương pháp hoá học từ Clotetraxyclin. Kháng sinh Tetraxyclin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gr- tốt hơn vi khuẩn Gr+. Trong sản xuất kháng sinh này, người ta thường sử dụng Streptomyces aureofaciens và Str. Rimosus. [20] Cephalosporin : Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm sợi thuộc giống Cephalosporium sp. có khả năng chống được cả VK Gr+ và VK Gr- đặc biệt là Vibriocholerac. Ngày nay, người ta phát hiện nhiều loại nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có khả năng tổng hợp cephalosporin. Tuy nhiên, hoạt tính của Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin. 21 Griseofulvin : Năm 1959, Oxford và đồng sự phát hiện do chiết được từ một số loài nấm sợi thuộc giống Penicillium (Pen. Urticae, Pen. Nigricans, Pen. Raistrichi..). Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc. Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòng penicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp. Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo. Kháng sinh được chiết suất từ nấm sợi như Citrinin (P.citrinum), Fumagilin (A. fumigatus), Nudulin (A. nidulans), Humicolin (A. humicola), Viridin (T.viride)… Có nhiều công trình nghiên cứu về Trichoderma, đã xác định nó có khả năng chữa bệnh. Trong đó chú ý nhất là loài Trichoderma viride, phân tán khắp nơi trong đất. Glytoxin là chất kháng sinh từ giống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài lòai Penicillium. Glytoxin không bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng. Phổ kháng sinh của nó chống các vi khuẩn Gr+ và các nấm gây bệnh. Trong kết quả thực nghiệm glytoxin không thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao của chuột, không ngăn cản sự phát triển của u ác tính. Hoạt tính kháng sinh của glytoxin liên quan tới sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều nhà khoa học khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu to lớn lao. Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS trong thời gian ngắn. Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như DNA tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen và biểu thị sự tổng hợp ở VK E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong việc phát triển chủng, giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển 22 vọng trong sản xuất các chất kháng sinh. Kỹ thuật enzyme bất động được coi là một trong những phương hướng nghiên cứu, sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21. Ngày nay, tuy đã có hàng ngàn CKS mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới vẫn đang chạy đưa trong việc tìm tòi và tổng hợp CKS mới, đặt biệt là CKS chống virus và chống ung thư. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất CKS bắt đầu từ năm 1949 do Giáo sư Bác sĩ Đặng Văn Ngữ tiến hành với chủng Penicillium và thu được dịch lọc penicilin (sử dụng trong điều trị vết thương cho các bệnh binh). Sau kháng chiến 9 năm, công trình được tiếp tục nghiên cứu ở ĐH Y Dược Hà Nội. Cho đến nay nghiên cứu CKS đã được quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành. Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng những nghiên cứu về CKS của chúng ta vẫn còn hạn chế so với thế giới. [27 ] 1.2.2 Ứng dụng của chất kháng sinh từ nấm sợi. 1.2.2.1 Ứng dụng kháng sinh từ nấm sợi trong điều trị bệnh nhiễm trùng và hiện tượng lờn thuốc của VSV gây bệnh. VSV là căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng. Bệnh nhiễm trùng đã xuất hiện cùng với loài người từ xa xưa và thực sự loài người đã biết về nó một cách khoa học hơn một thế kỷ. Thế nhưng, hiện nay, bệnh nhiễm trùng vẫn còn là vấn đề lớn trong bệnh tật của thế giới. Các bệnh nhiễm khuẩn, nhờ có thuốc kháng sinh và vacxin được khống chế ở các nước phát triển. Nhưng ở các nước đang phát triển thì nhiễm khuẩn vẫn là vấn đề rất nặng nề. Bên cạnh những bệnh nhiễm khuẩn cũ thì gần đây còn nổi lên một số bệnh nhiễm khuẩn mới như do E.coli gây tiêu chảy, xuất huyết tiêu hoá và tiết niệu (do nhóm EHEC), hoặc gây viêm loét dạ dày do Helicobacter pylori. Vi khuẩn này còn là căn nguyên gây ung thư dạ dày. Một số nước Nam Á còn xuất hiện một týp vi khuẩn tả mới là V.cholerae O139 khác với týp V.cholerae O1 vẫn gây dịch ở 23 nhiều nước trên thế giới. Riêng HIV/AIDS đang gây đại dịch toàn cầu và là vấn đề nổi cộm của toàn thế giới. Gần đây nhiều nước (trong đó có Việt Nam) xuất hiện một loại dịch bệnh viêm phổi cực kỳ nguy hiểm (SARS), do một loại virus mới giống như Coronaviridae và gọi là virus SARS-COV. Tuy chưa lây lan ra toàn cầu và số người nhiễm khoảng 8000 người, nhưng tỷ lệ tử vong khá cao (gần 10%). [2] Dịch cúm A/H1N1 bùng phát ở Mê-xi-cô hồi tháng 4/2009, sau đó lan tràn rộng khắp ở nhiều quốc gia trên trên thế giới gây nên mối đe doạ cho hàng triệu người. Ngày 11/06/2009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tuyên bố đại dịch cúm trên quy mô toàn cầu trong vòng 40 năm qua. Khác với các virus cúm theo mùa thông thường, H1N1 có khả năng tấn công sâu vào các tế bào phổi, nơi nó gây ra chứng viêm phổi và thậm chí dẫn tới tử vong trong trường hợp nghiêm trọng. Trái lại, virus cúm theo mùa thường chỉ tấn công các tế bào thuộc phần trên của hệ hô hấp. [50] [51] [52] Từ khi Penicillin được sản xuất đề đưa vào điều trị, sự phát triển của kỹ thuật công nghệ kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát và khống chế các bệnh nhiễm khuẩn. Việc sản xuất CKS, sử dụng CKS trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời. Song song với hiện tượng này, con người biết đến hiện tượng lờn thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng. Nhờ dày công nghiên cứu, trước sự tấn công của vi trùng, các nhà bác học đã tìm ra ngày càng nhiều kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại vi trùng lờn thuốc. Tuy nhiên, một kháng sinh mới được sử dụng thì trong một thời gian ngắn lại có một số vi trùng coi thường. Cephalosporidines thế hệ thứ 3, thứ 4, Aminoglycosides, Quinolones các thế hệ mới đều đã bị lờn từ 25% đến 50%. Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các VSV gây bệnh. Một trong số các biện pháp hữu hiệu nhất là tìm các kháng sinh 24 mới từ các loài VSV trong thiên nhiên. Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhóm VSV đầu tiên sinh ra CKS – đó là nấm sợi nói riêng và nấm nói chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc. [27] 1.2.2.2 Sử dụng kháng sinh của nấm sợi trong phòng chống nấm bệnh hại cây trồng. Giữa các loài VSV với nhau, thường xảy ra hiện tượng đối kháng. Sở dĩ như vậy là vì VSV tiết ra CKS trong quá trình hoạt động sống, có nghĩa là CKS đó chỉ có ảnh hưởng đến một số loài VSV nhất định. VSV đối kháng và CKS do chúng tiết ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác phòng chống bệnh cho cây.