Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH  VOÕ THÒ BÍCH VAÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT MÃ SỐ: 06-005 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS: TRẦN THANH THỦY TP. Hồ Chí Minh. 2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong Khoa Sinh và Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Xin gởi lời cảm ơn đến Phòng Khoa học Công nghệ- Sau đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ. Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn. MÔÛ ÑAÀU NS hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn. Một trong những đặc điểm nổi bật của NS là có hệ enzym ngoại bào rất phong phú. Trong đó, protease là một trong những enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất nhờ protease của chúng có tính chất bền vững rất cao và có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease từ động vật, thực vật và vi khuẩn. [22] Trong cơ thể động vật, thực vật quá trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể. Vì vậy, muốn thu được enzym cần phải phá bỏ tổ chức đó, nguồn thu enzym thường phải tươi và quá trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó, thời gian thu họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym là không kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzym của con người. Hiện tại và tương lai gần, NS vẫn là một trong những đối tượng quan trọng nhất, kinh tế nhất trong sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp vì: - Chúng có hệ enzym vô cùng phong phú với hoạt tính cao hơn các sinh vật khác. - Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên có thể sản xuất lượng lớn enzym trong thời gian ngắn. - Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy NS sinh enzym. - Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp. Các enzym từ NS được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), trong CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ô nhiễm MT. [4] Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế các tác hại do NS gây ra, con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến NS. Trước đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu NS phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST. Với điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen. Từ đây, có thể tìm được các chủng NS có hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính có lợi cho con người. Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt. Đây là nơi có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., trong đó NS chiếm số lượng rất lớn. Có thể thấy RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng NS có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác. Thảm thực vật và các hệ động vật có trong RNM Cần Giờ thật sự là các nguồn thức ăn tốt nhất cho VSV sống trong RNM đặc biệt là hệ NS. NS có khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngoài ra, NS còn có thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase… phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể hấp thu. Vậy hệ NS là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về NS sinh protease khá nhiều và chỉ tập trung trên đất liền. Các công trình khoa học chính thức nghiên cứu về NS sinh protease từ RNM Cần Giờ đã có song còn nhiều hạn chế. Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ NS chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Mục tiêu của đề tài: Phân lập và tuyển chọn một chủng NS có khả năng sinh protease cao từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Nhiệm vụ đề tài. - Phaân laäp NS từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh -Tuyeån choïn chuûng NS coù hoạt tính protease cao nhất - Nghieân cöùu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng NS được chọn. - Khảo sát caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh tröôûng vaø tổng hợp protease cuûa chuûng NS từ đó xác định động thái quá trình tổng hợp protease của chuûng NS nghiên cứu. - Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm protease thô từ NS - So sánh hoạt độ enzym của chủng NS nghiên cứu với chế phẩm enzym trên thị trường. Thời gian, địa điểm làm đề tài - Thời gian: từ tháng 9/2008- 7/ 2009 - Địa điểm thí nghiệm: PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khaùi quaùt veà RNM Caàn Giôø TP Hồ Chí Minh Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đông hiện hữu một khu RNM đan xen với hệ thống sông rạch dày đặc chứa đựng các HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều loài động thực vật đặc hữu của miền duyên hải Việt Nam. Đó là khu RNM Cần Giờ nằm gọn trong địa giới huyện Cần Giờ và rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam thành phố Hồ Chí Minh. Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha. RNM Cần Giờ giới hạn bởi các đoạn sông, rạch, tắc như sông Soài Rạp, sông Vàm Sát, rạch Đôn, tắc An Nghĩa, sông Lòng tàu, tắc Rổi, sông Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sông Thị Vải, sông Gò Gia , sông Cái Mép và biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km. Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá và quá trình nhiễm mặn. Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt. Lượng mưa: thấp nhất TP. Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9. [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. - Độ ẩm không khí: cao hơn các nơi khác trong TP. Hồ Chí Minh. Mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4 [36]. - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày. Các tháng có đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4 và tháng 5 [36]. - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực có thể lên đến 18% lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và tháng 10 [13]. * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa và các vườn cây ăn trái [34]. * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho thấy: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34]. + Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau [35]. Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [35] . * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này. Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34]. Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển. - Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng. Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá TV (Fell và cộng sự 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên [33]. Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST bởi vì NS tham gia các chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn. Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ, rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những SV khác [46]. Bản thân NS từ RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ và ấu trùng của một số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989). VSV ở RNM ngoài VK và NS còn có nấm men, xạ khuẩn,… chúng đóng vai trò hết sức quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái nơi này. Chúng tham gia bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng và MT sinh thái nói chung, cũng như vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài SV. Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này.  Vai troø cuûa RNM Một số loài TV ở RNM có thể xếp vào nhóm công dụng chủ yếu: 30 loài cây cho gỗ, than, củi, 14 loài cây cho tannin, 24 loài cây làm phân xanh, 21 loài cây dùng làm thuốc, 9 loài cây chủ thả kiến cánh đỏ, 21 loài cây cho mật nuôi ong, 1 loài cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2]. Ngoài ra, RNM còn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 loài lưỡng cư, 22 loài bò sát, 67 loài chim, 21 loài thú,… Các SV ở nước rất phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 loài tôm, 66 loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh và 22 loài ĐV đáy [2] . Ngoài ra các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái RNM đã phát hiện trong đất RNM có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và chủng NS Paecilomyces farinosUIs. Các loại vi sinh vật này tạo được protein tinh thể độc, có khả năng tiêu diệt một số loài côn trùng gây hại cho người và động thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi. Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm thực bờ biển. RNM cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuôi của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,… Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18]. 1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ 1.2.1 Vị trí phân loại. Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina và Basidiomycotina [41] Ngành phụ Deuteromycotina được chia theo 3 lớp: [42] + Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm men và có sự nảy chồi. + Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống, không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT. + Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT: Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales. Theo C. J. Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ protista) và giới Protista. Giới nấm có 4 ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota. Phần của nấm trong giới Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota. Bốn ngành khác của nấm được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota. Lý do của sự phân chia này là từ những bằng chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học. Các bằng chứng chứng minh sự tồn tại của 3 nhóm nấm khác nhau. Gần đây, sau khi hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu trúc và sắp xếp lại. Tất cả các phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới nấm. Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần còn lại [43]. 1.2.2 Hình thái, cấu trúc Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn. Ngược lại, các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách. Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào. Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại các bộ phận sợi nấm bị thương tổn. Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể [5]. Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân. Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào. Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào. Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao đó tiến dần vào trong và lấp kín lại. Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng. Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh. Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể chuyển động, đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm). Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi nấm. Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử. Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm. Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm [4] [44]. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể golgi [4], các giọt lipid, các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitô đường kính 40-70 nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome) Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn Ribosome của nấm thuộc loại 80S đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S [45] Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì BT của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu. Ngoài những đặc điểm chung thì NS từ RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau: Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14]. Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS từ RNM. Do đó, phần lớn các NS từ RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống. Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzym, nhất là các enzym ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng của NS trong quá trình cạnh tranh ở MT sống. Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc. Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này bằng khả năng sinh tổng hợp được hệ enzym phân giải các chất độc hại. RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão. Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13]. Nhờ có những đặc tính sinh học (a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm Hình 1.2: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi (b) Cấu trúc của sợi nấm Vách tế bào Màng tế bào Nhân Thể golgi Không bào Ti thể Luới nội chất Nhân đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại mà NS có thể cải thiện MT sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật. Đa số các NS từ RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 1,5 % - 2,5%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13]. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM. Tóm lại, NS ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về NS RNM còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng, 1.2.3 Sinh sản của NS Nói chung, NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính NS sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Bào tử kín: được tạo thành từ đỉnh một sợi nấm được phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản. Bào tử trần: là loại bào tử vô tính thường gặp nhất ở nấm. Chúng có hình dạng, kích thước, kết cấu hết sức phong phú. Tế bào sinh bào tử trần gọi là giá (hay cuống) bào tử trần (conidiophore). Hình 1.3 Bào tử kín (a) và bào tử trần ( b) của NS Sinh sản hữu tính Xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:  Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử  Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid)  Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội). a b b Hình 1.4: Sự tiếp hợp của NS 1.2.4 Vai troø cuûa NS NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có họat tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydrat [5],[9].  Họat tính enzym thủy phân ngoại bào. Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể [22]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. NS có tiềm năng lớn nhất sinh các lọai enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: xellulase, protease, amylase, pectinase và kinase [5].  Enzym cellulase: Cellulase là một nhóm nhiều enzym xellulase C1( endo cellulase), cellulase Cx(exoxellulase) và xellobiaza có tác dụng thủy phân cellulose tạo thành glucose. Các VSV có hoạt tính cellulase cao là các loài vi khuẩn, xạ khuẩn chịu nhiệt và NS. Trong đó, các chủng NS thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong chăn nuôi để nâng cao sự tiêu hóa cellulose ở động vật. Ngoài ra chúng còn được dùng trong sản xuất glucose từ bã và sản phẩm thải ở của công nghiệp rừng, làm phân bón, xử lí rác thải[17],[18].  Enzym protease: Protease là nhóm enzym thủy phân protein thành peptit và axit amin bằng cách cắt đứt các liên kết peptid. Protease gồm có proteinaza và peptidaza chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng. Protease NS có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi khuẩn, người ta chia protease NS thành ba nhóm: protease axit, protease kiềm và protease trung tính. NS có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus… Protease NS thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy ….[8], [10],[20].  Enzym amylase: Xúc tác quá trình phân giải glycogen và các polysacarit thành đường glucose. Nhiều loại NS có khả năng sinh amylase. Tổ chức phức hệ enzym amylase của NS gồm α amylase, γ amylase (glucoamylase), α- glucozidaza (mantaza) và dextrinaza sẽ cắt đứt các liên kết α- 1,4- glucoside và α- 1,6 glucoside trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysacarit tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là các chủng thuộc chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma Rhizopus, Mucor,… Amylase được dùng trong sản xuất siro, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, …[20], [21].  Enzym kitinase: Kitinase phân giải kitin, kitin là các biopolyme chứa các gốc N- acetyl- glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β- 1,4- glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong vỏ tôm, cua, ốc …rất nhiều. NS thuộc chi Trichoderma, Chaetominum,… sinh enzym kitinase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin. Như vậy, NS còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông – lâm – ngư – nghiệp [16]. Các chủng NS thuộc các chi Acremoium, Penicillium, Aspergillus còn có khả năng sinh enzym phân giải dầu mỏ là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lí ô nhiễm dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ, các loài NS có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó.  Khả năng sinh kháng sinh của NS. KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephaco- sporin- C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch hầu, uốn ván… Trong phẫu thuật , KS dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất kháng có nguồn gốc từ VSV của RNM đang được quan tâm nghiên cứu hàng đầu và ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực hiện nay [14].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng. Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ từ VSV ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit acetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit citric bằng A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [19], [20] 1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam Hiện nay, có khoảng 800 - 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2 loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7 loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài. Qua đó, có thể thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của ngành VSV học [35]. Năm 1988, Agate A.D, Subramania C.V và Vanuci M đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV học RNM cần được các nhà khoa học giải quyết. Trong đó, có lĩnh vực phân loại và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới. Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ông đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao, bao gồm 23 loài thuộc Ascomycetes, 17 loài thuộc Deuteromycetes và 3 loài thuộc Basidiomycetes. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó, bao gồm 87 loài thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes. Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới. Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994) Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài cây ngập mặn. Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là các loài Alternaria alternate, Rhizopus nigricans, Aspergillus sp [41]. Một số NS còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị đối với sinh học và y học (theo Mai Thị Hằng và cộng sự ) [11]. Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng NS có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng. Với đặc tính này NS góp phần quan trọng giúp phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ [1]. Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay [20]. NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống và với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13]. Bên cạnh đó chúng còn có chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường. Kết quả nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có hoạt tính đối kháng với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, cùng với khả năng chịu mặn. Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ [18]. Năm 2009 công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương đã tuyển chọn được các chủng NS có hoạt tính amylase cao. Với đặc tính này của NS người ta có thể sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền như bã mía, bã khoai mì để sản xuất rượu, bia cho năng suất cao. Cùng năm 2009 Võ Thị Bích Viên đã khảo sát tính đối kháng của một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị trong y học. 1.3 Protein và enzym protease 1.3.1 Protêin Protein là một loại hợp chất hữu cơ cao phân tử có kết cấu hoá học phức tạp. Protein được cấu thành từ 4 nguyên tố chính là cácbon, hiđro, oxy và nitơ. Các loại prôtêin đơn giản gồm các axit amin nối nhau nhờ các liên kết peptit bền vững. Các loại prôtêin phức tạp hơn có liên kết thêm với các nhóm bổ sung. Prôtêin chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào. Cấu trúc của prôtêin Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi pôlipeptit. Đầu mạch pôlipeptit là nhóm amin (của axit amin thứ nhất), cuối mạch là nhóm cacbôxyl (của axit amin cuối cùng). Một phân tử prôtêin đơn giản có thể chỉ được cấu tạo từ vài chục axit amin nhưng cũng có những phân tử prôtêin bao gồm nhiều chuỗi pôlipeptit với số lượng axit amin rất lớn. Chức năng của protein Prôtêin là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống. Chúng đóng vai trò cốt lõi của cấu trúc nhân, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học Các enzym có bản chất là prôtêin đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học. Một số prôtêin có vai trò như những “xe tải” vận chuyển các chất trong cơ thể (ví dụ hêmôglôbin). H2O Tham gia cấu thành các kháng thể có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm hại của vi khuẩn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể Điều tiết áp lực thẩm thấu: Nếu trong bữa ăn bị thiếu protein lâu ngày, hàm lượng protein trong huyết tương sẽ hạ thấp, thành phần nước trong máu sẽ thấm quá nhiều vào các mô xung quanh, gây ra phù nề do thiếu dinh dưỡng. Các hoocmôn - phần lớn là prôtêin – có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất trong tế bào và trong cơ thể (ví dụ insulin điều hoà lượng đường trong máu). . Nhiều loại prôtêin tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể (ví dụ miozin trong cơ, các prôtêin cấu tạo nên đuôi tinh trùng). Lúc thiếu hụt cacbohiđrat và lipit, tế bào có thể phân giải prôtêin dự trữ cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể hoạt động. Tham gia cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể: là công dụng sinh lý chủ yếu nhất của protein thần kinh, cơ bắp, nội tạng,…Sự sinh trưởng phát triển của cơ thể, sự đổi mới của các tổ chức suy lão, sự phục hồi các tổ chức sau tổn thương đều cần đến protein [40]. Ngoài ra, một số prôtêin còn có vai trò là giá đỡ, thụ thể… Sự đa dạng của cơ thể sống do tính đặc thù và tính đa dạng của prôtêin quyết định. 1.3.2 Đặc điểm của protease từ NS. Enzyme protease là nhóm enzym xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO- NH-)n trong phân tử protein hoặc các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.5 : Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid. Protease cần thiết cho các sinh vật sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. H2NCH CO N H CHCO – NH CH COOH  R1 R2 Rn H2N CH COOH + H2NCHCO – NHCHCOOH R1 R2 Rn H2O Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Protease VSV được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid : pH 2- 5 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9.5 - 10.5 Phần lớn những protease acid thương mại được thu từ NS. Các NS được nghiên cứu kỹ nhất và được sử dụng nhiều nhất để thu enzym là Asperillus saitoi, Asperillus niger, Asperillus oryzae ( Keay etal). Khá nhiều protease acid khác được thu từ Rhizopus sp ( Wang và Hesseltine ) đã được nghiên cứu. 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng protease NS trên thế giới và Việt Nam. Protease VSV được nghiên cứu và thu nhận đầu tiên vào năm 1884 do người Nhật tên là Takamine. Đó là chế phẩm được tách từ chủng nấm mốc Asperillus oryzae (Kretovitch). Tiếp theo đó, vấn đề nâng cao khả năng tạo protease của các chủng nấm mốc ứng dụng cho công nghiệp rượu bia đã được nghiên cứu ở Nhật (Yosida, ) và ở Mỹ ( Matsushima, ). Đến những năm 70, chế phẩm protease của các chủng nấm mốc Asperillus oryzae có tên thương mại là Proteorizin Px đã được dùng nhiều ở Liên Xô (Iarovenko, 1973). Protease của các NS có tính chất bền vững rất cao và tùy thuộc vào từng chủng giống và điều kiện nuôi cấy mà nó mang tính chất kiềm, axit hay trung tính (Harigara, 1971). Trong công nghệ thực phẩm người ta sử dụng protease NS để sản xuất phomat ( Mohanty et al, 1999), sản xuất bánh mì (Hozova et al, 2003) hay chế biến các sản phẩm từ đậu tương (Ghazi et al ,2003; Ma et al, 2004) Ở Việt Nam, năm 1993- 1994 TS. Trương Thị Hòa và các cộng sự Viện Công nghiệp thực phẩm đã nghiên cứu và ứng dụng enzym protease của A.oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn. Từ năm 2000-2001 nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh cùng các cộng sự phòng vi sinh, Viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu cải thiện quy trình công nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae . Quy trình mới này rút ngắn được thời gian sản xuất, cho chất lượng nước tương ổn định, mùi vị thơm ngon tự nhiên. Năm 2003, Lê Thị Cẩm Tú tiến hành chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao và chịu mặn. Luận văn thạc sĩ sinh học Trường ĐHKHTN – TP.HCM. Năm 2007 Th.S Phan Thị Thanh Quế sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae để thủy phân protein thịt cá trong chế biến nước mắm. Ngoài những nghiên cứu về protease của NS còn có những công trình nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ NS như: Các chế phẩm từ NS được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loại côn trùng, VSV gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau ( Harman và Kubicek, 1998) Từ NS RNM người ta đã thu được một số chất kháng sinh mới có khả năng chống các VSV gây bệnh đã nhờn các loại thuốc kháng sinh hiện có ( Isaka M, Suyarnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002) Năm 2007 Phan Thanh Phương khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân lập được một số chủng NS phân giải các thành phần hydrocacbua thơm và các hợp chất mạch vòng benzen trong dầu mỏ. Năm 2007 Phạm Thị Thanh Thuý đã nghiên cứu khả năng phân giải carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ.  Một số ứng dụng của protease [39], [28] Trong chế biến thực phẩm Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng. Muốn vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thời gian chế biến thường dài, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử dụng chế phẩm protease thực vật (bromelain và papain) và từ VSV để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn bột, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [6]. Công nghiệp dệt Trong công nghiêp dệt, protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. Công nghiệp thuộc da Protease được sử dụng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông. Ở Mỹ, chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [4] . Chế biến các loại bột giặt Ngày nay, enzyme được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ... Hương mỹ phẩm Chế phẩm protease có thể pha chế trong mỹ phẩm như xà bông, dầu gội, kem xoa, dầu chải tóc, có tác dụng làm da, tóc mềm mại, tách biểu bì đã chết, tạo sự phát triển lớp da non. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong số ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, KS 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của NS a. Nguồn cacbon Trong MT nuôi cấy NS sinh protease nhất thiết phải có protein làm chất cảm ứng và nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbohydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [24],[25]. Nguồn cacbon cho sinh trưởng của NS thường dùng là glucose. b. Nguồn nitơ Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của NS. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất là NH4 + và NO3 - , chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm imin và amin. Các muối amon của axit hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của NS hơn là muối amon vô cơ. Cơ chất dùng để cảm ứng NS sinh protease thường là bột đậu nành, cám, ngô, casein, cao thịt,…[28]. c. Độ ẩm Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30-80% (Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuôi cấy NS thu protease, độ ẩm tối ưu là 50-60%. Nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho VK phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở NS, hoạt tính enzym sẽ giảm.[25] d. pH Sự sinh trưởng của NS sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra axit hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải phóng amonium qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các loài NS khác nhau từ 3-8 ( Prior, 1992) tùy vào từng chủng . Nhưng đa số NS pH tối thích là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH 9 [26]. e. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh protease. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số NS từ 30-320C [26]. Nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35 - 400C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 00C và ở 600C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C NS phát triển chậm , sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzym. Nếu nhiệt độ quá cao có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym bị ức chế [25]. f. Thời gian Thời gian nuôi cấy NS thu enzym trong khoảng 36-60 giờ. Tùy từng chủng và tùy loại enzym mà thời gian nuôi cấy có thể ngắn hơn hay dài hơn. Đối với A.oryzae và A. awamori nuôi trên MT cám để sản xuất amylase khoảng 36-40 giờ, nhưng nuôi A .oryzae để thu protease khoảng 48 – 52 giờ [25]. 