[38] Trong thời gian gần đây, nhiều CKS còn được sử dụng có hiệu quả trong đấu tranh sinh học. Trong bảo vệ thực vật, người ta tăng cường phương pháp bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học. Trong số các “biện pháp đấu tranh sinh học” trong bảo vệ thực vật theo Cook và Baker (1953) là sử dụng một hay nhiều VSV để kiềm chế bệnh thực vật. CKS và dịch lên men các chủng sinh kháng sinh được dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Nhìn chung, so với y học, việc sử dụng kháng sinh trong bảo vệ thực vật còn mới mẻ. Tuy nhiên, nhờ những thành tựu của khoa học sinh học hiện đại và xu hướng phát triển tất yếu trong công nghệ sản xuất kháng sinh hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của kháng sinh trong nền nông nghiệp hiện đại. Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nông nghiệp có hiệu quả cao như strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus. [27] Trong thực tế sản xuất ở nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại vi sinh đối kháng để tiêu diệt những VSV gây bệnh cho cây. Những VSV đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng. [38] Từ năm 1935, một số nhà khoa học Liên Xô (cũ) đã dùng một số loài vi khuẩn, Pseudomonas bón vào đất đế chống nấm Selerotia và Botrytis bảo vệ nhiều loại cây trồng khác nhau. 25 Hoạt động đối kháng của nấm Trichoderma cũng đã được biết từ lâu. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp. Nếu bón vào trong đất ẩm với một lượng lớn nấm này, chúng sẽ đàn áp sự phát triển nấm gây bệnh chết lụi ở cây trồng. [38 ] Người ta sử dụng CKS để kiểm soát dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng. CKS có tác dụng nhanh, dễ phân hủy lại có tác dụng chọn lọc cao. Dịch lên men của một số VSV sinh CKS không chỉ chống bệnh cho cây mà còn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt mầm bệnh, có thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng VSV có ích cho vùng rễ. Nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại VSV đối kháng để tiêu diệt các loại VSV gây bệnh cho cây. Những VSV đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng. Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp ở các nước châu Âu, Liên xô… Công trình nghiên cứu của Wells và cộng sự (1972) đã thông báo ở điều kiện ngoài đồng ruộng Tri.harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii. Backman, Redriguer – Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Tri. herzianum ngăn chặn bệnh do nấm Scherotium rolfsii, Pythium sp. bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc, thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng. Các VSV đối kháng không chỉ ức chế các VSV gây bệnh ở vùng rễ mà những CKS do chúng tiết ra (Trichoderma, Giltoxin) có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Vì vậy, một số chủng nấm Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hoàn toàn có thể sử dụng trong đấu tranh sinh học. Các chủng nấm sợi như Trichoderma spp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp nguồn phân bón an 26 toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. [27],[38]. Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Những loài phổ biến là T. hamatum, T.harzianum. Các nấm Tricoderma có thể kìm hãm nấm gây bệnh cây thông qua các cơ chế tiết kháng sinh, men đặc trưng và có thể ký sinh trên các nấm gây bệnh cây. Hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây được gọi là hiện tượng “giao thoa sợi nấm”. Trước tiên sợi nấm của Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh, cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm gây bệnh làm thủng màng ngoài của nấm gây bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm gây bệnh cây (minh họa bằng hình 1.3). Nấm Trichoderma thắt chặt sợi nấm gây bệnh Pythium. Nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh Pythium Pythium Trichoderma 27 Sợi nấm Trichoderma harzianum quấn quanh, siết chặt sợi nấm gây bệnh Rhizoctonia solani. Hình 1.3: Nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh cho cây trồng. [79] Đây là một số nấm đối kháng thường gặp: Các nấm Penicillium oxalicum, P. frequentans, P. vermiculatum. P. nigricans, P.chrysogetum là những loài đối kháng của nấm Pythium spp., Rhioctonia solani, Sclerotium cepivorum, Verticillium alboatrum (martin et al., 1985). Cơ chế tác động của nấm Penicillium chưa được biết rõ ràng. Nấm Aspergillus niger đối kháng với các nấm Fusarium solani, Rhizoctonia solania, Alternaria alternata. Nấm Aureobasidium pollulans và Sporobolomyces roseus đối kháng với nấm Septoria nodorum. Nấm Cercospora kikuchii đối kháng với nấm Diaporthe phaseolorum var. sojae. [34] Các kết quả nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu của Đồng bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt đới đã cho thấy vai trò của nấm sợi đối với cây trồng. Như nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Fusarium solani (gây bệnh thối rễ). Hoặc để phòng trừ bệnh thối gốc chảy mũ trên cây bưởi (do nấm Phythophthora sp gây ra) thì dùng một kg chế phẩm nấm Trichoderma harzianum trộn đều với 40kg phân chuồng rồi rải xung quanh cây từ 3-5kg tùy theo cây lớn nhỏ. Dùng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp hay trộn nấm sợi 28 với phân chuồng hoai mục trước khi bón ruộng 5-10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [23], [27]. Hiện nay, các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại. Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virus đã gây tổn thất lớn cho cây trồng. Việc dùng thuốc hóa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng. Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học cũng gây hậu quả nặng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng. Nhiều hóa chất còn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng. [4]. Việc sử dụng nấm sợi có khả năng sinh KS để bảo vệ cây trồng là biện pháp an tòan và hiệu quả, làm tăng năng suất cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản [27]. 1.3 Thuốc trừ sâu Sinh học – giải pháp cho một ngành Nông nghiệp xanh, sạch, an toàn 1.3.1 Đặc tính VSV kí sinh gây bệnh cho cây trồng [23] Cây thường bị nhiễm bệnh sau một quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của một loại kí sinh trùng hay do sự tác động một thời gian tương đối dài của một yếu tố môi trường. Bệnh do môi trường hay còn gọi là bệnh không truyễn nhiễm, bệnh sinh lý. Bệnh truyền nhiễm là nhóm bệnh kí sinh trùng gây ra. Đó là những bệnh do VSV hay do những động vật bậc thấp gây hại. Ví dụ: bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, Phytoplasma, Viroide, tuyến trùng, Protozoa, thực vật thượng đẳng ký sinh gây ra. 1.3.1.1 Sự tác động của VSV gây bệnh vào cây trồng. VSV gây bệnh khi tấn công vào cây thường gây ra những hiện tượng sau: - Sử dụng vật chất dinh dưỡng của cây để nuôi sống cơ thể chúng. - Phá hủy quá trình vận chuyển và tích lũy chất dinh dưỡng ở cây làm hỏng bó mạch, hủy hoại bộ rễ cây. 29 - Trong khi kí sinh trên mô bệnh, chúng thường sinh ra các hoạt chất sinh học, thực chất là chất độc và men đầu độc, phân giải tế bào cây và làm rối loạn, phá vỡ quá trình trao đổi chất ở cây. Như vậy, VSV gây bệnh là những sinh vật dị dưỡng bằng cách lấy dinh dưỡng của cây kí chủ để sống, phát triển và sinh sản. Cây kí chủ là cây mà ở đó kí sinh sống, phát triển và là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho kí sinh. Vì vậy, thực chất mối quan hệ kí sinh là sự thiết lập quan hệ kí sinh và kí chủ. Mối quan hệ này sẽ xảy ra khi kí sinh xâm nhập và gây bệnh được trên cây kí chủ - kí sinh thắng được mọi sự đề kháng của kí chủ để thiết lập mối quan hệ kí sinh. Kết thúc của mối quan hệ này là cây bệnh bị nhiễm bệnh. 1.3.1.2 Phân chia tính kí sinh Tùy theo tính chất và phương thức kí sinh mà chia các VSV kí sinh thành các nhóm: - Nhóm VSV kí sinh chuyên tính (kí sinh bắt buộc): là nhóm kí sinh chỉ có khả năng sử dụng các vật chất hữu cơ sẵn có trong mô cây sống và đang phát triển. Chúng không sử dụng hay không phát triển trên các mô cây đã chết (tàn dư cây trồng). Ví dụ: Các loài nấm sương mai, gỉ sắt, nấm phấn trắng hại cây, trong nhóm kí sinh chuyên tính có thể kể đến các virus, phytoplasma, viroide, nhưng có quan niệm cho rằng 3 kí sinh vật này có mức độ kí sinh cao hơn có thể gọi là kí sinh tuyệt đối ở mức độ tế bào, khi tế bào đang phát triển mạnh, khi tế bào chết thì chúng mới bị tiêu diệt. - Nhóm VSV bán kí sinh (hoại sinh tự do có điều kiện): là các kí sinh vật chủ yếu sống trên các mô cây đang sống (thường ở bộ phận lá bánh tẻ, lá già), sinh trưởng và sinh sản bằng cách nhân vô tính (nấm) nhưng trong điều kiện nhất định nào đó trong quá trình phát triển các thể (hữu tính) hoặc khi không có cây kí chủ trên đồng ruộng thì vẫn có khả năng sống và tồn tại trên 30 tàn dư cây trồng, trên các mô cắt rời hoặc một số bộ phận cây đã chết hẳn. Các loại nấm lúa von, tiêm lửa thuộc lớp nấm túi và nhiều loài nấm khác là những loài thuộc nhóm bán kí sinh điển hình. - Nhóm VSV bán hoại sinh (kí sinh tự do có điều kiện): nhóm này gồm các VSV gây bệnh trên các phần của cây đã già, suy yếu như trên lá già, gốc thân, củ hay cây con suy yếu, chúng có thể tồn tại trên các mô đã chết, trên tàn dư cây trồng trong đất, trên hạt, quả, củ,v.v… Điển hình của nhóm này có thể kể đến một số loài nấm sợi như Aspergillus niger gây bệnh héo rũ gốc mốc đen ở cây lạc, hay nấm gây bệnh trên bắp cải Botrytris cinerea và nhiều loài nấm sợi khác. Các loài nấm này còn có khả năng gây hại cả trong bảo quản nông sản ở các kho thô sơ trong nhiệt độ bình thường. - Nhóm VSV hoại sinh: nhóm này gồm các VSV chỉ sống trên các vật chất hữu cơ cây đã chết, trên tàn dư cây trồng, trong đất và nước,… Nhóm VSV này không có khả năng sống kí sinh trên các cây đang sống, kể cả các mô cây đã suy yếu. Nhóm sinh vật hoại sinh này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ giải phóng CO2 bổ sung vào bầu khí quyển của trái đất. Chúng giúp phân hủy chất hữu cơ và tạo mùn cho đất, trong số đó có rất nhiều loài VSV đối kháng sống ở đất đã được sử dụng để thực hiện biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Trước đây, nhóm này được coi như hoàn toàn không gây hại cho cây trồng, nhưng ngày nay một số vi khuẩn và nấm hoại sinh cũng có thể phá hại trong khi như nấm sợi Mucor, Penicillium và một số loài vi khuẩn. Sự phân chia bốn mức độ của 4 nhóm VSV kí sinh chỉ mang tính tương đối, khi điều kiện sinh thái môi trường thay đổi có thể một VSV ở nhóm này sẽ mang đặc tính của một nhóm khác và sự phân chia 4 nhóm trên chỉ là 4 nhóm chủ yếu mà thôi. 31 1.3.1.3 Khả năng gây bệnh của VSV gây bệnh cây VSV gây bệnh có khả năng gây bệnh hay không phụ thuộc vào khả năng gây bệnh của kí sinh, khả năng này được xác định bằng tính xâm lược, tính gây bệnh và tính độc. - Tính xâm lược: là khả năng VSV xâm nhập vào bên trong của cây, vượt qua sự phản ứng tự vệ của cây để thực hiện bước đầu của quá trình thiết lập mối quan hệ kí sinh. - Tính gây bệnh : là khả năng của VSV sau khi xâm nhập gây ra những tác động bên trong cây để thực sự thiết lập mối quan hệ kí sinh, biểu hiện rõ rệt của tính gây bệnh là triệu chứng bệnh đặc trưng của cây kí chủ sau khi bị nhiễm bệnh. - Tính độc (Virulence): là khái niệm bao quát cả hai khái niệm về tính xâm lược và tính gây bệnh, biểu hiện ở mức độ lây nhiễm nặng hay nhẹ, mức độ gây hại nặng hay nhẹ. Tính độc có nhiều biến động phân hóa tùy theo đặc điểm di truyền của các giống khác nhau thuộc loại cây nhiễm bệnh. Hiện tượng này có thể giải thích khi một giống cây bị một chủng độc của một kí sinh nào đó gây hại rất nặng trong khi một giống khác cùng loài hầu như không bị chủng này gây hại. Bình thường, nếu tính xâm lược, tính gây bệnh cao thì cũng có tính độc cao, nhưng trong một số trường hợp không hoàn tòan như vậy. Sự khác nhau về tính độc luôn thể hiện theo chủng sinh lý và nòi sinh học khác nhau của VSV gây bệnh. 1.3.2 Tình hình phá hoại cây trồng của sâu, bệnh. Từ cuối thế kỷ 20 đến nay, nông nghiệp thế giới đã đạt được những thành tựu to lớn, sản lượng và năng suất cây trồng không ngừng ổn định và ngày một nâng cao. Tuy vậy, do những tác động của sự thay đổi khí hậu, sự biến động của dịch hại đã dẫn đến những thiệt hại đáng kể về năng suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều vùng trên thế giới. 32 Hàng năm trên thế giới cũng như ở nước ta bệnh cây đã làm thiệt hại rất lớn đến nền nông nghiệp, khoảng 537 tấn nông sản. Các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, loét cam, bạc lá úa, héo xanh cà chua. Các bệnh do nấm gây ra như bệnh thối cổ rễ ở cây bông và cỏ đinh lăng, bệnh đạo ôn ở lúa, bệnh khô vằn hại lúa…trong đó có 13/45 bệnh hại lúa do nấm gây ra, có 26/34 bệnh ở ngô do nấm gây ra [27]. Theo tài liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO), thiệt hại về bệnh cây trong những năm 90 thế kỷ 20 ước tính 11,6%. Trong đó, bệnh hại do nấm có tới hàng chục ngàn loài, hơn 1000 loài virus, 600 loài vi khuẩn,…tuyến trùng và rất nhiều bệnh hại khác do viroide và phytoplasma, protozoa gây ra. Trên thế giới, trong lịch sử đã có rất nhiều trận dịch bệnh lớn được ghi nhận như trận dịch do mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra ở Aixơlen vào năm 1845-1847 làm 1 triệu người chết và hơn 2 triệu người phai di cư đi nơi khác. Trận dịch bệnh rỉ sắt cà phê ở Sơrilanca đã gây thiệt hại hơn 150 triệu frăng Pháp gây mất mùa đói kém. Những trận dịch do bệnh Greening và Tristeza gây ra hiện tượng tàn lụi cây cam ở nhiều vùng thuộc Bắc Phi, Trung Mỹ và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, bệnh hại thực vật đã gây nên nhiều trận dịch nghiêm trọng gây thiệt