1.3.5 Nuôi cấy và thu nhận enzym từ NS [20] Nuôi cấy Nuôi cấy NS để thu enzym người ta thường dùng MT bán rắn Môi trường bán rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như: cám, ngô, bột đậu tương,… Môi trường bán rắn hay dùng nhất là cám. Chất lượng cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzym, muốn nâng cao hoạt tính một số enzym cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bột đậu tương giàu protein, bã khoai mì giàu tinh bột, củ cải đường giàu pectin và xelullose,….Ngoài ra, cần bổ sung thêm khoảng 15 – 20% trấu, rơm băm vụn, mùn cưa…để tạo độ xốp.cho MT. Môi trường bán rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60 – 65% rồi đem thanh trùng. Môi trường được tãi mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2-2.5cm hoặc trong các bình tam giác, để nguội tới 300C thì tiến hành cấy giống. Quá trình nuôi cấy NS trên môi trường bán rắn được chia làm 3 thời kì: Khoảng 10-14 giờ đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kì này chưa hình thành enzym Thời kì giữa kéo dài khoảng 14-18 giờ, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát thấy bằng mắt thường Thời kì thứ ba kéo dài trong khoảng 10-20 giờ ,thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng NS, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzym tạo thành tối đa. Các phương pháp thu nhận enzym [20], [24] * Chiết rút enzym từ MT bán rắn : Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym Các bình tam giác đã cấy giống sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem nghiền mịn bằng cách giã trên cối với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thủy tinh đã được rửa sạch và sấy khô. Cát hay bột thủy tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của VSV mà không làm thay đổi bản chất enzym. Sau khi nghiền MT, cho vào đó lượng nước (ở nhiệt độ 25- 28 0C) gấp 4-5 lần khối lượng MT để hòa tan enzym. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu sẫm , khá trong, chứa 10-15% chất khô hoà tan. Tiến hành lọc hoặc quay ly tâm 3000 vòng/ phút /15 phút, thu và bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 40C. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô. * Thu nhận enzym từ dịch nuôi cấy chìm: Dịch nuôi cấy chìm sau khi lọc sinh khối NS và các tạp chất rắn không tan để thu nhận enzym. Về nguyên tắc tách enzym từ dịch lọc nuôi cấy chìm cũng tương tự như tách từ dịch chiết từ MT bán rắn. Tinh sạch enzym Nguyên tắc: Dung môi hữu cơ vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm protein mất nước và tạo tủa. Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Tiến hành: Tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp. Thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút. Đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng - Caùc chuûng naám sôïi phaân laäp töø caùc maãu ñaát, thaân, laù caây ôû 4 xã RNM Caàn Giờ TP. HCM: Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý Nhơn - Bột đậu tương ,mua ở chợ Tân Định – TP. HCM - Cám gạo, trấu mua ở Vĩnh Long - Các VSV kiểm định: E.coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur – TP. HCM - Chế phẩm enzym protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu (VN) tỉnh Đồng Nai. 2.1.2 Hóa chất – thiết bị  Hóa chất - Glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactosse, pepton, cazein, kitin, tinh bột tan, agar, cồn. - K2HPO4, KCl, NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO47H2O, HgCl2, NH4NO3  Thiết bị, dụng cụ - Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng Huxley (Đài Loan) Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam) Tủ sấy Memmert (Đức) Tủ ấm Binder (Đức) KHV quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật) Tủ lạnh (National - Nhật) Máy đo pH Hana (Nhật) Máy li tâm Heraeus( Đức) Cân điện tử Scientech ( Mỹ) Máy lắc (Gerhardt - Đức) - Các dụng cụ thí nghiệm: Thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy, giấy lọc, lame, lammel, bông mỡ , bông thấm nước…. 2.1.3 Môi trường  MT1: (Czapek) Môi trường phân lập NS [22], [32] NaNO3 3,0g K2HPO4 1,0g MgSO4 0,5g KCl 0,5g FeSO4 0,1g Glucose 20g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT2: Glucose Yeast Agar (YEA) MT nuôi cấy NS [32] Cao nấm men 4g Agar 20g Glucose 20g Nước biển 1000ml pH = 5,5 – 6.0. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT3 thử hoạt tính enzym cellulose [30] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g CMC 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT 4: thử họat tính protease [14] K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Cazein 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT 5: thử hoạt tính amylase [30] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Tinh bột tan 15g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT6 thử hoạt tính kitinase [16] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Bột kitin 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT7 :Môi trường nuôi cấy NS tạo enzym protease [16] Cám :70% Trấu :25% Các nguyên liệu chứa chất cảm ứng:(Bột đậu nành ) :5% Độ ẩm môi trường 60-65% Khử trùng 1210C trong 30 phút  MT 8: thử hoạt độ enzym protease [20] Dung dịch NaOH 0,5N Acid trichloacetic 10% Casein 1% (R55) Tyrosine (R57) Thuốc thử Folin- Ciocalteu (R56)  MT9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [21] KH2PO4: 3.3g MgSO4: 0.4g KNO3 : 3g Na2HPO4 : 0.7g Nước biển : 1000ml Dầu DO: 5ml pH = 5.5 -6.0.Khử trùng ở 1atm/30 phút.  MT10 : Meat peptone agar ( MPA): MT nuôi cấy giữ giống VK kiểm định [19] Pepton : 5g NaCl: 5g Cao thịt: 5g Agar : 20g nước cất: 1000ml pH: 7,5. khử trùng 1atm/30 phút  MT11 MT cơ chất cảm ứng MT 11.1 : cám – trấu- đậu nành ( 70% : 5%: 25%) MT11.2 : cám - trấu - bột bắp ( 70% : 5%: 25% 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Các phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Lấy mẫu Phân lập các chủng NS từ các mẫu lá vàng trên cành (Ký hiệu là L), lá mục (LM), cành khô (CK), cành mục (CM), đất mặt (Đ), đất sâu 5 – 10cm (ĐS) từ RNM Cần Giờ. Tiến hành thu mẫu 3 đợt vào tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm 2009 tại 4 xã Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng cắt khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm, ngày tháng lấy mẫu. Các mẫu được bảo quản lạnh và phân lập ngay không quá 24 giờ [32], [37] Với mục đích thu được nhanh các chủng có khả năng sinh protease như mong muốn, chúng tôi chuẩn bị sẵn MT có chất cảm ứng sinh protease ( ghi ở mục 2.1.3) trong bình tam giác đặt ở nhiều vị trí khác nhau như : ở mặt đất, thân cây, cành cây tại RNM Cần Giờ. Sau một tuần thu các bình tam giác lại để phân lập. Hình1.6 Baûn ñoà RNM Caàn Giôø vaø ñòa ñieåm laáy maãu. 2.2.1.2 Phân lập NS theo phương pháp pha loãng mẫu (theo F. Uyenco (1988) [32], [37]. a. Nguyên tắc Tách rời các bào tử NS . Nuôi cấy các BT trên MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, cách biệt nhau. b. Tiến hành Cân 10g đất, lá, thân (đã nghiền nhỏ) cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển. Sau đó đưa vào máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút, thu được dịch lọc có độ pha loãng 10-1. Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2). Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3. Sau đó, ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của NS [32], [43]. c. Yêu cầu Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết. 2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc: Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của NS . b. Tiến hành Cho 0,2 ml dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendoff, khử trùng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút, để nguội. Nuôi cấy NS đạt đến độ trưởng thành. Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT cho vào ống eppendoff, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh 4- 6 0C [32]. 2.2.1.4 Quan sát hình thái NS * Quan sát đại thể NS NS sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng. - Dùng que cấy lấy một ít BT của NS từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm trên chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp. Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch. - Nuôi cấy NS trong tủ ấm 3-7 ngày rồi quan sát.và mô tả các đặc điểm KL: + Hình dạng, kích thước KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5] * Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J.T.Dunean ) Chuẩn bị MT thích hợp (YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2. Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước vô trùng. Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C. Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái NS. Quan sát dưới vật kính 40, 100 và mô tả các đặc điểm: + Giá BTT, thể bình và cuống thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai. 2.2.1.5. Hoạt tính enzym ngoại bào của NS [30] a. Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzym của NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt quanh KL b.Tiến hành  Phương pháp cấy chấm điểm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT6, MT7, MT8, MT9, MT10. Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT ( 3 điểm/ hộp) Ủ các hộp petri trên trong tủ ấm 300C trong 3-5 ngày. c. Kiểm tra kết quả Kiểm tra họat tính xellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch: - Nếu NS có hoạt tính xellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL do cellulose bị phân giải. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt. - Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL . Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm - Nếu NS có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giả có màu nâu đỏ nhạt Kiểm tra hoạt tính protease : Dùng HgCl2 10% nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.1.6 Khả năng chịu mặn của NS [6] a. Nguyên tắc Mỗi loài NS thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính protease khác nhau. b. Tiến hành Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%. Cấy 3 điểm các chủng NS nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl. c. Kết quả Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng. Thử hoạt tính enzym ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 ứng với từng nồng độ muối. 2.2.1.7 Khả năng phân giải dầu [21]. Cấy NS trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của NS, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải của NS. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, tiến hành quan sát bình tam giác. Nếu NS sinh trưởng được có nghĩa NS đó có khả năng phân giải dầu, ngược lại NS chết thì NS đó không có khả phân giải dầu. 2.2.1.8. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh (Egorov và cộng sự, 1969) [19]. a. Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thích hợp, không dùng nước biển mà dùng nước cất thay thế. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng NS cần thử hoạt tính kháng sinh. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định. c. Kiểm tra kết quả Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Xác định hoạt độ protease [16] Định nghĩa Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35,50C, pH 7.6) Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein( hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt độ protease. Hóa chất: Dung dịch Na2HPO41/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4 . 12H2O trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177mldung dịch Na2HPO41/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng . Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm Sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml. Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 500ml. Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosine trong dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml. Tiến hành: Dựng đường chuẩn tyrosine: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Dung dịch HCl 0,2N 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆ OD) theo lượng tyrosine ở các ống. Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu: Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1%(ml) 5 5 TCA 10%(ml) 0 5 Dịch enzym mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút. TCA 10%(ml) 5 0 Dịch enzym mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử folin 0.6 0.6 Lắc đều và để 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm Cách tính: Hoạt độ protease: Hoặc HT (UI) = mvT KVX .. .. (UI/g) X: số µ mol tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (11ml) v: thể tích lọc đem phân tích (1ml) K: độ pha loãng mẫu T: thời gian phản ứng (phút) m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g) 1UI (Anson) = 1 micromol tyrosine/ml/ phút hoặc = 1 micromol tyrosine / g /phút 2.2.2.2 Phân loại NS bằng Di truyền phân tử Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại 1 trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS. Tiến hành  Ly trích DNA và nhân bản Lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendoff. Cho thêm 180 µl TE1X và 20 µl proKprep rồi đem ủ ở 56oC qua đêm vT KVX UIHT . .. )(  (UI/ml) Thêm 500 µl Phenol Buffer và 500 µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC trong 15 phút. Sau đó cho thêm 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex. Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 10 phút. Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendoff mới. Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 – 2 giờ. Ly tâm 14.000 vòng / phút ở 4oC trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần. Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 15 phút rồi đổ bỏ dịch nổi Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10 – 15 phút. Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X. Lấy 5 µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR - Bước 1 ( biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao thường khoảng 950C, trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Bước 2 (lai) : nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30 giây đến 1 phút. - Bước 3( tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất . Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến 1 phút.  Giải trình tự gen Nhằm xác định trình tự nucleotit dựa vào 2 phương pháp: - Phương pháp hóa học: ( phương pháp Maxam và Gilbert) : dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA. tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotit - Phương pháp enzym học ( phương pháp Sanger và phương pháp cải biên): Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzym DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotit cùng với các deoxynucleotit thông thường. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotit Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR có độ dài là 260 bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự gen 28 S rARN và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu. Hình sau đây minh họa kết quả Fungi PCR được điện di trên gel agarose 2% 2.2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng NS a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ [18] - Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của chủng NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong đó glucose lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon khác như: lactose, sucrose, maltose, sorbitol. Trọng lượng các chất thay thế được lấy bằng lượng cacbon trong MT1. Mẫu đối chứng là MT1. - Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, chúng tôi dùng MT1, thay NaNO3 bằng các nguồn nitơ khác : bột đậu, cao thịt, casein, NH4NO3. với lượng tương tự. Mẫu đối chứng là MT1. Cách tiến hành: Cấy chấm điểm NS nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng để tủ ấm trong 3 ngày, đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của chủng nghiên cứu. Quy ước: d = 0 mm : không mọc d= 1- 2mm : mọc yếu d= 2,1- 5 mm : mọc trung bình d= 5,5 – 10 mm : mọc tốt d= 11- 30 mm : mọc rất tốt b. Ảnh hưởng của pH [18] Để xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 và điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 7.0, 7.5, 8.0 . Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm NS, nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng của chủng ứng với từng pH khác nhau. c. Ảnh hưởng của nhiệt độ[18] Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các chủng NS, nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Khi NS đạt đến độ trưởng thành tiến hành đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng. 1 3 2 4 5 6 7 MK d. Ảnh hưởng của thời gian [18] Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các giống NS nghiên cứu. sau đó ủ trong tủ ấm ở các thời gian khác nhau: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ. Đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng. e. Ảnh hưởng của độ mặn Sử dụng MT2 có bổ sung muối NaCl với các nồng độ khác nhau từ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, . Mẫu đối chứng nuôi trên MT không có NaCl Cấy chấm điểm chủng nấm nghiên cứu lên lên các MT có nồng độ muối khác nhau. Nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn. 2.2.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng NS [4][18] a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Nhằm chọn MT thích hợp nuôi NS sinh protease, chúng tôi chọn các MT ký hiệu M1, M2, M3, M4, M5 để khảo sát quá trình nuôi cấy chủng NS . - Môi trường M1 (MT đối chứng) gồm: Cám : trấu : đậu nành tỉ lệ :70 : 25 : 5% - Môi trường M2 gồm: Cám : trấu : casein - tỉ lệ 70: 25: 5% - Môi trường M3 gồm: Cám : trấu - tỉ lệ 70: 30%: - Môi trường M4: cám : trấu : cao nấm men - tỉ lệ 70: 25: 5% - MT5: Cám: trấu: cao thịt –tỉ lệ 70: 25: 5% Độ ẩm các MT 60%, nhiệt độ 300C Chủng NS được nuôi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng loại MT trên bằng phương pháp Anson b. Ảnh hưởng của thời gian Để xác định thời gian thích hợp cho quá trình tổng hợp protease, tiến hành nuôi chủng NS trên MT đã chọn trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60giờ, 72 giờ. Sau đó, xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson c. Ảnh hưởng của pH Để xác định pH thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn dùng HCL 5% hoặc NaOH 5%, điều chỉnh pH MT về các độ pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng pH bằng phương pháp Anson d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Nuôi chủng NS trên MT đã chọn ở các nhiệt độ khác nhau: 200C , 250C, 300C, 350C, 400C, 450C khi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson e. Ảnh hưởng của độ mặn Để xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease . Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn với các nồng độ muối khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson. f. Ảnh hưởng của độ ẩm Để xác định độ ẩm thích hợp cho quá trình tổng hợp protease. Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT đã chọn điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson. 2.2.3 Động thái quá trình tổng hợp protease Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt lực của enzym protease. 2.2.4 Khảo sát một số đặc tính của enzym thô thu được từ chuûng NS a. Tách và thu nhận protease Tiến hành tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.  Tác nhân tủa là aceton và ethanol 960 Nguyên tắc: Dung môi hữu cơ bổ sung vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm protein mất nước và tạo tủa. Tiến hành: Bước 1: Thu dịch enzym từ canh trường nuôi cấy NS giữ lạnh dịch enzym và dung môi hữu cơ ( aceton, ethanol 960) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C. Khảo sát với tỷ lệ Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzym: cồn) Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzym : aceton) Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzym và khuấy đều, giữ ở nhiệt độ lạnh 30 – 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh.  