hại rất lớn cho sản xuất: năm 1955-1956 bệnh đạo ôn đã hại trên 2000 ngàn mẫu Bắc bộ tại Hà Đông (cũ). Bệnh lúa non đã phá hại đến hàng trăm mẫu Bắc bộ ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng. Bệnh lúa vàng lụi xuất hiện từ 1910 ở Yên Châu, Tây Bắc tới những năm 40, 50; bệnh xuất hiện cả ở đồng bằng Bắc bộ nhưng tập trùng phá hoại nặng nhất từ năm 1963–1965 trên diện tích rộng hàng trăm ngàn ha ở đồng bằng Bắc bộ. Chỉ tính riêng các tỉnh Thanh Hoá, Thái Bình, Nam Định, Hà Đông và Hà Nam trong năm 1964 đã có 57.500 ha lúa bị bệnh vàng lụi tàn phá hoàn toàn và hàng trăm ngàn ha bị nhiễm bệnh. Bệnh đạo ôn phá hại thường xuyên ở vùng đồng bằng Bắc bộ, Bắc và Nam trung bộ, miền Nam. Từ năm 1981 đến năm 1986 đã thường xuyên phá hại trên 33 10000 ha, có lúc tới 160.000ha bị nhiễm đạo ôn (1985) với mức độ thiệt hại nặng, nhẹ khác nhau. Cây khoai tây, cà chua, ớt, cây cam, chanh bị virus, cây hồ tiêu, cà phê, thuốc lá bị tuyến trùng. Các cây họ cà bị héo xanh vi khuẩn và vô số bệnh hại rau, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây làm thuốc, hoa cây cảnh gây thiệt hại to lớn trong điều kiện nhiệt đới gió, ấm và mưa nhiều quanh năm ở nước ta. [23] Thất thu hàng năm do các loài dịch hại gây ra chiếm khoảng 35% khả năng sản lượng mùa màng (khoảng 75 tỷ đôla); trong đó thiệt hại do sâu là 13,8% (29,7tỷ đôla); do bệnh cây là 11,6% (24,8 tỷ đôla); do cỏ dại là 9,5% (20,4 tỷ đôla) (theo Cramer H. H,1967). Nếu tính cho diện tích nông nghiệp của thế giới là 1,5 tỷ hecta, không kể đồng cỏ và bãi hoang thì thiệt hại bình quân là 47-60 đôla trên 1hecta. [54] 1.3.3 Một số nấm gây bệnh cho cây trồng. 1.3.3.1 Nấm gây bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae - Pyricularia grisea (Cooke) Saccardo) Nấm Pyricularia oryzae thuộc nhóm Nấm khuyết (nấm bất toàn) Deuteromycetes, họ Moniliales. P. oryzae là nguyên nhân chính gây bệnh đạo ôn (nổ lốp) ở lúa. Nấm bệnh thường giết chết hoàn toàn cây con, đôi khi trên lúa trưởng thành, nó cũng nhiễm trên nhiều thực vật như cỏ mần trầu voi (Euleusine coracana) và kê (Setaria italica). Bệnh đạo ôn trên cây Lúa; là một trong hai bệnh nguy hại nhất của lúa, là yếu tố làm giảm năng suất lúa của nhiều vùng, đặc biệt các vùng lúa Đồng bằng Sông Hồng và Duyên hải Miền Trung. Bệnh thường gây tác hại nặng trong vụ lúa đông xuân. Chúng tàn phá đặc biệt dữ dội trên các giống nhiễm hoặc trên các ruộng lúa bón dư thừa đạm. Nấm Pyricularia oryzae có hệ sợi nấm phát triển và phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm nội bào hoặc gian bào, tế bào thường nhiều nhân, cuống sinh bào tử thường đơn, dài, mảnh, có hoặc không có vách ngăn (tạo 3 ngăn) (minh họa bằng hình 1.4). Mỗi bào tử gắn với cuống bào tử bởi rốn hạt (hilum) như nhú lồi. Bào tử 34 phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, bào tử không màu, kích thước trung bình của bào tử nấm 19-23 x 10-12µm. Nhìn chung kích thước của bào tử nấm biến động tùy thuộc vào các isolates, điều kiện ngoại cảnh khác nhau cũng như trên các giống lúa khác nhau. Bảo tử nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24-28oC. Bào tử phân sinh chính là phương tiện giúp nấm lan truyền và bùng phát trong vụ thông qua gió và nước mưa. Bào tử được phóng thích khi ẩm độ rất cao đặc biệt vào ban đêm, có thể sự vỡ ra của rốn hạt gây phóng thích bào tử [22], [26], [45]. Conidia = bào tử đính, conidiophore = cọng mang túi bào tử Hình 1.4 :Cuống bào tử và bào tử của Pyricularia oryzae (Sharma, 1998)[45] 1.3.3.2 Nấm gây bệnh khô vằn (Rhizoctonia sp) Rhizoctonia có phạm vi kí chủ 180 loài cây. Đây là một loại nấm thuộc nhóm nấm vô sinh, theo đó dưới điều kiện thuận lợi về sinh thái và kí chủ, nấm không hình thành bất cứ loại bào tử hữu tính hoặc vô tính nào. Để bảo tồn và lưu truyền, nấm hình thành các cấu trúc dạng hạch có sức chống chịu cao và có khả năng phát tán rộng. Nấm cũng lấy cấu trúc này làm phương tiện phát tán và lây nhiễm. Hạch của Rhizoctonia là dạng hạch chưa hoàn thiện, được kết tụ và cấu trúc từ các sợi nấm với mức độ chắc – chắc thấp. Đó chỉ là 35 những thể kép từ sợi, không mấy chặt chẽ, không phân biệt về mặt giải phẩu giữa lớp vỏ và lớp ruột của hạch. Một số sợi nấm tạo hạch còn bám dính lại như lông tơ, vì thế nhìn bề ngoài các hạch như có lông. Chính những lông này giúp các hạch kết nối lại với nhau hoặc bám dính vào giá thể mà tại đó hạch tồn tại. Rizoctonia sp là nấm đa thực. Chúng gây nên bệnh khô vằn hại lúa và một số cây đơn tử diệp khác. Chúng cũng là tác nhâu gây các bệnh lở cổ rễ cho nhiều loại cây trồng cạn. [26], [23]. 1.3.3.3 Nấm gây bệnh tiêm hạch ở lúa, thối thân ở cây thuốc lá (Sclerotium sp) Nấm được xếp vào nhóm nấm vô sinh, theo đó dưới các điều kiện thuận lợi, nấm lấy hạch làm cơ quan bảo tồn, lưu truyền, phát tán và lây nhiễm. Hạch của Sclerotium là loại hạch thực sự, có kết cấu hoàn thiện. Đó là các cấu trúc hạt, nhỏ, bề mặt trơn nhẵn, màu sậm, hoàn toàn biệt hóa giữa hạch này với hạch khác, có cấu tạo giải phẩu khác biệt giữa phần vỏ và phần ruột của hạch. Người ta cũng phát hiện rằng dưới những điều kiện sinh thái xác định, loài nấm này cũng hình thành các loại bào tử vô tính và hữu tính. Giai đoạn vô tính của nấm mang tên Leptosphaeria salvinii Catt. Ở Việt Nam, nấm này tồn tại chủ yếu dưới giai đoạn hạch. Nấm này gây bệnh tiêm hạch ở lúa, gây bệnh thối thân ở cây thuốc lá. [26], [27]. 1.3.3.4 Nấm gây bệnh đốm nâu (Curvularia sp.) Curvularia là một thành viên của họ Dematiaceae của bộ Moniliales, nó được giới thiệu trên 30 loài. Curvularia tìm thấy trên lúa (Benoit và Mathur, 1970) và nhiều cây trồng khác. Nó là tác nhân gây bệnh đốm lá, bệnh rỉ sét (thối khô), biến dạng hạt, biến màu (bạc màu) hạt và thậm chí thối rễ. Giai đoạn hòan chỉnh đã được biết là dạng loài của Cochliobolus, một thành viên của Loculoascomycetes. Cuống bào tử đứng thẳng, sợi lớn (marconematous) và sợi đơn (mononematous). 36 Bào tử xoắn thành vòng trên cuống bào tử. Bào tử thường cong. Có 3 bào tử trên một đế là nhiều nhất (minh họa bằng hình 1.6); Cành bào tử phân sinh màu nâu đậm, đa bào, không phân nhánh mọc đơn hoặc thành cụm, đỉnh hơi tròn, kích thước 70-270 x 2-8 µm. Bào tử phân sinh mọc thành cụm ở đỉnh, cong, hình gù vai trâu, đa bào, có 2-5 vách ngang, đa số có 3 ngăn ngang, đỉnh tròn hơn thắt ở gốc. Nấm có thể kết hợp gây hại với một số loại nấm khác. Sự lồi lên của rốn hạt bào tử trên đế gặp ở một vài loài như C. Combopogonis, đôi khi cuống bào tử trên chất nền. Hình 1.5: Cuống bào tử và bào tử của Curvularia lunata (Sharma, 1998).[45] Ở miền Bắc nước ta, từ năm 1969-1979, bệnh đốm nâu đã xuất hiện ở nhiều vùng trên các giống lúa mới và vụ 1971 bệnh phổ biến ở khắp các vùng trồng lúa ở nước ta. Bệnh làm tăng số hạt lép, giảm khối lượng hạt ảnh hưởng tới năng suất, bệnh nặng kéo dài tới cuối kỳ sinh trưởng có thể làm cây lúa cằn lại, trỗ kém. Hạt bị bệnh tỷ lệ lép lên tới 60-70%. Có khoảng 14 loài nấm Curvularia có liên quan đến bệnh này [22], [45]. 37 1.3.3.5 Nấm gây bệnh héo rũ gốc mốc đen ở cây lạc (Aspergillus niger) Khuẩn lạc của Aspergillus có màu đen nâu, khuẩn ty không màu hay nâu xẩm tuỳ vùng của khuẩn lạc. Cuống sinh bào tử phồng to ở đầu thành bọng hình chùy hay cầu. Thể bình xếp hai tầng. Bào tử trần không vách ngăn, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, bên ngoài có gai, xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn tụ họp thành hình cột hay tia tỏa tròn.[27] Aspergillus niger gây bệnh héo rũ gốc mốc đen ở cây lạc. Ở cổ rễ, gốc, thân ngầm sát mặt đất có vết bệnh màu nâu biểu bị và vỏ nứt vỡ thối mục. Cành lá héo cong, màu lá xanh vàng, mất sắc bóng. Trên cổ rễ, gốc thâm đen, mục nát bao phủ bởi một lớp mốc đen. Khi nhổ cây bệnh lên rất dễ bị đứt gốc [22], [23]. 1.3.3.6 Nấm gây bệnh thối (Pythium sp.) Pythium thuộc họ Pythiaceae bộ Peronosporales lớp Phycomycetes. Cành sinh bào tử (Sporangiophore hoặc conidiophore) sinh ra bọc bào tử (sporangium) hoặc dạng conidi. Bào tử động hai lông roi sinh ra ở trong sporangium. Sinh sản hữu tính cho bào tử trứng: Trên sợi nấm sinh ra các cơ quan sinh sản riêng biệt là bao trứng (Oogonium) cái và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao thì toàn bộ nhân và chất tế bào của bao đực dồn sang trứng thụ tinh và hình thành một bào tử trứng. Nấm Pythium có thể tự tổng hợp Vitamin cần thiết cho cơ thể nếu không có trong môi trường. Pythium sp gây bệnh thối trên ngô, đậu, ngũ cốc và một số cây trồng khác [23]. 1.3.4 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu, bệnh hiện nay Ngành Nông nghiệp đang đối mặt sự xuất hiện nhiều loại sâu, bệnh hại nguy hiểm. Để bảo vệ mùa màng, người nông dân đã phải sử dụng thuốc hoá học có nồng độ cao để phun phòng trừ ngay trong khi dịch sâu hại mới xảy ra mới có thể đạt kết 38 quả. Bình thường trong một vụ rau nông dân đã phun từ 8-10 lần. Ở những vùng trồng hành tỏi, sâu keo da láng là loại sâu đã làm mất trắng sản lượng, vì vậy người dân phải phun từ 12-15 lần. Trung bình 1ha cây trồng chỉ một lần phun, họ đã dùng 3-5kg thuốc. Ðây là vấn đề nghiêm trọng đòi hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên cứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịch ngay nên nông dân quen sử dụng vì thấy hiệu quả. Sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp mang lại lợi ích kinh tế to lớn, song việc lạm dụng thuốc đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khoẻ cộng đồng, gây ô nhiễm môi trường, tiêu diệt nhiều loại động vật có ích, từ đó làm phát sinh nhiều bệnh dịch do sâu hại kháng thuốc và do không còn thiên dịch trên đồng ruộng để đảm nhận chức năng tự nhiên là hạn chế sâu hại phát triển thành dịch [53]. Trong sản xuất nông nghiệp có mâu thuẫn là càng thâm canh cây trồng cao thì sâu, bệnh phát sinh càng nhiều, càng phun thuốc để phòng trừ thì càng huỷ diệt nhiều sinh vật có ích với con người và càng gây tính kháng thuốc với sâu hại nghĩa là có khi phun xong thuốc hoá học thì sâu, bệnh lại tăng nhanh đến mức gây đột phát trận dịch mới, cứ như vậy cái vòng luẩn quẩn này ở hầu hết các vùng nông thôn nước ta diễn ra hàng năm mà các cán bộ kỹ thuật chưa đủ để khắc phục hạn chế này. Trước thực tế đó, nhu cầu cấp bách là phải nghiên cứu các chế phẩm sinh học có khả năng thay thế, hoặc giảm thiểu thuốc hoá học, tiến tới xây dựng nền nông nghiệp sinh thái không sử dụng hóa chất, duy trì sự cân bằng tự nhiên. Nếu cây trồng được bón phân vi sinh, phun thuốc trừ sâu bằng chế phẩm vi sinh thì đất đai được cải tạo, môi trường sẽ được trong lành. [53 ] Thuốc trừ sâu vi sinh chỉ mới được đưa vào nước ta đầu những năm 1970 với số lượng rất ít. Nếu tình hình về doanh số chế phẩm sinh học phòng dịch trên thế giới chưa vượt quá 1% doanh số thuốc phòng dịch thì ở nước ta tỷ lệ đó còn thấp hơn nhiều. 39 Nhiều nghiên cứu trong nước về các tác nhân sinh học phòng trừ sâu hại đã có những thành tựu, song việc triển khai ra sản xuất lại rất chậm chạp. Hiện nay, có nhiều nơi đang sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, chủ yếu là B.T., với quy mô thí điểm. Một vài nơi đã sản xuất thuốc virus N.P.V, như Trung tâm nghiên cứu bông Nha Hố. Còn lại, các tác nhân trừ sâu từ vi khuẩn thuộc giống Serratia, các vi nấm, các virus C.P.V, G.V, trùng bào tử Nosema, tuyến trùng Stelnennema ... rất có hiệu quả, nhưng chưa được quan tâm [80]. 1.3.5 Những chế phẩm VSV trong phòng trừ sâu, bệnh Thuốc trừ sâu sinh học không gây độc hại cho người sử dụng, gia súc, làm trong sạch môi trường, tiêu diệt sâu bệnh với tỷ lệ cao mà không làm cho chúng nhờn thuốc, hạn chế việc “giết nhầm” những loài côn trùng hữu ích. Chế phẩm vi sinh sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích nhằm hướng đến sự phát triển nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững trong tương lai. Các kết quả nghiên cứu trong thời gian qua cho thấy việc sử dụng các sản phẩm sinh học này sẽ mang lại lợi ích như tăng độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất và chất lượng nông sản, phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng, phân hủy chất hữu cơ phể phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến, xử lý môi trường sản xuất. Từ đó giúp cân bằng hệ sinh thái và phát triển cây trồng khỏe mạnh. Tiếp thu những thành quả của thế giới. Ở nước ta, một số cơ quan chức năng như Viện Bảo vệ thực vật, các Viện Sinh học, các phòng thí nghiệm của các trường Đại học cùng một số cơ quan phối hợp đã tiến hành nghiên cứu và đã đưa xuống một số địa phương ứng dụng như: - Công nghệ sản xuất và sử dụng một số loài ong ký sinh mắt đỏ Trichogramma để trừ sâu cuốn lá loại nhỏ, sâu đục thân ngô, mía, lúa, sâu đo hại đay, sâu bông, sâu đậu đỗ. - Công nghệ sản xuất trứng ngài gạo (Corcyra cephalonica Stein), ngài mạch (Sitotroga)…. 