Tác nhân tủa là muối sulfate amon (NH4)2SO4 Nguyên tắc: Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Tiến hành: Bước 1: Thu dung dịch enzym từ dịch nuôi cấy Bước 2: Tiến hành tủa: Cho muối vào dung dịch enzym tỉ lệ 1:3 rồi khuấy đều, giữ ở nhiệt độ phòng 45 – 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa. Bước 3: Chế phẩm enzym thô thu được còn lẫn nhiều muối. Thẩm tách qua màng thẩm tách là phương pháp dùng để tách các phân tử muối ra khỏi protein. Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường...) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzym). Màng thẩm tách thường làm bằng collodion hay celophan. Bước 4: Sấy khô chế phẩm enzym ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh. Hiệu suất thu nhận H = m/v Trong đó: m là khối lượng enzym thu được sau khi tủa V là thể tích dung dịch có chứa enzym trước tủa tính bằng ml. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu,sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50 ,60, 70, 800C. c. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym Dịch enzym thu được xử lí ở các nhiệt độ khác nhau 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100oC trong pH thích hợp. Sau đó xác định hoạt độ . Độ bền enzym được tính bằng số % hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, đối chứng là hoạt độ của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở nhiệt độ 4oC. d. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng thời gian khác nhau:10’, 20’,30’, 40’, 50’, 60’, 70’, 80’, 90’, 100’ e. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzym Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng pH khác nhau: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 2.2.5. So sánh hoạt độ protease của chủng A. oryzae với chế phẩm protease trên thị trường. Tiến hành khảo sát với 0,1g chế phẩm enzym protease của A. oryzae và enzym protease ngoài thị trường, mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ enzym protease bằng phương pháp Anson trong cùng một điều kiện nhiêt độ, pH, thời gian phản ứng. 2.3 Phương pháp toán học Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản - Phương pháp tính giá trị trung bình  : Giá trị trung bình n lần thí nghiệm. Xi : Giá trị lần thí nghiệm thứ i n : Số lần lặp lại thí nghiệm - Phương pháp tính khoảng ước lượng Trong đó: tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía. Sn +2(X) là phương sai mẫu. Sn +2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2 a =  ± tα S + 2n (X) √n CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo hai cách: truyền thống và sử dụng MT có chất cảm ứng để phân lập NS. Kết quả thu 333 chủng và được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.1 Kết quả phân lập NS từ RNM Cần Giờ Nguồn cơ chất Số lượng chủng NS Tỷ lệ % Đất: - Đất mặt - Đất sâu 10 cm 66 45 21 .9% 13.5% 6.3% Lá: - Lá vàng - Lá mục 75 25 50 22.5% 7.5% 15.01% Thân: - Thân khô - Thân mục 91 31 70 27.3% 3.9% 23.4% MT có chất cảm ứng 101 30.3% Từ kết quả ở bảng trên cho thấy khu hệ NS ở RNM Cần Giờ rất phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên thân, lá, đất mặt, đất sâu 5- 10cm. Trong đó, ở MT có chất cảm ứng số chủng NS nhiều nhất (101/333) chiếm 30.3% tổng số chủng phân lập được. Số chủng NS sống trên lớp đất mặt, trên lá mục và trên thân mục nhiều hơn lớp đất sâu. Điều này có thể giải thích vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc. Hơn nữa, đây là những nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào nhất do xác lá, thân, cành cây, xác các động vật như tôm, cua, giáp xác,….đang bị phân hủy [22] . Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả khi phân lập NS tại RNM như Mai Thị Hằng ( 2000), Khưu Phương Yến Anh (2007), Phan Thạnh Phương (2004). Võ Thị Bích Viên (2009) 3.2 Khảo sát và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao. * Tuyển chọn lần 1 Để kiểm tra khả năng sinh protease của 333 chủng NS đã phân lập được chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.1.5. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Khả năng sinh protease của 333 chủng NS phân lập từ RNM STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 C-Ư16 20 75 C-Ư64 12 149 TK208 9 2 C-Ư16.2 17 76 C-Ư60 15 150 TK5 2 3 C-Ư9 20 77 C-Ư71 11 151 TM6 9 4 C-Ư25.1 21 78 C-Ư72 10 152 TM8 6 5 C-Ư13 11 79 C-Ư75 1 153 TM162 11 6 C-Ư20.1 20.5 80 C-Ư61 16 154 TM153 3 7 C-Ư32 25 81 C-Ư36 17 155 TM186 2 8 C-Ư3 12 82 C-Ư47 17 156 TM200 4 9 C-Ư20 20 83 C-Ư46 22.5 157 TM221 2 10 C-Ư24.1 16 84 C-Ư37 15 158 TM216 1 11 C-Ư1 8 85 C-Ư5.2 15 159 TM165 1 12 C-Ư56 14 86 C-Ư69 16 160 TM179 1 13 C-Ư68 26 87 C-Ư74 2 161 TM120 7 14 C-Ư36.1 16 88 C-Ư73 2 162 TM212 9 15 C-Ư23 13 89 C-Ư51 15 163 TM135 4 16 C-Ư8 16 90 C-Ư58 14 164 TM232 1 17 C-Ư20.2 17 91 C-Ư25.1 4 165 TM228 14 18 C-Ư16.1 15 92 C-Ư70.1 16 166 TM214 6 19 C-Ư24.1 13 93 C-Ư43 6 167 TM342 2 20 C-Ư25.2 19 94 C-Ư21 2 168 TM217 24 21 C-Ư29 18 95 C-Ư 11 169 TM215 2 22 C-Ư41 11 96 C-Ư27 7 170 TM221 3 23 C-Ư45 14 97 C-Ư28 5 171 TM150 4 24 C-Ư70 16 98 C-Ư67 17 172 L6 12 25 C-Ư35.1 17 99 C-Ư10 1 173 L90 0.5 26 C-Ư44 16 100 C-Ư30 2 174 L72 3 27 C-Ư50 18 101 C-Ư2 4 175 L67 0.5 28 C-Ư63 11 102 Đ238 24.5 176 L89 0.5 29 C-Ư35 17 103 Đ239 12 177 L91 6 30 C-Ư39 15 104 Đ242 17 178 L66 11 31 C-Ư29.2 12 105 Đ272 18 179 L74 12 32 C-Ư15 9 106 Đ267 3 180 L60 6 33 C-Ư14.1 13 107 Đ240 12 181 L76 9 34 C-Ư14 12 108 Đ246 13 182 L60.1 15 35 C-Ư12 1 109 Đ24 3 183 L90.1 6 36 C-Ư7 8 110 Đ244 2 184 L67.1 7 37 C-Ư3 9 111 Đ279 8 185 L3 6 38 C-Ư29.1 6 112 Đ48 2 186 L69 14 39 C-Ư33 12 113 Đ269 11 187 L63. 13 40 C-Ư4 3 114 Đ7 14 188 L77 12 41 C-Ư6 7 115 Đ100 11 189 L95 14 42 C-Ư31 1 116 Đ11 4 190 L87 11 43 C-Ư11 15 117 Đ10 6 191 L63.1 14 44 C-Ư17 5 118 Đ273 7 192 LM122 2.5 45 C-Ư18 2 119 Đ2 18 193 LM108 4.5 46 C-Ư5.1 12 120 Đ9 3 194 LM120 47 C-Ư90 2 121 ĐS77 12 195 LM122.1 15.5 48 C-Ư81 7 122 ĐS79 13 196 LM138 13 49 C-Ư89 16 123 ĐS266 4 197 LM125 12.5 50 C-Ư83 8 124 ĐS253 7 198 LM89 17 51 C-Ư82 14 125 ĐS253.1 4 199 LM131 16 52 C-Ư85 15 126 ĐS46 3 200 LM136 15 53 C-Ư88 18 127 ĐS46.1 12 201 LM137 11 54 C-Ư84 11 128 ĐS1 17 202 LM1 8.5 55 C-Ư80 16 129 ĐS255 4 203 LM117 17 56 C-Ư86 9 130 ĐS256 1 204 LM1 15 57 C-Ư87 12 131 ĐS260 5 205 LM110 8 58 C-Ư34.2 16 132 ĐS262 8 206 LM61 1 59 C-Ư44 16 133 ĐS263 5 207 LM204 4 60 C-Ư42 15 134 ĐS265 11 208 LM112 8 61 C-Ư57 12 135 ĐS258 10 209 LM1.1 13 62 C-Ư45 12 136 ĐS259 16 210 LM109 18 63 C-Ư54 15 137 ĐS267 14 211 LM105 14 64 C-Ư38 13 138 TK144 12 212 LM78 1 65 C-Ư53 16 139 TK141 8 213 LM132 1 66 C-Ư34.3 17 140 TK1 9 214 LM44 2 67 C-Ư48 16 141 TK2 20 215 LM86 8 68 C-Ư40 12 142 TK145 1 216 LM75 2.5 69 C-Ư41 11 143 TK43 11 217 LM118 5 70 C-Ư66 13 144 TK216 1 218 LM78.1 4 71 C-Ư62 11 145 TK2 5 219 LM27 4 72 C-Ư52 15 146 TK229 1 220 LM113 4 73 C-Ư34 16 147 TK172 1 221 LM124 3 74 C-Ư59 15 148 TK30 4 222 LM96 1.5 Phân tích số liệu từ bảng 3.2 ta được kết quả như sau: - Tổng số chủng có enzym protease: 222/333 chiếm 66.7% + Chủng sinh enzym mạnh: 2/222 chiếm 0.9% + Chủng sinh enzym khá mạnh: 9/222 chiếm 4.05% +Chủng sinh enzym trung bình: 53/222 chiếm 23.9% + Chủng sinh enzym yếu: 158/222 chiếm 71.15% Trong đó: - Số chủng trên MT cảm ứng có enzym protease: 101/222 chiếm 45.5% - Số chủng trên lá có enzym protease: 35/222 chiếm 15.8% - Số chủng trên thân có enzym protease: 32/222 chiếm 14.4% - Số chủng trên đất có enzym protease: 54 chiếm 24.3% Qua phân tích, có thể thấy các chủng NS ở RNM Cần Giờ có khả năng sinh enzym protease khá cao ( 222/333) chiếm 66.7% tổng số chủng phân lập được Số chủng phân lập từ MT có chất cảm ứng nhiều nhất do chất cảm ứng là bột đậu nành và bột bắp có hàm lượng protein cao là nguồn cơ chất kích thích cho những chủng NS sinh enzym protease. Số chủng NS sinh enzym protease sống trên đất chiếm 24.3% cao hơn so với các chủng sống trên cành và lá. Nguyên nhân do nguồn thức ăn trong RNM Cần Giờ ngoài lá cây, thân cây còn có nhiều thành phần khác như vỏ tôm cua, xác động thực vật…cung cấp nguồn protein dồi dào cho các chủng NS sinh enzym protease [31],[32]. Từ 222 chủng trên chúng tôi chọn ra được 6 chủng NS sinh enzym mạnh và khá mạnh để nghiên cứu tiếp Tuyển chọn lần 2 Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của 6 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease của 6 chủng theo phương pháp Anson. Bảng 3.3: Hoạt độ protease của 6 chủng NS tuyển chọn STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập Hoạt tính protease D-d (mm) Hoạt độ protease (UI/ml) 1 TM217 Thân mục 24,0 0.88 2 Đ238 Đất mặt 24,5 1.071 3 C-Ư68 MT có chất cảm ứng 26,0 1.259 4 C-Ư32 MT có chất cảm ứng 25,0 0.951 5 C-Ư46 MT có chất cảm ứng 22.5 0.702 6 C-Ư25.1 MT có chất cảm ứng 21,0 0.589 Phân tích số liệu từ bảng 3.3 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym này của 06 chủng là thống nhất nhau. Trong đó một chủng có hoạt độ enzym cao nhất là C-Ư 68( 1,259 mol/ml ), có khả năng sinh trưởng tốt nhất và có nguồn gốc từ MT có chất cảm ứng. Như vậy để tuyển chọn nhanh các chủng NS sinh protease có thể sử dụng MT có chất cảm ứng là bột đậu nành. Từ đó chúng tôi quyết định chọn chủng C-Ư 68 để đi sâu nghiên cứu. Kết quả này được minh họa trong hình 3.1 và biểu đồ 3.1 và 3.2 Hình 3.1 Vòng phân giải casein của 6 chủng NS sinh protease mạnh Biểu đồ 3.1 Hoạt độ protease của 6 chủng NS Đ 238 C-Ư 46 C-Ư 25.1 C-Ư 68 C-Ư32 TM 217 Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng phân giải protase của 6 chủng Kí hiệu chủng H o aï t ñ o ä p ro te as e ( U I/ m l) Kí hiệu chủng H o aï t ñ o ä p ro te as e ( U I/ m l) 2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại Nhằm bước đầu xác định được tên chi của chủng NS tuyển chọn, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.1.4. Cấu trúc đại thể NS được quan sát dưới kính lúp 3 chiều. Cấu trúc vi thể NS được quan sát dưới KHV. Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S. Heekstra, Jens C. Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2004). Kết quả trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4: Các đặc điểm tương ứng để phân loại đến chi của chủng C-Ư 68 Đặc điểm hình thái chủng NS Các đặc điểm phân theo Bùi Xuân Đồng (2004) Xếp loại thuộc chi - Khuẩn lạc: Tròn, mặt phải lúc đầu màu trắng có sợi mịn như nhung về sau chuyển dần sang màu xanh rồi đến vàng hoa cau. Mặt trái lúc đầu trắng sau chuyển sang nâu vàng. Không tiết sắc tố. Mép khuẩn lạc xẻ rảnh nhỏ, sợi nấm mọc tỏa tròn - Sợi nấm màu xanh lục có vách ngăn, phân nhánh. - Cuống sinh BT không phân nhánh - Bọng hình chùy, hình cầu. - Thể bình một tầng hoặc hai tầng. - BT trần hình cầu không có vách ngăn. - Khuẩn lạc màu lục xám, xanh xám, xám, lục, lục vàng, lục nâu, nâu đen, trắng, vàng. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt. - Bộ máy mang BT không nhánh - Giá BT phát triển từ tế bào chân, không có hoặc có ít vách ngăn. - Bọng hình chuỳ, hình elíp, hình nữa cầu hoặc hình cầu. - Thể bình một tầng hoặc hai tầng. - BT trần không có vách ngăn, mặt ngoài nhẵn hoặc có gai, hoăc có nốt sần. Aspergillus Kết quả so sánh đặc điểm hình thái đại thể, vi thể chủng NS với đặc điểm tương ứng trong khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng năm 2004, chúng tôi kết luận chủng này thuộc chi Aspergillus. Sau đó, chúng tôi tiến hành định danh đến loài của chủng NS trên bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA tại Phòng xét nghiệm NK-Biotek công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Q7 TP.HCM ) Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA như sau: GCGTCCGTGCCGAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACTCCCGG CTAAAGGTGCCCCGGAGGGCACTCATTCCGGGAGCCTTTGACCGGCCGCCCAAC CGACGCTGGCCCGCCCCCAGGGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCT GGAGGCGAGTCTGGTCGAAGCGCTTCCCTTTAAAATTTCAC Trình tự này được đem đối chiếu với trình tự 28S rARN của các NS đã được định loại trong ngân hàng gen BLAST. Kết quả đối chiếu cho thấy chủng C-Ư 68 thuộc loài Aspergillus oryzae với độ chính xác là 100% 3.3 Khảo sát các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp protease của chủng A. oryzae 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS. Hình 3.3 Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng C-Ư 68 . a b Hình 3.2 Hình thaùi maët phaûi (a) vaø maët traùi (b) cuûa KL chuûng C-Ö 68 a. Ảnh hưởng nguồn cacbon Nhằm mục đích xác định nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Mẫu đối chứng nguồn cacbon là glucose. Kết quả trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của chủng A. oryzae Nguồn cacbon Đường kính KL của A. oryzae (mm) Đối chứng 29 Lactose 22.5 Sucrose 26 Sorbitol 22 Maltose 22.5 Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy chủng A.oryzae sinh trưởng tốt ở các MT có nguồn cacbon khác nhau, tuy nhiên NS ở mẫu đối chứng có nguồn cacbon là glucose phát triển mạnh nhất và sự sinh trưởng giảm dần ở mẫu sucrose  maltose  lactose  sorbitol. Sở dĩ NS ở mẫu có nguồn cacbon là glucose phát triển mạnh nhất do glucose là nguồn cacbon đơn giản dễ sử dụng với hầu hết các VSV trong đó có NS . RNM Cần Giờ là nơi có nhiều xác thực vật, glucose có trong thành phần của thực vật và NS sống ở đây sẽ sử dụng nguồn cacbon này. Như vậy glucose là nguồn cacbon thích hợp cho A. oryzae sinh trưởng. Kết quả này được minh họa trong đồ thị 3.2 0 10 20 30 Glucose Lactose Sucrose Sorbitol Maltose Nguồn cacbon Đ K k h u ẩ n l ạ c (m m ) Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Mục đích của thí nghiệm này xác định nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành nuôi chủng NS theo phương pháp 2.2.2.3. Mẫu đối chứng nuôi trên MT có nguồn nitơ NaNO3. Kết quả trình bày ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Nguồn nitơ Đường kính KL (mm) NaNO3 (ĐC) 29 NH4NO3 25 Bột đậu nành 34 Casein 23 Cao thịt 21 Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy chủng A.oryzae có thể đồng hóa được các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau, trong đó NS ở mẫu có bột đậu nành sinh trưởng mạnh hơn mẫu đối chứng khoảng 17,2%. Ở MT bổ sung bột đậu nành, KL mọc tốt và có màu sắc rất đẹp, đặc trưng của chủng A.oryzae. Do đó, chúng tôi cho rằng bột đậu nành là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng A.oryzae. Vì đây là nguồn nitơ mà ngay từ đầu chúng tôi đã chọn làm chất cảm ứng để phân lập nhanh những chủng NS có khả năng sinh protease cao. Mặt khác bột đậu nành là nguồn nitơ tự nhiên dễ kiếm và rẻ tiền, thích hợp cho việc nuôi cấy NS sinh enzym với số lượng lớn. Kết quả này phù hợp với nghiên cưú của Lê Thị Cẩm Tú ( 2003) là A.oryzae sinh trưởng tốt nhất trên nguồn nitơ là bột đậu nành. 0 5 10 15 20 25 30 35 NH4NO3 Bột đậu nành Casein Cao thịt Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae c. Ảnh hưởng của pH Cũng như nguồn cacbon và nitơ, pH là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của NS. Để xác định độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của NS chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.7 Đ K k hu ẩn l ạc ( m m ) Nguồn nitơ NH4NO3 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae pH Đường kính KL A. oryzae (mm) 6.5(ĐC) 27.5 4.0 8 4.5 14 5.0 19 5.5 23 6.0 25.5 6.5 27,5 7.0 26 7.5 24.5 8.0 23.5 Kết quả từ bảng 3.7 cho thấy chủng A.oryzae có thể hoạt động ở khoảng pH rất rộng từ 4.0 - 8.0. Ttuy nhiên, chủng NS này sinh trưởng mạnh trong khoảng pH từ 6.0-7.0 tốt nhất ở pH = 6.5 ( bằng với đối chứng) đồng thời sinh trưởng giảm dần ở pH dưới 6.0 và trên 7.0 . Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Mai Thị Hằng về pH của RNM Nam Định, Thái Bình dao động từ 6.5 -7.4 [12]. d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Nhiệt độ (0C) Đường kính KL (mm) 30(ĐC) 31 25 13 30 31.5 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của chủng A. oryzae Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy ở nhiệt độ 500C chủng A.oryzae gần như không sinh trưởng được, vậy A. oryzae không phải là chủng ưa nhiệt. Trong khoảng nhịêt độ 300C - 350C A.oryzae sinh trưởng mạnh. Ở nhiệt độ 250C A.oryzae sinh trưởng yếu. Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh thái RNM Cần Giờ vì nơi đây biên độ nhiệt trong ngày dao động từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) khi khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của A. oryzae . Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A.oryzae e. Ảnh hưởng của thời gian Nhằm xác định khoảng thời gian A.oryzae sinh trưởng tốt nhất Chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae 35 29 40 27 45 15 50 1 Qua kết quả ỏ bảng trên chúng ta thấy từ ngày 1 đến ngày 3, chủng A .oryzae sinh trưởng nhanh và tạo nên KL có kích thước lớn. Đến ngày thứ 3 trở đi là thời gian bắt đầu sinh bào tử, thì sự sinh trưởng của chủng này chậm hẳn lại Điều này phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trưởng của chủng A.oryzae của các tác giả Nguyễn Lân Dũng ( 2000), Đoàn Văn Thược (2005), Löông Ñöùc Phaåm (2006) là chủng A.oryzae sinh trưởng nhanh trong 3 ngày đầu nuôi cấy. Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của thời gian lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae f. Ảnh hưởng của độ mặn Độ mặn là yếu tố rất quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của các NS ở RNM Cần Giờ. Điều này càng đặc biệt hơn với các NS thuộc nhóm ưa mặn. Để xác định độ mặn thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.11 Bảng 3.11: Ảnh hưởng độ mặn đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Thời gian (giờ) Đường kính KL A.oryzae (mm) 24 7 48 21 72 30 96 36 120 40 144 42 168 43 Khả năng chịu mặn là một đặc trưng của nấm sợi RNM Cần Giờ. Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy chủng A.oryzae đều sinh trưởng tốt trên MT cả nước ngọt lẫn nước mặn. Ở MT có độ mặn 3% A.oryzae sinh trưởng mạnh hơn đối chứng 0% nhưng khi độ mặn tăng trên 3% thì sinh trưởng giảm dần. Điều này chứng tỏ đây là chủng NS chịu mặn, có nguồn gốc từ đất liền đưa tới lâu dần thích ứng với môi trường nước lợ ở RNM Cần Giờ. Như vậy, độ mặn thích hợp cho A.oryzae sinh trưởng là 3% phù hợp với điều kiện sinh thái ở RNM Cần Giờ. Vì nơi đây độ mặn trung bình từ 1,5 – 2,5% .Kết quả này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu khác về độ mặn tốt nhất cho sự sinh trưởng của A.oryzae của Khưu Phương Yến Anh (2007), Nguyễn Thị Lan Hương(2009), Võ Thị Bích Viên ( 2009) là 3%. Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của A.oryzae Dưới đây là bảng tổng hợp các điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng của A.oryzae Độ mặn (%) Đường kính KL (mm) ĐC(0) 25 1 27 2 31 3 35 4 32 5 26 6 24 7 23 Bảng 3.12 : Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh trưởng của A.oryzae Kết luận: Chủng A.oryzae sinh trưởng nhanh, KL lớn và thích nghi với môi trường nước lợ ở RNM . Nguồn gốc của chủng này có thể từ đất liền đưa tới 3.4.2 Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A.oryzae a. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy. Để tìm ra MT thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của chủng A.oryzae, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease của chủng NS nghiên cứu với các loại MT sau: - Môi trường M1 gồm: Cám : trấu : cao thịt – tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - Môi trường M2 gồm: Cám : trấu : casein - tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - Môi trường M3 gồm: Cám : trấu - tỉ lệ ; 70%: 30%: - Môi trường M4: cám : trấu : cao nấm men - tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - MT5 ( MT đối chứng): Cám : trấu : đậu nành – tỉ lệ ; 70%: 25%: 5%. Nuôi cấy chủng đạt đến độ trưởng thành, xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson. Kết quả trình bày ở bảng 3.13 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của A.oryzae Ký hiệu MT MT5 ( ĐC) MT1 MT2 MT3 MT4 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.277 0.989 1.089 1.173 1.223 Từ kết quả ở bảng 3.13 cho thấy hoạt độ protease của A.oryzae đều cao trên các loại MT khác nhau. Điều đó cho thấy nguồn cacbon mà A.oryzae sử dụng tổng hợp protease rất phong phú. Các yếu tố khảo sát Các điều kiện thích hợp Đường kính KL (mm) Nguồn cacbon (g) Glucose 29 Nguồn nitơ (g) Bột đậu nành 29 pH 6.5 27,5 Nhiệt độ (0C) 30 31.5 Thời gian(giờ) 48-72 21-30 Độ mặn (%) 3 35 Ở thí nghiệm này, hoạt độ protease của A.oryzae cao nhất trên MT5 có chất cảm ứng là bột đậu nành, còn ở các MT khác A.oryzae có hoạt lực thấp hơn. Nguyên nhân do bột đậu nành là chất cảm ứng được chúng tôi đưa vào ngay từ lúc lấy mẫu nhằm nhanh chóng chọn được chủng có khả năng sinh protease cao, và A.oryzae là chủng thu được từ MT có chất cảm ứng có hoạt độ protease cao nhất trong số các chủng thu được từ RNM Cần Giờ. Từ đây chúng tôi chọn MT5 làm MT nuôi A.oryzae sinh protease trong các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả nghiên cứu phù hợp với Lê Thị Cẩm Tú (2003) chọn MT bột đậu nành nuôi cấy A.oryzae thu protease có hoạt độ cao. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy trên MT có nguồn nitơ là bột đậu nành thì A. oryzae sinh trưởng mạnh hơn các nguồn nitơ khác. Như vậy đối với chủng A. oryzae mà chúng tôi tuyển chọn thì nguồn thức ăn nitơ là bột đậu nành là phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng . 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT nuôi cấy Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên hoạt độ protease của A.oryzae b. Ảnh hưởng của thời gian Thời gian là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo enzym của NS. Để xác định thời gian thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của chủng A.oryzae, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp 2.2.2.4 . Kết quả trình bày ở bảng 3.14 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease của A.oryzae Thời gian (h) 24 36 48 60 72 Hoạt độ protease ( UI/ml) 0.821 0.890 1.391 1.249 1.152 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có họat độ protease cao nhất ở 48 giờ nuôi cấy. Vì trong khoảng thời gian đầu A. oryzae sinh trưởng rất mạnh, thời kì này enzym cũng được tạo thành. Đến giai đoạn bắt đầu tạo bào tử enzym được tổng hợp mạnh nhất [21]. Về sau quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần nên tốc độ sinh trưởng chậm dần và việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục nhưng ít dần. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2003) về H o ạt đ ộ p ro te as e (U I/ m l) thời gian sinh enzym cao nhất của chủng A. oryzea là 48 giờ. Kết quả này được minh họa bằng biểu đồ 3.5 . 0 0.5 1 1.5 24 36 48 60 72 Thời gian (h) Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt độ protease của A.oryzae c. Ảnh hưởng của pH Thí nghiệm này được tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4, dùng HCl 5% hoặc NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các giá trị: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 8.0. Nhằm xác định pH thích hợp cho sinh tổng hợp protease của chủng A.oryzae. Kết quả trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease của A. oryzae pH 6.5 (ĐC) 5.0 5.5 6.0 7.0 7.5 8.0 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.163 1.007 1.046 1.188 1.383 0.99 0.98 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có hoạt độ protease cao trong khoảng pH từ 6.0 - 7.0 và cao nhất như ở pH = 7.0. Còn các mẫu ở pH dưới 6.0 và trên 7.0 đều có hoạt độ protease thấp hơn. Theo tác giả Mai Thị Hằng thì pH ở RNM dao động từ 6.5-7.4, với khoảng pH này thì NS sinh trưởng tốt, hơn nữa đối với chủng A. oryzae thì sinh trưởng và tạo enzym tỉ lệ thuận với nhau. Kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Trần Thạnh Phong ( 2004), Lê Thị Cẩm Tú ( 2003) cho rằng A. oryzae có protease hoạt động mạnh ở MT axit hơi trung tính. Ở pH quá thấp hay quá cao hoạt độ enzym sẽ giảm mạnh. Nguyên nhân do pH quá thấp hay quá cao sẽ làm bất hoạt một số protease và làm cố định enzym này bên trong khuẩn ty nấm, enzym không tiết ra ngoài sợi nấm nên hoạt độ giảm [22]. H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease của A.oryzae d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Thí nghiệm này được tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Nuôi cấy chủng A. oryzae để ở các nhiệt độ khác nhau 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C nhằm xác nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae. Kết quả trình bày bảng 3.16 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của chủng A.oryzae Nhiệt độ ( 0C) 30 ( ĐC) 20 25 35 40 45 50 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.090 0.701 0.740 1.212 0.850 0.589 0.154 Từ kết quả bảng trên cho thấy, khoảng nhiệt độ 30-350C chủng A.oryzae có hoạt độ proteaes cao. Ở nhiệt độ 350C có hoạt độ cao hơn so với mẫu đối chứng. Mặt khác kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng A.oryzae thì ở khoảng nhiệt độ này thích hợp cho chủng A.oryzae sinh trưởng mạnh. Hơn nữa chủng A.oryzae mà chúng tôi đang nghiên cứu có quá trình sinh trưởng và tạo enzym xảy ra đồng thời. Như vậy chủng A.oryzae sinh trưởng mạnh ở 300C và có hoạt lực protease cao ở nhiệt độ 350C. Sở dĩ có kết quả như vậy là do khi nhiệt độ tăng lên trong giới hạn cho phép thì kéo theo các quá trình trao đổi chất cũng diễn ra nhanh hơn, trao đổi chất cần có enzym nên lúc này enzym được tạo ra nhiều dẫn đến hoạt lực tăng cao. Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh thái RNM Cần Giờ vì nơi đây biên độ nhiệt trong ngày dao động từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. 0 0.5 1 1.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 pH H o aï t ñ o ä p o te as e (U I/ m l) 0 0.5 1 1.5 20 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ ( C) Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease của A.oryzae e. Ảnh hưởng của độ mặn Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Nuôi cấy chủng A.oryzae ở các MT có độ mặn khác nhau 0%, 1%, 2%, 3%, 4% . Kết quả trình bày ở bảng 3.17 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ protease của A.oryzae Độ mặn (%) 0 1 2 3 4 Hoạt độ protease (UI/ml) 1.187 1.296 1.399 1.416 1.363 Từ kết quả ở bảng 3.17 cho thấy chủng A.oryzae có hoạt độ protease khá cao ở MT không có NaCl, nhưng cao nhất ở MT có nồng độ muối 3%. Kết quả này phù hợp với điều kiện sinh thái của RNM Cần Giờ vì nơi đây có độ mặn trung bình từ 1,5 – 2,5% . Ở độ mặn 3% chủng A.oryzae sinh trưởng rất mạnh.Vậy độ mặn thích hợp cho chủng A.oryzae sinh protease là 3%. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007). Nguyễn Thị Lan Hương (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn sinh trưởng và tạo enzym của A.oryzae là 3%. H o ạt đ ộ P ro te as e (U I/ m l) 1 1.2 1.4 1.6 0 1 2 3 4 Độ mặn(%) Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh protease của A.oryzae f. Ảnh hưởng của độ ẩm Để tìm ra độ ẩm thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease của chủng NS nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Xác định hoạt độ protease của chủng trên các MT có độ ẩm khác nhau: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% . Kết quả trình bày ở bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh protease của chủng A.oryzae Độ ẩm (%) 45 50 55 60 65 70 Hoạt độ protease UI/ml) 1.180 1.224 1.280 1.047 0.846 0.836 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có hoạt độ protease mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Chúng ta đã biết, độ ẩm là yếu tố rất quan trọng đối với sự lên men bề mặt. Vì nếu nuôi cấy trên khay hở độ ẩm trên 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí. Đặc biệt ở độ ẩm 75%, MT bị bết lại vì quá nhiều nước làm NS sinh trưởng rất yếu nên hoạt độ enzym giảm rất mạnh còn độ ẩm là 45 - 50 % thì MT quá khô, NS sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính của enzym tạo thành. Như vậy để chủng A. oryzae có hoạt độ protease cao ta nên nuôi ở MT có độ ẩm 55%. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2003) , Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) độ ẩm thích hợp cho sự tạo enzym của A. oryzae là 55%. H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 0 0.5 1 1.5 45 50 55 60 65 70 Độ ẩm (%) Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của độ ẩm lên sự tạo enzym protease của A.oryzae Dưới đây là bảng tổng hợp các điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Bảng 3.19: Tổng hợp các điều kiện thích MT hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Các yếu tố khảo sát Các điều kiện thích hợp Hoạt độ (UI/ml) H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 3.4.3. Động thái quá trình sinh tổng hợp protease của A.oryzae Tiến hành nuôi cấy chủng A.oryzae ở những điều kiện thích hợp đã khảo sát ở trên và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp protease với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt độ của enzym tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.20 Kết quả động thái quá trình sinh tổng hợp protease Thời gian (giờ) Các giá trị Nhiệt độ(0C) pH Hoạt độ (UI/ml) 0 30 6.5 0 24 30.5 6.6 0.511 36 34 6.8 0.876 48 33 7.2 1.391 60 32 8.1 1.332 72 31 7.4 0.983 Kết quả bảng 3.20 cho thấy tại thời điểm 48 đến 60 giờ, chủng A.oryzae cho hoạt độ protease có giá trị cao hơn hẳn so với các thời điểm khác. Đây chính là thời điểm thích hợp để thu enzym. Tương ứng với sự tăng hoạt độ enzym, pH của MT cũng tăng theo. Sau các thời điểm này thì hoạt độ enzym giảm rõ rệt. Tuy nhiên, theo thời gian pH ngày càng tăng. Điều này có thể giải thích do MT nuôi cấy sử dụng nguồn bột đậu nành bổ sung đã làm MT ngày càng chuyển sang trung tính, hơi ngã sang kiềm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Fenikxova, Silova ( 1960 ). Nhiệt độ của mẫu nuôi cấy cũng tăng theo thời gian, nhiệt độ tăng nhanh khoảng 24 -36 giờ đầu lúc này A.oryze sinh trưởng mạnh và bắt đầu tổng hợp enzym, sau 40 giờ nuô