40 - Công nghệ sản xuất bọ mắt vàng (Chrysopa), bọ rùa (Cocinellidae) ăn rệp, nhện ăn thịt. - Công nghệ sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu VSV trên cơ sở tạo bào tử mang tinh thể độc tố Endotoxin của vi khuẩn Bacillus thuringiensis trừ sâu tơ, sâu xanh, sâu đo, sâu khoang ở một số rau chuyên canh của Hà Nội, Ðà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh”. - Công nghệ sản xuất và sử dụng các chế phẩm nấm gây hại côn trùng như nấm trắng Beauveria bassiana, nấm xanh Metathizium anisopliae, Metathizium flavoviridae trừ sâu róm thông, rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đay, châu chấu hại ngô, mía, kiến vương hại dừa, đặc biệt là nấm Metathizium trừ châu chấu hại ngô mía ở miền Ðông Nam bộ. Nấm Trichoderma và một số xạ khuẩn trừ bệnh hại cây trồng như bệnh héo rũ lạc, bệnh ngô vằn ngô, lúa”. - Công nghệ sản xuất và sử dụng các chế phẩm virus trừ sâu xanh bông, virus trừ sâu tơ, sâu khoang hại rau, virus trừ sâu keo da láng, virus trừ sâu xanh hại đay và virus trừ sâu róm hại thông rừng”. Nhìn chung tất cả các nghiên cứu trên đã thu được những kết quả nhất định và trong thực tế sản xuất người nông dân sử dụng các chế phẩm sinh học như một tác nhân sinh vật trên một số diện tích đối với một số cây trồng trừ được một số loài sâu hại như B.T. trừ sâu rau, nấm trừ sâu đo đay, châu chấu hại ngô ở Bà Rịa-Vũng Tàu, sâu róm thông hại rừng ở Thanh Hoá, virus trừ sâu róm thông, sâu bông được các địa phương đánh giá tốt và đề nghị được sử dụng trên diện tích rộng mới thuyết phục được nông dân. Bên cạnh đó, hiện nay có nhiều sản phẩm sinh học mới được nghiên cứu từ các Viện, Trường, Doanh nghiệp được sản xuất và thương mại hóa: - Chế phẩm vi sinh hữu hiệu EM (Effective microorganisms) là tập hợp các VSV có ích (các vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm sợi) sống cộng sinh trong cùng môi trường, có thể sử dụng chúng như là một chất nhằm tăng cường tính đa dạng VSV đất, bổ sung các VSV có 41 ích vào môi trường tự nhiên, giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường do các VSV có hại gây ra, từ đó cải thiện chất lượng, làm tốt đất, chống bệnh do VSV gây ra và tăng cường hiệu quả của việc sử dụng chất hữu cơ cho cây trồng. Sử dụng chế phẩm EM góp phần tăng năng suất cây trồng, vật nuôi, tăng sản lượng nông sản. Chế phẩm EM còn dùng để xử lý rác thải, nước thải, khử mùi hôi của chất thải chăn nuôi [53], [82]. - Sản phẩm BIMA của Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Vi-ĐK của Công ty sát trùng Việt Nam đang được nông dân sử dụng để tăng khả năng hoai mục của phân chuồng và giảm mùi hôi thối; đồng thời phòng chống một số bệnh do nấm Phytophthora palmirova, Fusarium solani, Pythium sp, Sclerotium rolfosii do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong chế phẩm. - BIO-F của Viện Sinh học nhiệt đới có chứa Streptomyces sp., Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp. có tác dụng phòng trừ bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani và bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzea gây ra. - OMETAR từ nấm xanh Metarhizium anisopliae và BIOVIP từ nấm trắng Beauveria bassiana của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long có tác dụng diệt một số sâu bệnh hại lúa và cây ăn trái. - Sản phẩm PHÂN HỮU CƠ VI SINH như vi khuẩn cố định đạm (Azotobacter), vi khuẩn và nấm phân giải lân khó tan (Bacillus polymixa, Bacillus megaterium, Pseudomonas striata, Aspergillus awamori) [81]. - Chế phẩm Liquid Vigo của Trung tâm ứng dụng kỹ thuật Lâm Đồng là chế phẩm VSV đối kháng nấm bệnh cây trồng Trichoderma và đang được ứng dụng trên cây rau (bắp cải) và cây hoa (cẩm chướng) ở Đà Lạt [66]. 42 1.3.6 Tình hình sản xuất rau, hoa tại Đà Lạt [39] Đà Lạt là vùng sản xuất rau, hoa lớn nhất đất nước. Diện tích gieo trồng rau, hoa ngày càng tăng theo từng năm. Chúng ta có thể thấy điều đó qua bảng sau: Bảng 1.2: Diện tích gieo trồng rau và hoa cắt cành từ năm 1996-2005 Năm Diện tích gieo trồng rau (ha) Sản lượng (tấn) Diện tích gieo trồng hoa cắt cành (ha) Sản lượng (tấn) 1996 3902 82448 174 26 1997 4819 102670 242 38 1998 4984 107041 253 46 1999 5231 118450 286 58 2000 5520 143520 453 113 2001 7810 187400 508 147 2002 7638 183300 630 183 2003 8490 203800 788 228 2004 8723 209400 930 270 2005 8521 219000 1063 308 Qua bảng 1.2 cho thấy: diện tích gieo trồng rau tăng 218% và diện tích gieo trồng hoa cắt cành tăng 610% từ năm 1996-2005. Với diện tích tăng nhanh như vậy trong vòng 9 năm cho thấy hệ quả tất yếu là sâu, bệnh sẽ tăng và số lượng thuốc trừ sâu, bệnh sử dụng ở Đà Lạt cũng gia tăng. Đặc biệt là những loại sâu trên diện tích trồng hoa gia tăng nhanh chóng và người nông dân Đà Lạt đã chọn giải pháp trồng hoa trong nhà kính. (minh họa bằng hình 1.6). 43 Hình 1.6 : Vùng rau hoa Vạn Thành, Cam Ly. Ngày nay, các tiến bộ kỹ thuật về sản xuất rau theo hướng nông nghiệp tổng hợp, sử dụng các giống cây trồng mới có đặc tính chống chịu với sâu bệnh, áp dụng các chế độ phân bón hợp lý và các biện pháp quản trị dịch hại tổng hợp (IPM) đã làm tăng năng suất và chất lượng nông sản. Trong 5 năm 1996-2000, hàng năm vùng rau Đà Lạt đã xuất sang các nước trong khu vực với mức xuất khẩu chiếm 10% sản lượng. Từ năm 2001, sản xuất nông nghiệp Đà Lạt chuyển dịch theo hướng sản xuất nông sản chất lượng cao, phù hợp với xu thế hội nhập kinh tế với các vùng, miền trong nước và các nước trong khu vực; được xác định là một thế mạnh để tạo việc làm cho lao động nông nghiệp với tôn tạo và làm đẹp cảnh quan, môi trường, góp phần phát triển du lịch của thành phố Đà Lạt. Chất lượng sản phẩm ngày càng được nâng lên, mức độ tồn dư các dư lượng độc hại trong sản phẩm rau thấp hơn ngưỡng cho phép nhiều lần. Giai đoạn năm 2001-2005 là giai đoạn nông nghiệp Đà Lạt bắt đầu có những sự thay đổi. Sản xuất nông nghiệp phát triển theo định hướng ứng dụng công nghệ cao trên các vùng nông nghiệp của Đà Lạt đã hình thành những mô hình kinh tế 44 nông nghiệp có hiệu quả. Các chương trình, dự án đầu tư hổ trợ phát triển kinh tế nông nghiệp được đầu tư trực tiếp vào nông hộ, đã góp phần kích thích sản xuất phát triển. Tuy nhiên, khi số sâu hại có xu hướng giảm thì nền Nông nghiệp Đà Lạt phải đối mặt với những loại bệnh cây mà hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị như bệnh sưng rễ ở họ cây thập tự, bệnh thối rễ ở cây Địa Lan.v.v… Do đó cần có nhiều nghiên cứu hơn về công tác phòng, trị bệnh cho cây trồng nói chung và cây rau, hoa Đà Lạt nói riêng, đặc biệt là cây Địa Lan (Cymdibium) ở Đà Lạt (minh hoạ bằng hình 1.7) và thuốc trừ sâu vi sinh chính là sự lựa chọn tối ưu cho nền Nông nghiệp Đà Lạt xanh, sạch, an tòan. Hình 1.7: Vườn Hoa Địa Lan Phường 7, Đà Lạt. 1.3.7 Tình hình bệnh hại cây Địa Lan (Cymbidium) Đà Lạt được gọi là “xứ sở của ngàn hoa” vì phong phú về chủng loại và đa dạng về màu sắc của những loài hoa nơi đây. Trong đó có thể kể đến Địa Lan (Cymbidium) được mệnh danh là “nữ hoàng” của các loài lan nhờ chúng có những 45 điểm nổi bật cả về giá trị khoa học lẫn giá trị mỹ thuật. Đặc biệt, một số loài Địa Lan chỉ có thể ra hoa tại “xứ sở sương mù” này mà thôi. 1.3.7.1 Vài nét giới thiệu về Địa Lan (Cymbidium) Phân loại : Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, người ta đã xếp riêng Cymbidium vào một chi, chi này đã được nhà thực vật học người Thụy Điển Otto Swartz mô tả năm 1799. Trong khoá phân loại của Lindley - Bentham-Brieger năm 1983, chi Cymdibium thuộc tông phụ Cymbidinae, tông Dendreae, phân họ Orchidoideae. Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dương, từ năm 1932, Henri Lecompte cho rằng chi này có 120 loài. Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp lại và xác định có khoảng 60 loài. Những nhà phân loại học Việt Nam như Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi… đã giới thiệu ở nước ta có khoảng 12 loài. Các loài thuộc chi Cymbidium phân bố chủ yếu ở Châu Á, từ dãy Hy Mã Lạp Sơn (Hymalaya) đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), các nước Đông Dương, Miến Điện, Thái Lan… Và một vài loài phân bố ở các châu lục khác. Phần lớn các loài trong chi này sống ở các vùng rừng núi cao, khô và lạnh, một vài loài khác chịu được điều kiện nóng ẩm của rừng nhiệt đới. Tại Đà Lạt, Địa Lan phát triển rất tốt, ra hoa đều đặn, kể các những giống lai nhập nội. Các điều kiện khí hậu, thời tiết ở đây cơ bản đã phù hợp với các yêu cầu sinh thái và sinh lý của Cymbidium. 46 Hình 1.8: Hình thái cây Địa Lan( Cymbidium) Hình thái: Địa Lan (Cymbidium) là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. [54] Thương hiệu “ Nữ hoàng” Địa Lan (Cymbidium) được nhiều người biết đến bởi sắc đẹp lộng lẫy của hoa. Đà Lạt là nơi có khí hậu lý tưởng vào loại bậc nhất để cho loài hoa này sinh sôi nảy nở. Ngoài tiêu thụ nội địa, loài hoa này còn được xuất khẩu, mang lại thu nhập đáng kể cho người dân Đà Lạt và góp phần tạo nên thương hiệu xứ sở ngàn hoa. Thế nhưng, các nông dân trồng Địa Lan đang lao đao vì căn bệnh thối củ Địa Lan, nhiều vườn Địa Lan đang chết dần chết mòn và được coi là “vô phương cứu chữa”. Tỷ lệ vườn bị bệnh vào cuối năm 2007, đầu năm 2008 đã lên đến 70-80%, trong đó tỷ lệ cây chết từ 30-60%, thậm chí nhiều vườn chết 100%. Với tình hình Địa Lan chết nhiều như vậy nhưng hầu hết các hộ nông dân phải tự cứu mình. Nghe giới thiệu thuốc gì, cách chữa trị ra sao thì lập tức đi tìm mua về phun, xịt. Xác Lan chết được vứt lung tung, có nơi chở vào rừng đổ, có chỗ bỏ ra đường cho xe rác hốt, có người mang đi đốt... Nguy hiểm hơn có nhà dùng lại chậu 47 lan đã chết để trồng những cây kiểng khác. Điều này có thể tiềm ẩn bệnh và lây lan bệnh đi nơi khác. Nhiều hộ trồng Địa Lan đã không dám đầu tư vào cây Địa Lan nữa, số chậu còn lại họ lo bán đổ, bán tháo để vớt vát. Tuy nhiên, có nhiều hộ “lỡ” đầu tư vào nhà vườn (nền, khung, lưới) với số tiền khá lớn nên bây giờ vẫn tiếp tục xoay sở tái đầu tư, dù chưa biết kết quả thế nào. Điều này cho thấy cần có nhiều đề tài nghiên cứu về cây Địa Lan ở Đà Lạt hơn nữa, đặc biệt là những nghiên cứu về phòng trừ sâu, bệnh cho cây trồng ở Đà Lạt nói chung và cây Địa Lan ở Đà Lạt nói riêng. 1.3.7.2 Các loại bệnh ở cây Địa Lan [6], [62], [54] Theo kết quả nghiên cứu tác nhân gây bệnh và các biện pháp phòng trừ bệnh chết củ Địa Lan tại Đà Lạt của TS. Lê Đình Đôn (Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM) thì tác nhân gây bệnh chính trên cây Địa Lan gồm 7 loài nấm, 3 loài vi khuẩn, 2 loài virus, chưa phát hiện tuyết trùng kí sinh. Thế nhưng, điều đáng nói là nông dân thì làm sao xác định được nguyên nhân gây bệnh do nấm, virus hay vi khuẩn để lựa chọn đúng thuốc trị bệnh. 1.3.7.2.1. Bệnh thối chồi non và hư giả hành do nấm Phytophithora sp Đặc điểm triệu chứng: Giả hành : Có bẹ lá gần ngọn bị hư với màu nâu. Khi xẻ dọc, mô bên trong giả hành bị thâm đen ở phần gốc, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ khá rõ ràng, có mùi hôi nhẹ nhưng không thối nhũn. Giả hành khô và chỉ còn trơ lại xơ khi bị nhiễm bệnh nặng. Chồi và phát hoa: Bệnh thường xuất hiện trên phát hoa và chồi non, không thấy xuất hiện bệnh trên những phát hoa đã có tai hoa hoặc phát hoa đã trưởng thành. Vết bệnh ban đầu là một điểm nhỏ dạng hình bất định, ủng nước màu nâu đen, bệnh có thể hình thành dịch trong điều kiện có ẩm độ cao (giọt nước, giọt sương, mưa phùn) và nhiệt độ thấp (trên dưới 20oC), ở gốc phát hoa không nhày, 48 nhưng vẫn úng nước và ngửi có mùi hôi nhẹ. Thời tiết khô, vết bệnh khô lại và có màu xanh đen. Đặc biệt mô khoẻ vẫn giữ được màu xanh bình thường, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ được phân biệt khá rõ ràng. Sự phát triển của bệnh theo quy luật : từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài. Có thể dùng tay rút phát hoa hoặc chồi bệnh lên một cách dễ dàng. Nguyên nhân gây bệnh và điều kiện phát triển bệnh Do nấm Phytophthora sp thuộc lớp nấm tảo Phycomycetes gây ra Nấm xâm nhiễm qua vết thương vùng thân ngầm, hay vết thương trên giả hành. Thời gian xâm nhiễm tới xuất hiện triệu chứng dài hơn 1 năm ở Địa Lan 2-3 năm tuổi. 1.3.7.2.2. Bệnh thối chồi non và giả hành do nấm Fusarium sp. Đặc điểm triệu chứng Trên lá: Lá bị bệnh có sự chuyển màu trên các mô lá còn non từ xanh chuyển sang vàng nâu đen, ấn nhẹ giả hành bị nhiễm bệnh vẫn cứng, sau đó vết bệnh lớn dần làm khô tóp đoạn thân gần gốc và cổ rễ, thân gốc có màu đen. Khi xẻ dọc giả hành, mô bệnh có màu vàng cam sũng nước, cò mùi hôi nhẹ nhưng không thối nhũn. Cây con thường chết sau 2-3 tuần nhiễm bệnh. Nguyên nhân gây bệnh Do nấm Fusarium sp., thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes gây ra 1.3.7.2.3. Bệnh thối nâu gốc do nấm Sclerotium rolfsii Đặc điểm triệu chứng Khi điều kiện thời tiết ẩm ướt, nấm xâm nhiễm từ gốc rễ gây chết mô rễ, bẹ lá giả hành và bệnh phát triển dần hướng lên trên làm thân cây teo tóp, lá vàng. Do gốc rễ bị tổn thương nên thân lá thường răn rúm, cây lan sinh trưởng kém, bệnh nặng làm cây chết. Mô bệnh có màu nâu đen, khô và không có mùi hôi, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ khá rõ ràng, 49 Khi mô bệnh xuất hiện rất nhiều những hạch nấm nhỏ tròn đều có màu nâu và những sợi nấm trắng xuất hiện dày đặc khi tách bé lá tại các vị trí bị nhiễm bệnh. Nguyên nhân gây bệnh Do nấm Sclerotium rolfsii, thuộc nhóm nấm bất thụ Mycelia sterilia gây ra 1.3.7.2.4. Bệnh đốm đen do nấm Colletotrichum sp., Đặc điểm triệu chứng Trên lá: Nấm bệnh xâm nhiễm là đầu chóp lá cháy khô có màu nâu đen vằn vện, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ khá rõ ràng. Khi quan sát mặt dưới lá bị bệnh, thường thấy xuất hiện những chấm đen nhỏ, đó là những ổ bào tử của nấm bệnh. Trên hoa và cuống hoa: Với triệu chứng là mô bệnh bị hoại tử, vết bệnh lõm xuống. Vết bệnh vô định hình có màu nâu đen trên cuống hay vết đốm trong trên cánh hoa. Trên đỉnh sinh trưởng: Chẻ dọc đỉnh giả hành có thể thấy tất cả mô lá ngọn đều có vết bệnh, đỉnh sinh trưởng bị khô với màu nâu sáng. Nguyên nhân gây bệnh Do nấm Colletotrichum sp., thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes gây ra. 1.3.7.2.5. Bệnh đốm lá do nấm Cercospora sp. Đặc điểm triệu chứng Vết bệnh thường có hình thoi hoặci hình tròn nhỏ (đường kính trung bình 1mm, màu xám nâu, xuất hiện ở mặt dưới lá. Bệnh nặng làm lá vàng, chóng rụng, cây cằn cỗi, sinh trưởng kém. Nguyên nhân gây bệnh Do nấm Cercospora sp. thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes gây ra. 50 1.3.7.2.6. Bệnh thối do vi khuẩn: Trên chồi: Bệnh thường xuất hiện khi cây con từ 11-20cm. Vết bệnh đầu tiên tại gốc chồi phát triển lên trên, từ lá trong ra lá ngoài và lan theo chiều rộng của phiến lá. Ở những chồi bệnh có thể rút các lá lên một cách dễ dàng. Dựa vào màu sắc vết bệnh có thể chia thành 2 triệu chứng bệnh khác nhau (bệnh thối nâu đen và bệnh thối nâu vàng). Trên giả hành: triệu chứng bệnh do vi khuẩn gây ra trên giả hành rất dễ nhằm lẫn với bệnh do nấm. Điểm khác biệt duy nhất giữa chúng là vi khuẩn thường gây thỗi nhũn giả hành kèm theo mùi hôi rất nặng đặc trưng. Trên phát hoa: Vi khuẩn thường gây bệnh trên phát hoa có chiều cao khoảng 10cm, nhưng hiếm khi gây hại trên phát hoa đã có tai hoa hay phát hoa đã nở. Bệnh xuất hiện từ gốc phát hoa, từ lá bao trong ra lá bao ngoài và lan theo chiều rộng của lá bao hoa. Khi phát hoa bị bệnh, có thể dùng tay rút bao phát hoa lên một cách dễ dàng. Mô bệnh có màu nâu vàng, vết bệnh nhày, úng nước và ngửi có mùi hôi rất khó chịu. ¾ Bệnh thối đen do vi khuẩn Pseudomonas gladioli. Đặc điểm triệu chứng Trên thân: Bệnh lây lan từ trên xuống giả hành. Vết bệnh ban đầu có màu nâu nhạt, sau đó chuyển sang màu nâu đen, không có dịch nhầy, có mùi hôi. Khi bệnh phát triển mạnh làm gia tăng số lượng chồi bị thối dẫn đến cả chậu bị bệnh. Trên giả hành : Ban đầu bộ lá chuyển vàng nhưng chậm, giả hành mềm ít đôi khi vỏ giả hành hơi nhăn, mô giả hành có màu nâu đen, nhầy ít, có mùi hôi nhẹ. Bộ lá vàng và rụng dần, giả hành mềm rỗng ruột chỉ còn lại xơ bên trong. Nguyên nhân gây bệnh Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra 51 ¾ Bệnh thối vàng do vi khuẩn Erwnia. Đặc điểm triệu chứng Trên thân: Mô bệnh có màu nâu vàng, vết bệnh nhầy, sũng nước, lá ngọn dễ rút ra khỏi thân chính dễ dàng, ngửi có mùi hôi rất khó chịu. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám. Trên giả hành: Triệu chứng nhận biết giả hành mềm nhũn, mô giả hành có màu nâu vàng, bị nhày, ướt, ngửi có mùi rất khó chịu, không phân biệt được phần bệnh và không bệnh. Vết bệnh ban đầu có thể từ gốc bẹ lá, gốc thân ngầm, và vết cắt của phát hoa cũ. Nguyên nhân gây bệnh Do vi khuẩn Erwnia carotovora, Erwnia sp. Gây ra. 1.3.7.2.7. Virus gây sọc vàng trên lá Đặc điểm triệu chứng Trên lá có nhiều sọc vàng nhạt phân biệt rõ với vùng xanh của phiến lá. Cây bệnh nặng các vết bệnh liên kết lại với nhau làm cho cây bị vàng, lá thẳng đứng và mọc xít vào nhau. Bệnh xuất hiện ở cây con 6 tháng tuổi với bộ lá vàng nhạt. Trên cây lớn với phát hoa thấp ngắn và hoa không nở. Nguyên nhân gây bệnh Do virus Odontoglossum Ringspot Virus (ORSV) 1.3.7.2.8. Virus gây đốm đen trên lá Đặc điểm triệu chứng Vết bệnh gồm nhiều chấm đen nhỏ xuất hiện tại một vị trí trên lá. Các vết bệnh lớn liên kết với nhau tạo thành những mảng đen cả mặt trên và dưới lá. Khi bệnh nặng, các chấm đen phát triển trên cả phần bẹ lá, làm bộ lá bị khô nhanh gây 52 hiện tượng khô xám giả hành. Bệnh nặng trên cây có nhiều tuổi, tất cả giả hành, chồi con, phát hoa đều có triệu chứng bệnh trong cùng một chậu. Nguyên nhân gây bệnh Do virus Cymbidium Mosaic Virus (CymMv) Ngoài ra trên lan còn nhiễm 1 loại virus khác là Orchid Fleck Virus (OFV) Ngoài các bệnh hại nêu trên, cây lan còn bị các bệnh khác gây hại như bệnh tàn cánh hoa do nấm Botrytiss cineria, bệnh thối trắng rễ do nấm Rhizoctonia solani. 1.4 Vài nét giới thiệu về Đà Lạt. 1.4.1. Vị trí địa lý Thành phố Đà Lạt nằm trên cao nguyên Lang Biang, độ cao trung bình so với mặt biển khoảng 1500m. Đà Lạt ở phía đông bắc tỉnh Lâm Đồng, không có đường địa giới hành chính chung với các tỉnh lân cận, phía bắc giáp huyện Lạc Dương, phía đông và đông nam giáp huyện Đơn Dương, phía tây giáp huyện Lâm Hà, phía tây nam giáp huyện Đức Trọng. Diện tích tự nhiên là 391,06km 1.4.2. Địa hình Bình sơn nguyên Đà Lạt chỉ là một bộ phận của đới Đà Lạt. Từ lâu người ta vẫn thường gọi bình sơn nguyên này là cao nguyên Lang Biang hay Lâm Viên. Bình sơn nguyên Đà Lạt có độ cao trung bình 1500m, độ cao có xu hướng thấp dần từ 1600m ở phía Bắc xuống 1400m về phía nam. Giới hạn về phía tây, bắc, đông bắc là các dãy núi hình cánh cung cao gần 2000m. Trên bề mặt có những núi sót có độ cao tương đối từ 200-400m. Bình sơn nguyên Đà Lạt có dạng một thung lũng cổ, đây là bề mặt sang bằng cổ được bảo tồn tốt nhất trên lãnh thổ Việt Nam. 53 Bên trong bình sơn nguyên, thành phố Đà Lạt có hai dạng địa hình: Địa hình núi và địa hình bình sơn nguyên trên núi. - Địa hình núi phân bố chung quanh vùng cao nguyên trung tâm thành phố. Từ thành phố Đà Lạt nhìn về hướng bắc, dãy núi Lang Biang sừng sững như một trường thành kéo theo hướng đông bắc – tây nam từ suối Đạ Sar đến hồ Đan Kia. Dãy núi này có nhiều đỉnh cao, trong đó có hai đỉnh cao nhất có độ cao 2167m và 2064m. - Dọc theo ranh giới giữa thành phố Đà Lạt và huyện Lâm Hà, kéo dài từ khu vực Măng Linh phía bắc đến tận hồ Tuyền Lâm ở phía nam là các dãy núi có độ cao trên 1600m kéo dài liên tục theo hình cánh cung án ngữ phía tây thành phố. - Về phía đông, các núi phân bố theo hình cánh cung chạy từ bắc xuống nam ôm lấy vùng trũng trung tâm Đà Lạt - Ở phía nam, địa hình núi chuyển tiếp sang bậc địa hình thấp hơn, đặc trưng là khu vực đèo Prenn với các núi cao xen với các thung lũng sâu. Địa hình phân cắt dọc và ngang lớn, các núi có độ cao tương đối từ 200 – 300m, sườn dốc. - Ở phía tây nam, gần ranh giới Đà Lạt – Lâm Hà, núi Pin Hatt (1691m) là một bộ phận trong dãy núi Voi. Địa hình bình sơn nguyên trên núi phân bố ở vùng trung tâm thành phố, được bao quanh bởi những dãy đồi đỉnh tròn, sườn thoải hướng về trung tâm là hồ Xuân Hương có cao độ 1477m. Phần lớn các đồi này là đồi trọc, có độ cao tương đối đồng nhau, càng xa trung tâm càng cao dần để đi đến vùng núi cao bao phủ chung quanh, làm cho trung tâm thành phố Đà Lạt có dạng như một lòng chảo hình bầu dục mà trục lớn theo hướng bắc – nam có độ dài độ 18km và trục nhỏ theo hướng đông – tây dài độ 12km. 54 1.4.3. Tài nguyên rừng. Lâm Đồng là một vùng đất cực Nam Tây nguyên, nơi tập trung một hệ thực vật phong phú, đa dạng mang những đặc trưng vùng nhiệt đới núi cao, mưa mùa và những nét của rừng Á nhiệt đới với nhiều kiểu rừng thưa (rừng lá kim), rừng kín thường xanh, rừng rụng lá, rừng hỗn giao và rừng tre nứa, … Rừng Lâm Đồng nói chung và Đà Lạt nói riêng là nơi nổi tiếng với nhiều loài cây, loài con quý hiếm được đưa vào sách đỏ. Hiện nay, nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đang chú ý đến các loài thông hai lá dẹt (Pinus krempfii), thông năm lá (Pinus dalatensis), thủy tùng (Glyptostrobus pensisis), thông đỏ (Taxus willichiana). Động vật rừng phong phú với nhiều loài chim, thú như: Heo rừng, Hoẵng, Nai, Sơn dương, Gấu, Két, Đa đa, Gõ kiến ... và còn là nơi cư trú và sinh sống của những loài động vật quý hiếm như tê giác một sừng, voi, bò tót, sói xám, voọc xám, beo gấm, báo hoa mai, gấu, vượn,… cùng vớ